Sunteți pe pagina 1din 6

I embrioni, - trebuie s3 fie imperecheate cu cei rnai buni rnasculi. Se

intensificg prin transferul de embrioni ~iritmul ameliorgrii efectivelor. lm~ortantaeconomicZi a transferului de embrioni rezida in faptul ca

re obfin rnai multi descendenti valoro.$ rezultati din cupluri cu insugiri I superioare, iar reproducgtorii cei mai buni (masculi gi fernele) sunt folositi

intens la reproductie.

I Transferul de ernbrioni are gi irnportante imwlicatii sanitar- veterinare ~igenetice. lnteresul genetic se explica prin posibilitatea de a

schimba, far3 risc, genele dorite, regrupate individual, independent de

mediul matern. Tn anumite conditii de rnanipulare, transferul de embrioni

constituie rnijlocul cel mai sigur pe plan sanitar-veterinar de rnutatie a

::

i

genelor.

De o mare actualitate, cu implicatii sanitar-veterinare, dar gi

economice, este problerna ernbrionilor purtstori de boli. in cadrul

opera,iunilor de asanare, mi de anirnale contaminate sunt eliminate dln

efectiv prin sucrificare, rezultand astfel pierderi economice imense.

1 Unele cercetari intreprinse de Singh Elizabeth $i col. in 1982. au

I demonstrat ci ernbrionii recoltati de la animale serologic pozitive gi

transferati la receptoare negative, nu au transmis infectia la produgri

rezultati. Din punct de vedere ~tiintific, transferul de embrioni permite

studierea proceselor intime ale reproducerii animalelor, ca gi utilizarea I unor metode biotehnologice conexe, cum ar fi: micrornanipularea $i microchirurgia ovulelor $i embrionilor, fertilizarea "in vitro", conservarea

(

1

(

embrionilor pe lunga durata, obtinerea de hirnere, etc.

Ca un corolar al activitaei pe plan mondial in domeniul transferului

de embrioni, stau miirturie importantele consfituiri $i simpozioane

gtiintifice organizate in diferite tari, care au subliniat importanta acestei

biotehnologii. Astfel, in

1974, in SUA s-a infiintat "International Embryo-

Transfer Society", care cuprinde speciali~tidin dorrieniu~transferului de

1

mblioni la specia umanil pi la animale. In Europa, la paris, in,982 s-a

ituit "L' Association Europene de Transplantation Embrionairen.

In tara noastra s-au facut lucrgri de transfer de embrioni la taurine

(ICPCB Balotegti. SEZ Tg. Mureg, Facultatea de zootehnie gi

Biotehnologii Timigoara), la ovine (SCPCOC Palas, USAM" Cluj-Napoca

$1 Timigoara), la suine (Romsuintest Perig) $1 acestea

14.5.2.Napele transferului de embrionj Transferul de embrioni cuprinde rnai multe &ape.

- alegerea donatoarelor gi receptoarelor,

- preggtirea fernelelor donatoare gi receptoare;

- sincronizarea estrului la femelele donatoare gi femelele

receptoare;

- provocarea poliovulatiei la fernelele donatoare-

- recoltarea embrionilor gi controlul Calitatil lor;

- conservarea embrionilor;

- transferul propriu-zis al embrionilor la fernelele receptoare;

- ingrijirile donatoarei gi receptoarelor dups transfer,

14.5.2.1.Aleaerea donatoarelor Alegerea donatoarelor este 0 etapa deoseb~tde importants pentru

reugita transferului de embrioni. in aceasta acthitate se !in, seama de

starea de reproductie a efectivulul d~ncare provln donatoarele

Princ~palelecriterii de selecfie a donatoarelor sunt, rasa, vgrsta

valoarea zootehnica, dezvoltarea corporala armonioasi, starea de

sanatate perfect&. modul de comportare la reproductie, rnodul cum au

decurs fgtarile anterioare, rezistenta la boli. etc. Foane importants este

valoarea progesteronemiei, stabilitg in perioada ciclului de control,

inaintea inducerii s~per~vulatiei.De mare actualitate este problems utilizsrii gi reutilizgrii donatoarelor pe parcursul unuia sau maimu{tor

consecutivi. Pentru aceasta sunt cercetate posibilitatile de evitare a

imbolnavirilor donatoarelor in timpul sincronizsrii estrulu~,a provocarii

poliovulatiei, recoltarii embrionilor gi altor operatiuni legate de transferul

de embrioni.

14.5.2.2.Aleaerea receptoarelor.

Cu toate ca, aparent, receptoarele sunt mai ugor de selec!ionat

decat donatoarele, alegerea lor este o problema complexii. Se au in

vedere rnai multe criterii:

,

-

este de preferat ca transferul de embrioni sa se fac3 la tineret

femel gi primipare, deoarece la aceste categorii de femele

frecventa infectiilor genitale este rnai redusa, traumatismele

postpartum sunt rnai rare, iar raspunsul la sincronizare este mai

bun;

-

starea de sangtate perfects, pentru aceasta fiind obligatoriu

examenul ginecologic;

-

starea de intretinere bung pentru a face fat3 solicit3rilor din

timpul gestatiei;

-

situatia epizootologic2 a efectivului - bung.

Receptoarele pot avea cslduri naturale sau. induse hormonal. Tn

efectivele mici se recomanda sincronizarea provocat8, iar din efectivele

mari se pot folosi femele cu calduri spontane, urmarite pe parcursul mai

multor cicluri.

Foarte importante sunt: depistarea caldurilor i stabilirea

momentului optim pentru insamintarea donatoarei $i respectiv transferul

propriu-zis la receptoare; este necesars eliminarea receptoarelor care nu

sunt bine sincronizate cu donatoarele.

lnainte de efectuarea transferului gi dups acesta trebuie sa se evite

stresul provocat de schimbarea brusca a regimului de furajare,

f

[

rarea

animalelor,

variaqile - dimatice,

actiuni

,.

sanitar-veteij~larip,

' .&urata §i intensitatea zilei luminil (ovine).

Scopul acestor m8suri preventive este realizarea unui echilibru

hormonal, metabolic, de histocompatibilitate pentru a pastra calitatea

mediului uterin ce conditioneazg implantarea gi nidatia embrionului.

14.5.2.3,lnducerea poliovulatiei la donatoare.

<

B

i

1

d

1

i

Principalul factor lirnitativ in eficacitatea transferului de embrioni

este productia de embrioni. Actualmente se apreciaza c3 30% din

donatoare nu produc niciun embrion utilizabil, iar 45% produc in medie 4

embrioni. Aceasta diferentg de rispuns se datoreaza, pe de-o parte,

variabilitstii produselor hormonale utilizate, iar pe de altg parte

! receptivitgtii individuale (Saumande, J. 1980, Buggin, M. 1990).

i Pentru provocarea poliovulatiei la donatoare se pot folosi diferite

%

b

9 scheme de tratament:

i

t
$

- administrarea de PMSG in doz3 unicg sau in doze r.?petate, la

diferite intervale de timp, asoc~atcu anticorpi anti-PMSG gi cu

?

i

3

progesteron;

- folosirea FSH, obtinut din extracte hipofizare de porc;

- utilizarea uor produse comerciale, pure, de FSH $i LH;

- adm~n~strareade gonadotrop~nacorionic3 (HCG), urmats de

PGF2, la 48 ore dupe stimularea hormonala cu HCG.

lndiferent de substantele stimulente utilrzate, eficac~tatea lor

depinde de reactiv~tatea ovarelor donatoarei, de echilibrul neuro-

hormonal $i metabolic al acesteia.

:. $

14.5.2.4. Sincronizarea estrulur recei~toarelorcu a1 donatoarelor.

in vederea asigurarii conditiilor optime pentru n~dat~e$i dezvoltarea

in organele genitale ale "mamei

adoptive" (femela receptoare) este necesars sincronizarea estrului

produsului de conceptie transferat

acesteia cu al urnarnei naturalen (fernela donatoare). Aceart8 necesitate

decurge din faptul c3 nurnai astfel modificerile aparatului genital al

receptoarei sunt identice cu cele de la niveiul aparatului genital a1

donatoarei.

Exista doue posibilititi de sincronizare a estrului donatoarei cu

receptoarele: naturala gi horrnonala.

1

1

Sincronizarea pe cale naturalg este rnai greu de realizat, deoarece

necesita existents unui nurnar mare de femele din care sa fie alese

1(1 receptoarele gi o perioada rnai indelungata de tirnp, in care fernela

donatoare $i viitoarele receptoare sZi fie urrnirite riguros pe parcursul

3

10

rnai multor cicluri succesive de cilduri.

La ovine, aceasti sincronizare consti in aplicarea "flushing-ului" gi

introducerea berbecilor in turma de oi. Flushingtul asigura o rnai buna

rnetabolizare a proteinelor din hrana $i ca urrnare cregte greutatea

urmata de intensificarea capacitatii acesteia de a

hipofizei, care este

fl sintetiza horrnoni gonadotropi: FSH $i LH. Prezenta berbecilor in turrna,

prin ferornonii elaborati, stirnuleaza functia de reproductie a oilor

(Signoret, J.P. 1991). DacP, ins& berbecii sunt introdugi prea devrerne in

turrni, inainte ca oile si fie receptive, atunci prezenta berbecilor poate

i

1

i

avea efecte stimulative doar pentru o parte din oi. in tirnp ce altele i~i

I

'

prelungesc anestrul.

a produse hormonale ca:

S~ncronizareacaldurilor poate fi obtinuta $i prin utilizarea unor

a

-

cloprostenol, care este un analog al prostaglandinei PGF2,;

-

PGF2, - in doza de 100-150pg. de 2 orihi, la intervale de 13-15

zile;

-

progesteron -

administrat intramuscular sau sub forrna de

pesarii (bureti vaginali) rnentinute 11-12 zile, urrnat de

inocularea a 400-750 U.I. de PMSG.

1

'1

Metoda hormonala de sincronizare a estrului la cele doua categbrii fernele, degi este rnai costisitoare, este mai raspindita in practici pi

rezultatele obtinute sunt rnai sigure, rnai bune.

14.5.2.5.Recoltarea embrionilor.

Tehnica pi mornentul recoltarii ernbrionilor variaza in functie de

specie, cunoscindu-se metode nechirurgicale $i rnetode chirurgicale.

Metoda nechirurgicali de recoltare a embrionilor se aplice la

taurine gi ovine gi necesita un instrurnentar adecvat cu ajutorul ciruia se

realizeaz3 spalarea oviductelor $i a coarnelor uterine. Acest procedeu

de recuperare a ernbrionilor din aparatul genital a1 femelei donatoare se

aplica la citeva zile dupa rnornentul fecundatiei, cand embrionii se

gisesc la nivelul segrnentelor respective.

La vaca, aceasts metods se asearnana cu insamantarea spermei

prin rnetoda bimanuali, in timp ce la oaie este necesara endoscopia

precedata de anestezie $i laparascopie; aceasta metode de recoltare a

ernbrionilor nu se aplica la scroafa d&torita lungirnii mari a coarnelor

uterine.

Recoltarea ernbrionilor prin rnetode chirurgicale se poate face de la

animale sacrificate sau de la animale vii. Astfel, in cazul sacrificarii

animalelor, se pot recolta at%t ovule pentru fecundare "in vitro", cat $i

ernbrioni din oviducte sau din coarnele uterine. Aceasti rnetoda nu este

raspandita datorita lmposibilitgtii reutilizgrii donatoarelor.

Recoltarea de la animate vii elirnina acest neajuns, creind

posibilitatea reutilizarii donatoarelor de rnai multe ori. Se face la 4-5 zile

de la fecundare $i cuprinde urrnatoarele rnomente operatorii: contentia

fernelei in decubit lateral sau dorsal (in functie de specie); laparatomia

pe linia alb5, aproape de sirnfiza ischic-pubiena; exteriorizarea aparatului

genital; realizarea punctiei cornului uterin cu un ac bont, care face parte

dintr-un crrcuit: oviduct-corn uter~n-canula-cateter-placa de recoltare-

.

&.,

pghar colector cu peretii dubli; spillarea cornului uterin; examinarea

embrionilor cu stereolupa; cultivarea sau transferul imediat al

embrionilor; aplicarea unor tratamente postoperatorii pentru prevenirea

infectiilor gi aderenfelor.

14.5.2.6.Examinarea embrionilor.

Dupa recoltare pi p5ni c%ndace~tiasunt transferati la receptoare

sau conservati, embrionii sunt examina\i pentru a se aprecia viabil~tatea

lor in momentul recoltarii gi gansele ulterioare de a fi transferati.

Examenul embrionilbr & realizeazi in dou3 etape:

- identificarea gi clasificarea embrionilor;

- aprecierea viabilitgtii embrionilor:

Prima etapa const3 in identificarea gi recuperarea embrionilor din

lichidul de spalare, unul cate unul, cu ajutorul unei lupe binoculare qi a

unei micropipete gi introducerea lor intr-o placa cu mediul de cultura; cel

ma; des utilizat mediu de cultura este PBS (Phosphate Buffered Saline).

Urmeaza clasificarea lor astfel:

- ovocite nefecundate - au membrana pelucida neregulata,

lipsegte conturul celular, apar vacuole gi dispersia rnaterialului

celular;

- embrioni degenerati - caracterizati prin degenerescenla

{

i

1

5

:

i

t

i

;

i

I

/

I

1

1

I

i

i

i

I

blastomerelor, aparitia in interiorul membranei pelucide a unei

mase netransparente, nestructurate;

- embrioni normali dezvolta!~ - au blastomerele integre 51 in

numar variabil, in funcfie de momentul recoltarii;

- embrioni retardati - au blastomerele integre, dar ca dezvoltare

nu corespund momentului recoltirii.

Cea de-a doua etap5 gi anume aprecierea viabilitajii embrion~lor

are o mare important3 pentru

evitarea factorilor de risc in aparitia gi

nsferuldi, nidatiei $i gestatiei.

,:

Metode utilizate pentru aprecierea viabilitgtii embrionilor sunt:

-

aprecierea morfologic~;

-

metode biochimice;

-

metode histologice;

-

cultura "in vitro".

in aprecierea morfologica a embrionilor se are in vedere o serie de

regularitatea

embrionului, grosimea, fisurile membranei pelucide, transparenta

ernbrionului, structura lui, conturul celular, variabilitatea taliei celuielor,

integritatea celulelor. Pe baza acestor criterii se stabilegte calitatea

embrionilor: excelenti, bung, mijlocie, slaba.

Dintre metodele biochimice utilizate amintim: folosirea diacetatului

criterii,

cum

ar

fi:

sfericitatea

embrionilor,

forma

gi

de fluoroscein5 (devin fluorescente numai celulele vii), determinarea

consumului de glucozA, determinarea lactatdehidrogenazei, care este

invers propoqional5 cu calitatea embrionilor.

Prin metode histologice se apreciazs ca fiind nesatisfiicatori

embrionii care au celule cu nucleu picnotic.

Pentru cultura "in vitro" a embrionilor, se folose9te mediul PBS, cu

adaos de ser de capri (25%) sau de ser fetal (20%) sau de ser de bou

(20°/0) sau de ser urnan inactivat (20%); acest mediu complex se aduce

la temperatura de 37 OC gi trebuie si contin3 5% oxigen, 5% dioxid de

carbon, 90*/0 azot.

14.5.2.7. Conserwarea embrionilor

Pentru mentinerea qi prelungirea vrabilititii embrionilor pan8 in rnomentul transferulu~,se folosesc diferite metode de conservare de

scurti durata gi respectiv de lung4 durats.

Consewarea de hcurta durat. arigurd mentinerea embr~onilorin vitro", o perioada variabilG de timp: 9-48 ore, in cazul conservar~ila temperatura camerei; cind temperatura este de 37 OC embrion~iig~

continua dezvoltarea putind ajunge pan8 in stad~ulde blastoc~st;la

( temperatura de 0-10 OC dezvoltarea embr~on~loreste oprita gi se rela la

37 OC. se folosesc diferite medii de culturfi, dar rata gestatiilor este mai 1 mica decat Tn cazul in care embrionii ar fi transferati imediat dupe

recoltare. Conservarea de lunaii durata presupune congelarea embrionilor.

Embrionul, spre deosebire de spermatozoid este un ansamblu de celule

bogate in apa gi evolueaza in timp. De aceea, congelarea embrionilor

a este un proces mai complex, care impune mdsuri severe pentru evitarea

I

mortalitatilor.

Tn procesul de crioconservare sunt implicati doi factori:

- evitarea formarii ghetii intracelulare, care prin forrnarea de

cristale mari poate sfi duce la distrugerea membranei

citoplasmatice; - evitatarea deshidratarii brutale.

Pentru evitarea acestor factori daunatori se iau urmatoarele

I r

I masuri:

- asigurarea unei viteze optime de racire. Pentru aceasta, embrionul aspirat intr-o paieta de plastic se introduce intr-un congelator prograrnabil, echilibrat la -7 OC. Apoi temperatura

I scade progresiv cu 0,3 "C, p2na ajunge la -30 OC, dupa care

I paieta cu embrion se introduce in azot lichid la -196 OC.

I

- utilizarea crioprotectorilor pentru reducerea 9ocurilor osmotice:

I dimetil sulfoxid (DMSO), glicerol 10% sau propandiol. Eficienta congelgrii in paiete se apreciaze prin compararea ratei de uupravietuire obtinuta dupa stocare cu cea a ratei utilizsrii embrionilor

I

I

I

necongelati.

incepdnd cu lucr~rilelui Foley 9i col. (1984), vitrificareq suscits un

I mare interes Tn criobiologie, constituind o nouA cale de crioconservare a

embrionilor, prin care este depA9it obstacolul de formare a cristalelor mari de gheata, intracelular. Cu ajutorul vitrificarii, trecerea de la stadiul lichid la cel solid se

realizeaza progresiv, astfel incat, la o temperatura suficient de joasa, lichidul devine atit de vascos incit are rigiditatea unui solid. in cazul metodelor clasice de congelare, concentratiile de crioprotector sunt prea mici pentru a obtine un stadiu viscos gi la

exteriorul celulelor embrionare. De aici, necesitatea cregterii acestor

concentratii, indiferent de viteza de congelare. lnconvenientul major al concentratiilor mari de crioprotectori este toxicitatea acestora pentru embrioni. De aceea, s-a incercat reducerea acestui efect toxic prin scaderea temperaturii gi a duratei de expunere a celulelor inainte de congelare gi utilizarea unor amestecuri de

crioprotectori (glicerol+propandiol). Embrionii aflati in diferite stadii de dezvoltare (morule compacta,

blastocist tsnar, blastocist) sunt aspira!i intr-o paietfi cu mediu de

vitrificare gi depugi intr-o picatura din ace1 rnediu, situat la mijlocul

4 paietei. Picatura cu embrion este separata prin doua bule de aer de o solutie de sucroza. Paieta se inchide apoi la cele doua capete $1 este plonjatg progresiv in azot lichid, incep2rrd cu extremitatea dinspre capul uzinal.

Dupa o duratfi variab~ltide stocaj, paietele sunt scoase d~nazotul

lichid pi imersate intr-o baie de ap5 la temperatura de 20 OC, pin8

i d~sparegheata din solutia de sucroza Continutul f~ecereipaiete ~te

I trecut apoi fntr-o place gi Issat la temperatura camerei tirnp de 5-10

i minute; apoi embrioni~sunt trecuti de 1-3 ori prin solutie de PBS, inainte
I e a fi pugi in culture sau transferati la receptoare.

i

f

Y

11'1

74.5.2.8.~~~~l D~~~~~-ZIS.II/efbbn'nndl~r

la rece~toare,

lntroducerea embrionilor proaspat recoltati sau a celor congelati in

aparatul genital al receptoarelor se poate realiza prin metode

nechirurglcale sau chirurgicale.

Metodele nechirurgicale se aplica la vaca, dupa aceiagi tehnica de

~nocularea spermei, prin metoda recto-vag~nalg.

Metodele chlrurg~calese aplicg la oaie 81 scroafa $1 constau in

efectuarea laparatomiei pe linia alba, ev~dentiereacornului uterln in care

se va introduce embrionul cu ajutorul unui p~petede plastic sau a unel

ser~ngispeciale. Locul de depunere a embrionului trebuie si corespunds

cu dezvoltarea lui gi poate fi treimea posterioara a oviductului sau viirful

cornului uterin

La oale, transferul embr~onilorse face gi prln metoda endoscoplca,

procedindu-se astfel: receptoarea se contenfioneazii in decub~tdorsal, I

se face toaleta mecanici local3 ~i anestezia localti. Apoi se

punctioneaza abdomenul gi se insufla aer in cavitatea abdorninala. Se

v1zualizeaz3 cornul uter~ncorespondent ovarulur cu corp galben $1 se

fixeazii

cu

o

pensi.

Se punctioneaza cornul uter~ngi se depune

embrionul la locul corespunzator virstei lur.

14.5.3.Pers~ectiveletransferului de embrioni.

Transferul de embrioni va capata o extindere mai mare, deoarece

cu ajutorul lui pot fi studiate procese biologice, cum ar fi: limitele de

hranire ~i adgpostire a produgifor de conceptie in uter, relatiile dintre

embrion-uter-ovar, influenla unor factori genetici gi nutritionali asupra

produsului de conceptie, crearea de linii consangvine, de rase noi.

Biotehnologiile finalizate prin transfer de embrioni cuprind

integrarea 9tiintelor

totalitatea

metodelor

qi tehnicilor

rezultate din

biologice, biochimiei, biofizicii, informaticii, in scopul manipularii genetice

a unui embrion, celule embrionare, nucleu, gene, etc. in cadrul acestora

disting o serie de tehnici ca: fecundatia 'in vitro", diagnosticul timpuriu

i

1

1

?

j

'i

1

E

r

1

!

.

sexului, rnanipularee&$tic&.

Fecundatia "in vitro" cuprinde o serie de etape: obtinerea

ovocitelor, maturarea ovocitelor "in vitro", capacitarea spermatozoizilor,

fecundarea, cultura embrionilor "in vitro", transferul embrionilor.

Sexarea ernbrionilor se poate realiza prin.

-

procedeul citogenetic - presupune analiza cariotipului celulelor

trofoblastice, in metafaza, recoltate prin microchirurgie; este

traumatizant pentru embrion;

-

procedeul imunolog~c- se bazeaza pe prezenta la suprafata

celulelor mascule a unui antigen de histocompatibilitate, numit

AgH-Y; acesta poate fi evidentiat prin imunofluorescent~sau cu

ajutorul anticorpilor monoclonali anti H-Y;

-

procedeul enzimologic - care se bazeaza pe faptul ci unele

enzime celulare sunt codificate de

X; cantitatea acestor enzime este de

femele decst la cele mascule,

cgtre gene din cromozomul

2 ori mai mare la celulele

- determinarea unei secvente de AND speclfics cromozomului Y

ajuta la identificarea embrionilor masculi, cu o precizie de 95%

Biotehnica transferului de embrioni a creat posibilitatea obtinerii

ovulelor gi a embrionilor in stadiile de dezvoltare dorite, pe care apoi se

pot efectua diferite manipulari genetice. Cu ajutorul unui microscop

micromanipulator gi a unor microinstrumente specifice se pot efectua

diferite manopere microchirurgicale, cum ar fi:

- extractiile de celule embrionare, pronuclei. fragmente de nuclei;

- sectionarea embrionului gi repunerea jumZitelllor rezultate in alte

membrane pelucide; obtinerea de himere, de clone;

- transferul de gene, grupuri de gene, nuclei d~ploizi.

i

b

b

d

a