Sunteți pe pagina 1din 2

Lucrare practica 1 - Dozari de proteine utilizand diferite metode si standarde

proteice

Metode de dozare: Lowry


Standarde proteice: BSA si cazeina

1. Dozarea concentratiei de proteine prin metoda Lowry

Principiul metodei
Dozarea proteinelor se bazeaza pe doua reactii. In prima reactie are loc reducerea ionilor de
cupru (Cu2+), in mediu alcalin care formeaza un complex cu legaturile peptidice, iar a doua
reactie se bazeaza pe reducerea fosfomolibdatilor si fosfowolframatilor din reactivul Folin-
Ciocâlteu de catre compusii fenolici din proteina (tirozina) [Lowry et al., 1951]. Produsii de
reactie sunt colorati in albastru si au un spectru de absorbtie cuprins intre 650 - 750 nm.

Solutii si reactivi:
1. reactivul alcalin de cupru preparat din 10 parti reactiv A si o parte B:
reactivul A este o solutie Na2CO3 anhidru 10% preparata in solutie NaOH 0.5N,
reactivul B este o solutie de CuSO4x5H2O 0.5% preparata in solutie citrat de sodiu 1%.
2. reactiv Folin-Ciocalteu; reactivul de lucru s-a obtinut prin dilutia acestuia 1:9 in apa
distilata
3. solutie BSA (albumina serica bovina) 0.01% sau cazeina 0.01%
4. proba

Mod de lucru:
Se pipeteaza în ordine:
- 200 μl din fiecare proba (diluata 100x)
- 200 μl reactiv alcalin de cupru
! repaus 10 minute la t˚ camerei
- 600 μl de reactiv de lucru Folin-Ciocalteu
! incubare 10 minute la 50˚C
- dupa racirea probelor la t˚camerei se citeste absorbanta acestora la spetrofotometru la 660
nm fata de apa

Trasarea curbei etalon:


Pentru determinarea concentratiei proteice este necesara trasarea unei curbe de
etalonare. Se folosesc solutii BSA/cazeina de diferite concentratii cunoscute care se supun
aceluiasi tratament (reactiv alcalin de cupru, reactiv Folin-Ciocalteu), iar a caror absorbanta
va fi citita la 660 nm. In tabelul urmator este prezentata schema de lucru:

Nr. tub μl solutie μl apa distilata μg/ml


BSA/cazeina 0.01% BSA/cazeina
1 0 200 0
2 40 160 20
3 80 120 40
4 120 80 60
5 160 40 80
6 200 0 100
Se traseaza grafic variatia D.O. la 660 nm (pe ordonata) in functie de concentratia
proteica (pe abscisa). Se determina ecuatia dreptei care trece la distante egale intre cele 6
puncte si R2.