Sunteți pe pagina 1din 30

CUPRINS

CAPITOLUL I – CELULA-UNITATEA DE BAZA A VIETII SI


EREDITATII
1.1 Introducere
1.2 Proprietati fizice si chimice ale celulei
1.3 Functiile celulei
1.4 Componentii citoplasmici cu rol genetic
1.5 Nucleul
1.6 Cromozomii
1.7 Reproducerea celulei
1.8 Sporogeneza si gametogeneza la plante

CAPITOLUL II - REGENERAREA,SELECTIA SI TESTAREA


PLANTELOR MODIFICATE GENETIC

2.1 Regenerarea,selectia si testare plantelor modificate genetic


2.2 Genele-marker si raportoare utilizate in selectia PMG
2.3 Biotestul fenotipic al PMG
CAPITOLUL 1

Celula-unitatea de baza a vietii si ereditatii


1.1 INTRODUCERE
Cu 300 de ani în urmă, englezul Robert Hooke(1665) a privit la un
microscop rudimentar o secţiune printr-o bucată de plută şi a observat nişte
cămăruţe separate prin pereţi rigizi. Acestea au primit numele de celule (lat.
Cella - cameră)
Mult mai târziu,o dată cu perfecţionarea microscopului optic a devenit
posibil studiul componentelor celulare: membrana, citoplasmă, nucleul,
cloroplastele, vacuolele .
Structura celulei cu o parte restrânsă a componentelor ei a fost descrisă
mai întâi, la plante (M. Schleiden – 1838).
Descoperirea microscopului electronic a extins câmpul cercetărilor asupra
componentelor celulare până la dimensiunea macromoleculetor (de ordinul
nanometrilor - 1 nm = 10 ' m). La nivelul structurilor electronice se verifică
ideea unităţii materiei vii, întrucât dispar, în marea lor majoritate, deosebirile
dintre celulele diferitelor organisme.
În concepţia actuală, celula este unitatea biologică structurală şi funcţională a
materiei vii. Ea intră în componenţa tuturor organismelor, fiind cea mai mică
unitate vie capabilă să se multiplice.
Celula apare ca un ansamblu de părţi diferite care se găsesc într-o strânsă
corelaţie şi interacţiune, formând un lot unitar. Ea este un sistem deschis, aflat
într-un permanent schimb de materie şi energie cu mediul.
Celulele, fie că au o existenţă individuală, fie că fac parte din organizarea
unui individ pluricelular, au, în general, toate caracteristicile vieţii. Ele
manifestă funcţii neîntâlnite în sistemele nevii ale materiei şi anume:
• pot conserva mediul intern pe baza acumulării şi transformării materiei şi a
energiei;
• sintetizează compuşi proprii după reguli precise (un anumit cod);
• au capacitate de refacere şi autoreproducerE;
• manifestand reacţii adaptative faţă de condiţiile variabile ale mediului.
Forma celulelor, forma celulelor diferă în funcţie de rolul pe care îl
îndeplinesc. Ea este mai puţin variată la plante decât la animale. Celulele pot
fi: sferice, ovale, cubice, cilindrice, prismatice, poliedrice, stelate, fusiforme
etc.
Tipuri de celule. Celulele se împart, după absenţa sau prezenţa unui
nucleu individualizat, în procariote şi eucariote.
• celulele procariote nu au un nucleu individualizat, delimitat de citoplasmă
printr-o membrană, ci numai o masă nucleară care se numeşte nucleotid. Ele
reprezintă unitatea de structură şi funcţie a organismelor procariote dintre care
fac parte bacteriile.
• celulele eucariote au nucleul bine individualizat, delimitat de o membrană şi
constituie temelia tuturor organismelor eucariote.
Celulele vegetale sunt celule eucariote tipice. Structura lor este similară,
însă prezintă anumite particularităţi.
Ereditatea este proprietatea esentiala a vietii si trebuie sa fie determinata,
ca si celelate proprietati ale materiei vii, de un substrat material, cu o anumita
localizare, structura si functie.
Pentru cunoasterea ereditatii, cercetarea celulei si a mecanismelor diviziunii
celulare prezinta o deosebita importanta. Intr-adevar, cunostintele acumulate au
permis identificarea materialului genetic, descoperirea mecanismului de transmitere a
genelor de la o celula la alta, de la un organism la altul si a modului cum se
realizeaza recombinarea genetica. Toate aceste fenomene sunt determinate de un
complex de structuri si functii celulare.
O mare importanta petru dezvoltarea geneticii a avut descoperirea mitozei sau
diviziunii nucleare indirecte (cariokineza) la plante de catre W. Fleming (1882). La
interval scurt este descoperita meioza si fecundarea la plante de catre L. Guignard
(1899). Descoperirea diviziunii nucleului a permis studiul cromozomilor, denumiti
astfel de W. Waldeyer (1888) carora, datorita proprietatilor pe care le au, li s-a atribuit
un rol esential in ereditate. Legarea fenomenelor ereditare de nucleu, respectiv de
materialul cromozomal, a deschis drumul cercetatorilor privind substratul material al
ereditatii.
In ultimele decenii, mijloacele moderne de cercetare au contribuit la mari
descoperiri in domeniul citologiei. Pentru studiul celulei se foloseste astazi
microscopul cu contrast de faza, fluorescent, electronic etc. Se obtin imagini marite
pana la cateva sute de mii de ori.
In continuare vor fi prezentate componentele de baza ale celulei, rolul lor
genetic fara cunoasterea carora nu se pot intelege si explica multiplele functii ale
celulei in ereditate.

1.2 Proprietăţi fizice şi chimice ale celulei


Întreaga substanţă vie din celulă constituie protoplasma. Ea se deosebeşte
de materia nevie printr-o serie de proprietăţi fizice şi chimice:

 Proprietăţi fizice. Protoplasma este un lichid vâscos, incolor şi trans-


parent. Gradul de vâscozitatc creşte o dată cu îmbătrânirea celulei,
mediul de dispersie este apa, iar faza dispersată o constituie particulele
coloidale foarte mici de substanţe organice numite micele. Ele se află într-o
continuă mişcare. Micelele se pot aglomera în complexe care cresc gradul de
vâscozitate. Coloizii pot trece uşor de la starea de sol (fluid) la starea de gel
(aspect de gelatină). Trecerile sunt reversibile şi influenţate de diferiţi factori:
temperatură, unele substanţe, etc. Între starea protoplasmci şi funcţiile ei
există o strânsă legătură (de exemplu, curenţii citoplasmatici sunt legaţi de
starea de sol, iar diviziunea celulară de starea de gel).
 Compoziţia chimică. În celulă se găsesc peste 60 de elemente
chimice si sunt elementele de bază.
Componentele chimice ale celulelor vii sunt: apa, sărurile minerale şi
substanţele organice. Ele se găsesc în proporţii diferite în funcţie de tipul
celulei, vârstă, rol etc.
1. Apa- ocupă la majoritatea celulelor înjur de 60% din masa celulara. Ea
este principalul solvent şi mediul de dispersie al diferitelor substanţe. Apa ia
parte la transportul substanţelor în celulă şi la numeroase reacţii chimice.
Conţinutul în apă al diferitelor celule variază foarte mult.
2. Substanţele minerale sunt prezente în soluţie sub formă de ioni sau
intră în diverse combinaţii cum sunt: clorurile, carbonaţii. Fosfaţii (de Ca, Na, Mg
etc.). Ele impregnează unele membrane, polarizează membranele celulare,
schimbă starea fizică a protoplasmei etc.
3. Substanţele organice sunt: glucidele, lipidele, proteinele şi acizii
nucleici.
• glucidele au rol nutritiv şi energetic (glucoza). Se găsesc în cantităţi mai
mari în celulele plantelor. Dintre glucidele complexe, amintim:
- amidonul - cea mai importantă substanţă de rezervă din celulele vegetale;
- celuloza - substanţa din structura peretelui celular la plante.
• lipidele sunt o sursă importantă de energie. Ele se găsesc sub formă de
emulsii, iar uneori sunt depozitate în cantităţi mari în diferite celule (celulele
adipoase, celulele din unele seminţe de: rapiţă, floarea-soarelui ).
• proteinele sunt substanţe cu molecule mari (macromolecule), care se
coagulează la temperaturi ridicate (+50°C).Ele se găsesc în celulă într-o
proporţie mai marc decât celelalte substanţe organice şi sunt cele mai
importante.
Micelele proteice se dispun sub forma unor filamente care formează în
citoplasmă, o reţea tridimensională. În ochiurile căreia sunt reţinute moleculele
de apă, diverşi ioni, diferite molecule organice si realizează o suprafaţă
enormă în care diferitele substanţe se întâlnesc şi pot intra în reacţie. Deci,
proteinele constituie elementul de construcţie al materiei vii. Ele participă şi la
alcătuirea membranelor celulare împreună cu lipidele; de asemenea, au rol
energetic, reglează diferite activităţi, transportă unele substanţe etc.
Enzimele sunt substanţe proteice care determină sensul, viteza şi
succesiunea proceselor metabolice din celule. Fiecare enzima acţionează
numai asupra unei anumite substanţe numită substrat. Enzima şi substratul
trebuie să se potrivească precum cheia în broască .
Acizii nucleici sunt macromolecule complexe prezente, mai ales, în nucleu.
Ei au rol în sinteza moleculelor proteice şi în transmiterea caracterelor
ereditare. Se cunosc doi acizi nucleici: acidul dezoxiribonucleic (ADN) şi
acidul ribonuclic(ARN). La microscopul electronic au putut fi identificaţi toţi
constituenţii celulari, flecare având o structură specifică.
Membrana plasmatică se găseşte ia exteriorul citoplasmei . Ea delimitează
celula, are rol de protecţie şi mediază schimburile de substanţe între celulă şi
mediu, având permeabilitate selectivă.
Citoplasma este substanţa fundamentală a celulei care ocupă spaţiul dintre
membrana plasmatică şi membrana nucleului.
Reticulul endoplasmatic (R.E.) este o reţea de canalicule ramificate, pe
alocuri dilatate , care face legătura dintre membrana plasmatica şi membrana
nucleului. El are aspect neted sau rugos (când se asociază cu ribozomii). În
interior, se află o substanţă în continuă mişcare, reticulul având rolul unui
aparat circulator intracelular, dar şi rol mecanic.
SReticulul endoplasmatic este implicai în sinteza lipidelor (R.E. neted) şi a
proteinelor (R.E. rugos). R.E. este mai bine dezvoltat în celulele cu activitate
metabolică intensă (exemplu, celula hepatică).
1.3 Funcţiile celulei

Totalitatea transformărilor care au loc in celulă, în urma schimbului de


materie si energie cu mediul, constituie metabolismul celular.
Raportul dintre cele două procese ale metabolismului, asimilaţia şi
dezasimilaţia, se schimbă permanent. În timpul creşterii celulei predomină
asimilaţia, iar când celula intră în declin predomină dezasimilaţia.
Excitabilitatea este răspunsul specific dat de celulă la acţiunea diferiţilor
factori din mediu. Factorii nocivi pot provoca leziuni ,chiar moartea celulelor.
Dintre aceştia mai importanţi sunt:
• temperaturile prea ridicate sau prea scăzute;
• unele radiaţii (ultraviolete, ionizante ele);
• lipsa apei şi a substanţelor nutritive;
unele substanţe toxice (metalele grele);
• agenţii patogeni (virusuri, microorganisme parazite etc).
Mişcarea presupune; deplasarea activa a unor constituienţi celulari
(mitocondrii, cloroplaste), precum şi curenţii citoplasmatici care antrenează
conţinutul celular . Există şi celule libere care se pot deplasa activ cu ajutorul
cililor, flagelilor.
Semipermeabilitatea sau permeabilitatea selectivă este însuşirea
membranei plasmatice de a fi permeabilă pentru apă şi anumite substanţe sub
formă de ioni sau molecule şi impermeabilă pentru substanţe care au
dimensiuni mari (macromolecule).
Trecerea diferitelor substanţe prin membrana plasmatică se face pasiv şi
activ.
Forţele pasive. Prin difuzie moleculele a două substanţe (gazoase sau
lichide) puse în contact se deplasează de la o concentraţie mai mare spre o
concentraţie mai mică. Ca urmare are loc o întrepătrundere a celor două
substanţe până la egalizarea concentraţiilor .
Dacă membrana este semipermeabilă, fenomenul de difuzie ia aspectul de
osmoză.
Prin osmoză, moleculele unei substanţe aflată în soluţie traversează o
membrană semipermeabilă şi se deplasează într-un singur sens, de la
concentraţie mare la concentraţie scăzută . Moleculele trec prin membrană
până la repartiţia lor egală pe cele două feţe ale acesteia. Un exemplu de
osmoză îl constituie preluarea apei din sol de către perişorii absorbanţi. Când
concentraţia apei în celulă este mai mare decât în exterior, apa iese din
celulă, iar aceasta îşi micşorează volumul. Ca urmare, la plante se produce
ofilirea( pierderea apei prin osmoză). Celula îşi revine când în mediul extern
concentraţia apei este mai mare decât concentraţia soluţiei intracelulare.
Forţele active. Diferitele molecule trec prin membrana plasmalică în mod
selectiv, împotriva gradientului de concentraţie. Are loc un transport activ care
se face cu ajutorul unor proteine de transport existent în structura membranei.
Transportul necesită consum de energie;la nivelul membranei se găsesc
canale ionice .
Datorită repartiţiei inegale a ionilor (+ şi -) pe cele două feţe ale
membranei, aceasta este polarizată electric. În repaus, sarcinile pozitive (+)
sunt dispuse la exterior, iar cele negative (-) în interior. In stare de activitate,
polaritatea se inversează.
1.4 Componentii citoplasmici cu rol genetic

Celula vegetala este constituita dintr-o masa mica de substanta vie,


protoplasma, care contine doua componente fundamentale: citoplasma si nucleu (la
eucariote, care sunt organisme evoluate, cu nucleu tipic, cu membrana, cromozomi si
diviziuni nucleare) sau nucleoid (la procariote care sunt organisme primitive: virusuri,
bacterii si alge albastre, la care materialul nuclear nu este organizat intr-un nucleu
tipic). La exterior celula este inconjurata de o membrana, iar in interior, in afara de
nucleu, se afla diferitii constituenti citoplasmici: mitocondrii, cloroplaste, ribozomi,
centrozomul etc.
Mitocondriile. Studiul complex al mitocondriilor a relevat existenta unui ADN
mitocondrial si a unui aparat enzimatic propriu, ce permite sinteza unor proteine
caracteristice. ADN din mitocondrii e format dintr-un helix dublu in forma circulara,
asemenea ADN-ului bacterian. Intr-o mitocondrie pot exista pana la 6 molecule de
ADN; ADN mitocondrial se deosebeste de ADN-ul nuclear prin proprietatile sale fizice
si chimice: densitate, temperatura de denaturare, eficienta foarte scazuta in
hibridarile cu ADN nuclear etc.
Mitocondriile au proprietatea de a creste, de a se divide si poseda continuitate
genetica.
Mutatiile care apar la nivelul mitocondriilor afecteaza in primul rand functiile de
respiratie, acestea pot sa apara cu o frecventa relativ mare.
Ribozomii. Au un continut in acizi ribonucleici si proteine in proportie de
aproximativ 50:50%. Din cauza acestui continut ridicat de acid ribonucleic, G.E.
Palade (1953), descoperitorul acestor particule, le-a numit ribozomi. Ei se gasesc
liberi in citoplasma sau fixati de reticulul endoplasmic. Ribozomii indeplinesc un rol
deosebit de important, prin participarea lor la sinteza proteinelor. Ei se gasesc in
cantitate mare in tesuturile cu diviziuni celulare intense, in care si sinteza proteica se
realizeaza intens. In sinteza proteica ribozomii devin activi prin asocierea lor cu
molecule de acid ribonucleic mesager(mARN), impreuna cu care formeaza
poliribozomii. Ribozomii au marime diferita si se pot clasifica dupa constanta de
sedimentare (S) la ultracentrifugare: categoria de 80 S prezenti in celulele eucariote
(plante superioare). Sub actiunea ionilor de Mg, ribozomii se pot unii intre ei formand
structuri polimere sau se pot descompune in subunitati.
Cloroplastele. Contin si ele acizi nucleici si sunt bogate in enzime cu rol in
fotosinteza. Ele participa la transmiterea caracteristicilor ereditare care determina
culoarea frunzelor, iar prin constanta si continuitatea lor celulara intrunesc
caracteristicile de baza ale unui material genetic. Cloroplastele contin ADN dublu
catenar in forma circulara, ca si acela al bacteriilor. La plantele superioare, in
tesuturile meristematice nu se gasesc cloroplaste dezvoltate, ci proplastide care vor
evolua in plastide si care se multiplica odata cu diviziunea celulei. Principal,
proplastidele se transmit urmasilor prin citoplasma gametului femel, si mai putin prin
gametul mascul.
Centrozomul. Joaca un rol important in diviziunea celulelor plantelor
inferioare.
Se divide in doi centrozomi-fii, numiti sfere directrice. In jurul fiecareia se
formeaza filamente radiare, care alcatuiesc cate un aster. Sferele directrice se
deplaseaza apoi spre doi poli ai celulei. Datorita autoduplicarii, in fiecare centrozom
se gasesc tot doi centrioli. Acestia sunt inzestrati cu continuitate genetica. Centriolii
separa in structuri duplex la inceputul fiecarei noi diviziuni (profaza urmatoare).
In citoplasma se afla factorii ereditari responsabili pentru ereditatea
extranucleara-plasmagenele. Majoritatea plasmagenelor se afla in genomul
plastidelor (plastogenele) si in genomul mitocondriilor (mitogenele).
O schema generala a structurii celulei,alcatuita dupa imaginile obtinute la
microscopul electronic(dupa Brachet, 1961),este prezentata in figura de jos:

1.5 Nucleul
Datorita componentilor sai principali, cromozomii, nucleului i s-a acordat o
deosebita atentie in cercetarile de genetica. La microscopul fotonic, nucleul apare cu
o structura omogena, iar la cel electronic cu o structura mai complexa, constituit
dintr-o retea fina de fire. Pentru a studia compozitia chimica a nucleului, el trebuie
izolat din celule. Pe baza analizei cantitative s-a stabilit ca nucleul contine 14%ADN,
12% ARN, 22,5% proteine bazice si 51,5% proteine stabile. Din proteinele bazice fac
parte prolaminele si histonele, bogate in aminoacizii lizina, histidina si mai ales
arginina. ADN se gaseste in structuri cromatice, in timp ce ARN mai ales in nucleoli.
In nucleu se mai gasesc: enzime, lipide, ioni de calciu, magneziu, cupru etc.
Nucleul este delimitat la exterior de o membrana nucleara si contine in interior
un suc nuclear (cariolimfa), cromozomi si nucleoli. Ultrastructura membranei nucleare
este foarte complicata si joaca un rol tot atat de complex in schimburile nucle-
plasmatice. In cariolimfa s-a determinat prezenta unei structuri reticulare,
asemanatoare reticulului endoplasmic, dar mult mai fina, care contine bicatene de
ADN ce formeaza complexe cu histonele si cu proteinele nehistonice reprezentand
procropozomi. Filamentul de cromatina este lung si se gaseste sub forma spiralizata.
Nucleolii. Se formeaza in zona constructiei secundare a cromozomilor,
asociati cu o anumita regiune, denumita organizator nucleolar. In timpul diviziunii
mitotice nucleolii sufera un ciclu de transformari inverse acelora prin care trec
cromozomii. Ei sunt vizibili in interfaza, dispar in profaza si reapar la sfarsitul
anafazei. Din punct de vedere chimic, nucleolii cuprind doua grupe de substante
(proteine si acid ribonucleic), care formeaza un complex ribonucleoproteic. Acesta
sintetizeaza o mare cantitate de ARN pe care il trimite in citoplasma.

1.6 Cromozomii
Cromozomii sunt structuri permanente in nucleul celulei si constituie materialul
genetic de baza. In cromozomi sunt localizate genele. S-a stabilit ca ei sunt prezenti
tot timpul in celula, dar sufera unele schimbari, odata cu diferitele etape care succed
in viata celulei. Numarul si structura lor genetica raman insa constante si specifice
fiecarei specii de-a lungul generatiilor.
Morfologia cromozomilor. Aspectul cromozomilor poate fi bine studiat in
cursul diviziunii celulare mitotice, in metafaza, cand se coloreaza foarte intens. Ei
sunt constituiti din perechi identice, dar diferiti ca marime si forma de la pereche la
pereche. Fiecare cromozom e format din doua cromatide, sudate intr-un punct, printr-
o formatiune cu diametrul mai mic ca acela al cromozomului numit centromer sau
kinetocor. Acesta are o functie mecanica, pentru ca in metafaza se fixeaza de unul
din firele fusului nuclear atrenand cromozomul spre unul din polii fusului de diviziune.
Deoarece in dreptul centromerului cromozomul are diametrul mai mic, acestei
zone i s-a dat denumirea de constrictie primara. Pozitia centromerului in raport cu
lungimea cromozomului poate fi diferita. Astfel, cand e situat la mijloc (metacentric),
centromerul imparte cromozomul in doua brate egale, iar cand e situat spre o
extremitate (submetacentric, acrocentric sau telocentric) bratele sunt inegale.
Fragmentele de cromozom fara centromer sunt capabile de a se duplica, dar
incapabile de a se orienta in mitoza spre polii celulelor. Centromerul este o formatie
capabila de autodedublare. Diviziunea cromozomului este precedata de diviziunea
centromerului.
Forma cromozomilor este o insusire caracteristica speciilor, dar variaza si in
functie de specializarea celulei in tesut, de starea fiziologica a celulei si de influenta
diferitilor factori externi. In metafaza cromozomii se prind de firele fusului de diviziune
la nivelul centromerului, luand forma de V,X,J,O etc. Clivajul longitudinal incepe
intotdeauna in acelasi loc. Toate acestea demonstreaza, in plus, individualitatea
pronuntata a cromozomilor.
Marimea cromozomilor variaza in functie de specie. Ca lungime pot atinge
valori cuprinse intre 1µ si 25µ, iar ca grosime valori de 0,1µ pana la 2µ. In general,
marimea lor este proportionala cu marimea celulei si invers proportionala cu numarul
lor. De asemenea, cercetrile arata ca lungimea cromozomului este, in general,
proportionala cu numarul de gene pe care le contine.
Se cunosc anumiti agenti ai mediului exterior care pot influenta marimea
cromozomilor. De exemplu, scaderea temperaturii face ca in celule vegetale in plina
divizune sa apara cromozomi mai contractati, mai scurti. Prezenta alcaloidului
colchicina in timpul diviziunii celulare scurteaza cromozomii.
Numarul de cromozomi este relativ constant pentru indivizii ce alcatuiesc o
specie de plante. Acest numar variaza in limite mari la diferite specii, de la 2, cati
intalnim in celulele somatice la Ascaris megalocephala, pana la cateva sute (Amoeba
proteus). In celulele somatice, numarul lor este dublu (diploid) si se noteaza cu 2n,
iar in celulele sexuale este pe jumatate (haploid) si se noteaza cu n.
In celulele somatice cromozomii sunt perechi. Numarul lor reprezinta un
caracter de specie; acest numar nu este legat de pozitia sistematica a speciei in
lantul filogenetic. Numarul si morfologia cromozomilor pentru diferite forme apropiate
pot insa sa fie folosite ca indicatii pentru inrudirea filogenetica a formelor de plante.
Pe aceste constatari se bazeaza ramura sistematicei numita kariosistematica.
Constanta numarului de cromozomi este totusi relativa, starea organismului si
conditiile externe pot produce schimbari. La speciile de plante angiosperme nucleii
din celulele endospermului, datorita fenomenului dublei fecundari, contin trei garnituri
haploide de cromozomi, fiind simbolizat 3n. Numarul, forma si marimea cromozomilor
din celulele somatice ale unui organism in metafaza sunt indicate prin notiunea de
cariotip.
Structura cromozomului.Cromozomii sunt formati din doua unitati alipite in
lungul lor numite cromatide.Cu ajutorul microscopului electronic s-a descoperit ca
aceste subunitati observate la microscopul obisnuit nu sunt unitati structurale
elementare ale cromozomilor,ci se compun,la randul lor, din cate doua subunitati
numite cromoneme. In preajma diviziunii celulare, cromonemele se spiralizeaza si se
scurteaza. In timpul mitozei, cromozomii se coloreaza intens cu coloranti vitali.
Spiralizarea este inegala, asa ca exista zone cu spirale mai dense si mai putin
dense. La microscopul optic aceste portiuni apar ca o succesiune de granule, insirate
ca margelele intr-un sirag denumite cromomere. S-a crezut mult timp ca aceste
cromomere ar reprezenta unitatile functionale (genele). In realitate, aceste ingrosari
vizibile sunt portiuni de spirale mai dense, ce dau aspectul de granule de culoare mai
inchisa. Cromomerele includ un numar variabil de gene.
Spiralizarea si scurtarea cromozomului sunt maxime in metafaza, cand
cromozomii apar destul de compacti. In telofaza incepe procesul de despiralizare a
cromonemelor care devin laxe in interfaza.
Cercetarile actuale au pus in evidenta faptul ca, in afara de spiralizarea
cromonemei (spiralizare primara), are loc si o spiralizare intercromonemica
(spiralizare secundara). Ambele se produc simultan.
Dublarea cromatidelor si a cromonemelor se efectueaza in interfaza, cand
acestea se gasesc in stare de despiralizare maxima. Fiecare cromatida isi
construieste una similara, asa ca fiecare pereche se compune din una veche,
formata in diviziunea precedenta si din una noua.
O structura importanta, care joaca un rol caracteristic in evolutia
cromozomului, este heterocromatina. In toate stadiile ciclului mitotic, unele sectoare
ale cromozomului se coloreaza intens. Acestea s-au numit sectoare heterocromatice,
spre deosebire de altele eucromatice, care se coloreaza mai slab. Colorarea mai
intensa se explica prin cresterea densitatii spirelor cromonemelor.

Fig 2.Schema evolutiei cromozomilor in


mitoza:1-interfaza:cromozom despiralizat,prezinta resturi de spiralizare in zonele mai condensate; 2,3,4-
profaza:fiecare cromozom se scindeaza in doua cromatide,ce se separa in anafaza; 5-prometafaza:cele
doua cromatide sunt formate fiecare din doua cromoneme; 6-metafaza:aspectul cel mai condensat; 7-
anafaza:separarea cromatidelor; 8- telofaza:o noua despiralizare; c- centromer(depa Saez,1955).

Heterocromatina se poate prezenta sub trei forme:

- Heterocromatina constitutiva, prezenta in toti cromozomii si localizata de-o


parte si de alta a centromerului. Ea se aglomereaza intr-o masa compacta
cromatica, care se numeste cromocentru;
- Heterocromatina facultativa, care inactiveaza genele pentru unul din
cromozomii X. Se stie ca la femele din cei doi cromozomi X numai unul este
activ. In felul acesta se realizeaza o egalitate in functionarea genelor celor
doua sexe la mamifere, deoarece sexul mascul, cu cromozomii XY, are numai
un cromozom X activ;
- Heterocromatina condensata este distribuita diferit la celule din diferite
tesuturi si blocheaza actiunea genelor ce se gaseste in regiunea ei.

Structura moleculara a cromozomilor la eucariote

ADN-ul cromozomal la eucariote manifesta o mare heterogenitate fiind format


din trei tipuri:
- ADN non repetitiv alcatuit din secvente nucleotidice care nu se repeta,
existent in proportie de 30 – 80% si continand cea mai mare parte a genelor
structurale implicate in codificarea sintezei proteinelor;
- ADN repetitiv, in cantitate de 20 – 80%, reprezentat prin secvente
nucleotidice care se repeta, este inert din punct de vedere genetic, serveste
ca spatiator intre genele structurale;
- ADN satelit, care este un tip de ADN repetitiv ce nu are functie genetica;
exista parerea ca acest ADN ar avea rol in imperecherea cromozomilor,
miscarea si mentinerea integritatii lor
Proteinele cromozomale impreuna cu ADN formeaza complexul nucleohistonic.
Histonele sunt proteine bazice si sinteza lor este strans corelata cu sinteza si
replicarea ADN-ului. Ele au rol in mecanismele de reglare genetica, in mentinerea si
controlul conformatiei cromatinice in timpul ciclului celular.
Proteinele nonhistronice sunt proteine acide, fiind numai partial asociate cu ADN.
Ele cuprind enzime ale metabolismului cu functie reglatoare si interactioneaza cu
ADN-ul pentru a modifica sau intensifica transcriptia intr-un mod specific.
ADN eucariotic este organizat in nucleozomi. S-a stabilit ca histonele sunt
alcatuite din cinci clase principale: H1, H2A, H2B, H3 si H4. Acestea se asociaza
pentru a forma un miez octomeric compus din cate doua molecule din componentii
H2A, H2B, H3 si H4, in jurul caruia este rasucit un segment de ADN de 160 perechi
de baze. Intre nucleozomi se gasesc linkeri de ADN, reprezentati de segmente scurte
de ADN asociate cu componenta histonica H1. Spiralele de ADN de pe miezul
octomeric sunt legate de o mare varietate de proteine a caror functie este
necunoscuta. Ele pot fi implicate in reglarea expresiei genelor. In timpul transcriptiei
structura nucleozomului se modifica profund, permitand despiralizarea si liniarizarea
moleculei de ADN.
Tipuri speciale de cromozomi. In afara de tipul obisnuit al cromozomilor din
celulele somatice, autozomi si heterocromozomi, au fost descoperiti in anumite celule
si alte tipuri de cromozomi: cromozomi uriasi, cromozomi perie de lampa si
cromozomi accesorii sau B.
Cromozomii uriasi s-au format prin multiplicarea cromatidelor de peste 1000 de
ori, care au ramas insa alipite, neseparate (sinapsa mitotica) si despiralizate, fara ca
nucleul sa se divida. Din cauza numarului mare de cromatide, acestia se mai numesc
si polyteni. Structura cromozomilor polyteni se deosebeste de a celorlalti cromozomi
somatici prin lungimea si grosimea lor mult mai mare. Dimensiunile lor foarte mari
permit cercetarea unor detalii de structura. In metafaza, configuratia cromozomilor
polyteni este alta, comparativ cu acea a cromozomilor somatici obisnuiti.
Cromozomii lambrush (perie de sticla de lampa) au fost pusi in evidenta in
ovocitele vertebratelor, in timpul profazei meiozei. Spre deosebire de cromozomii
uriasi, ei sunt foarte subtiri, ajungand uneori la limita vizibilitatii microscopice, ating
lungimi de peste 1000µ fiind considerati cei mai lungi cromozomi. Acestia poseda un
ax central, in lungul caruia sunt insirate cromomere, din care ies lateral perechi de
bucle filiforme, dand aspectul firelor de par ale unei perii de sticla de lampa. Se
presupune ca buclele sunt spirale ale cromonemei, active din punct de vedere
genetic.
Cromozomii accesorii se gasesc in plus fata de cromozomii autozomi si ai
sexului.
Spre deosebire de cromozomii obisnuiti, cromozomii accesorii se mai numeste si
cromozomii B. Numarul lor variaza de la un organism la altul si de la un tesut la altul
si nu sunt homologi intre ei, sunt heterocromatici, mici si inerti din punct de vedere
genetic. In meioza si in mitoza nu se distribuie in mod egal in celulele in care se
formeaza. Nu se cunoaste inca originea si rolul lor, ei pot lipsi fara a perturba viata
organismelor. Mai curand s-ar putea considera drept pagubitoare existenta lor, astfel,
la secara tetraploida, atunci cand cromozomii B sunt prezenti scade fertilitatea
polenului si viabilitatea plantelor.

Fig 3.Morfologia si structura unui cromozom


1.7 Reproducerea celulei

Una din caracteristicile materialului genetic este continuitatea lui celulara.


Aceasta este asigurata prin reproducerea sa cu mare fidelitate, transmitandu-
se de la celula la celula, de la parinti la urmasi. La eucariote, reproducerea
cromozomilor are loc odata cu reproducerea celulelor.
Mitoza. Dintre formele de reproducere celulara, mitoza ocupa cea mai
importanta pozitie. Dintr-o celula initiala, prin diviziuni repetate mitotice, se formeaza
in mod succesiv 2,4,8,16 celule, cu acelasi numar de cromozomi care exista in celula
initiala. Prin mitoza, materialul genetic, cromozomii, se mentin in structura si numar
constante. Din cauza modificarilor pe care le sufera nucleul in mitoza, acestui mod de
diviziune i s-a mai dat denumirea de kariokineza.
Mitoza cuprinde duplicarea cromozomilor si a centrilor mitotici si separarea
cromozomilor la cei doi poli ai celulei, in vederea formarii a doua celule fiice. In
procesul mitozei se desprind doua etape de baza: diviziunea nucleului (kariokineza)
si diviziunea citoplasmei (citokineza). In perioada dintre doua diviziuni, nucleul se afla
in interkineza (interfaza).
Interfaza. In interfaza nucleul creste si se pregateste de o noua diviziune.
Cercetarile efectuate cu izotopi radioactivi si autoradiografiere au demonstrat
ca in interfaza la inceput cromozomii sunt monocromatidici, iar apoi fiecare cromatida
isi reconstituie cromatida pereche, in urma unui proces de sinteza a elementelor ce o
compun. Dupa unele observatii, aceasta faza se imparte in trei perioade: G1, in care
are loc sinteza proteica, S1 in care se produce dublarea cantitatii de ADN din celula
si G2, in care se inceteaza sinteza ADN.
In interfaza, cromozomii sunt despiralizati si contin gene active.
Profaza. Constituie prima faza a mitozei. In nucleu, structura lui reticulara se
transforma in filamente vizibile, incolacite sub forma unui ghem numit spirem.
Filamentul, prin rasucire in jurul axei sale, se scurteaza, se ingroasa si, prin
fragmentare, da nastere la cromozomi. Inca de la inceputul profazei se observa
natura dubla a lor. Se disting bine cele doua cromatide, ca niste benzi longitudinale,
paralele sau incolacite. De asemenea, se distinge si centromerul, ca un segment ce
uneste, printr-o singura structura, cele doua cromatide.
Terminarea profazei este indicata de dizolvarea nucleolilor, fragmentarea si
dizolvarea membranei nucleare si formarea fusului de diviziune.
Se admite si un stadiu intermediar intre profaza si metafaza numit
prometafaza. Aceasta corespunde perioadei de dizolvare a membranei nucleare, a
migrarii cromozomilor spre ecuatorul celulei si a formarii incomplete a fususului de
diviziune.
Ansamblul: poli, asteri, fus acromatic si cromozomi formeaza aparatul mitotic.
Formarea fusului constituie cea mai importanta schimbare structurala a celulei
de la sfarsitul profazei. Fusul acromatic este alcatuit din fibrile si din fibre
cromozomale ce unesc centromerii de polii fusului. Fusul incepe sa se formeze in
citoplasma, cand nucleul mai este delimitat de membrana. Mitocondriile, microzomii
si alte organite citoplasmice nu patrund in zona din interiorul fusului.
Metafaza. Cromozomii se insereaza pe tubulii fusului de diviziune prin cate un
punct de insertie din regiunea cenromerului si se dispun pe un plan perpendicular la
mijlocul fusului, formand placa ecuatoriala.
In metafaza planul ecuatorial se mareste, iar odata cu el si fusul. In acest timp,
cromozomii se indeparteaza usor unul de altul si manifesta tendinta de a-si orienta
bratele paralel cu lungimea axului fusului. Intotdeauna ei raman in interiorul fusului,
fara a-l depasi spre citoplasma. In metafaza cromozomii pot fi studiati bine la
microscop deoarece sunt spiralizati la maximum, compacti si se coloreaza intens.
Anafaza. Cromozomii isi despart cromatidele prin clivarea in lungul lor, dupa
ce in prealabil s-a produs divizunea centromerilor. Ei devin cromozomi
monocromatidici si aluneca pe fusul central catre cei doi poli ai sai. Simultan cu
deplasarea cromozomilor catre cei doi poli ai fusului, acesta din urma se
stranguleaza in partea din mijloc, grabind astfel alunecarea cromozomilor catre polii
fusului. Centromerii inainteaza spre poli si trag dupa ei bratele cromozomilor. In cazul
in care un cromozom isi pierde centromerul, el ramane dezorientat si produce o
deviere a mitozei de la mersul normal. Un astfel de cromozom se poate pastra si
poate participa la mitoza numai daca aloca altui cromozom ce poseda centromer.
Telofaza. In cursul telofazei, fibrele fusului dispar, iar cromozomii ajung la cei
doi poli, se despiralizeaza, reconstituind filamentele de cromatina, care se subtiaza,
se alungesc si iau forma unui ghem. Fragmentele membranei nucleare migreaza
spre poli, se agrega in jurul filamentelor de cromatina, dand nastere cate unei
membrane pentru fiecare dintre cei doi nuclei care se formeaza. Are loc procesul de
reconstituire a nucleolilor, in numarul in care au fost prezenti in nucleul matern.
Totodata, corpul celulei se gatuie si, prin formarea unui perete despartitor iau
nastere doua celule.

Fig 4. Schema mitozei:A-interfaza; B,C,D- profaza;


F- anafaza; G- telofaza;H- celule-fiice.
Timpul in care are loc mitoza depinde de tesutul in care se gaseste celula, din
starea fiziologica a organismului si de anumiti factori externi. Ea poate dura de la
cateva minute pana la 200 de minute.
Dintre toate fazele din tot ciclul mitotic, profaza este cea mai lunga (circa
60%), telofaza mai scurta (circa 30%), iar metafaza si anafaza cele mai scurte (circa
5%).
Citokineza. Diviziunea nucleului este insotita aproape intotdeauna si de
diviziunea citoplasmei. Se crede ca aparatul mitotic ar raspunde si de diviziunea
citoplasmei. In cursul diviziunii mitotice, structura citoplasmei sufera modificari
importante: membrana nucleara dispare, continutul cromozomic al nucleului se
disperseaza in citoplasma, iar reticulul endoplasmic sufera modificari structurale,
reducandu-se. Vascozitatea celulei scade treptat, ajunge la minimum in metafaza,
dupa care creste, atingand din nou starea initiala in telofaza.
Amitoza. In afara de mitoza se observa in multe tesuturi, la plante, o diviziune
simpla, in care nucleul si citoplasma se impart in doua sau un multiplu de doi,
formand mai multe celule. Amitoza a fost constanta in endospermul angiospermelor,
in antipodele sacilor embrionari, in celulele somatice ale tesuturilor reproducatoare, in
tesuturile metazoarelor, etc. Caracteristica amitozei este lipsa fusului acromatic.
Unele date arata ca diviziunea mitotica se poate restabili in celulele la care
una sau mai multe generatii s-au repordus pe cale amitotica.
Endomitoza. Prin endomitoza se intelege multiplicarea numarului de
cromozomi in nucleu, fara ca membrana nucleara sa se descompuna. Cromozomii
rezultati se duplica, fara a se individualiza, contin un numar mare de cromatide si se
numesc polyteni. Endomitoza este precedata de cresterea in volum atat a nucleului,
cat si a celulei. Endomitoza este conditionata de anumite stari fiziologice ale celulei
care impiedica formarea aparatului mitotic.
Diviziunea reductionala ( meioza). Meioza reprezinta o forma de diviziune
celulara caracteristica organismelor ce se inmultesc pe cale sexuata si in urma careia
din celule somatice cu 2n cromozomi se formeaza celule sexuale cu n cromozomi.
Reducerea numarului de cromozomi este fenomenul invers procesului de
dublare a lor, care are loc in urma fecundarii. Daca organismele ar forma celule
sexuale cu acelasi numar de cromozomi ca acel al celulelor somatice, cu fiecare
generatie numarul de cromozomi din celulele organismelor s-ar dubla. Meioza
asigura deci mentinerea constanta a numarului de cromozomi de-a lungul
generatiilor la organismele ce se inmultesc sexuat.
In meioza se disting, defapt, doua diviziuni succesive: o diviziune meiotica
primara, numita si heterotipica sau reductionala, in care din celule diploide se
formeaza celule haploide si o diviziune meiotica secundara sau homeotipica, in care
din celule haploide se formeaza tot celule haploide.
In meioza primara, fazele prin care trece diviziunea celulara sunt aceleasi ca
la diviziunea mitotica, numai ca profaza este mult mai complexa si cuprinde mai
multe stadii: leptonem, zigonem, pachinem, diplonem si diakineza.
Profaza I. In stadiul de leptonem, nucleul se mareste in volum, cromozomii
apar initial sub forma unor filamente foarte fine, in lungul carora se pot distinge niste
ingrosari, cromomerele, ca urmare a unor zone mai dense de spiralizare a lor.
Aparent, filamentul este format dintr-o singura cromatida, din care cauza
cromozomii se numesc monovalenti, iar numarul lor este egal cu 2n.
Stadiul de zigonem corespunde cu imperecherea cromozomilor homologi, doi
cate doi, formand perechi sau cromozomi bivalenti. Fenomenul de alaturare a celor
doi cromozomi in lungul lor poarta numele de sinapsa. In fiecare pereche se gaseste
cate un cromozom de origine materna si cate unul de origine paterna. Sinapsa
incepe intr-un anumit punct de pe lungimea cromozomului si se continua apoi in tot
lungul cromozomului. Sinapsa este atat de perfecta, incat toate segmentele
homologe se alatura fata in fata(homologie=similitudinea structurala si functionala a
cromozomilor).
Daca dintr-un cromozom pereche lipseste un segment, portiunea
corespunzatoare a cromozomului pereche face o bucla, asigurand sinapsa pentru
celelalte regiuni homologe ale cromozomilor.
Sinapsa are loc in doua etape: in prima etapa se produce o aliniera a
cromozomilor homologi iar in a doua etapa apropierea lor fie la unul din capete sau
ambele, fie in mai multe puncte pe lungimea cromozomilor, dupa care se continua pe
toata lungimea. Aceasta apropiere duce la formarea asa numitelor complexe
sinaptinemale. Apropierea cromozomilor constituie unul din cele mai importante
momente ale meiozei.
In stadiul de pachinem cromozomii se scurteaza, se ingroasa, iar legatura
dintre perechi devine din ce in ce mai intima, fapt care a determinat denumirea de
gemeni cromozomali.
In stadiul de diplonem, la fiecare dintre membrii bivalentului se pot observa
cate doua cromatide surori, astfel ca perechea de cromozomi este constituita din
patru cromatide, care alcatuiesc asa zisa tetrada cromozomala. Cromozomii
homologi au tendinta de a se indeparta unul de altul: cromatidele nesurori sunt insa
retinute in mai multe puncte de contact numite chiasme(chiasma e considerata ca
reprezentand manifestarea citologica a crossing overului).
In stadiul de diakineza, cromozomii ce alcatuiesc perechile se indeparteaza,
scurtarea lor devenind si mai accentuata. Spatiile dintre chiasme se largesc, acestea
se deplaseaza catre extremitatile perechilor de cromozomi numai la extremitatile lor.
Cu aceasta se incheie profaza primara.
Metafaza I. Membrana nucleara dispare si se formeaza fusul de diviziune.
Tetradele cromozomale se repartizeaza in planul ecuatorial al celulei. Fiecare
cromozom homolog, alcatuit din doua cromatide surori, se ataseaza la nivelul
centromerului de firele fusului, pentru a conduce cromozomii la polii celulari.
Odata cu indepartarea lor dispar si ultimele chiasme.
Anafaza I. Cromozomii bicromatidici migreaza la polii celulei. Ei pot diferi din
punct de vedere genetic, in urma schimbului de segmente care a avut loc in stadiile
anterioare.
Telofaza I. Cromozomii ajunsi la cei doi poli ai celulei formeaza cate un nucleu
cu un numar haploid de cromozomi. Fenomenul care duce la separarea celor doua
celule poarta numele de plasmodiereza, iar cele doua celule haploide formeaza o
diada.
Odata cu incheierea acestei faze, nucleii intra in interkineza. Cromozomii
prezinta cromatidele perechi separate, dar unite numai prin centromeri, aspect
caracteristic numai mitozei.
Dupa un interval scurt incepe a doua faza a diviziunii meiotice, homoeotipica,
care curpinde urmatoarele faze:
Profaza II si metafaza II. Cromozomii apar formati din cromatide surori, care
se orienteaza in planul ecuatorial al fusului de diviziune ce apar la sfarsitul profazei
secundare. Cromozomii se cliveaza imediat dupa clivarea centromerilor.
Anafaza II si telofaza II. Cele doua cromatide se indeparteaza spre cei doi
poli, unde constituie doi nuclei. Din diada initiala cu celule haploide s-au format deci
patru celule haploide, ce formeaza o tetrada celulara. Aceste celule, in urma unor
procese, vor da nastere gametilor.

Fig 5. Schema meiozei

1.8 Sporogeneza si gametogeneza la plante


Sporul haploid rezulta in urma diviziunii meiotice, proces numit sporogeneza.
Din spori se dezvolta gametofitul, forma sub care se prezinta unele organisme
in cea mai mare parte a vietii lor, cum este la ciuperci, muschi, ferigi. La
angiosperme, faza haploida este redusa ca timp si gametii se formeaza dupa ce
nucleii sporului mascul si femel sufera unele diviziuni mitotice.
Microsporogeneza si microgametogeneza. In zona profunda a anterelor
florilor, dupa mai multe diviziuni mitotice repetate, se formeaza celulele mama ale
graunciorilor de polen. Acestea sunt analoge cu spermatocitele primare de la
metazoare si cu ele se incheie diplofaza. Fiecare celula mama a graunciorilor de
polen da nastere, in urma diviziunii meiotice, la o tetrada de microspori, adica la patru
graunciori de polen haploizi. Graunciorul de polen constituie gametofitul mascul.
Megasporogeneza si megagametogeneza. In ovul se formeaza si se
dezvolta sacul embrionar (megasporul). Celula initiala, din care isi are originea sacul
embrionar, se divide in doua, formand o celula superioara care, prin diviziuni
repetate, va da nastere la un tesut numit calota, si o celula inferioara (celula mama a
tetrasporilor).
Celula mama a tetrasporilor sufera doua diviziuni, dintre care prima este
reductionala si din care iau nastere patru celule haploide. Una din ele creste mai
mult, devine sac embrionar, in timp ce celelalte trei se resorb.
Cu formarea megasporului se incheie megasporogeneza.
Megasporul (megasporangele) sufera urmatoarele transformari: nucleul se
divide in doi nuclei, care se deplaseaza catre cei doi poli ai megasporului. Acolo,
fiecare nucleu se divide dand nastere la cate patru nuclei. Cate unul din acestia se
indreapta spre centrul megasporului, unde fuzioneaza dand nastere nucleului
secundar al sacului embrionar sau nucleului de fuziune (2n).
Cei sase nuclei ramasi se inconjoara cu citoplasma si devin celule: la un pol
este situata oosfera si doua sinergide, iar la celalat pol trei antipode.
Syngamia. Este fenomenul prin care se unesc doi gameti (n) pentru a forma
un zigot (2n). Ea asigura trecerea de la faza haploida la faza diploida in ciclul de
dezvoltare a unui organism.
Cand gametii sunt diferentiati din punct de vedere morfologic se spune ca ei
sunt heterogeni sau anisogami, iar fenomenul a fost denumit heterogamie sau
anisogamie. De obicei, gametul femel este mai voluminos. La plantele superioare
poarta numele de oosfera. Gametul mascul este mai mic si redus la un nucleu,
inconjurat de putina citoplasma; el se numeste spermatozoid la animale si la plantele
inferioare. La conifere si angiosperme nucleul haploid al graunciorului de polen, dupa
o prima diviziune da nastere nucleului vegetativ si nucleului germinativ, iar dupa o
alta diviziune a nucleului generativ rezulta doua spermatii. Una din spermatii se
uneste cu oosfera, dand nastere zigotului diploid (2n), iar a doua se uneste cu
nucleul diploid al sacului embrionar, dand nastere endospermului triploid (3n).
Din punct de vedere genetic synagmia reconstituie perechile de cromozomi
homologi, intrunind in acelasi genotip ereditatile celor doi parinti. In acelasi timp,
fecundarea asigura continuitatea materialului genetic in generatiile urmatoare.

Fig 6.Schema spermatogenezei (A) si ovogenezei (B)


B
CAPITOLUL II

2.1 Regenerarea, selecţia şi testarea plantelor


modificate genetic

Regenerarea, selecţia şi testarea PMG reprezintă componente esenţiale ale


unui protocol de transformare. Datorită totipotenţei caracteristice organismului
vegetal,celulele transformate pot regenera prin cultura in vitro plante transgenice,
care fiind supuse unor etape intermediare de selecţie sunt cultivate în câmp pentru o
testare a stabilităţii expresiei transgenei în condiţii naturale.
Sistemele de cultură in vitro includ atât cultura explantelor care îşi păstrează
integritatea: embrioni zigotici, meristeme, cât şi a celor pentru care condiţiile in vitro
determină o dediferinţiere celulară mai mult sau mai puţin pronunţată.
Dediferenţierea este procesul prin care celulele unui organ pierd capacitatea
de a şi regla dezvoltarea, devenind apte de a se divide cu formarea unei mase de
celule parenchimatice numit calus .
În calitate de explante pentru inducerea calusului pot fi folosite diferite părţi
ale organelor plantei. Excizia explantului induce un răspuns de rănire la nivelul
secţiunilor care, cultivate în prezenţa hormonilor din mediu, formează calus. Prin
modificarea raportului de substanţe reglatoare de creştere în mediul de cultivare este
indusă organogeneza, asigurată de meristemele care apar în calusurile cultivate in
vitro. Prin organogeneză se formează lăstari care, transferaţi pe un mediu lipsit de
hormoni sau cu un conţinut scăzut de auxină, vor înrădăcina. Plantele, astfel
obţinute, vor fi transferate în seră şi, ulterior, în câmp.
Lăstarii pot fi induşi să se formeze şi direct pe explantele diferenţiate: frunze,
tulpini, hipocotile, inflorescenţe, rădăcini. În acest caz, ei îşi au originea în zone
rămase în stare meristematică sau pot rezulta din diferenţierea anumitor celule.
Obţinerea plantelor din celule cultivate in vitro se poate realiza prin regenerare
atât direct, cât şi indirect prin calus urmat de organogeneză.
Deşi etapa de regenerare de novo prin calus nu este o cerinţă obligatorie
pentru a genera plante transgenice, aceasta reprezintă o etapă de bază în
majoritatea protocoalelor de transformare. Procedura de regenerare trebuie să
corespundă anumitor condiţii. De exemplu, în cazul transformării mediate de
Agrobacterium, pentru a fi accesibile bacteriei, celulelor care urmează să fie
regenerate li se aplică diferite forme de rănire, iar acestea trebuie să fie competente
pentru a primi şi integra ADN-T.
Regenerarea plantelor poate fi influenţată negativ de concentraţii înalte ale
bacteriei şi perioada lungă de cocultivare – factori esenţiali în eficienţa transformării.
De aceea, este necesar de a găsi un echilibru între frecvenţa de transformare
şi viabilitatea ţesutului. S-a constatat că modul în care materialul vegetal este cultivat
înainte şi după infectare cu bacterii, şi în special prezenţa în mediu a hormonilor,
reglatorilor de creştere şi a diferitor substanţe: antioxidanţi sau antibiotice pot
influenţa profund atât competenţa pentru transformare, cât şi capacitatea de
regenerare.
Frecvenţa regenerării variază şi este influenţată de genotip şi de metoda de
transfer. Depăşirea acestor dificultăţi este posibilă prin elaborarea unor metode de
transformare directă a unor structuri cu potenţial natural de regenerare, cum sunt
embrionii şi meristemele. Dezvoltarea transformanţilor din astfel de explanţi este 33
asociată cu un număr mai mic de manipulări ale tehnicii culturii in vitro. De
asemenea,se consideră că plantele obţinute din cultura meristemelor apicale sau
auxiliare nu prezintă variaţia somaclonală. Cu cât este mai redus gradul de
organizare a ţesutului şi cu cât este mai lung timpul petrecut în această stare, cu atât
este mai mare amplitudinea fenomenului de variaţie somaclonală (variabilitate
genetică generată în timpul culturii de ţesuturi).
Indiferent de metoda de transfer utilizată, frecvenţa de integrare a genelor în
genomul celulei este redusă. Din această cauză, genei „de interes”, îi este asociată o
genă-marker, care permite selecţia celulelor vegetale transformate. Cele mai folosite
gene-marker selectabile conferă rezistenţă la un antiobiotic sau un erbicid. Produsul
unei asemenea gene este de obicei o enzimă, care inactivează o substanţă toxică şi
astfel permite celulelor transformate să supravieţuiască pe un mediu de cultură
adiţionat cu antibioticul sau erbicidul respectiv şi să regenereze.
Alegerea agentului de selecţie în concentraţie şi durată optimă de aplicare
este importantă atât pentru un nivel înalt de selectare a celulelor transformate, cât şi
pentru o regenerare calitativă. Există o varietate mare de gene-marker,
care favorizează optimizarea factorilor cu incidenţă în transformare (Wilminkand şi
Dons, 1993).
Cea mai des utilizată transgenă în calitate de marker de selecţie este gena
neomicin fosfotransferazei aminoglicozidice (3’) de tip II (nptII), derivată de la
transposonul Tn5 al E. coli, care mai este denumită şi gena rezistenţei la
kanamicină.
Această genă conferă rezistenţă faţă de antibioticele aminoglicozide. Gena
nptII poate fi pusă sub controlul elementelor reglatoare de origine bacteriană, astfel
nu va fi expresată în plante sau poate fi controlată de un promotor eucariot care va
determina expresia ei în planta-receptor.
O altă categorie de gene care permit analiza eficienţei transformării genetice
sunt genele raportoare. Expresia acestor gene nu se reflectă asupra metabolismului
sau rezistenţei plantelor transgenice în condiţii normale sau selective. Scopul utilizării
lor constă în identificarea cu uşurinţă a produselor lor de expresie (enzime, care pot fi
detectate cu substraturi cromogene, fluorigene,care emit fotoni sau radioactive)
pentru a concluziona despre prezenţa şi expresia genelor „de interes” .
Domeniul de utilizare a genelor raportoare este mult mai larg decât
transgeneza.
Un aspect al utilizării lor este cel de a analiza expresia temporal-spaţială a
genelor în general, proprie organismului dat, sau a transgenei. În funcţie de scopul
cercetării, secvenţa codificatoare a genelor raportoare pot înlocui anumite secvenţe
în construct. De exemplu, ataşarea genei la regiunea promotor permite de a cerceta
rolul acestuia în expresia genei respective la nivel de transcripţie. Înlocuirea
secvenţei codificatoare a genei „de interes” cu cea a genei raportoare cu păstrarea
regiunilor care codifică secvenţa de la capătul 5` netranslabil al ARNm permite de a
aprecia rolul acestei succesiuni nucleotidice în procesul transportului ARNm din
nucleu în citoplasmă şi iniţierea translării. Prin combinarea secvenţelor codificatoare
ale genei „de interes” şi raportoare se poate determina, în unele cazuri direct,
cantitatea proteinei active în celule, interacţiunea cu alte proteine, polipeptide, acizi
nucleici, membrane etc.
În ultimii ani au fost propuse o serie de gene utilizate în monitorizarea celulelor
vegetale transformate genetic: genele octopinsintetazei – OCS, nopalinsintetazei
– NOS, cloramfenicol acetiltransferazei – CAT, β-galactozidazei – LacZ, β-
glucoronidazei
– GUS, luciferazei – LUC, proteinei fluorescente verzi – GFP (Sambrook şi
Russell, 2001).
Apelarea la genele raportoare este în funcţie de avantajele şi limitările
acestora.
Nu există gene cu utilizare universală, de aceea selectarea unui marker
adecvat se începe cu informaţia cunoscută. De exemplu, metodele enzimatice de
elucidare a activităţii proteinelor raportoare GUS, LUC şi CAT sunt mai sensibile
decât detectarea fluorescentă a GFP, iar stabilitatea înaltă a proteinelor GFP, GUS şi
CAT in vivo nu permite de a elucida pe baza lor modificările rapide în expresia
genelor.
Pentru acest scop este mai eficientă LUC, întrucât timpul de degradare a
proteinei în celulele vii este de 2-3 ore (3вepeвa şi Poмaнoв, 2000).
În primii ani ai practicii de transformare genetică a plantelor, s-a apelat la gena
β-glucoronidazei, însă din cauza intervenţiei distructive a celulelor utilizarea acesteia
în testarea transgenelor este limitată (vezi cap. 4). În calitate de markeri vizuali
alternativi s-a recurs la luceferază şi la genele antocianinelor, în special în
transformarea gramineelor. Dar şi în acest caz, simplitatea în vizualizare la
microscop a acumulărilor de pigmenţi antociani este contrastată de faptul că aceştia
afectează dezvoltarea celulelor transformate. Însă utilizarea pe larg a luciferazei,
care nu manifestă activitate toxică asupra celulelor, este limitată de echipamentul
costisitor pentru vizualizarea produselor reacţiei enzimatice.
Proteinele GFP sunt unele din cele mai recent utilizate în calitate de markeri în
transformarea genetică. Aceştia permit detecţia vizuală nedistructivă a celulelor
transgenice prin microscopie fluorescentă. Sistemul dat este independent de genotip
şi de ţesutul analizat şi prezintă un nivel jos de toxicitate.
Diferite strategii aplicate în scop de selecţie (antibiotice, erbicide, gene
raportoare) vizează asigurarea celulelor cu un component final, esenţial pentru
regenerare.
De exemplu, benziladenina glucoronidul inactiv este convertit în citochinina–
benziadenina activă în celulele care expresează gena gus (Joersbo şi Okkels, 1996).
Un alt sistem este bazat pe expresia unei gene isopentiltransferaza (ipt), care
determină producerea unui precursor al citochininei (Ebinuma şi al., 1997). Această
strategie determină producerea unui fenotip transgenic aberant, însă problema în
cauză a fost înlăturată prin clonarea genei ipt într-un element transpozabil, făcând
posibilă eliminarea genei prin selecţia transgenei.
Ultima verificare a plantelor transgenice în cazul speciilor de interes economic
se face în teste de câmp. Aceste teste au drept scop determinarea stabilităţii
genetice a caracterului transferat şi evaluarea altor însuşiri cu incidenţă asupra
producţiei şi calităţii. Pentru tehnologia de transfer al genelor, cea mai importantă
confirmare a reuşitei transformării constă în acceptarea produselor plantelor astfel
manipulate de către fermieri şi consumatori..
Eficienţa transformării genetice, indiferent de metoda de transfer utilizată, este
extrem de redusă. Doar o parte dintre celule pot integra în genomul său genele
străine, iar dintre acestea doar celulele totipotente regenerează o nouă plantă
transgenică.
Reieşind din aceste considerente, la fiecare etapă a procesului de modificare
genetică sunt necesare sisteme eficiente de selecţie, bazate pe gene-marker şi gene
raportoare.
2.2 Genele-marker şi raportoare utilizate în selecţia PMG

Selecţia celulelor transformate reprezintă o componentă esenţială a unui


protocol de transformare, genele „de interes” fiind cointegrate, în construcţiile
genetice, cu genele-marker. În unele cazuri, genele-marker reprezintă în acelaşi timp
şi gene „de interes” (de exemplu, genele de rezistenţă la erbicide). Frecvenţa de
cotransfer al ambelor tipuri de gene este de 100% în cazul înlănţuirii acestora şi de
50%, în cazul transferului în vectori separaţi. Ca şi genele „de interes”, genele-
marker sunt puse sub controlul promotorilor constitutivi: 35S CaMV, P-nos, P-FMV
etc.
Genele-marker pentru selecţia transgenelor sunt genele de rezistenţă la
antibiotice sau erbicide, care permit creşterea şi dezvoltarea celulelor transformate.
Printre cele mai utilizate gene-marker se numără:
• gena npt II sau neoizolată din transpozonul Tn5 de la E. coli K12. Această
genă codifică neomicinfosfotransferaza II, enzimă implicată în neutralizarea unor
antibiotice aminoglucozidice ca neomicina şi kanamicina. Pentru selecţia PMG se
recomandă concentraţia de 100 mg/l kanamicină;
• gena spt izolată de la transpozonul Tn5 (Genbank: L19385) codifică
streptomicin-fosfotransferaza şi oferă rezistenţă la streptomicină la concentraţia de 1
mg/ml;
• gena npt sau hph (Genbank: VO1499), care codifică enzima
higromicinfosfotransferaza,
izolată de la bacteria E. coli şi oferă rezistenţă la antibioticul aminoglicozidic
higromicina B la concentraţia 50 mg/l;
• Fosfinotricin-acetiltransferaza codificată de gena bar oferă rezistenţă la bialafos
(fosfinotricină sau PPT) (Genbank: A02804). Concentraţia recomandată este
de 50 mg/l PPT.
• gena epsps codifică enzima enolpiruvilşikimat-3-fosfatintaza (EPSPS), ce
conferă rezistenţă la glifosat. Rezistenţa plantelor la acest erbicid este conferită şi de
gena aroA, care codifică o altă enzimă EPSPS (Genbank: X63374). Selecţia in vitro a
celulelor are loc la concentraţia de 0,5 mM glifosat.

Principalele gene-marker folosite în selecţia PMG


Agentul de
selecţie Gena-marker Markerul de selecţie

kanamicină nptII (APH3´II) neomicinfosfotransferaza II


gentamicină aacC3, aacC4 g entamicin-3-N-acetiltransferaza
higromicină hph, hpt (APH4) higromicinfosfotransferaza
metotrexat dhfr dihidrofolatreductaza
spectinomicină aadA aminoglicozidă-3-adeniltransferaza
blasticidină bsr blasticidin S deaminaza
sulfonamidă sul dihidropteratsintaza
fosfinotricină bar fosfinotricinacetiltransferaza
clorsulfuron als, csr-1 acetolactatsintetază
bromoxinil bxn bromoxinilnitrilaza
glifosat gox glifosatoxidaza
2,4-D tfdA 2,4-diclorfenoxiacetat monooxigenaza
ampicilină bla β- lactamaza
Genele raportoare sunt gene care codifică proteine/ enzime detectabile în
celule sau extracte celulare, utilizate ca markeri pentru vizualizarea expresiei spaţiale
a genelor la un spectru larg de procariote şi eucariote.
În calitate de gene raportoare se utilizează:
• gena gus (uidA), care codifică enzima β-glucuronidaza, izolată de la E. coli
K12. Conform datelor lui Jefferson R. A. şi col. (1987), activitatea enzimei, aflată
sub controlul promotorului 35S CaMV, este mai activă în ţesuturile bătrâne
comparativ cu cele tinere. Reacţiile catalizate de enzima GUS sunt;
1. 4-metilumbeliferil-β-D-glucuronida (4-MUG) → 4-metilumbeliferonă
(4-MU) + acid glucuronic;
2. acid 5-brom-4-clor-3-indolil-β-glucuronic (X-gluc) + apă → acid
uronic + 5-bromo-4-cloroindolil → (5-bromo-4-cloro)indigo
• gena luc, care codifică enzima luciferaza şi scindează luciferina ca substrat,
rezultând bioluminescenţă, care poate fi cuantificată. Gena luc a fost izolată de la
o specie de licurici (Photinus pyralis) din America de Nord, fiind exprimată şi în
plante. Enzima are masa moleculară de 61 kDa şi reprezintă un monomer. Reacţiile
de apariţie a luminescenţei, în urma oxidării luciferinei în prezenţa ATP, ionilor de
calciu şi enzimei luciferaza, au loc în două etape:
1. luciferină + ATP → luciferiladenilat + PPi
2. luciferiladenilat + O2 → oxiluciferină + AMP + lumină
• gena gfp pentru proteina cu fluorescenţă verde (Green Fluorescent Protein
GFP) este izolată de la meduza Aequarea victoria. Se evidenţiază în ţesuturi intacte
in vitro şi in vivo în lipsa oricărui substrat datorită prezenţei unui cromofor fluorescent,
care emite luminescenţă verde în urma excitării la lumina albastră sau UV (maximum
de adsorbţie la λ = 395 nm). Poate fi fuzionată cu alte proteine, permiţând
monitorizarea transportului şi metabolismului acestora. Însă gena gfp, ca şi gena luc,
nu se conţine în PMG aprobate pentru agricultura biotehnologică, fiind utilizate doar
pentru atestarea transgenezei organismelor utilizate în cercetările fundamentale.
Pentru viitor, se pune problema eliminării complete a genelor-marker, care
conferă rezistenţă la antibiotice şi erbicide. Eventualele consecinţe negative ale
utilizării acestora asupra sănătăţii omului şi protecţiei mediului ambiant, precum şi
riscul inserţiei lor în genomul bacteriilor patogene au stimulat dezvoltarea unor
strategii noi de selecţie, bazate pe procese metabolice celulare endogene – selecţia
pozitivă.
Cel mai frecvent utilizat sistem de selecţie pozitivă la cereale include
genamarker, care codifică enzima fosfomanoz-izomeraza (man A sau pmi) şi
manoza în calitate de factor de selecţie. Celule transformate genetic posedă
abilitatea de a izomeriza manoza-6-fosfat în fructozo-6-fosfat, care poate fi imediat
încorporată în căile metabolice, în timp ce cele non-transgenice acumulează niveluri
citotoxice ale manoza-6-fosfat, inducându-se astfel încetinirea creşterii şi în final
moartea celulelor.
Plantele modificate genetic sint create prin utilizarea tehnicilor ingineriei
genetice. In ultimii ani, alaturi de metodele clasice de incrucisare a soiurilor sau de
utilizare a ingrasamintelor, au aparut metode noi, care presupun folosirea unor
tehnici specifice ingineriei genetice. Toate aceste plante nou create de catre om nu
exista in natura, iar impactul lor asupra mediului si asupra fiintei umane nu este pe
deplin cunoscut si scapa cu totul sferei de control a „specialistilor“.

Prin tehnicile de inginerie genetica, materialul genetic „de interes“ este


transferat de la organismul donor la cel acceptor, in scopul obtinerii de organisme cu
caracteristici noi, utile.

Aceste tehnici sunt:

• tehnici de recombinare a acizilor nucleici, care implica formarea de noi combinatii


ale materialului genetic, prin insertia moleculelor de acizi nucleici (obtinute prin
diferite tehnici in afara unui organism) intr-un virus, o bacterie sau alt sistem vector si
incorporarea acestora intr-un organism gazda, in care nu exista in mod normal, dar
care este capabil sa continue propagarea;

• tehnici care implica introducerea directa intr-un microorganism a materialului


ereditar preparat in afara microorganismului;

• tehnici de fuziune celulara sau tehnici de hibridizare, in care celulele vii cu noi
combinatii de material genetic ereditar sunt formate prin fuziunea a doua sau mai
multe celule, prin metode care nu au loc in mod natural.

Pentru obtinerea unei plante transgenice este necesara urmatoarea succesiune


de operatii:

 Transferul genei de interes in celulele gazda;


 Selectarea celulelor gazda care au integrat, in mod real, transgena in genomul lor;
 Regenerarea de plante intregi pornind de la plantulele obtinute prin cultivarea in
vitro a celulelor gazda;
 Cultura plantelor transgenice in medii protejate (sere, camere climatizate);
 Cultura experimentala, in aer liber, a acestor noi plante.

Transferul genei de interes

Introducerea unei gene straine in genomul unei celule vegetale poate fi


realizata fie indirect (prin folosirea unui vector biologic), fie direct (prin metode fizico-
chimice). Datorita totipotentei celulelor vegetale, pot fi folosite ca si celule gazda
oricare dintre celulele somatice care, puse in conditii adecvate si prin tratamente
speciale, ele pot da nastere unei noi plante.

Obtinerea unei plante transgenice

 Transferul indirect.

Se cunoaste faptul ca bacteria Agrobacterium tumefaciens se gaseste si in sol


si poate patrunde in radacinile plantelor prin intermediul unor mice rani. La speciile
sensibile poate provoca o proliferare exagerata a celulelor si aparitia unor tumori,
situate mai ales la nivelul coletului. Aceasta proliferare este data de patrunderea
plasmidului bacterian (Ti= tumor inducing) si insertiei ADN-ului plasmidial ancogen in
genomul vegetal. Inlocuind gena oncogena printr-o gena straina (gena bacteriana ce
codifica rezistenta la un antibiotic), echipa Profesorului M.Van Montagu
(Universitatea din Gand Belgia) a obtinut astfel de bacterii transgenice lipsite de
puterea oncogena, dar capabile totusi de introducerea ADN-ului lor plasmidial in
genomul vegetal.

Realizand o cultura mixta de bacterii transgenice si celule de tutun, cercetatorii


belgieni obtinusera, in 1983, prima planta transgenica: un tutun rezistent la
ampicilina. Chiar lipsit fiind de interes agricol, acest tutun obtinut a confirmat
validitatea transgenezei, via Agrobacterium tumefaciens, si a facut din echipa
belgiana liderul incontestabil al plantelor transgenetice in Europa.

Transferul direct

Deoarece transferul indirect nu reuseste decat rareori la monocotiledonate


(insensibile la injectia cu Agrobacterium) si procesul este asemanator si in cazul soiei
(la care Rhizobium produce cunoscutele nodozitati pe radacini), cercetatorii au fost
nevoiti sa apeleze si la metode directe pentru transferul genelor de interes. Spre
exemplu, pentru porumb, matoda cea mai utilizata este cea de tip biolistic: microbile
de tungsten, de aur sau de platina invelite cu genele de interes sunt proiectate spre
celulele gazda cu ajutorul unor „tunuri de gene” microproiectilele trebuie sa fie
suficient de mici pentru a nu distruge definitiv celula gazda, dar, in acelasi timp, cu
suficiena energie cinetica spre a traversa peretii celulelor si membranelor
citoplasmatice.

Tehnicile actuale nu permit inca un control exact al localizarii fixarii


transgenelor in genomul celulei gazda. Insertia unei gene straine ar putea sa
intrerupa secventele unei gene endogene, sa perturbe expresia altor gene endogene
si, astfel, sa provoace modificari metabolice si efecte secundare nedorite.

Selectarea celulelor gazda purtatoare ale genei de interes

Oricare ar fi metoda de transfer, rata reusitei este intotdeauna foarte mica, de


aceea este necesara asocierea la gena de interes si a unei gene marker (care
codifica rezistenta la un antibiotic sau ierbicid), care favorizeaza selectarea
celulelorin care s-a integrat transgena.

Regenerarea plantelor transgenice si cultura in spatii protejate

Plantele transgenice trebuiesc trecute din cultura in vivo in sere sau in camere
climatizate. Acest procedeu trebuie repetat de-a lungul mai multor generatii pentru a
se controla expresia noului caracter(o gena poate fi prezenta in genomul unui
organism fara insa a se exprima fenotipic), transmiterea sa ereditara si absenta
efectelor nedorite.
Cultura experimentala in aer liber(in camp)

Scopul principal al acestei culturi (realizate pe parcele de dimensiuni mici)


este acela al testarii comportamentului noii plante transgenice la cultura in conditii
naturale. Apoin, un alt scop este cel al incrucisarii plantei transgenice cu varietatea
sau soiul conventional de tip elita, pentru obtinerea de organisme modificate genetic
cu un randament productiv cat mai apropiat de varietatile conventionale
corespunzatoare. Dar, aceste operatii de incrucisari-selectionari pot dura mai multi
ani, motiv pentru care anumiti producatori de seminte Omg stabilesc culturi
experimentale in ambele emisfere, beneficiind astfel de doua oerioade de vegetatie
pe an. Teoretic, aceste culturi experimentale ar trebui sa evalueze si impactul OMG-
urilor asupra mediului inconjurator si asupra sanatatii oamenilor.

Entuziasmul suscitat de aplicatiile potentiale ale transgenezei vegetale era


extraordinar printre pionierii noii biotehnologii. Van Mellaert (1999, Universitatea din
Gand, Belgia), spunea: „ …traiam intr-un fel de vis. Eram convinsi ca biotehnologiile
umane aveau sa schimbe totul si ca ele vor constitui solutia tuturor problemelor. Noi
traiam intr-o faza de exaltare, aveam intr-adevar dorinta de a porni masina si de a
gasi finantarea pentru ca aceasta sa mearga”.

Visurile cele mai nebune obsedau spiritele anumitor cercetatori: tehnicile


transgenezei urmau sa permita crearea de plante care necesita mai putine
ingrasaminte azotate gratie transferului genelor Nif (prezente doar la unele
eucariote); prin aceste tehnici se vor putea crea plante rezistente la conditiile de stres
ambiental (aciditatea sau salinitatea solurilor, inghetul, seceta etc.) si care limiteaza
dezvoltarea agiculturii in anumite regiuni ale globului; tot prin aceste tehnici se vor
putea obtine plante rezistente la boli si la insectele daunatoare, plante mai usor de
prelucrat pe cale industriala etc.

Printre proprietatile noi ale plantelor testate in culturi experimentale


precedand primele culturi comerciale, putem aminti:

 rezistenta la ierbicide(reprezentand mai mult de jumatate dintre incercari);


 rezistenta la boli (mai ales la cele virale);
 rezistenta la insectele daunatoare;
 testele de calitate si sterilitate barbateasca (in scopul crearii de hibrizi).

Rezistenta la ierbicide

Acest caracter nou este dat de transferul genei Bar si, sub aspect biologic, cu
totul surprinzator, este dat de diversele tipuri de actiuni enzimatice (enzime codificate
de transgene de origine bacteriana si, in cateva cazuri de origine vegetala):
transformarea ierbicidului intr-un compus netoxic, usoara modificare a enzime vizate
sau supraexprimarea sintezei sale, in asa fel incat planta tratata sa dispuna in orice
moment de cantitati suficiente de enzime pentru a se dezvolta normal. Rzistenta unei
plante de OMG este unispecifica, adica ea nu se manifesta decat fata de ierbicidul
produs de intreprinderea producatoare de seminte transgenice.
Rezistenta la insecte daunatoare

Plantele care poseda aceasta proprietate sintetizeaza in permanenta, in


tesutul lor, o proteina insecticida care duce la moartea unor insecte fitofage
daunatoare. Gena care codifica rezistenta la insecte provine de la o bacterie din sol
Bacillus thuringiensis (Bt), cunoscuta pentru proprietatile insecticide si folosita in
lupta biologica (integrata) din agricultura conventionala, precum si in silvicultura
(impotriva omizilor defoliatoare). Preparatele obtinute din susele naturale de Bt,
contin gena insecticida, asa cum se prezinta ea in bacterie, adica inactiva. Numai
dupa ingestia sa si contactul cu sucurile digestive ale daunatorului, ea este activata
si provoaca moartea intr-un timp mai lung sau mai scurt.

In natura au fost identificate peste 100 de suse care se disting prin puterea lor
insecticida si prin relativa lor selectivitate. Tocmai aceasta biodiversitate a fost
vlorificata pentru crearea de organisme modificate genetic rezistente la diverse grupe
de daunatori, in special lepidoptere si coleoptere. Dar, inainte de transgeneza, ea a
fost modificata in asa fel incat sa codifice proteina activa, ceea ce face ca
organismele modificate genetic sa contina o toxina mult mai rapida si eficace, chiar
inaintea ajungerii ei in tubul digestiv al insectei.

Rezistenta la boli

Prin transferul genei care codifica proteina capsidei virale (gena cp.- coat
protein) s-au obtinut plante care rezista la bolile generate de anumite virusuri,
deoarece ea blocheaza propagarea virusurilor in planta transgenica. Se stie ca
sinteza de catre planta a unor mici cantitati din aceasta proteina impiedica
dezvoltarea virusurilor si, astfel, declansarea bolilor virale (virozelor).

O serie de alte realizari privesc rezistenta la atacul ciupercilor fitopatogene, in


esenta, prin insertia in plante a genelor care codifica enzime capabile sa distruga
peretii ciupercilor (distrugand chitinele, glucosidele etc.

Rezistenta la inghet

Chiar daca organismele modificate genetic rezistente la inghet nu se cultiva pe


scara larga vom mentiona doua dintre strategiile utilizate pentru a le oferi aceasta
proprietate.

Tratamentul culturilor de soiuri conventionale (mai ales a capsunilor), prin


pulvarizarea cu bacterii transgenice „antigel”, pentru protejarea acestora de
ingheturile tarzii.

Insertia unor gene provenind de la pestii din apele reci, spre exemplu o gena
de la Hippoglossus hippoglossus (peste pleuronectid din Marea Nordului) transferata
la capsuni.
2.3 Biotestul fenotipic al PMG

Prezenţa unor transgene introduse în genomul plantei poate fi atestată la


diferite faze de dezvoltare prin utilizarea biotestelor aplicate atât în condiţii in vitro,
cât şi in vivo.
Vizualizarea fenotipică a expresiei genelor-marker, care conferă rezistenţă
faţă de erbicide (de exemplu, Basta, Roundup) sau antibiotice (kanamicina,
neomicina etc.), precum şi a celor raportoare, prin monitorizarea produselor reacţiei
enzimatice cu substratul specific (testul GUS şi GFP), reprezintă metode preliminare
de screening al PMG.
Testul aplicat plantelor cultivate in vitro se bazează pe creşterea şi
dezvoltarea materialului vegetal modificat genetic (seminţe, explante de frunze, calus
etc.) pe medii nutritive universale sau speciale, suplimentate cu factorul de selecţie
(erbicid, antibiotic etc.). În calitate de criteriu de apreciere a prezenţei transgenelor
servesc plantele dezvoltate normal, datorită toleranţei faţă de agentul de selecţie.
Aplicarea testului de expresie fenotipică a alogenelor, la care se poate apela
cu uşurinţă în lipsa unui echipament şi a reagenţilor speciali sau în cazul în care
activitatea alogenei se manifestă la o anumită etapă de dezvoltare, reprezintă
selectarea plantelor cultivate in vivo tratate exogen cu factorul de selecţie prin
stropire foliară.
În acest caz, plantele susceptibile vor manifesta simptome de cloroză sau
necroză.
Spre exemplu, prezenţa genei marker nptII este confirmată prin imersarea
frunzelor în soluţii cu kanamicină, vizualizând procesul de depigmentare a frunzelor.
Pentru selectarea seminţelor transgenice se recomandă germinarea lor în prezenţa
concentraţiei 100 mg/l kanamicină, analiza rezultatelor fiind efectuată după 1-2 zile,
în baza numărului de seminţe germinate ale PMG faţă de control.
De asemenea, monitorizarea produselor de reacţie se bazează şi pe
identificarea transgenei green fluorescent protein (GFP), care pentru prima dată a
fost aplicată în practică la nematoda Caenorhabditis elegans pentru studiul expresiei
genelor in vivo (Tsien, 1998). Includerea şi expresia genei gfp s-a realizat la conifere,
citruşi, Arabidopsis, tutun, grâu, porumb şi sfecla de zahăr. Aceste proteine globulare
compacte (se cunosc circa 20 tipuri de GFP cu masa moleculară aproximativă de 27
kDa) servesc drept markeri fluorescenţi ai expresiei genelor în celulele
intacte, în organismele animale si vegetale.
Identificarea GFP se bazează pe prezenţa unui cromofor fluorescent ,
format ca rezultat al modificării prin ciclizarea a trei aminoacizi (Ser-Tyr-Gly) din
poziţiile 65 - 67 ale polipeptidului nativ, care emite luminescenţă verde (maximum
de absorbţie la 509 nm) în urma excitării la lumina albastră sau UV cu maximum de
absorbţie la 395 nm .
Astfel, utilizarea testelor de selecţie bazate pe evidenţierea unui marker
genetic, respectiv a unei proprietăţi de care este responsabilă gena străină în planta-
gazdă, prezintă una din primele etape în detecţia PMG, care permite stabilirea
prezenţei caracterelor ce conferă toleranţă la erbicide.
BIBLIOGRAFIE

1. BADEA E.M., SĂNDULESCU D.- Biotehnologii vegetale, Bucureşti, 2001

2. MIHAELA CORNEANU,GABRIEL CORNEANU- Genetica generala si evolutia


genomului, Ed Universitaria.

3. I. ANGHEL,AURELIA BREZEANU,N. TOMA- Ultra-structura celulei


vegetale,Ed. Academiei Republicii Socialiste Romania 1981.

4. www.regie.ro , www.referate.ro , www.scribd.ro .