UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA
CURSO: MICROBIOLOGÍA - LABORATORIO

INFORME DE PRÁCTICA N°8

Título: ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Integrantes:

ALUMNO CÓDIGO FIRMA

Fuentes Guevara, Dennisse Yeriot 20161438

Huachaca Vilca, Erick Bryan 20161444

Méndez Reyes, Yoselin 20170265

Yalta Aliaga, Anderson Alexsander 20161468

Ciclo: 2018-II
Especialidad: Ingeniería en Industrias Alimentarias
Horario de práctica: Lunes 11:00 am - 1:00 pm (B*)
Profesor de laboratorio: Juscamaita Morales, Juan Gabriel
Fecha de la práctica: 22/10/18
Fecha de entrega del informe: 29/10/18

LA MOLINA - LIMA - PERÚ

1. INTRODUCCIÓN

Todos los seres vivos llevan a cabo el procesamiento de los nutrientes que los mantienen
vivos. A este conjunto de procesos, se le conoce como metabolismo y consiste de un gran
número de reacciones químicas destinadas a transformar las moléculas nutritivas en elementos
que posteriormente serán utilizados para la síntesis de los componentes estructurales; como
pueden ser las proteínas. Otra parte importante del metabolismo es la de transformar y
conservar la energía que está contenida en una reacción química en algún proceso que requiera
de energía, como puede ser el trabajo o el movimiento (ILCE, 2003).

Es evidente que los nutrientes son transformados cuando entran en un organismo, ya que en
ningún caso el alimento contiene todas las moléculas que una célula requiere. Esto se vio con
claridad al observar el crecimiento normal de levaduras en un medio de cultivo que sólo
contenía glucosa como única fuente de energía. Así pues, se pensó que la síntesis de todos los
componentes celulares se llevaba a cabo en el interior de las levaduras. Hoy sabemos que las
transformaciones que sufre la glucosa no ocurren en un solo paso, sino que, por el contrario, se
forman varios productos intermedios que en muchas ocasiones no tienen una función
específica a no ser la de formar parte de lo que se conoce como vía metabólica (ILCE, 2003).

La capacidad de efectuar esta serie de reacciones que les permiten incorporar y transformar
diversos compuestos, son catalizadas por enzimas y son acompañadas por reacciones
energéticas. Aún cuando todas las reacciones biológicas son catalizadas por enzimas el tipo de
estas o de los sistemas enzimáticos varía en los diferentes microorganismos. De este modo
para estudiar el metabolismo de un microorganismo se utiliza diferentes medios de cultivo
,donde luego de incubar una cepa bacteriana se procede a reconocer el tipo de reacciones que
se efectuaron mediante la determinación de los productos que se formaron (Cortijo et al.,
2013).

Por ejemplo, entre las enzimas que descomponen carbohidratos tenemos la enzima celulasa
,que descompone la celulosa y las amilasas ,que degradan almidón; por otro lado, las
proteasas, degradan proteínas; y las lipasas, descomponen grasas y aceites (Picho, 2016). La
suma de las actividades enzimáticas, así como las características nutricionales permiten la
identificación de las bacterias (Cortijo et al., 2013).

2. OBJETIVOS

● Determinar el tipo de actividad enzimática que presentan los microorganismos Bacillus sp.,
Salmonella sp., Staphylococcus sp. y E. coli de acuerdo a la hidrólisis que realizan en Agar
almidón, Agar gelatina, Agar grasa y Agar caseína.
● Realizar un cultivo de Staphylococcus sp. en Agar Manitol Salado.

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3. RESULTADOS

3.1. Hidrólisis del almidón

Bacillus sp. Salmonella

Staphylococcus sp. E. coli

Figura 1. Acción enzimática en agar almidón

3.2. Hidrólisis de la gelatina

Bacillus sp. Salmonella

Staphylococcus sp. E. coli

Figuras 2. Acción enzimática en agar gelatina

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3.3. Hidrólisis de la Caseína

Bacillus sp. Salmonella

Staphylococcus sp. E. coli

Figuras 3. Acción enzimática en agar caseína

3.4. Hidrólisis de los lípidos

Bacillus sp.

Salmonella

Staphylococcus
E. coli

Figuras 4. Acción enzimática en lípidos

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 3.5. Agar manitol salado inoculado con Staphylococcus

Figuras 5. Cultivo de Staphylococcus sp. en manitol salado

4. DISCUSIONES

Agar Almidón:
La molécula del almidón es muy compleja y para su asimilación por las bacterias, estas deben
descomponerla (hidrolizarla) en sustancias más simples y fácilmente asimilables. Un gran número de
bacterias son capaces de elaborar una enzima amilasa que hidroliza el almidón con formación de
maltosa. La maltosa puede ingresar a la célula para ser utilizada. La enzima amilasa es también una
enzima extracelular, por lo tanto, la demostración de la hidrólisis del almidón puede hacerse tanto en
medio líquido como en medio sólido.
En el medio sólido (sobre las placas) al agregar la solución de Lugol, se formará un color azul si no
hubo hidrólisis; la aparición de una zona clara alrededor de las colonias significa la hidrólisis del
almidón. Cuando la bacteria no hidroliza el almidón todo el medio permanece azul. Para evidenciar la
formación ácida será necesario agregar un indicador apropiado al medio de cultivo (UNMSM, 2010).
Las bacterias con capacidad amilolítica representan entre el 22 al 51% de bacterias viables, su
principal sustrato es el almidón, sin embargo, pueden utilizar lactato; son responsables de la
degradación de materiales amiláceos en ácidos grasos volátiles. Algunos ejemplos son: Bacteroides;
Streptococcus, Bacillus y Staphylococcus (Frioni, 2011). En nuestro caso las dos últimas bacterias
mencionadas por autor presentaron actividad amilolítica, lo cual confirma lo dicho por el autor.

Agar Gelatina:
Las proteínas que se producen naturalmente son demasiado grandes para entrar en una célula
bacteriana; por lo tanto, para que una célula utilice las proteínas, primero deben ser catabolizadas en
componentes más pequeños. Las enzimas exocelulares de tipo proteolítico, gelatinasas, son secretadas
por ciertas bacterias para desdoblar a las proteínas y este proceso se realiza en dos etapas
Ciertas bacterias elaboran una enzima extracelular que tiene la propiedad de hidrolizar la gelatina, esta
enzima es conocida como Gelatinasa. La presencia de gelatinasa puede ser demostrada inoculando un
cultivo bacteriano en un medio conteniendo gelatina.
La prueba se realiza a temperatura a la cual la gelatina se mantenga en estado sólido por sí misma (por
ejemplo, a 37°C de temperatura)
La presencia de líquido significa que la gelatina ha sido hidrolizada (liquefactada). Por el contrario, si
el medio permanece sólido es señal de que la bacteria no posee la enzima gelatinasa. Este medio puede
ser repartido en placas, 20 mL por placa y sembrado en estrías, luego de la incubación se agrega el

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siguiente reactivo: Se cubre la placa con el reactivo, cuando la gelatina no es hidrolizada, se formará
un precipitado blanco muy opaco (ausencia de hidrólisis), y cuando la gelatina es hidrolizada se
formará un halo claro en el contorno de la colonia sobre la estría (UNMSM, 2010).
Algunas bacterias con actividad proteolítica son: Peptostreptococcus anaerobius, Clostridium
sticklandii, Clostridium aminophilum, Escherichia Coli y del genero gram (-) patógeno Pseudomonas
(Frioni, 2011). En nuestro caso las bacterias que presentaron actividad enzimática proteolítica fueron
Escherichia Coli y en menor medida el patógeno Salmonella sp.

Agar Caseína:
Aquellas bacterias que pueden degradar esta proteína (caseína), necesitan de la caseasa, una
exoenzima hidrolizante. En otras palabras, la caseasa es una proteasa que rompe el enlace peptídico
CO-NH introduciendo agua a la molécula, liberando pequeñas cadenas de aminoácidos llamados
péptidos, los cuales luego serían disminuidos a aminoácidos libres para ser utilizados por las células.
Esta peptonización produce un aclaramiento en aquellas zonas de proliferación de bacterias con
caseasa en el momento de la reacción de revelado (Swamy, 2008).
En cuanto a las bacterias que son capaces de producir proteasas extracelulares encontramos a bacterias
patogénicas como el Staphylococcus y Streptococcus, bacterias acuáticas como las Pseudomonas y
bacterias de suelo como los Bacillus y Clostridium (Swamy, 2008). En nuestro caso, experimentamos
con cuatro bacterias Bacillus, Staphylococcus, E. coli y Salmonella. Las bacterias que mostraron
actividad proteolítica fueron las dos primeras bacterias mencionadas, pues alrededor de sus colonias se
pudo observar zonas claras lo cual nos indica que hubo degradación de caseína. Mientras que las dos
últimas bacterias no presentaron actividad enzimática, no hubo reacción de desclarificación con la
proteína.

Agar Grasa:
El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio que contiene
triglicéridos, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar como nutrientes a los
ácidos grasos mediante la lipólisis enzimática. Al medio de cultivo se le añade un colorante, SO4Cu2,
y al difundir la enzimas en el medio de cultivo sólido, disminuye el pH debido a la acumulación de los
ácidos grasos libres, y su color se vuelve visualmente más brillante e intenso en aquellas zonas en
donde se encuentran los ácidos grasos libres. Las lipasas se definen como aquellas enzimas capaces de
hidrolizar los enlaces éster de los ácidos carboxílicos de sustratos insolubles. El rol biológico de las
lipasas consiste en iniciar el metabolismo de las grasas y aceites reduciéndolos a ácidos grasos libres
realmente metabolizables y glicerol. Los triglicéridos no se absorben intactos dentro de la célula, así
que la hidrólisis inicial ocurre extracelularmente. Por esta razón, las lipasas microbianas generalmente
son excretadas por la célula, y se encuentran como enzimas extracelulares (Koneman, 2008).
Las bacterias que utilizamos para la determinación de enzimas lipolíticas fueron Bacillus,
Staphylococcus, E. coli y Salmonella. En los cuales todas presentaron actividad enzimática, pues al
colocar el indicador, las colonias se tornaron azuladas lo que nos indica que hay producción de
enzimas lipasas.

Agar manitol salado inoculado con Staphylococcus sp.:

La selectividad de este medio se basa en la presencia de cloruro sódico que inhibe el crecimiento de
las bacterias Gram (-) y permite el crecimiento de las bacterias Gram (+) (Brunker, 2004). El tipo de
bacteria usado en la inoculación fue el Staphylococcus, esta es una bacteria Gram positiva, esta tiene
capacidad para fermentar el manitol induciendo a la acidificación del medio volviéndolo amarillo.

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5. CONCLUSIONES

● El microorganismo Bacillus sp. tiene actividad enzimática amilolítica, proteolítica en caseína

y lipolítica; mientras que el patógeno Salmonella sp. tiene actividad proteolítica en gelatina y
lipolítica. Staphylococcus sp. presenta actividad enzimática amilolítica, proteolítica en caseína
y lipolítica; y por otro lado, E. coli tiene actividad enzimática lipolítica y proteolítica en
gelatina.
● El cultivo de Staphylococcus sp. en Agar Manitol Salado se realizó de forma exitosa
ocurriendo un cambio de color en el agar de rojo a amarillo que indica la acidificación del
medio por la fermentación del manitol.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

● Cortijo, K; Gamboa, W; Taboada, Y; Villaca, W. 2013. Actividades bioquímicas de los

microorganismos, Metabolismo General (en línea). Ancash, Perú, Universidad Nacional del
Santa. . Consultado 27 oct. 2018. Disponible en https://es.slideshare.net/ruddymin/analisis-
microbiologia
● ILCE (Instituto Latinoamericano de la Comunicación Educativa, MX). 2003. Metabolismo
bacteriano (en línea). México. Consultado 27 oct. 2018. Disponible en
http://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/ciencia/volumen1/ciencia2/43/html/sec_6.html
● Picho, J. 2016. Enzimas microbianas. (PDF). Microbiología aplicada. Ecuador, Universidad
San Francisco de Quito. Consultado 27 oct. 2018. Disponible en
https://es.scribd.com/document/368508732/Enzimas-Microbianas-pdf
● Finegold, SM; Bailey, WR; Baron, EJ; Fineglod, SM; Scott, EG. 1991. Bailey Scott:
diagnóstico microbiológico. Médica Panamericana.
● Brunker, T; González, N; Prendas, O. 2004. Medio de Enriquecimiento Selectivo para el
Aislamiento de Staphylococcus aureus.
● Koneman, EW; Allen, S. 2008. Koneman. Diagnostico Microbiologico/Microbiological
diagnosis: Texto Y Atlas En Color/Text and Color Atlas. Ed. Médica Panamericana.
● Swamy, PM. 2008. Laboratory manual on biotechnology. Rastogi Publications.
● UNMSM. 2010. Medios de Cultivo en Microbiología Manual de Laboratorio. Consultado 28
oct. 2018. Disponible en http://microbiologiamedica.web16.top/medios/medios-
comunes/medio-de-gelatina
● Frioni, L. 2011. Microbiología: básica, ambiental y agrícola. 1ra ed. Buenos Aires, Argentina,
Orientación Gráfica Editora.