UUNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD
DE CIENCIAS QUIMICAS
CARRERA EN QUIMICA Y FARMACIA

TEMA:

 OBSERVACIONES AL MICROSPIO
 TECNICAS DE OBSERVACION

SUBTEMAS

1.-EL MICROSCOPIO.- TIPOS Y PARTES

2.- PREPARACIONES EN FRESCO O HUMEDAS
3. PREPARACIONES TEÑIDAS: 3.1FROTIS 3.2FIJACION 3.3 TINCION 3.4 LOS
COLORANTES 3.5TINCION SIMPLE
4.- TINCION DOBLE O DIFERENCIAL 4.1 TECNICA DE GRAM 4.2 TINCION DE
ALCOHOL ACIDO RESISTENTE 4.3 TINCION DE BACTERIAS
ESPORULADAS.- TINCION DE LA TINTA CHINA

INTEGRANTES

 ALEJANDRO ALMEIDA SAMANTHA

 HEREDIA CABRERA EVELYN
 PARRAGA LOOR PAUL

GRUPO 2 – SUBGRUPO Nº 3

DOCENTE
Q.F MARIANITA DE JESUS RENDON MARISCAL MS. C

5to SEMESTRE

G2
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 2018 - 20
Contenido
1. El Microscopio ....................................................................................................................... 3
MICROSCOPIO COMPUESTO........................................................................................... 3
MICROSCOPIO ÓPTICO O LIVIANO. ............................................................................. 3
MICROSCOPIO DIGITAL. .................................................................................................. 3
MICROSCOPIO FLUORESCENTE. ................................................................................... 4
PARTES DEL MICROSCOPIO ........................................................................................................... 4
OCULAR: ................................................................................................................................ 4
El TUBO: ................................................................................................................................. 5
REVÓLVER: ........................................................................................................................... 5
BRAZO..................................................................................................................................... 5
PLATINA ................................................................................................................................. 5
OBJETIVO .............................................................................................................................. 5
PINZAS DE SUJECIÓN: ....................................................................................................... 5
CONDENSADOR: .................................................................................................................. 6
TORNILLOS DE ENFOQUE: .............................................................................................. 6
BASE ........................................................................................................................................ 6
2. PREPARACIONES EN FRESCO O HÚMEDAS. .......................................................................... 6
3. PREPARACIONES TEÑIDAS..................................................................................................... 7
3.1 FROTIS ................................................................................................................................... 7
3.2 FIJACION ......................................................................................................................... 8
3.2 TINCION ..................................................................................................................... 8
3.4 LOS COLORANTES ........................................................................................................ 8
3.5 TINCION SIMPLE ........................................................................................................... 8
4. TINCIÓN DIFERENCIAL: .............................................................................................................. 9
4.1 TECNICA DE GRAM ...................................................................................................... 9
4.2 TINCION ALCOHOL ÁCIDO RESISTENTE (ZIEHL-NEELSEN) ....................... 10
4.3 TINCION DE BACTERIAS .......................................................................................... 10
4.4 TINCION CON TINTA CHINA ................................................................................... 11
5. RECOMENDACIONES ............................................................................................................... 12
6.CONCLUSIONES ........................................................................................................................ 12
Bibliografía .................................................................................................................................. 12

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 1. El Microscopio

El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto

pequeño. Es el instrumento que más se usa en los laboratorios que estudian los
microorganismos.

Si pensamos en un laboratorio ya se químico, clínico, biológico o científico en general, lo

primero que se nos viene a la mente es un microscopio, pues hay que conocer al
instrumento más común del laboratorio.

Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original.

El microscopio existe en varias formas como:

MICROSCOPIO COMPUESTO.

Es un aparato óptico hecho para agrandar objetos, consiste en un

número de lentes formando la imagen por lentes o una combinación de
lentes posicionados cerca del objeto, proyectándolo hacia los lentes
oculares u el ocular.
MICROSCOPIO ÓPTICO O LIVIANO.

Es un tipo de microscopio compuesto que utiliza una

combinación de lentes agrandando las imágenes de pequeños
objetos. Los microscopios ópticos son antiguos y simples de
utilizar y fabricar.

MICROSCOPIO DIGITAL.

Tiene una cámara CCD adjunta y está conectada a un LCD, o a una

pantalla de computadora. Un microscopio digital usualmente no
tiene ocular para ver los objetos directamente.

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MICROSCOPIO FLUORESCENTE.

Es un tipo especial de microscopio liviano, que en vez de tener

un reflejo liviano y una absorción utiliza fluorescencia y
fosforescencia para ver las pruebas y sus propiedades.

PARTES DEL MICROSCOPIO

MICROSCOPIO CON SUS PARTES.

OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador (por donde
mira). Su misión es ampliar la imagen del objetivo. Suelen tener
dos oculares, por eso se llaman binoculares, si solo tiene uno se
llama monocular.

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El TUBO: El tubo óptico se puede acercar o alejar de la
preparación (lo que se quiere ver) mediante un TORNILLO
MACRO MÉTRICO o de grandes movimientos que sirve
para realizar un primer enfoque.

REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos.

Permite, al girar, cambiar los objetivos. La esfera se suele
llamar CABEZAL y contiene los sistemas de lentes oculares
(monoculares o binoculares (2 lentes).

BRAZO: Es una pieza metálica de forma curvada que

puede girar; sostiene por su extremo superior al Tubo
Óptico y en el inferior lleva varias piezas importantes.

PLATINA: Lugar donde se

deposita la preparación que se quiere observar. Tiene en su
centro una abertura circular por la que pasará la luz del sistema
de iluminación.

OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la

imagen de ésta determinando las cantidades de aumentos con la que
queremos observar.

PINZAS DE SUJECIÓN: Parte mecánica que

sirve para sujetar la preparación. La mayoría de los microscopios
modernos tienen las pinzas adosadas a un carro con dos tornillos, que
permiten un avance longitudinal y transversal de la preparación.

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CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos que
inciden sobre la preparación. El condensador de la parte de abajo
también se llama FOCO y es el que dirige los rayos luminosos hacia
el condensador.

TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima

el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.

BASE: Sujeccion de todo el microscopio.

ESPEJO con una cara plana y otra cóncava,

está montado sobre un eje giratorio ubicado en la zona más inferior
del brazo por debajo de la Platina. (RLbuhos, 2015)

2. PREPARACIONES EN FRESCO O HÚMEDAS.

La forma más simple de preparar un espécimen para su examen microscópico es hacer

una preparación en fresco. Existen dos técnicas, una preparación en fresco simple ("entre
porta y cubre") consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un
portaobjetos y a continuación cubrirla con un cubreobjetos.

Una preparación en gota pendiente se realiza colocando una

gota del material en un cubreobjetos y cubriéndolo con un
portaobjetos (invertido) con una excavación central
(portaobjetos excavado). Hay que sellar la preparación con
vaselina alrededor de la excavación. La ventaja de esta última
técnica, es que la preparación no se seca y puede ser observada
durante un tiempo más largo.

Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Por

ejemplo, para la búsqueda de Trichomonas vaginalis en secreciones vaginales. Este

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protozoo de gran movilidad causa inflamación de la vagina y la uretra. Si en la
preparación se observan células en forma de huso que se mueven mediante contracciones
o sacudidas cruzando el campo, probablemente se tratará de T. vaginalis, pudiéndose
efectuar el diagnóstico.

Sin embargo, el inconveniente de la observación en fresco

es que no permite aumentar el contraste de la preparación.
Por tanto, su uso, con un microscopio óptico de campo
claro, está bastante limitado. Normalmente, para observar
microorganismos vivos se utiliza alguno de los otros
microscopios ópticos que hemos mencionado anteriormente.

3. PREPARACIONES TEÑIDAS

La preparación consiste en una capa de la muestra extendida sobre un portaobjetos libre

de grasa. Esta preparación debe ser lo suficientemente delgada para permitir el paso de
la luz a través de ella. Los extendidos o frotes se dejan secar al aíre; para asegurar que
las células queden adheridas al portaobjetos y no se desprendan durante los lavados que
se realizan durante la tinción; la preparación se fija con calor moderado, pasando el
portaobjetos 5 o 6 veces sobre la flama del mechero, o adicionando sustancias
deshidratantes y/o precipitantes como metanol o cloruro mercúrico, procediendo a hacer
la tinción. Esta puede ser:
Positiva: Cuando se colorea directamente a los microorganismos o a las estructuras en
estudio; utilizan colorantes.
Negativa: Cuando se oscurece el fondo de la preparación y se observa la silueta incolora
de los microorganismos.

3.1 FROTIS

Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va
a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. Puede usarse
una aguja estéril para transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la
superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solución
salina previamente colocada sobre el portaobjetos. El material colocado en el portaobjetos
se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero
de Bunsen hasta que el vidrio esté tan caliente que moleste al tacto pero no queme.

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3.2 FIJACION

La fijación, procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a

cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. La fijación por
calor es la más utilizada para la observación de bacterias. Este procedimiento consiste en
pasar el portaobjetos, con la suspensión bacteriana extendida y seca, a través de una llama
de un mechero. La fijación por calor preserva la morfología externa de los
microorganismos pero no las estructuras internas. La fijación química con agentes como
etanol, folmaldehido y ácido acético entre otros muchos, se utiliza para preservar las
estructuras celulares. (seramix.blogs.uv.es, 2013)

3.2 TINCION

Se pueden utilizar dos tipos de procedimientos, la tinción positiva es la más frecuente,

en ella un colorante se une a ciertas estructuras microbianas. Todos los colorantes
utilizados en microbiología tienen en común la presencia de grupos cromóforos, grupos
con dobles enlaces conjugados que son los responsables del color mediante la unión a
estructuras celulares por enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos, los que establecen
enlaces iónicos son los más frecuentes. Entre los colorantes que se unen por enlaces
covalentes destaca el reactivo de Schiff, utilizado para la tinción de DNA, donde el
colorante se une a la desoxi-ribosa.
Por otra parte, en la tinción negativa se utilizan compuestos que no penetran en las
células sino que impregnan el medio circundante. Los microorganismos aparecen
refringentes sobre un fondo negro. (Llanos, 2017)

3.4 LOS COLORANTES

Compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les imparten color; están
formados por un grupo cromóforo que es la parte responsable del color, y un grupo
auxócromo que al formar sales le permite disociarse y combinarse. Mordente : compuesto
químico intensificador de color.

3.5 TINCION SIMPLE

En las tinciones simples se usa un único colorante, que siempre

es de tipo básico como safranina, azul
demetileno o cristal violeta.

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Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán el
colorante y quedarán teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción simple mejora la
observación de la célula completa. Se fija el espécimen, se añade el colorante y se deja el
tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparación ya
está lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente, hay que añadirlo justo antes del
colorante.

4. TINCIÓN DIFERENCIAL:

El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas o entre

partes de una misma célula. Estas técnicas utilizan más de un colorante o bien ciertos
reactivos complementarios para la tinción. Ejemplos: Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-
Neelsen, etc.

4.1 TECNICA DE GRAM

Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de
cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para
quitar el exceso de colorante. En este estado,
todas las células, tanto las grampositivas como
las gramnegativas, están teñidas de azul. El
portaobjetos se cubre entonces con una
solución de yodo-yoduro potásico. El
ingrediente activo es aquí el I2; el KI
simplemente hace soluble el I2 en agua.

El I2 entra en las células y forma un complejo

insoluble en agua con el cristal violeta. De
nuevo tanto las células grampositivas como las
gramnegativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después la
decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el
complejo I2-cristal violeta.

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 Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros
(gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por
tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho
de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente
lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar
la membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano).

La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-

yodo y la célula se decolora. Las células grampositivas, a causa de sus paredes celulares
más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente,
provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared
celular. Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules, pero las
gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las células gramnegativas se
utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la
safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células
gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules.

4.2 TINCION ALCOHOL ÁCIDO RESISTENTE (ZIEHL-NEELSEN)

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos
micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de
resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos.
Por esto se denominan ácido-alcohol resistente. El frotis se tiñe durante unos 5 min con
Fucsina fenicada aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etílico
95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teñir durante 30-60 seg con Azul de
Metileno (color de contraste). Lavar y secar.

4.3 TINCION DE BACTERIAS

Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la
desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden
dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los términos

10
positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan
dos grupos morfológicos distintos de bacterias). Descripta en forma breve, la secuencia
de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se
lava con agua, se cubre con solución Yodada durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con
agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color
de contraste) durante 1 – 2 min. Lavar y secar. Las bacterias gram-positivas y gram-
negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de
sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma
al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular
bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano.
La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas
de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared
de la célula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, por
otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está
rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y
lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano.

4.4 TINCION CON TINTA CHINA

La tinción tinta china o nigrosina se usan para el examen de microscopia directo delas
cápsulas de muchos microorganismos. Se utiliza
principalmente para la detección de Cryptococos
neoformans, hongo causante de
la criptococosis, infección que puede ser grave en
pacientes con un sistema imnunológico debilitado
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las
estructuras celulares se tiñencon la misma
tonalidad (TINTA CHINA, AZUL DE
METILENO O LOEFFLER) La tinta china o

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nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas(cryptococcus), sobre todo
en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan latinta china y la capsula aparece como
un halo claro alrededor de los microorganismos. La tinción negativa es el reverso del
procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio
el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia
utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los
constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que
es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro
insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste
de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la
presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

5. RECOMENDACIONES

1. No tocar las lentes con las manos.

2. Mantener seca y limpia la platina del microscopio.
3. Las preparaciones teñidas deben de ser observadas en el microscopio con el
objetivo de 100X
4. Conocer las técnicas para la correcta tinción de las placas.
5. Contar con los materiales y reactivos.

6. CONCLUSIONES

El microscopio es sin duda el elemento más importante en cualquier laboratorio ya que

nos permite ver células, microorganismos y bacterias lo cual es imposible observar a
simple vista.

Para realizar las preparaciones teñidas se lleva a cabo una serie de pasos como el frotis,
fijación, tinción y el uso de los colorantes el cual ayudara en la observación e
identificación de la bacteria que estamos estudiando. La tinción simple solo usa un
colorante el cual mejora la observación de la célula completa.

7. Bibliografía

ferchonpacheco. (9 de julio de 2009). overblog. Obtenido de overblog: http://inter-micro-

uvm.over-blog.es/article-33657472.html
RLbuhos. (4 de septiembre de 2015). Medium. Obtenido de Medium:
https://medium.com/@Rogerloaeza/el-microscopio-875d288a6c97

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Tortora, G., Funke, B. & Case., C. (2016). Microbiology: An Introduction. Pearson. p. 65
Madigan, T., Martinko, J., Bender, K., Buckley, D. & Stahl, D. (2015). Brock Biology of
Microbiology. Pearson. p. 28
Martín-Lacave, I. and T. García-Caballero, Atlas de Inmunohistoquímica:
Caracterización de células, tejidos y organos normales. 2012, Ediciones Díaz de Santos,
S.A. p. 22.
Revista Portales Médicos (15 de marzo, 2013) Artículo de revisión. La coloración de
gram y su importancia en el diagnóstico microbiológico. Obtenido de http://www.revista-
portalesmedicos.com/revista-medica/coloracion-gramdiagnostico-microbiologico/

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