UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICA

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA.

Practica: AISLAMIENTO DE BACTERIOFAGOS

Curso: Virología

Profesora: Ramsés Salas

Alumnos:

 Arango Ochante Sara

 Ochoa Porras Mayra
 Ríos Gutiérrez Lidabel
 Vásquez Gálvez Lita

2014
 AISLAMIENTO DE BACTERIOFAGOS

1. INTRODUCCIÓN

Los bacteriófagos son virus que fueron descubiertos de forma independiente

por los microbiólogos Frederick W. Twort en 1915 y Félix d’Hérelle en 1917.
Siendo esta la última clase principal de virus en ser descubierta; este tipo de
virus constituye un sistema simple y de gran abundancia en la naturaleza. En
esencia, los bacteriófagos se encuentran de manera ubicua en el ambiente y
en el lugar en que se encuentre su célula huésped. Los bacteriófagos son virus
que infectan y se multiplican en la bacteria, llevando a la destrucción la célula
hospedera con la liberación de bacteriófagos que re-infectan otras bacterias.

Los bacteriófagos fueron descubiertos en las primeras décadas del siglo XX,
pero su uso clínico no se extendió en países occidentales sino hasta la década
del 80, debido a diferentes razones. En 1980, de nuevo se empezaron a usar
los bacteriófagos en animales de experimentación en los países occidentales.
En este sentido, los trabajos de Smith y Huggins en la década del 80 se
pueden considerar como un punto de inflexión, al retomar de nuevo la
importancia de los bacteriófagos en la terapia animal, ya que de estos se
habían obtenido resultados muy esperanzadores. Los bacteriófagos se
componen de un solo tipo de ácido nucleico (ARN o ADN) encapsulado por una
cubierta proteica que exhibe los elementos estructurales necesarios para una
infección específica (1). Algunos presentan una envoltura
lipídica que se deriva de la célula hospedera.

La conformación y organización proteica de sus cápsides les confiere la

habilidad de permanecer viables por largos períodos de tiempo en el ambiente
en condiciones adversas, como la exposición a ADN-asas, variaciones de pH y
temperatura . Los bacteriófagos han sido tomados como modelo para el estudio
de la genética bacteriana y los mecanismos de control de la expresión génica,
debido a que los hospederos bacterianos son fácilmente cultivables y
manejables en el laboratorio (3). Se consideró importante el uso de aguas
residuales para este estudio debido a su composición o naturaleza. Las aguas
servidas consisten de dos componentes: un efluente líquido y un constituyente
sólido en el que se asocian diferentes tipos de materiales particulados como
sedimentos de residuos biológicos, lodo y otras sustancias. A este tipo de
material se asocian microorganismos como bacterias, hongos y virus, los
cuales tienen como sustrato los contenidos de este tipo de aguas (2).

Debido a que, por el grado de contaminación que presentan, en las aguas

residuales se encuentra gran cantidad de bacterias de diferentes especies y se
espera encontrar también los bacteriófagos que infectan estas mismas
bacterias, ya que estos últimos constituyen un control biológico para las
colonias bacterianas.
 2. MARCO TEORICO

Los virus son moléculas de DNA o RNA rodeadas por una envoltura proteica
que necesitan células viables para poder replicarse. Los virus utilizan la
maquinaria metabólica de las células para sintetizar su material genético y
proteínas de la envoltura. Existen distintos tipos de virus que pueden infectar
células procariontes o células eucariontes. Los bacteriófagos o fagos son virus
que se reproducen en células procariontes.

Composición.
Aunque diferentes bacteriófagos pueden contener diferentes materiales todos
ellos contienen ácido nucleico y proteína. Dependiendo del fago, el ácido
nucléico puede ser DNA o RNA pero no ambos y puede existir en varias
formas. Los ácidos nucléicos de los fagos a menudo contienen bases raras o
modificadas. Estas bases modificadas protegen a los ácidos nucleicos del fago
de las endonucleasas que cortan los ácidos nucléicos del huésped durante la
infección. El tamaño de los ácidos nucleicos varía dependiendo del fago. Los
fagos más simples solo tienen suficiente ácido nucleico para codificar un
promedio de 3-5 productos génicos, mientras que los fagos más complejos,
pueden codificar para más de 100 productos génicos.

El número de proteínas de diferentes clases y la cantidad de cada una de ellas

en la partícula del fago variará dependiendo de la clase de fago que se trate. El
fago más simple posee varias copias de solo una o dos diferentes proteínas,
mientras que los más complejos podrían poseer muchos tipos de proteínas
diferentes. La función de las proteínas durante la infección es proteger al ácido
nucleico de las nucleasas de su medio ambiente.

Estructura.– Los bacteriófagos vienen en muchas diferentes formas y

tamaños.

1. Tamaño.- T4 está entre los fagos más grandes, tiene aproximadamente 200
nm de largo y 80-100 nm de ancho. Otros fagos son más pequeños. La
mayoría de los fagos están entre un rango de 24-200 nm de longitud.

2. Cabeza o Cápside.– Los fagos clásicos poseen una estructura a manera de

cabeza y pueden variar de tamaño y forma. Algunos son icosaédricos (20
caras) otros son filamentosos. La cabeza o cápside está compuesta de muchas
copias de una o más proteínas diferentes. Al interior de la cabeza se encuentra
el ácido nucleico. La cabeza actúa como una cubierta protectora para el ácido
nucleico.

3. Cola.– Muchos, aunque no todos los fagos muestran una cola unida a la
cabeza del fago. La cola es un tubo hueco a través del cual el ácido nucleico
pasa durante la infección. El tamaño de la cola puede variar y algunos fagos ni
siquiera la tienen. En los fagos más complejos como T4, la cola se rodea de
una cortina contráctil durante la infección de la bacteria. Al extremo de la cola
los fagos más complejos como T4 presentan una placa en la base y una o más
fibras unidas a ella. Esta placa de base y las fibras de la cola están
involucradas en la unión de los fagos a la célula bacteriana. No todos los fagos
tienen placas de base ni fibras de la cola, En tales casos existen otras
estructuras que se ven asociadas en la unión de partícula del fago a la
bacteria.

Estructura del bacteriófago T4

Tipos de Ciclos

Actualmente, sabemos que existen dos tipos de bacteriófagos según su ciclo

de multiplicacion: virulentos o líticos y avirulentos, atenuados o lisogénicos.
Los bacteriófagos que han insertado su material genetico en una célula
bacteriana tiene una de dos opciones: seguir con el ciclo litico que culmina con
la lisis y muerte de la célula huésped, o el ciclo lisogénico en donde el huésped
permanece vivo.

a) Ciclo Lisogénico

El material genético del fago se une con el de la célula huésped para comenzar
el ciclo lisogénico. En este caso, ambos ADN se replican juntos sin
consecuencias obvias. El ADN del fago que se integró dentro del cromosoma
bacteriano se denomina profago y las bacterias que contienen profagos se
llaman bacterias lisogénicas. Sus fagos correspondientes se llaman fagos
lisogénicos.
 b) Ciclo Lítico

Es la alternativa más común en donde los fagos no se reproducen por división

celular como las bacterias, sino mediante la formación intracelular y ensamble
de los distintos componentes. El ADN del fago que ha ingresado en las
bacterias sirve de molde para la síntesis de ADN de un fago nuevo, el cual es
transcrito a un ARNm que codifica las proteínas de la cubierta. Estas son
ensambladas en nuevas partículas de fagos. Las enzímas celulares llevan a
cabo la traducción. Finalmente las partículas virales producen la lísis de la
bacteria. El ciclo de multiplicación de estos fagos, al igual que todos los virus,
tienen cinco etapas diferenciadas: fijación, penetración, biosíntesis, maduración
y liberación.

 Fijación.- El fago de fija a la celula huesped después de una colisión aleatoria

entre particulas de bacterifagos y bacterias.
 Penetración.- Después de la fijación el bacteriofago inyecta su ADN en el
interior de la bacteria, para ello la cola del bacteriofago libera una enzima la
lisozima del fago.
 Biosíntesis.- El ADN del fago direge la síntesis de los componentes virales por
la celula huésped.
 Maduración.- Los componentes virales se ensamblan en viriones.
 Liberación.- La celula huésped se lisa y se liberan los nuevos viriones.
INFECCIÓN DE LAS CÉLULAS HUÉSPED

Se multiplican intracelularmente como todos los virus, pero no en células

animales sino exclusivamente en bacterias. Los pasos para la infección son:

A. Adsorción.– El primer paso en el proceso de infección es la adsorción del

fago a la célula bacteriana- Este paso es reversible está mediado por las fibras
de la cola o por alguna estructura análoga en aquellos fagos que carecen de
las mismas. Las fibras de la cola se unen a receptores específicos en la célula
bacteriana y la especificiad del huésped del fago se determina usualmente por
el tipo de fibras de la cola que un fago posee. La naturaleza del receptor
bacteriano varía en las diferentes bacterias. Los ejemplos incluyen proteínas
sobre la superficie externa de la bacteria, LPS, pili y lipoproteínas. Estos
receptores están en la bacteria para otros propósitos y los fagos han
evolucionado de manera que son capaces de usar estos receptores para llevar
a cabo la infección.
B. Unión irreversible.– La unión del fago con la bacteria vía las fibras de la
cola es de naturaleza débil y es reversible. La unión irreversible del fago con la
bacteria está mediada por uno o más componentes de la placa de la base. Los
fagos que carecen placas de la base tienen otras formas de unirse
estrechamente a la célula bacteriana.

C. Contracción de la cortina.– La unión irreversible del fago a la bacteria da

como resultado la contracción de la cortina (para aquellos fagos que la
presentan) y la fibra hueca que es la cola se ve empujada a través de la
envoltura bacteriana. Los fagos que no tienen cortinas contráctiles usan otros
mecanismos para introducir la partícula del fago al interior de la envoltura de
bacteriana. Algunos fagos tienen enzimas digestivas que degradan varios
componentes de la envoltura bacteriana.

D. Inyección del Ácido Nucleico.- Cuando el fago ha logrado atravesar la

envoltura bacteriana el ácido nucleico que se encuentra en la cabeza pasa a
través de la cola hueca y penetra la célula bacteriana. Usualmente el único
componente del fago que realmente penetra la célula es el ácido nucleico. Los
remanentes del fado permanecen en el exterior de la bacteria. Hay algunas
excepciones para esta regla. Esto es diferente de los virus animales, en los
cuales la mayoría de las partículas virales normalmente se introducen en la
célula. Esta diferencia se debe probablemente a la incapacidad de la bacteria
para envolver a la bacteria a fin de endocitar materiales

3. OBJETIVOS

 Obtención de bacteriófagos a partir de aguas residuales.

 Visualizar las Placas de lisis.
4. MATERIALES Y METODOS

Material biológico:

 Cepas de Escherichia coli ATCC: 25922, Escherichia coli ATCC:

13216 Staphylococcus aureus, Pseudomona sp ATCC: 9027.
Psudomona sp. (con fago temperado), Salmonella sp.
 Agua residual

Material de laboratorio:

 10 tubos de ensayo
 Pipetas
 Filtro de 0.22 o 0.45 um.
 Agar tripticasa soya (TSA)
 Caldo tripticasa soya (TSB)
 Placas Petri
 Papel craf
 Algodón

Metodología

 Técnica de agar doble capa.

 Técnica de placa vertida.
 Técnica de sembrado por incorporación.
 Método A en caldo TSB

Muestra filtrada

Para E. coli. Para Pseudomonas sp.

B (Control) D (Control)
A C

 Después de 18 horas.

1ml de 1ml de
1ml de
cultivo cultivo
filtrado

5ml de
TSB
Tubos de
16x150mm

5ml de
TSB C D

Incubación a 37°C

 Primera lectura a las 24 horas.

 Posteriores lecturas a la semana.

 No hay turbidez Control:

 Puede haber  Presencia de
sedimentación. turbidez.
 Posible presencia de fago.  Sedimentación.

C D
 MÉTODO B: EN PLACA VERTIDA

Cepas trabajadas: Escherichia coli ATCC 13216, Pseudomonas sp.

1mL
muestra

1mL
cultivo

5 ml de TSA c/tubo
1. Preparación de
2 placas de TSA
2. Adición de 5ml de TSA + 1ml de la muestra
filtrada + 1 mL de cultivo bacteriano en TSB,
Escherichia coli ATCC 25922 para el tubo 1 y
Pseudomonas sp para el tubo 2.

4. Incubación por 48 h y
3. Inmediato se siembra lectura de las placas de
por incorporación lisis luego de 7 días
5. Resultados

De las 6 cepas analizas solo 2 resultaron positivas Pseudomona sp. (con

fago temperado) (Figura 1) y Escherichia coli ATCC: 13216. Se visualizo
que en los tubos que contenían el pul de aguas residuales no presento
turbidez a comparación del tubo control que contenía solo cepa y caldo
TSB.

A B

Figura 2.- Pequeña placa

de lisis de Pseudomonas
Figura 1.- Tubo positivo a
sp. Visualizada en agar
fago en Pseudomonas sp
TSA.
(A) y tubo control (B).

D
C

Figura 3.- Tubo positivo a Figura 4.- Pequeña placa

fago en Escherichia coli de lisis en Escherichia coli
(D) y tubo control (C). visualizada en agar TSA.
6. DISCUSIONES Y CONCLUSIONES

En la publicación “Técnica para aislamiento de bacteriófagos

específicos para E.coli DH5α a partir de aguas residuales” (Gaviria G.
et al. 2012) y en la tesis doctoral “Aislamiento y caracterización
molecular de bacteriófagos de bacterias enteropatógenas para
biocontrol de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA)” (Dini C.
et a. 2011) en la metodología de aislamiento del fago emplearon una
técnica de enriquecimiento previo al sembrado de placa vertida a
diferencia de ellos en nuestro trabajo no se realizo un enriquecimiento
del fago por lo que probablemente se observo una sola placa de lisis.

Según Gaviria G. en el aislamiento de bacteriófagos la temperatura,

afecta de manera directa la fase de infección viral, y por ende la
titulación de los bacteriófagos lo cual se constato en la presente
investigación.

En la metodología utilizada por Gaviria G. se empleo un fago control

(T4) para la comparación con los fagos encontrados en las aguas
residuales, en la metodología empleada para nuestro trabajo como
control solo se utilizo a la cepa sembrada en caldo (TSB) y en el
sembrado por incorporación de placa vertida no se utilizo control.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Dini C. Aislamiento y caracterización molecular de bacteriófagos de
bacterias enteropatógenas para biocontrol de enfermedades
transmitidas por alimentos (ETA) [Tesis para optar el grado de
Doctor]. Buenos Aires: Universidad Nacional de la Plata; 2011.
Lindqvist H. Bacteriophage and gene transfer. APMIS 1998; (Suppl
84):15-8.
Reynolds, K. Tratamiento de aguas residuales en Latinoamérica. Agua
Latinoamerica 2002; 12:1-4.
Hernández A. Aislamiento, caracterización y detección precoz de
bacteriófagos de Streptococcus thermophilus en la industria Láctea.
[Tesis doctorado en ciencias]. Oviedo: Universidad de Oviedo; 2007.
Gaviria G. Técnica para aislamiento de bacteriófagos específicos para
E.coli DH5α a partir de aguas residuales. MVZ Cordoba. 2012: 17(1).
2852-2860.