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CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA

SEPARACION DE LOS PIGMENTOS DE UNA PLANTA

PRESENTADO POR:

CASALLAS RAMÍREZ NATALIA

ORJUELA VARGAS WENDY VANESSA

GUEVARA YEISON

UNIVERSIDAD DE LA AMAZONIA

FACULTAD DE INGENIERIA

PROGRAMA INGENIERIA DE ALIMENTOS

III SEMESTRE

2019
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CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA

SEPARACION DE LOS PIGMENTOS DE UNA PLANTA

PRESENTADO POR:

CASALLAS RAMÍREZ NATALIA

ORJUELA VARGAS WENDY VANESSA

GUEVARA YEISON

PRESENTADO A:

ALBERTO FAJARDO

UNIVERSIDAD DE LA AMAZONIA

FACULTAD DE INGENIERIA

PROGRAMA INGENIERIA DE ALIMENTOS

III SEMESTRE

2019
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 INTRODUCCIÓN

La Cromatografía es una técnica de separación en la que los componentes de una muestra

se separan en dos fases: una fase estacionaria de gran área superficial, y una fase móvil.
El objetivo de la fase estacionaria es retrasar el paso de los componentes de la muestra.
Cuando los componentes pasan a través del sistema a diferentes velocidades, estos se
separan en determinados tiempos. Cada componente tiene un tiempo de paso
característico a través del sistema, llamado tiempo de retención. La separación
cromatografía se logra cuando el tiempo de retención del analito difiere del resto de
componentes de la muestra.

La cromatografía puede ser preparativa y analítica.

 La cromatografía preparativa se refiere a la separación de los componentes de una

mezcla para su posterior procesamiento, y se puede considerar un método de
purificación.
 En la cromatografía analítica generalmente se hace con una pequeña muestra
permitiendo para cuantificar la proporción relativa de los componentes en la mezcla.
La cromatografía es una de los principales métodos analíticos y permite la separación y
cuantificación de sustancias muy similar en estructura y propiedades químicas.

 OBJETIVOS

- Aplicar los principios de la técnica cromatografía en la separación e identificación

cualitativa de los principales componentes de los pigmentos de una planta.
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 FUNDAMENTO

Cromatografía en capa delgada:

Técnica cromatografía se emplea en la separación, identificación y cuantificación de los

componentes de una mezcla de sustancias (en solución) en la cual se hace uso de un lecho
constituido por un sólido finamente pulverizado (que opera como la fase estacionaria)
dispuesto o inmovilizado sobre una placa plana ordinariamente de forma cuadrangular o
rectangular, hecha de vidrio, aluminio o plástico. La separación se lleva a cabo colocando
una gota de la solución que porta la mezcla a una distancia de aproximadamente 0.5 mm
de uno de los costados de la placa, sin permitir que se extienda más allá de un par de
milímetros de diámetro; tras ello, luego de permitir o inducir la evaporación del
disolvente, la placa se introduce ligeramente inclinada dentro de un recipiente o cámara
de elución que contiene la fase móvil, que es un disolvente que asciende por capilaridad
por el lecho de la placa (el nivel del mismo no debe de rebasar en altura al de las muestras
de la mezcla que han sido colocadas sobre la placa).
Los diferentes eluatos se separarán de esta manera en base a sus diferentes afinidades
entre las dos fases al ir migrando a lo largo de la placa impulsados por la fase móvil. La
cámara se mantiene cerrada para que su atmósfera se sature en los vapores del eluyente
con el objeto de facilitar su ascenso, evitando pérdidas por evaporación y manteniendo un
flujo regular. Como fase estacionaria se han empleado el cloroformo. El desplazamiento
de un eluato se cuantifica en términos de su Rf o factor de retardo, la relación entre la
trayectoria recorrida por cada eluato entre la que ha recorrido el frente del disolvente.
Algunos expertos recomiendan que solamente se permita al disolvente recorrer a lo sumo
dos terceras partes de la placa, pero es posible dejar que el disolvente ascienda más sin
que los resultados se vean afectados y, de hecho, esto permite una mejor resolución de los
componentes de la mezcla. (Anónimo. 2017-12-06)
Estudio de pigmentos vegetales

Los colores que presentan los vegetales son debidos a unos compuestos químicos
llamados pigmentos. El color que presenta un determinado órgano vegetal depende
generalmente del predominio de uno u otro pigmento o la combinación de ellos. Además,
algunos de los pigmentos que condicionan el color están estrechamente ligados a las
actividades fisiológicas del propio vegetal. Los pigmentos vegetales se clasifican en tres
categorías principales que van a ser estudiados en esta práctica: Carotenos, Xantofila,
Clorofila A y Clorofila B.
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Fig. 1

CAROTENOS

Son pigmentos amarillos, naranjas o rojos. Estos siempre acompañan a la clorofila en una
relación e tres a cuatro partes de clorofila por una de carotenoides. Son insolubles en agua
y solubles en grasas y disolventes orgánicos. Existen varios tipos de carotenoides, que
difieren en cuanto a solubilidad:

Carotenos: Hidrocarburos solubles en éter de petróleo.

Xantofilas: Derivados oxigenados de los carotenos y solubles en alcohol.

CLOROFILAS

Son los pigmentos verdes de las plantas que se encuentran especialmente en la hoja. Son
los encargados de captar la energía de la luz para sus funciones vitales. Son pigmentos
insolubles en agua, pero en grasas y disolventes como el éter.

Podemos distinguir entre estos:

Clorofila A: Es de color azul verdoso.
Clorofila B: De color amarillo verdoso.

Dicho color se ve afectado por la temperatura, sufriendo una intensificación. El pH

también influye sobre estas macromoléculas.

Las clorofilas son sensibles a los ácidos. En un medio ácido, son capaces de sustituir el
átomo de magnesio por dos de hidrógeno, dando lugar a las feofitinas. En este paso, se
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produce una marcada alteración del color de los alimentos. Iones de cobre y zinc, pueden
unirse a dicha molécula, para restituir el color verde inicial de la planta. Bien es cierto que
no es recomendable para alimentos, destinados http://ilovepedospe.blogspot.com/ al
consumo.

XANTOFILA

Pigmento amarillo de las células vegetales, que se encuentra en la clorofila y forma parte
de su estructura.

 MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES REACTIVOS
4 portaobjetos 4 Erlenmeyer de 125 ml Sílica gel
Mortero con mango Agitador de vidrio Lana de vidrio
Balanza Piedras de ebullición sol: metanol al 50%
Embudo de separación Plancha de calentamiento Metanol: éter de petróleo
(5:7)
2 tubos capilares Papel filtro Cloroformo: metanol (2: 1)
Frasco de boca ancha Sulfato de sodio anhidro
Pinzas Espinaca
Embudo de caña larga Yodo

 PROCEDIMIENTO

 Preparación de las placas

Tome dos placas de vidrio del mismo tamaño (aproximadamente 12 x 3 cm) y lávelas
muy bien con agua y detergente abundante, enjuáguelas luego con abundante agua para
remover todo el detergente. Enjuague luego con 50% de metanol acuoso y póngalas a
secar en una estufa. Las placas deben manipularse por los bordes y no poniendo los dedos
sobre su superficie.
Por agitación con una varilla haga una suspensión lo más homogénea posible de 35 g. de
sílica gel en 100 ml de cloroformo: metanol (2: 1 volumen a volumen). Coloque esta
suspensión en un cilindro hasta casi llenarlo (unos 2 cm por debajo de su borde superior),
colocando las placas una sobre la otra y soportándolas con los dedos por su parte superior
sumérjalas lentamente en el cilindro con la suspensión dejando que penetre en la
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suspensión unas 4/5 partes de su longitud. Luego retírelas suavemente; después deje que
el solvente se evapore y sepárelas con mucho cuidado.
Ponga a activar las placas en una estufa a 110 °C por 10 minutos colocándolas dentro de
un vaso. Después de dejar que se enfríen a temperatura ambiente las placas quedan listas
para ser usadas.

 Extracción de la espinaca

En un mortero muela aproximadamente unos 65 gramos de espinaca con 50 ml de

metanol. Decante la solución de metanol haciendo presión sobre la espinaca tratando de
sacar la mayor parte del solvente. Vote la solución de metanol. Muela la espinaca con una
mezcla de 25 ml de metanol y 35 ml de éter de petróleo (p. de e. de 30 a 60°C). Filtre la
mezcla a través de un embudo tapado con un poco de lana de vidrio en un embudo de
separación de 125 m!. Vuelva a moler la espinaca con 25 m!. de metanol y 75 m!. de éter
de petróleo y vuelva a filtrar la mezcla en el embudo de separación. Estas operaciones
extraerán la mayor parte de los pigmentos orgánicos en la fase del éter de petróleo. Saque
la fase inferior de metanol y bótela. Agregue 50 ml de agua a la fase de éter de petróleo
tape el embudo y agite. Deje que se separen las fases y luego saque la fase acuosa inferior
y bótela. Repita esta extracción con otra porción de agua de 50 m!. EI objeto de lavar la
solución de éter de petróleo con agua es sacarle las pequeñas cantidades de metanol que
contenga. Vierta la solución de éter de petróleo en un Erlenmeyer de 125 ml y séquela
agregándole aproximadamente 2 gramos de sulfato de sodio anhidro y agitando. Decante
la solución en otro Erlenmeyer. Agregue una piedrita de ebullición y evapore la mayoría
del solvente en una plancha hasta que el volumen de la solución se haya reducido a unos
20 ml. Guarde esta solución para los siguientes experimentos.

 Aplicación de la muestra

Como ejemplo de sustancias a separar por cromatografía se han tornado los pigmentos
presentes en las plantas. Estos pigmentos son los carotenos y la clorofila. Introduzca la
punta de un capilar en la solución de los pigmentos. Luego que la solución haya
ascendido en el capilar retírelo. Toque momentáneamente y con suavidad con la puntas
del capilar lleno la placa, para colocar un punto (aproximadamente en al centro y a uno 2
cm del borde inferior). Se debe lograr una manchita circular de unos 3-5 mm de diámetro.
Debe tenerse cuidado en no perforar la superficie del adsorbente al hacer la aplicación, así
que el toque en la punta de aplicación debe ser muy suave. Si se estima que no quedó
suficiente compuesto en las mancha se puede hacer una segunda aplicación en el mismo
punto. Se deja que el solvente se evapore de la placa y así quedará lista para hacer la
cromatografía.
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 Cromatografía

En un frasco de boca ancha se introduce una tira de papel de filtro de unos 10 cm de

ancho y unos 3 cm más corta que la altura total del cilindro. Se impregna bien el papel
con cloroformo y luego se agrega cloroformo al cilindro hasta una altura de unos 5 mm y
se tapa el cilindro con un vidrio de reloj dejándolo en reposo unos 5 minutos para que su
atmósfera se sature con los vapores del solvente. Luego, con una pinza se coge la placa
por su parte superior limpia y se introduce verticalmente con cuidado (mancha hacia
abajo) en el cilindro volviendo luego a taparlo. El solvente al entrar en contacto con la
parte inferior de la placa empieza a ascender y cuando llega a la mancha empezara el
proceso de cromatografía. Permita que el solvente llegue hasta el nivel superior del
adsorbente en la placa, entonces retire la placa con cuidado con las pinzas y deje que el
solvente se evapore. ¿Cuántas manchas ve en la placa? ¿De qué color son? ¿Cuál es su
posición?

 Revelado de las placas

Para poder ver la posición de manchas incoloras en la placa se introduce esta en un

recipiente cerrado de unos 2 litros con 1 gramo de yodo en el fondo y se deja un rato. Una
mancha ligeramente café aparece donde hay compuestos orgánicos en la placa producto
de un complejo formado entre el yodo gaseoso y el compuesto. Como las manchas no son
muy estables al sacar la place del recipiente se deben dibujar con un lápiz.

 RESULTADOS

Carotenos

Clorofila b

Clorofila a

Xantofila
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Al observar el papel donde hemos hecho la cromatografía, vemos cuatro bandas o zonas,
que corresponden a los distintos pigmentos fotosintéticos presentes en las hojas de
espinaca. Según su grado de solubilidad con el éter de petróleo se reconocen estas bandas
y en este orden: · clorofila b · clorofila a · xantofila · carotenos Esta técnica de separación
se basa en la diferente solubilidad de los pigmentos en el alcohol. En primer lugar al
romper las células en el mortero los pigmentos que se hallaban encerrados en los
cloroplastos dentro de ellas pasan al alcohol. En numerosas ocasiones uno de los
pigmentos es más abundante y enmascara a los demás que no se pueden observar. La
separación se produce en la hoja de papel de filtro colocada sobre la placa , ya que el
pigmento más soluble en el alcohol será el que forme una banda coloreada en la parte
superior del papel y el menos soluble en alcohol será el último en ascender a través del
papel. En la disolución extraída del vegetal tendremos tantos pigmentos como bandas
coloreadas aparezcan en la cromatografía.

 Conclusión

En esta práctica de se aprendió que los vegetales tienen diferentes tipos de clorofila y
que esos son los pigmentos que la conforman, de igual manera se logró observar
diferentes tipos de colores y a utilizar aspectos importantes en el laboratorio que nos
van dejar buenos aprendizajes para futuros experimentos. Entre todos los caracteres
más externos de los vegetales, el más notable y característico es probablemente el
color. El color no es únicamente un carácter llamativo de la vegetación, sino que,
además, algunos de los pigmentos que lo condicionan están estrechamente ligados a
las actividades fisiológicas del propio vegetal. Por consiguiente, el estudio de cómo las
plantas viven y se desarrollan requiere el previo conocimiento de los pigmentos
vegetales.

 CUESTIONARIO

1 Analizar y explicar los resultados de sus cromatogramas. Puede dibujar las

placas y la posición de las manchas de los compuestos antes y después de la
cromatografía.
2 En la cromatografía de capa delgada, ¿cuál es la fase estacionaria y cuál es la
fase móvil?
3 Explique cómo y por qué se separan los componentes de la mezcla de
pigmentos. ¿Cuál de los pigmentos es atraído con más fuerza por la sílica gel?
¿Por qué?
4 ¿Qué solvente o mezcla de solventes recomendaría usted para hacer que el
desplazamiento de las manchas desde su posición original fuera menor que el
observado por usted en la práctica?
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5 Usted tiene un compuesto impuro y quisiera saber cuántas sustancias están

contaminando su compuesto. Explique cómo lo haría utilizando cromatografía
de capa delgada o de papel.

 DESARROLLO CUESTIONARIO

1 se encuentra en los resultados.

La solubilidad en alcohol de los pigmentos es, de mayor a menor: carotenos, clorofila a,

clorofila b y xantofila. Indicar que pigmento corresponde a cada banda. Las bandas
naranjas son los carotenos y las amarillas son las xantofilas, estas van por arriba de la
clorofila.

2 En la cromatografía de capa delgada, la fase estacionaría es aquella en la cual están

retenidos los componentes de la muestra, y a través de la cual fluye la fase móvil
arrastrando a los mismos, en cuanto a la fase móvil, es aquella que fluye a través de una
fase estacionaría, arrastrando con ella a los compuestos de la mezcla.

3 Lo que se deja es que se mueva la mezcla por un soporte y los componentes se separan
porque se mueven a diferentes velocidades, debido a las diferentes fuerzas de adsorción
que ejerce el soporte sobre cada elemento. El término adsorción hace referencia cuando
una sustancia se introduce en la estructura de otra; por ejemplo, una esponja absorbe agua,
de tal manera que si la cortamos en pedazos vamos a encontrar agua en todas partes de la
estructura de la esponja.

4 recomendaríamos el éter etílico para extraer la clorofila, porque las moléculas de la

clorofila tienen una compleja estructura, compuesta por cadenas orgánicas, que le
confiere un elevado carácter “hidrófobo”. En consecuencia se debe realizar la extracción
con un solvente orgánico donde la clorofila tenga una elevada solubilidad como es el caso
del éter etílico pero también es muy soluble en otros solventes orgánicos.

5 Al realizar el procedimiento respectivo para una cromatografía de capa delgada la cual

separa compuestos orgánicos de una muestra sirve para determinar si el compuesto
orgánico esta impuro y que sustancias lo están contaminando. Por consiguiente en la placa
cromatografía de capa delgada al mirar el extendido de las sustancias en la placa se
mostraran puntos o manchas al ser absorbida o atraídas con mayor fuerza por la capa
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estacionaria, por ende entre menos manchas allá en el extendido menos impura será esas
manchas corresponderán a las sustancias que contaminan.

BIBLIOGRAFIA

https://www.tplaboratorioquimico.com/laboratorio-quimico/procedimientos-basicos-de-
laboratorio/que-es-la-cromatografia.html