Lp 1: Metode de recoltare a sângelui

1. Obținerea sângelui pentru imunofenotipari:

tehnica de studiere a celulelor pe baza interacțiunii acestora cu diferiți Ac, direcționați imptriva unor
proteine aflate pe suprafața sau in interiorul celulelor.
se recoltează 2-3 ml de sange venos periferic, intr-o eprubeta sterila sau vacutainer cu K3 EDTA - rol
anticoagulant.
se prelucrează la maxim 6 h de la recoltare.
se pastreaza la 20-25 grade
contrar proba se înregistrează, nu se prelucrează.

2. Obținerea sângelui pt determinarea activității funcționale a limfocitelor, monocitelor si

granulocitelor:
se recoltează 2-3 ml de sange venos periferic intr-o eprubeta sterila sau vacutainer cu heparina;
se prelucrează proba la maxim 4h de la recoltare;
se pastreaza la 20-25 grade;
contrar nu se prelucrează proba;

3. Obținerea sângelui pt tipizarea HLA

HLA- molecule situate pe suprafața celulelor care dau produsul de compatibilitate intre indivizi in cazul
unor transplante de celule, țesuturi sau organe;
se recoltează 2-3 ml de sange venos periferic, într-un vacutainer cu heparina;
se prelucrează proba la maxim 4h de la recoltare;
se pastreaza la 20-25 grade;
contrar nu se prelucrează proba;

4. Obținerea serului:
se recoltează 8-10 ml de sange intr-o eprubeta sau vacutainer;
se introduce proba la 37 grade, 15 minute pana la coagulare completa;
se decantează serul intr-o alta eprubeta si se centrifugheaza 5 minute la 3000 rotații/min pt obținerea
serului;

5. Obținerea plasmei:
se recoltează sange pe Na2EDTA.
metoda de obținere ca la ser.

Reactii imunochimice: produse biologice (Ac, Ag, hematii) utilizate pentru determinări calitative si/sau
cantitative de Ag sau Ac.
Complementul (C): sistem enzimatic multifuncțional alcătuit din proteine si glicoproteine plasmatice cu
rol esențial de apărare a organismului.
Reactii de precipitare: poate avea loc in mediul lichid sau solid.
Lp 2: Difuziile in gel
IDRS: imuno-difuzia-radială-simplă
DD: dubla-difuzie
Clasificare:
simple
duble
combinate cu migrare in câmpul electric;
Clasificare 2 categorii:
naturale: simple/duble;
combinate cu migrare in câmp:
contra-imuno-electro-foreaza- CIEF
imuno-electro-forează - IEF
imuno-fixarea - IF
Aceste reactii folosesc geluri de agar si/sau agatoga in concentrație de 0,8-1,6 g%, conținut mare de apa.
Tehnicile de difuzie in gel au nivele de sensibilitate diferite, acest lucru e important pr a putea stabili tipul
de tehnica utilizată conform planului clinic.
IEF si DD - folosită pt determinarea nr de constituenți;
IDRS - folosit pentru determinarea cantitativa;
IEF, DD, CIEF - folosită pentru identificare Ag sau Ac.

IMUNODIFUZIA RADIALĂ SIMPLA -MANCINI :

• Se presupune difuzie unui reactant lichid intr-un gel in care e înglobat celalalt reactant;
• Diamensiunea haloului de precipitare e d.p. cu concentrația antigenului care difuzează si i.p. cu
concentrația Ac si înălțimea stratului de gel in care aceștia sunt înglobați.
• Cantitatea de antigen introdusă in godeuri nu trebuie sa depășească capacitatea de reglare a Ac înglobat.
• Timpul necesar obținerii unei difuzii totale sau complete depinde de: temp. la care are loc reactia, de
greutatea moleculara si concentrația Ag.
Aplicatii pentru determinarea cantitativa ale:
IgG, A, M
proteina C reactiva (CRP)
alfa1 antitripsină
complementul C3
Echipament: micropipeta, incubator, centrifugă. Protocol de lucru:
Inainte de a fi utilizate plăcile sunt menținute 30 min la temperatura camerei.
pt determinarea proteinelor enumerate sau altele atat serul uman de referință (SUR) cat si probele de
analizat se introduc in godeurile imunoplacilor si se întinează la 37grade.
dupa un timp de incubare (diferă in functie de tipul imunoplacii) cu o rigla gradată transparentă se citeste
diametrul inelelor obținute in mm si cantitatea din tabelul furnizat in instrucțiunile de lucru.
in cazul in care serul pt uman de referință nu se obtine val corespunzătoare cu valorile proteinelor
urmărite, atunci se poate face o corecție daca diametrul se încadrează intr-o val de toleranta astfel:
+/- 0,3 mm pt Ig, C3, alfa1 antitripsina;
+/- 0,5 mm pt CRP;
Determinările cantitative IgM,G,A - diagnosticarea de laborator a unor boli autoimune, infecțioase.
Determinarea complementului C3- diagnostic pt boli autoimune, renale, hepatice, infecțioase si
neoplazice.
Determinarea CRP- nu se detectează la individul sanatos, prezenta ei indica un proces inflamator.
Determinarea alfa1 antitripsina:
nivele crescute: Infecții bacteriene, poliartrita, reumatoidă, neoplazii
nivele scăzute: af pulmonare, ciroza hepatica.
Lp3: DUBLA DIFUZIE OUCHTERLONY
Foloseste 4-6 godeuri dispuse in jurul unui godeu central.
Liniile de precipitare se formează la distante constante pt fiecare sistem Ag, Ac.
Sunt 3 tipuri de reactii:
reactii de identitate completa sau de fuziunea completa a liniilor:
⁃ Cei 2 Ag sunt complet identici;
⁃ Serul conține Ac specifici fata de Ag;
⁃ Liniile de precipitare deviază si fuzionează complet.
reactii de neidentitate sau de absenta a deviaților liniilor:
⁃ serul conține Ac diferit fata de cele 2 Ag neînrudite;
⁃ Liniile de precipitare se intersectează;
reactii de identitate parțiala sau de fuzionare parțiala a liniilor:
⁃ cele 2 Ag au nr de grupări determinante comune dar si unele distincte.
⁃ Serul are Ac atat fata de determinarea Ag comun cat si fata de cei distincți;
⁃ Rezulta o linie curba de precipitare prin fuzionarea parțiala a celor 2 linii si are un mic pinten.

Lp4: Reactii de aglutinare

Aglutinarea = agregarea de particule prin Ac.
Ac reactioneaza cu Ag de la suprafața unor particule si det aglutinarea acestora.
Ag = natural sau fixat artificial datorita faptului ca reactia Ac-Ag, la care participa Ag de grup sanguin si
Ac lor specific, este una de aglutinare.
aglutinarea depinde de:
valența Ac ( Ac din clasa IgM sunt mai aflutinati decat IgG);
densitatea determinărilor antigenici de la suprafața particulei;
forta ionica a mediului in care are loc reactia.
caracteristici:
sensibilitate mai mare decat reactia de precipitare a Ag, fiind o particula si nu o molecula solubilă;
excesul de Ag nu inhiba reactia;
concentrația mare de Ac pot inhiba reactia.
sunt 5 reactii de aglutinare:
directa;
indirecta;
de inhibare a aglutinarii;
mediata de Ac antiimunoglobulinei
la rece: 4 grade.

AGLUTINAREA DIRECTA:
calitativa: efectuată pe lama si evidențiază prezenta Ac in serul pac., însă nu si cantitatea acestora.
R. Hudelson:
⁃ folosită pentru serodiagnosticul Brucelozei.
⁃ Serodiagnosticarea: tehnica de laborator unde se indentifica in serul pacientului Ac specifici fata de un
agent patogen.
⁃ Bruceloză: boala infecțioasă, grava produsă de o forma de bacterii Brucelle.
R. Kudicke-Steuer:
⁃ folosită pentru serodiagnosticarea Tifosului (boala contagioasa data de nickettsii - microbii ce fac trecerea
de la bacterii la virusuri si au caractere comune ale ambelor grupe)

cantitativa: in tuburi, pt determinări cantitative ale Ac din serul pacientului.

R. Widal: serodiagnosticarea febrelor: tifoida si paratifoide (boli infecțioase date de Salmonela Tifi
si paraziți);
R. Wright- diagnosticarea Brucelozei.
Lp5: Grupele de sange:
Ag- aglutinogen (A, B)
Ac- aglutinine ( alfa, beta)
grupa 0: pe suprafața eritrocitelor nu este prezent niciun Ag, exista in plasma ambele Ac.
grupa A: pe suprafata eritrocitelor este prezent AgA, iar in plasma avem Ac beta;
grupa B: pe suprafata eritrocitelor este AgB, iar in plasma avem Ac alfa;
grupa AB: pe suprafata eritrocitelor avem ambele Ag, in plasma nu exista niciun Ac.

Metode de obținere:

Beth Vincent: det. Ag necunoscut cu Ac cunoscut;

• Reactivi: serul hemotest - ser 10 pacienti cu grupa de sange cunoscuta
• Tehnica: se pune o picătura de sange/ser hemotest, cu ajutorul unui colt al unei lame se Adaugă o mica
cantitate de sange pe fiecare picătura de ser si se omogenizează.
• Citirea: se face cu ochiul liber dupa 2-3 minute.
• Daca amestecul este uniform, colorat in roz, nu are loc aglutinarea (avem grupa 0)
• Daca apare aglutinarea la 0 si B si lipsa la A (grupa A)
• Daca apare aglutinarea la 0 si A si lipsa la B (grupa B)
• Daca apare aglutinare la toate ( grupa AB)

Simonim: cunoastem Ag, nu cunoastem Ac. Se pune in contact ser cu eritrocite cunoscute.
• tehnica: pe o lama se pun 3 picaturi din ser, pe prima se pun eritrocite 0, mijloc - A si a3a- B. Si se
amesteca cu coletul unei lame.
• Citirea: cu ochiul liber dupa 2-3 minute.
• Daca are loc aglutinarea cu eritrocite A si B, serul conține Ac alfa si beta = grupa 0;
• Daca are loc agl cu eritrocite B, serul conține Ac beta = grupa A;
• Daca are loc agl cu eritrocite A, serul conține Ac alfa = grupa B;
• Daca nu are loc agl, serul nu conține Ac = grupa AB.

Lp 6: Tehnica Elisa
este bazată pe reactia Ac-Ag, folosită pentru a evidenția Ac sau Ag in unele boli infecțioase, endocrinol .
acestea sunt: indirecte si competitive;
testele folosesc Ag atașate de o faza solida ce poate fi o placa de microfiltrare.
daca Ac e prezent in proba, se va lega de Ag de pe faza solida, iar constituenți rămași nelegați sunt
îndepărtați in etapa de spălare.
se adaugă conjugatul care se va lega de Ac, daca acesta a fost prezent in proba.
excesul de conjugat e îndepărtat printr-o etapa de spălare.
conjugatele folosite: Ac cuplați sau conjugați cu o enzima si sunt direcționați impotriva unui Ac uman in
teste indirecte sau impotriva Ag de pe suport solid in testele competitive.

testul elisa indirect:

serul pacientului se adauga la faza solida, care conține Ag si e incubat un timp la o anumită temperatura;
reactia e atat mai intens colorata cu cat concentrația Ac din proba e mai mare.
testul elisa competitiv:
Ac din proba, competitioneaza cu conjugatul (Ac) pt sinusurile de pe Ag legat de faza solida;
atat proba care conține Ac cat si conjugatul, se adauga concomitent la faza solida care cont Ag.