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– Prácticas BCMM –
Práctica 2: Obtención de fusiones génicas entre genes (u operones) de una soca de Salmonella y el
gen reporter LacZ
Salmonella
Es lactosa – : no tiene los genes para usar la lactosa.
Gen reportero
Gen cuyo producto es fácilmente detectable. Se vinculan a una secuencia regulatoria de otro gen de
interés, en este caso a Salmonella.
Se usa en construcciones genéticas para verificar la transferencia del transgén a una célula o tejido,
o para estudiar la actividad de promotores y otras secuencias reguladoras.
→ En las prácticas usamos el gen reportero lacZ. El gen LacZ proviene del operón lac requerido
para el transporte y metabolismo de la lactosa en Escherichia coli entre otras. En este caso LacZ NO
Mariona Llad
Transducción vírica
El gen reporter (LacZ) está vehiculado en un transposón (MudJ). Eso se introducirá en la cepa
huésped (Salmonella enterica) a través de la transducción vírica.
También incluye el gen de la resistencia a la Kanamicina (Km) que es un antibiótico del grupo de
los aminoglucósidos. Esto sirve para seleccionar aquellas UFC que hayan incorporado en
transposón. Como tiene su propio promotor siempre se transcribirá → selección UFC resistentes.
La transposasa se no se encuentra estrictamente dentro del transposón pero reconoce la región
marcada con *:
* LacZ Km Transposasa *
Tn
Medios
→ McConkey normal: Lactosa + aminoácidos + indicador pH + NaCl…
→ McConkey Mal: Maltosa + aminoácidos + indicador pH + NaCl…
Escrutinio o “screening”
Se analizan miles de colonias sembradas en McConkey normal. Si hay degradación lactosa se
acumulan productos ácidos y el medio vira a rojo. Si la bacteria no puede degradar la lactosa, como
es el único azúcar, utilizará la peptona y el medio se basificará y será blanco.
Nosotros seleccionamos las UFC ROSAS, serán aquellas que han incorporado el transposón en el
sentido correcto, y además el Tn se habrá insertado en un operón de poca expresión (débiles,
inducibles...) →únicamente hay expresión basal como en los operones de la maltosa (que son
inducibles por la maltosa).
Si cogiéramos las rojas estaríamos cogiendo bacterias que sí han incorporado el Tn pero se ha
insertado en algún gen de expresión constitutiva o bien de expresión inducible (con inductor en el
medio). Lo que es seguro es que no será ningún operón de la maltosa.
Si cogiéramos las blancas estaríamos cogiendo bacterias que han incorporado el Tn pero invertido y
no puede haber transcripción de LacZ (ya que el nuestro no tiene promotor propio).
Las UFC seleccionadas que son las rosas se siembran en medio McConckey-MALTOSA.
Tendremos colonias blancas y rojas.
Las rojas son aquellas en las que hay degradación de la maltosa y serán la gran mayoría (la fracción
de DNA que son operones de la maltosa es muy pequeña comparado con todo el DNA).
Las blancas serán aquellas que se han vuelto incapaces de usar la maltosa porque el Tn se ha
insertado en uno o más operones de la maltosa. Serán aquellas que seleccionaremos y sembraremos
en LB-Km50.
Después se evalúa la actividad β-galactosidasa leyendo la DO a 600 nm.
Anotaciones:
- Se añade una gota de cloroformo para limpiar el lisado de posibles contaminaciones.
- Se mantienen los eppendorf 30 minutos a 37ºC para la adsorción y penetración del fago.
- Intentamos mantener la multiplicidad de infección 1:1.
- Dos controles: D→ bacteria + MgSO4. E → MgSO4 + lisado fago 1/10. Los dos sin crecimiento.
Mariona Llad
- Se cogen las colonias rosas de McConkey-lactosa de las placas “C”, es decir, de la dilución 1/100
del lisado.
- Para el blanco: todo igual sustituyendo la muestra de cultivo por LB.
- Podría suceder que se inserte más de un Tn en los operones de la maltosa. En este caso la
actividad de la β-galactosidasa se vería aumentada.*