Enzimología

Guía Nº2: Cinética enzimática

Desarrollar los ejercicios propuestos en hoja de cálculo. La validación de las respuestas para
cada problema se lo realizará mediante un gráfico en el que se confronte los valores de
velocidad obtenidos por el modelo, versus los valores obtenidos de los datos
experimentales.

La fecha de entrega será el día de la cátedra 2.

1. La siguiente enzima E cataliza la reacción S  P inhibida por I. Determine la expresión

cinética a partir de la siguiente tabla de valores:

Velocidad mmol / L h
S mM I=0 I = 100 mM I = 500 mM I = 1000 mM
0,01 0,05 0,04 0,023 0,02
0,5 0,95 0,18 0,12 0,11
1 1,8 0,36 0,23 0,22
5 6,7 1,7 1,1 1,03
10 10 3,1 2,1 1,96
50 16,7 9,5 7,4 7,04

2. Se desea determinar el tipo de inhibición y el valor de las constantes cinéticas de una

enzima que es inhibida por un agente externo y presenta los siguientes resultados de
velocidad de reacción:

V (mM/min)
S (mM) I = 0 mM I = 40 mM I = 150 mM I = 300 mM I = 800 mM
10 1,11 0,81 0,64 0,57 0,52
20 1,52 1,27 1,12 1 0,91
40 2,31 1,96 1,61 1,55 1,37
60 2,75 2,41 2 1,97 1,86
80 2,8 2,48 2,21 2,05 2,06
100 2,92 2,72 2,52 2,44 2,33
160 3,11 2,96 2,82 2,62 2,67
220 3,22 3,11 2,96 2,94 2,87

3. Se está intentando producir asparagina con la enzima asparagina sintetasa que cataliza la
reacción

ATP  AMP  PPi

aspartato  NH 3    asparagina
Enzimología
Guía Nº2: Cinética enzimática

Los siguientes resultados de velocidad inicial de reacción (mM asparagina / min) han sido
obtenidos con un preparado de asparagina sintetasa de 50 mg/L

Aspartato (mM) \ NH3 10 20 30 40

(mM)
10 71,4 125 166,7 200
20 111,1 181,8 230,8 266,7
30 136,4 214,3 264,7 300
40 153,8 235,3 285,7 320

Encuentre el mecanismo y la expresión cinética correspondiente y evalúe los parámetros

cinéticos.

4. Se sospecha que una enzima posee una inhibición competitiva parcial por sustrato.
Desarrolle una expresión para evaluar el comportamiento de la enzima. Explique cómo se
debiese llevar a cabo la etapa experimental para obtener los parámetros cinéticos del
modelo. Determine la expresión para el grado de inhibición de la enzima.

5. Se desea determinar el tipo de inhibición y el valor de las constantes cinéticas de la enzima

aminoacilasa. La reacción catalizada corresponde a: acetiltreoninatreonina + acetato.
Experimentalmente los resultados de velocidad de reacción son los siguientes, utilizando un
inhibidor externo a la reacción:

V(mmol/h )
Inhibidor
S (mM) 2 mM 4 mM 8 mM
0,3 1,20 0,94 0,65
0,5 1,85 1,47 1,043
1,0 3,13 2,56 1,89
1,8 4,50 3,83 2,96
2,7 5,51 4,82 3,86
4,6 6,77 6,13 5,17
6,1 7,35 6,78 5,87
7,6 7,77 7,24 6,39
Enzimología
Guía Nº2: Cinética enzimática

6. Determine el valor de las constantes cinéticas (Vm y Km) de la enzima lactasa de Aspergillus
niger si la velocidad de reacción obtenida a distintas concentraciones de sustrato
corresponde a :

S (mM) 0,1 0,2 0,4 0,8 1,6 2,0 2,2 3

v ( mM/min ) 0,28 0,45 0,66 0,85 0,99 1,03 1,04 1,08

7. Derive una expresión compacta para la velocidad de síntesis de un compuesto B de

acuerdo al modelo de reacción que se indica. Se sabe que el compuesto C es un inhibidor
competitivo total de la enzima. Utilice la hipótesis de estado estacionario.

A 
E
B 
E
C
Enzimología
Guía Nº2: Cinética enzimática

8. Se desea determinar el tipo de inhibición y el valor de las constantes cinéticas de la enzima

aminoacilasa. La reacción catalizada corresponde a: acetiltreoninatreonina + acetato.

Experimentalmente los resultados de velocidad de reacción son los siguientes, utilizando un

inhibidor externo a la reacción:

v (mmol/h )
Inhibidor
S (mM) 2 mM 4 mM 8 mM
0,3 1,20 0,94 0,65
0,5 1,85 1,47 1,043
1,0 3,13 2,56 1,89
1,8 4,50 3,83 2,96
2,7 5,51 4,82 3,86
4,6 6,77 6,13 5,17
6,1 7,35 6,78 5,87
7,6 7,77 7,24 6,39

9. La enzima fenilalanina amoniaco liasa (EC 4.3.1.5) de Rhodotorula glutinis cataliza la

conversión de Fenilalanina (X) en ácido trans-cinámico (Y) y amoniaco (Z) donde Y es un
inhibidor competitivo y Z un inhibidor parcial no competitivo.
Desarrollar una expresión cinética paramétrica para esta reacción y evaluar los parámetros
cinéticos aparentes en términos de la correspondiente constante e inhibición de Michaelis

Resp.

10 La nucleosidasa de inosina (EC 3.2.2.2) cataliza la hidrólisis del monofosfato de inosina (IMP) a
hipoxantina (Hx) y ribosa fosfato (R5Pi). Una preparación enzimática de Azotobacter vinelandil ha
Enzimología
Guía Nº2: Cinética enzimática

mostrado una inhibición no competitiva parcial por adenina (A). Los siguientes resultados para la
velocidad inicial de hidrólisis de IMP se han obtenido sin la adición de adenina.

(mM) v(µmoles Hx *
0.23 40
0.5 75
1 120
1.33 141
1.73 161
2.1 175

La velocidad máxima aparente de reacción a una concentración saturante de adenina se reduce en 70%. A una
concentración de adenina de 35mM, es de 125µmol* .
Determinar los valores de los parámetros cinéticos de la enzima y la expresión de la velocidad cinética
para la hidrólisis de IMP.

Resp.

KINC = 7 mM

11 Un Pseudomonas sp. Recombinante, cefalosporina C acilasa (CCA) expresada en Escherichia coli se

evaluó en la hidrólisis de la cefalosporina C (CC) en ácido 7-aminocefalosporánico (7ACA) y ácido
glutárico (GA). Se ha afirmado que 7ACA es un inhibidor competitivo de cefalosporina C acilasa de
Pseudomonas diminuta.
Recientemente se ha aislado y purificado una CCA de una bacteria desconocida del suelo y se han
obtenido los siguientes resultados a CC saturante y con concentraciones iniciales de 7ACA variables.

0 1 2 5 10 20 30 40
10 9.808 9.630 9.167 8.571 7.778 7.273 6.923

V= Tasa inicial de hidrólisis CC a concentración saturante de CC.

Determine el mecanismo de inhibición ejercido por 7ACA en CAA y evalúe sus parámetros cinéticos.
Deje de lado la eventual inhibición por GA.

Resp. La inhibición es parcial:

Vmax’/Vmax = 0.5
Enzimología
Guía Nº2: Cinética enzimática

12 La enzima aminoácido éster hidrolasa (EC 3.1.1.43) cataliza la hidrolisis de cefalosporina C(CC) en
ácido 7-aminocefalosporánico (7ACA) y ácido α-amonoadípico (AA) . Una cierta aminoácido éster
hidrolasa se somete a inhibición parcial de tipo mixto por AA pero no es inhibido por 7ACA. Los
siguientes resultados se han obtenido con una preparación de dicha enzima a concentraciones muy
altas de AA

CC(mM) 200 300 400 500 600

1.3 1.7 2.0 2.2 2.4
V= Tasa inicial de síntesis de 7ACA

Determine el valor de la velocidad máxima de formación de 7ACA a partir el complejo ternario de la

enzima CC-AA y la constante de disociación del complejo terciario en el complejo secundario de la
enzima-AA y CC

Resp La tasa máxima de formación de 7ACA a partir del complejo terciario de la enzima CC-AA es 4,16
; la constante de disociación de la enzima CC-AA del complejo terciario
en un complejo secundario de enzima AA y CC es 438.7 mM.

13 Los siguientes resultados han sido obtenidos en la síntesis de oleato de ascorbilo (ácido ascórbico +
ácido oleico→ oleato de ascorbilo + agua) con una lipasa de Candida rugosa (EC 3.1.1.3) inmovilizado
en nanopartículas magnéticas ƴ-Fe2O3

0.5 2.432 5.562 9.742 12.997 15.605

1 3.626 7.961 13.234 16.984 19.788
1.5 4.336 9.298 15.031 18.919 21.73
3 5.392 11.175 17.391 21.351 24.093
6 6.139 12.429 18.873 22.817 25.479
V=velocidad de reacción inicial de la síntesis de oleato de ascorbilo
Concentración de ácido oleico (mM)
Concentración de ácido ascórbico (mM)

Identificar el mecanismo de reacción, determinar los valores de los parámetros cinéticos correspondientes y
discutir la precisión de los valores informados
Enzimología
Guía Nº2: Cinética enzimática

Resp El mecanismo de síntesis del oleato de ascorbilo con lipasa de C. rugosa es un secuencial ordenando, con la
unión del ácido ascórbico al sitio activo de la enzima en primer lugar, seguido del ácido oleico.

Los parámetros cinéticos son los siguientes

Los valores de las constantes de disociación están dentro del rango de las concentraciones de sustrato
correspondientes, por lo que los resultados pueden considerarse precisos. Sin embargo, se recomiendan más
puntos de datos.
Las nanopartículas están esencialmente libres de limitaciones de transferencia de masa, por lo que los parámetros
obtenidos pueden considerarse intrínsecos.