UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA

AGRICULTURA
INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA
MICROSCOPIA

Fecha: 14/06/2019
Integrantes:
 David Chávez NRC: 4763
 Janine Peralta
 Sasha Sigüenza
 Gabriel Zambrano

TEMA: Preparación y observación de muestras en el microscopio electrónico de barrido (SEM)

OBJETIVO

Aprender a utilizar el microscopio electrónico de barrido (SEM) para observar muestras biológicas
y no orgánicas.

INTRODUCCIÓN

Los microscopios electrónicos permiten magnificar las muestras que se van a observar hasta 2
millones de veces, lo cual permite estudiar la ultraestructura de una gran variedad de muestras
orgánicas e inorgánicas. Dentro de los tipos de microscopios electrónicos se encuentra el
microscopio electrónico de barrido (SEM) el cual permite analizar una zona de interés con
aumentos sumamente altos. Mediante el empleo de este microscopio se puede obtener imágenes
de alta resolución y profundidad de campo detallada lo cual no se podría conseguir con lo
microscopios ópticos. El SEM emplea un haz de electrones de alta energía que escanea la
superficie de la muestra y se generan varias señales por la interacción de los electrones con la
muestra, las cuales dan información de la morfología externa, la composición química, la
estructura cristalina y la distribución de los materiales que componen la muestra (Swapp, 2017).
En el microscopio en estudio se puede realizar la técnica Espectroscopia de Dispersión de Energía
(EDS) mediante la cual se detectan todos los elementos químicos con número atómico mayor a 4
que conforman la muestra y permite determinar la abundancia de cada uno de ellos (López et al.,
2019). El SEM es importante en las áreas donde se requiere la caracterización de sólidos como en
la investigación, el control de calidad y el análisis de fallas de los materiales. Adicionalmente es
importante para la producción de microchips. Se lo emplea en las investigaciones forenses ya que
se pueden realizar análisis de residuos de bala, comparación de marcas de bala entre otros. Debido
a que se pueden observar muestras biológicas se lo usa para identificar nuevos microorganismos,
medir el efecto del cambio climático en las especies, etc. En la medicina contribuye a determinar
las causas de las enfermedades y medir los efectos de los tratamientos en los pacientes a través de
la comparación de muestras de sangre y tejidos (ATA Scientific , 2017).

MARCO TEÓRICO

Microscopio electrónico

El microscopio electrónico es un instrumento de gran utilidad en la investigación científica gracias

a su gran poder de aumento, al magnificar muestras hasta 2 millones de veces, mientras
que los mejores microscopios de luz están limitados a aumentos de 2000 veces (Bozzola & Lonnie,
1998).

El principio de funcionamiento de un microscopio electrónico se basa en utilizar electrones en

lugar de luz visible. Los electrones son acelerados a gran velocidad e impactan con la muestra,
algunos son reflejados por la muestra y otros la atraviesan, y mediante la detección de estos
electrones es posible reconstruir la imagen de la muestra (Science Learning Hub, 2012).

Las partes principales del microscopio electrónico son: una fuente de electrones, un conjunto de
lentes electromagnéticas, una cámara de vacío y una pantalla fluorescente. Adicionalmente es
necesario un ordenador para operar el microscopio y procesar las imágenes obtenidas (Science
Learning Hub, 2012).

El Microscopio Electrónico es utilizado por los investigadores para examinar materiales

biológicos (como microorganismos y células), una variedad de moléculas grandes, muestras de
biopsias médicas, metales y estructuras cristalinas, y las características de varias superficies
(Bradbury, Joy, & Ford, 2016).

Microscopio electrónico de barrido (SEM)

Un microscopio electrónico de barrido es un tipo de microscopio electrónico que produce

imágenes de una muestra al escanearla con un haz de electrones enfocado. Los electrones
interactúan con los átomos en la muestra, produciendo varias señales que pueden detectarse y que
contienen información sobre la topografía y composición de la superficie de la muestra
(Raghavendra & Pullaiah, 2018). La información tridimensional que proporciona esta técnica lo
convierte en un instrumento muy útil para determinados tipos de muestras (Science Learning Hub,
2012).

Los componentes principales de SEM incluyen:

 Fuente de electrones.
 Columna por la que viajan los electrones con lentes electromagnéticas.
 Detector de electrones
 Cámara de muestras
 Ordenador y pantalla para ver las imágenes.

Los electrones emitidos por un cátodo de tungsteno, se aceleran hacia abajo y pasan a través de
una combinación de lentes electromagnéticos (condensadora y objetivos) y aberturas, para
producir un haz enfocado de electrones que golpea la superficie de la muestra. La muestra se monta
en un área de la cámara donde se produce vacío mediante una combinación de bombas. El nivel
de vacío dependerá del diseño del microscopio (Nanoscience Instruments, 2017).

Funcionamiento básico del SEM

Un haz de electrones de alta energía explora la superficie de una muestra, generalmente recubierta
con una película delgada de oro o platino para mejorar el contraste y la señal de ruido. A medida
que el haz escanea la superficie, se producen interacciones entre la muestra y los electrones dando
como resultado diferentes tipos de señales de electrones emitidas en o cerca de la superficie de la
muestra. Estas señales electrónicas se recopilan, procesan y, finalmente, se convierten en píxeles
en un monitor para formar una imagen de la topografía de la superficie de la muestra que aparece
en tres dimensiones (Carter & Shieh, 2015).
Interacción electrón-muestra

Un haz de electrones es emitido termiónicamente desde un SEM típico por medio de un cañón de
electrones equipado con un cátodo de filamento de tungsteno. Cuando el haz de electrones
primario interactúa con la muestra, los electrones pierden energía por la dispersión y absorción
aleatoria repetida dentro de un volumen en forma de lágrima del espécimen conocido como el
volumen de interacción. El intercambio de energía entre el haz de electrones y la muestra resulta
en la reflexión de electrones de alta energía por dispersión elástica, emisión de electrones
secundarios por dispersión inelástica y la emisión de radiación electromagnética, cada uno de los
cuales puede ser detectado por detectores especializados (Kaech, 2013).

Para producir una imagen en un microscopio electrónico de barrido se requieren la interacción del
haz de electrones con los átomos a varias profundidades dentro de la muestra. Se producen varios
tipos de señales que incluyen electrones secundarios (SE), electrones retrodispersados (BSE),
rayos X característicos, catodoluminiscencia (CL) y calor. Los electrones secundarios son los más
valiosos para mostrar morfología y topografía en muestras. En cambio, los BSE son los más útiles
para contraste de ilustración en composiciones de múltiples fases (Swapp, 2017).

Los electrones secundarios por su baja energía (entre 3 y 5 eV) se originan a unos pocos
nanómetros de la superficie de la muestra (Goldstein et al., 1981). Se producen como resultado de
interacciones entre los electrones de alta energía del haz y los electrones de la banda de conducción
de la muestra. La generación de rayos X se produce por colisiones inelásticas de los electrones
incidentes con electrones en orbitales discretos de átomos en la muestra. A medida que los
electrones excitados regresan a estados de energía más bajos, producen rayos X que tienen una
longitud de onda fija. Por lo tanto, se producen rayos X característicos para cada elemento en un
mineral que es "excitado" por el haz de electrones. Los rayos X generados por las interacciones de
electrones no conducen a la pérdida de volumen de la muestra, por lo que es posible analizar los
mismos materiales repetidamente (Swapp, 2017).

Preparación de muestras

En los SEM convencionales la presión de la cámara de muestras se encuentra entre. Estas presiones
requieren una especial y elaborada preparación de las muestras biológicas con un alto contenido en
agua (Manzano, Garrido, & Jiménez, 2018).

Muestras biológicas

Antes de procesar una muestra de origen biológico se debe estudiar las características y
propiedades que posee, con la finalidad de decidir que método de procesamiento es el más óptimo.

El proceso de preparación de muestras biológicas sigue una serie de pasos definidos, los cuales se
van a realizar u omitir dependiendo de las características de la muestra.

 Fijación: el objetivo de la fijación es preservar las células y los constituyentes de los

tejidos con las mismas características que poseían al inicio del procesamiento. Su función
es detener la autolisis y la descomposición bacteriana, estabilizar los constituyentes
celulares y tisulares para que resistan los siguientes pasos del procesamiento, relacionados
con la pérdida total de agua. La fijación puede realizarse
 mediante métodos físicos o por métodos químicos (Manzano, Garrido, & Jiménez, 2018).

En cuanto a las sustancias fijadoras, las más utilizadas son los aldehídos, entre ellos el
glutaraldehído, el formaldehído y el tetraóxido de osmio. Estas sustancias son importantes
para mantener las estructuras en las condiciones más próximas a las vitales (Pino, 2008).

 Glutaraldehído: es el fijador más utilizado porque es el que mejor conserva la

estructura celular. No desnaturaliza las proteínas, las estabiliza. El mayor
inconveniente es que su poder de penetración es relativamente lento (Manzano,
Garrido, & Jiménez, 2018).

 Formaldehído: penetra más rápidamente en los tejidos en comparación con el

glutaraldehído. La desventaja del formaldehído es que produce importantes
retracciones en los tejidos (Manzano, Garrido, & Jiménez, 2018).

 Tetróxido de osmio: es muy volátil, tóxico y altamente oxidante. Se utiliza

fundamentalmente en la postfijación de muestras. Aumenta la conductividad
eléctrica de las muestras y las endurece. Su inconveniente principal es su lenta
penetración, aunque fija rápidamente (Manzano, Garrido, & Jiménez, 2018).

 Deshidratación: el propósito de la deshidratación es minimizar los cambios morfológicos

provocados por una rápida eliminación del agua contenida en el tejido de una muestra. La
mayoría de las muestras biológicas presentan un alto contenido en agua, por tanto, se
recomienda deshidratarlas mediante una serie de lavados progresivos con alcohol etílico
en concentración creciente. También se puede deshidratar utilizando concentraciones
crecientes de acetona o deshidratar con etanol, y a continuación hacer lavados a
concentraciones crecientes de acetato de amilo para a continuación hacer desecación por
punto crítico (Manzano, Garrido, & Jiménez, 2018)

 Desecación: la desecación se realiza generalmente empleando la técnica de punto crítico.

Mediante esta técnica los líquidos pasan directamente a la fase gaseosa sin modificar su
densidad. De este modo, se elimina la tensión superficial causante de la deformación de
la muestra al producirse el proceso por encima del punto crítico del líquido, sin que exista
una interfase líquido-gas (Manzano, Garrido, & Jiménez, 2018).

 Montaje: después de secar las muestras, se procede a su montaje en portamuestras

metálicos o stubs, generalmente, de aluminio, aunque también los hay de latón o cobre.
Deben estar limpios y libres de grasa. Para adherir la muestra al stubs, hay varias opciones.
Cinta o discos de carbón conductivo de doble cara pintura o pasta de plata coloidal y
pintura de grafito coloidal (Manzano, Garrido, & Jiménez, 2018).

 Recubrimiento conductor: el propósito del metalizado es, por un lado, hacer la muestra
conductora evitándose la formación de cargas en el punto de incidencia del haz de
electrones y por otro, aumentar la producción de señal incrementando la información de
la imagen. Se basa en la aplicación de una capa metálica muy delgada (de unos pocos nm)
sobre su superficie. Los materiales utilizados deben ser estables contra la oxidación
 como el Au-Pd, Pt-Pd. También se suele utilizar el C, sobre todo al realizar análisis
elementales mediante rayos X, ya que es un elemento de bajo número atómico que no
produce una significativa absorción de los rayos X que emergen de la muestra (Manzano,
Garrido, & Jiménez, 2018).

MATERIALES Y MÉTODOS

 Muestras

Las muestras empleadas en la práctica de laboratorio fueron: un dermáptero conocido como

Forficula auricularia (Tijerilla), un arete, una hoja seca y el tallo de la orquídea amarilla
Cymbidium hybrid.

 Fijación de muestras

Las muestras orgánicas fueron secadas al ambiente previo a su fijación, posteriormente se

colocaron sobre Pins de aluminio (Figura 1) desinfectados con etanol, empleando una cinta de
carbono doble faz (conductiva). Se verificó que las muestran no sobrepasen el área superficial del
pin.

Figura 1: Pins para la fijación de muestras.

 Metalización de las muestras

Para poder observar las muestras es necesario que ellas sean conductoras, por tanto, se recubrió a
las muestras biológicas (tallo y dermáptero) con oro por medio de un Metalizador/Evaporador
Quórum Q150R ES. La evaporación se realizó a una presión de 4psi y se recubrió la muestra de
forma uniforme formando una capa de 20nm de oro de 99,9% de pureza.

 Observación de las muestras en el microscopio electrónico de barrido (SEM)

Las muestras se observaron en el microscopio electrónico de barrido (SEM) Tescan MIRA 3. Se

observaron diferentes partes de la muestra, en el caso de la tijerilla se enfocó la cabeza y la cola.
Se realizaron distintos aumentos para ver con mejor detalle zonas específicas. Se tomaron varias
fotos de las muestras. Se obtuvieron las imágenes en formato digital como archivos JPG.

Se observó varias imágenes de muestras empeladas en otros estudios como piezas dentales,
morfología de la madera, nanopartículas de oro, entre otras.

 Análisis por Espectroscopía de Energía Dispersiva (EDS)

Se realizó un “mapping” del arete que se empleó como muestra para identificar los elementos
que lo conforman y determinar la distribución de cada uno de ellos.
RESULTADOS
La muestra analizada fue una muestra orgánica (mosco) a la cual se realizó el proceso de
recubrimiento con oro, para su visualización tridimensional en el microscopio de barrido SEM, la
muestra de metal no se pudo analizar por su tamaño.

El insecto (mosco) al ser una muestra biológica, no conductora fue sometida al evaporador de oro
en el cual se les colocó una capa fina uniforme de 20 nm de oro de 99,9% de pureza.

Figura 2: A) Evaporador de oro Quorum (Q1 SOR ES), B) muestras colocadas en el evaporador,
C) irradiación de la capa de oro sobre las muestras.

La Figura 3 muestra la estructura de la cabeza del insecto (mosco) observada en el microscopio

electrónico de barrido (SEM).

Figura 3: Muestra insecto (mosca) observado en el SEM a 98X,

 La siguiente imagen nos muestra la estructura de las alas y el torso del insecto donde se puede
apreciar incluso las vellosidades que este presenta.

A B

Figura 4: Estructura morfológica del insecto (mosco). A) Observación de las alas a 1.46 kX, B) Amplificación
del segmento del torso a 1.25 kX.

Imagen amplificada de la antena del insecto (mosco) se puede apreciar la presencia de vellosidades.

Figura 5: Antena de insecto (mosco) observado a una magnificación de 939X

La Figura 6 nos muestra el análisis de la composición química en cada parte del casquete de
una bala. A: es la imagen original, vemos bien diferenciados la parte externa de la interna.
B: el color verde representa la presencia de antimonio. C: presencia de azufre en la parte
interna de la balan. D: el color azul representa el oxígeno presente en toda la bala. E: plomo
en la parte interna y un punto en la parte externa. F: hay más zinc en la parte externa. G: BSE
tanto externa como internamente. H: cobre en el recubrimiento de la bala.

Figura 6: Imagen del casquete de una bala. A-H) Composición química diferenciada en cada parte del casquete de bala. J)
Composición química obtenida del EDS.

La Figura 7 nos muestra las glándulas del nematodo Anisakis, podemos ver 7 en total.
 Figura 7: Glándulas del nematodo Anisakis en una magnificación de 10.00 kx.

DISCUSIÓN

Según señala Renau-Piqueras & Faura (2011), la preparación de las muestras es un paso
fundamental para el éxito en la observación con SEM, por lo que se deben utilizar métodos
especializados que conserven la integridad de estructuras de las muestras analizadas y que
eliminen en su totalidad la presencia de agua en estas. Para las muestras estudiadas se
utilizó una técnica de secado al aire libre, por lo que no se utilizó métodos químicos o
físicos para mantener la integridad de las muestras, sin embargo esta técnica es la menos
viable para la observación debido a que las condiciones ambientales no conserva la
estructura natural, al momento de la observación existió la presencia de movimientos en
las imágenes obtenidas debido a que el proceso de deshidratación no se realizó por
completo, es decir había presencia de agua que impedía una buena visualización en zonas
donde este proceso no se había realizado con éxito, este es el caso para las Figuras 3-5.

Un factor crucial para el análisis de las muestras orgánicas en SEM es que estas deben
estar recubiertas con un material que les otorgue conductividad, por lo que para esto se
utilizó el recubrimiento “spputtering” de oro para obtener las mejores condiciones de
imagen, el cual consiste en recubrir la muestra con oro mediante un sistema de vacío en
conjunto con argón que permite el desprendimiento del oro desde la pastilla (upv, 2012),
como se observa en la Figura 1. Pero cuando se realiza el baño existen zonas en las que
por la conformación estructural de la muestra no lograron ser bañadas en su totalidad por
ello al momento de la observación estas zonas no pudieron ser observadas con claridad
por lo que es importante la repetición de las muestras analizadas que permitirán una mejor
caracterización de las mismas.

El SEM permite un mapeo de la superficie de una muestra con el fin de caracterizar la

morfología y determinar el tamaño de muestras, utilizando las interacciones electrón –
materia (Pina, 2004). Dentro del SEM se tiene el detector EDS, este analizará la
composición elemental de la muestra en áreas específicas (Chaves, Puente, & Jiménez,
2013). Como se puede ver en la Figura 6-J se obtuvo un espectro EDS, este análisis SEM
– EDS determinó la composición de una bala. Se encontraron los elementos cobre (Cu),
oxígeno (O), plomo (Pb), azufre (S), antimonio (Sb), selenio (Se), zinc (Zn). Una bala en
su composición tiene los siguientes compuestos: trinitroresolcinato de plomo, nitrato
bárico, bióxido de plomo, trisulfuro de antimonio, latón (cobre – zinc) y de la pólvora
(azufre y carbón) (UMA, s.f.), corroborándose así los elementos encontrados en por el
detector EDS del SEM. Además, como se muestra en las Figuras 1-A a 1-H gracias a que
el SEM permite la obtención de una imagen de alta resolución se colorearon
diferencialmente las diferentes áreas donde se hallaban cada uno de los elementos y en la
Figura 1-I se muestra la totalidad de las zonas coloreadas para cada uno de los elementos.

El SEM se usa de forma rutinaria para generar imágenes de alta resolución de formas de
objetos (SEI) y para mostrar variaciones espaciales en las composiciones químicas: 1)
adquiriendo mapas elementales o análisis químicos puntuales utilizando EDS, 2)
discriminación de fases según el número atómico medio ( comúnmente relacionado con
la densidad relativa) que usa BSE, y 3) mapas de composición basados en las diferencias
en los "activitores" del elemento traza (generalmente elementos de transición de metales
y de tierras raras) que usan CL. El SEM también se usa ampliamente para identificar fases
basadas en análisis químico cualitativo y / o estructura cristalina. En la Figura 6 se puede
observar la diferencia entre los metales pesados, siendo los mayores el Zn y Sb (Argast,
2018).

Aunque en la práctica únicamente se observó la morfología del insecto (Figura 3-5), se

pueden hacer otros análisis para definir el concepto de morfología evolutiva descrito por
Wirkner y Richter (2010) que enfatizan la importancia de las profundas investigaciones
morfológicas en un contexto que va más allá de los meros patrones de ramificación
filogenética. Esto también incluye investigaciones en un contexto funcional o el estudio
detallado y la documentación de la morfología de diferentes etapas de la vida de
organismos modelo como Drosophila o Tribolium. Por varias razones, es probable que La
morfología seguirá desempeñando un papel vital en la sistemática de los insectos y en la
biología evolutiva (Wirkner, 2010).

CONCLUSIONES

 Se pudo verificar que a través del uso de microscopio electrónico de barrido (SEM) se puede
obtener información topográfica, morfológica y composicional de forma rápida y eficiente de
distintos tipos de muestras.

 Es importante conocer si las muestras que se van a emplear son conductoras o no. Las muestras
no conductoras como las biológicas necesitan ser metalizadas para poder ser observadas en el
SEM, por lo que se las recubre con metales como el oro, aplicando una capa uniforme de 20
nm de este elemento.

 En el microscopio electrónico de barrido (SEM) se logró observar muestras orgánicas no

conductoras de la estructura morfológica de un insecto en las tres dimensiones.

 Mediante la técnica Espectroscopia de Dispersión de Energía (EDS) realizada en el SEM se

logró determinar la composición química del casquete de bala, además que tenia una mayor
composición de Zn y Cu, seguido por Pb.

RECOMENDACIONES
 Verificar que las muestras biológicas estén completamente secas pues el agua presente en ellas
no permite una adecuada observación en el SEM. En el caso de que no se pueda secar las
muestras se puede emplear bajo vacío en el microscopio en estudio.

 Se recomienda analizar si la muestra que se va a emplear es conductora, en el caso de no serlo

se metaliza la muestra con una cubierta de oro de 90nm.

 Cuando se emplean muestras biológicas se las puede fijar con glutaraldehído, el formaldehído
y el tetraóxido de osmio para que mantengan las condiciones lo más similares a las vitales.

 Se sugiere manipular correctamente las muestras para evitar su deterioro y contaminación.

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