GRUPO A [FUENTE DE SUSTRATO SACAROSA]

SACAROSA
N° ABS 540 nm
(2g/l)
1 4 0.804
2 3.5 0.659
3 3 0.594
4 2.5 0.509
5 2 0.322
6 1.5 0.253
7 1 0.168
8 0 0
TABLA Nº 01- CURVA DE CALIBRADO DNS

DNS y = 0.2029x - 0.0302

R² = 0.9876
0.9
0.8
0.7
0.6
ABSORBANCIA

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
-0.1 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
CONCENTRACION

GRAFICA Nº 01: CURVA DE CALIBRADO DEL DNS

Abs 640nm X (g/L)

0 0.000
0.081 0.053
0.143 0.094
0.222 0.147
0.439 0.290
0.579 0.382
0.829 0.547
0.957 0.632
TABLA Nº 02- CURVA DE CALIBRADO D.O.S cerevisiae
 Subgrupo A-1

1.600 Concentracion Celular Sustrato 7.00

1.400 6.00
1.200
5.00
1.000
4.00
X (G/L)

S (G/L)
0.800
3.00
0.600
2.00
0.400
0.200 1.00

0.000 0.00
0 2 4 6 8 10 12 14

GRAFICA Nº 03 Crecimiento cinético y consumo del sustrato con Saccharomyces

cerevisiae ATCC 4126 utilizando sacarosa como fuente de carbono.

Linealidad de cinetica de crecimiento Ln(X/Xo)

1
0.8 y = 0.1228x - 0.5955
0.6 R² = 0.9938
0.4
0.2
0
-0.2 0 1 2 3 5 6 7 8 9 11 13
-0.4
-0.6

Ln/X/Xo) Linear (Ln/X/Xo))

GRAFICA Nº 04 Curva del crecimiento celular con los puntos lineales para
determinar el umax con Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 utilizando
sacarosa como fuente de carbono.

Y x/s (g/g) Umax (h-1) Qx ( g/h)

0.206002 0.1228 0.09515052
GRAFICA Nº 05: Obtención de etanol en el vial 4, de acuerdo al cromatógrafo.
DISCUSIONES
En la curva de consumo de sustrato en el subgrupo A1, se observa que en el
transcurso de las cinco primeras horas de fermentación existe una fase de
latencia(Lag), subgrupo A2, se observa las siete primeras horas de fermentación
existe una fase de latencia(Lag), y en el subgrupo A3, se observa las 5 primeras
horas de fermentación existe una fase de latencia(Lag) cual indica el periodo de
adaptación del microorganismo hacia el medio. En donde el crecimiento es bajo.
Debido a la transferencia del inoculo al nuevo medio, este puede verse afectado
por cambios de pH, aumento en el suministro de nutrientes y descenso en los
inhibidores de crecimiento. Por ende, decimos que el subgrupo A1 tuvo menos
crecimiento microbiano en la fase Lag en un tiempo de siete horas.

Posterior a esta etapa se inicia el crecimiento exponencial de biomasa, el

cual se desarrolla de manera constante hasta la concentración de
1.395g/L en el subgrupo A1, 1.601g/L en el subgrupo A2 y 2,198 g/L en el
subgrupo A3, esperando que esta siga desarrollando su crecimiento, sin
embargo, hay que tomar en cuenta que, si se observa un descenso
durante el crecimiento microbiano, indica de la ausencia de sustrato. A su
vez, ello indica el ingreso a la etapa de decaimiento, careciendo de la zona
estacionaria. A pesar de ello, se obtiene nuevamente un aumento de
biomasa, considerándose el anterior una toma de muestra errónea;
debido a que en ese tiempo aún se cuenta con sustrato por lo que debe
continuar crecimiento.

En la etapa de crecimiento exponencial, la velocidad de crecimiento es

máxima y el tiempo de generación es mínimo. En esta fase el crecimiento
permanece constante. El crecimiento de las células se puede describir
cuantitativamente como la duplicación del número de células o biomasa
por unidad de tiempo. A través de esta fase las células alteran el medio
constante tomando los sustratos y excretando los productos
metabolizados. La velocidad de crecimiento es independiente de la
concentración de sustrato mientras exista sustrato en el medio. Durante
esta fase las bacterias consumen a velocidad máxima los nutrientes del
medio (Duarte, 1998) (1).

La fase estacionaria que no se dio en nuestro caso por falta de tiempo,

ocurre cuando se agota una sustancia nutritiva y el sustrato se ha
metabolizado, cuando se han formado sustancias tóxicas o ha ocurrido un
cambio de condiciones como el pH, temperatura, y concentración de
oxígeno disuelto.

A su vez, en la figura N°1 se observa que la cinética de consumo de

glucosa se encuentra en función a la velocidad de crecimiento de la
Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126, tal es así que se muestra el
consumo de sustrato en el medio de fermentación; que comienza con una
caída lentamente en la primera hora, motivo por el cual anteriormente se
observó una fase de latencia en el crecimiento celular.

El descenso de la concentración de sustrato, es un indicador de que la

fuente de carbono es destinada a la formación de productos o a la
manutención de las células para su respiración.
 Por otro lado, sabemos que las condiciones de máximo crecimiento de
biomasa para nuestra experiencia son de 2 g/L, en base al cual fue
diseñado nuestro medio, dando como resultado una concentración menor
de 1.395g/L(A1) y 1.601g/L(A2), esto se debe a que existió menor
cantidad de sustrato; sin embargo, en el subgrupo A3 no se consiguió
dicha concentración final, ya que este sobrepasó (2.198g/L), esto se debe
a que existió mayor cantidad de sustrato inicial.

Se estudió la conversión de sacarosa en etanol por Saccharomyces

Cerevisiae ATCC 4126. Se evaluó el medio de fermentación compuesto por
MgSO4 · 7H2O, extracto de levadura, (NH4)2SO4, KH2PO4 y solución de
sales a un pH de 4.5. Se obtuvo el valor de µmáx de 0.2582 h-1 muy por debajo
del valor teórico µmáx 0.3 h-1, este valor se debe a una baja concentración de
sustrato inicial, debido a la influencia de los demás nutrientes que aportan
más fuente de carbono al medio.
Con respecto a la productividad se determinó un Qx= 0.797 g/L.h,
relativamente alto comparado con la productividad de las otras mezclas. Esto
debido a una alta concentración celular (biomasa).
- Condiciones de aireación
Muchos microorganismos, tanto levaduras como bacterias, crecen en
condiciones anaeróbicas y el oxígeno en exceso tiene un efecto negativo
sobre la producción de etanol. En las bacterias, por ejemplo, la aireación
induce la producción de subproductos incluyendo acetatos, acetaldehídos
y lactatos, además, el oxígeno tiene un efecto inhibitorio sobre el consumo
de sustrato y el crecimiento microbiano. A bajas concentraciones de
sustrato, las velocidades de crecimiento y el rendimiento de biomasa son
independientes de la presencia de oxígeno. De forma opuesta, a altas
concentraciones de sustrato, decrecen los parámetros de crecimiento.
Chandraraj, K. et al. (2004) (2)
Según Brock, T. & Madigan, M., 1993 nos dice que: El pH es un factor
importante en la fermentación, debido a su importancia en el control de la
contaminación bacterial como también al efecto en el crecimiento de las
levaduras, en la velocidad de fermentación y en la formación de alcohol. Durante
la fermentación la levadura toma el nitrógeno de los aminoácidos orgánicos,
perdiendo su carácter anfótero y pasando a ácidos, lo cual origina una
disminución del pH del medio. Cuanto más bajo el pH del medio, tanto menor el
peligro de infección, pero si se trabaja con pH muy bajos la fermentación es muy
lenta, ya que la levadura no se desarrolla de la forma conveniente.

Producción de etanol

Para los ensayos de producción de etanol, se adquirió muestras de

sobrenadante del caldo fermentado, a distintas horas de cinética de
fermentación, centrifugadas a 4000 rpm por 15 minutos, reservadas en
viales enumerados según la hora de cinética. Se procedió a la lectura en el
cromatógrafo de gases, previamente filtradas con un microfiltro
conteniendo 1ml de muestra para el análisis.

El factor de rendimiento de etanol (YP/S, g / g) se calculó mediante la

relación entre la concentración de etanol (g/L) y el sustrato (sacarosa)
consumida (g /L). La productividad volumétrica de etanol (QP, g /Lh) se
definió por la relación entre la concentración máxima de etanol (g /L) y el
tiempo de fermentación respectivo (h).

- En la determinación de etanol, el cromatógrafo de gases detectó, que

el subgrupo A1, la muestra contenida en el vial 4 una concentración
de 0.051 g/L de etanol y en subgrupo A3, la muestra contenida en el
vial 9 una concentración de 0.044g/L. Asumimos que tales resultados
se deben a la agitación del medio de fermentación, ya que después
del sembrado la velocidad de agitación fue 150 rpm y 250 rpm
(durante 10 horas) ambos a temperatura de 30ºC. La disminución de
producción de etanol en el cultivo Saccharomyces Cerevisiae ATCC
4126 se debe al efecto del oxígeno incorporado al medio durante la
agitación (aireación), esto explica el comportamiento de la que
prefiere oxidar la sacarosa en presencia de oxígeno (para su
respiración celular) antes que fermentarla. Entonces, para casos
prácticos la producción de etanol podría ser controlado mediante la
tasa de aireación.
- Debido a que la levadura sintetiza el sustrato para dos afines:
respiración y fermentación, el etanol generado se debería a una baja
 actividad de las enzimas respiratorias (especialmente la piruvato
deshidrogenasa, acetaldehído deshidrogenasa y la acetil-CoA
sintetasa) como resultado de la limitación de oxígeno en el medio,
entonces se asume que las muestras contenidas en los viales 4 y 9,
correspondientes a las horas respectivas de 4 y 9 después de la
activación del medio, presentaban más contenido de oxígeno que el
vial 10 (relacionado a 10 horas de cinética celular) produciendo
crecimiento celular en lugar del producto; del cual también se observa
la influencia del tiempo en la producción de etanol.

Según Nagodawithana & Steinkraus (1976)3, la tolerancia al etanol

depende de la habilidad de la célula de levadura para exportar el
etanol producido hacia el exterior, un proceso que depende de la
composición y fluidez de la membrana citoplasmática del
microorganismo.

Un factor importante a considerar en el cultivo de Saccharomyces cerevisiae es la

aireación de medio de cultivo. En condiciones anaerobias, sin embargo, el crecimiento es
lento y el piruvato producido durante el catabolismo es procesado por la piruvato
descarboxilasa a acetaldehido y CO2. Se produce entonces etanol a partir de acetaldehido
mediante la reducción por la alcohol deshidrogenasa. Los sistemas discontinuos para la
producción de etanol se inician aeróbicamente para obtener la máxima biomasa, ya que
si las condiciones anaerobias comienzan demasiado pronto la densidad de la población
no será lo suficientemente alta para obtener una velocidad de conversión. Puede ser
incluso necesaria la aireación forzada durante un tiempo corto a fin de evitar pérdidas de
rendimiento.

BIBLIOGRAFIA

1. Duarte, 1998. Microbiología Industrial. Editor EUNED. Pág. 50

2. Chandraraj K, Gunasekaran P (2004) Bacterial alcoholic

fermentation. In: Ashok P. (ed) concise encyclopedia of bioresource
technology. Food Products Press, New York.

3. Gupta A. & G.A. Rao. 2003. Study of oxygen transfer in shake

flasks using a non-invasive oxygen sensor. Biotechnology and
Bioengineering, 84(3): 351–358.
4. Nikakhtari H. & G. Hill. 2006. Closure effects on oxygen transfer
and aerobic growth in shake flasks. Biotechnology and
Bioengineering, 95(1): 15–21.

5. Nagodawithana T.W. & K. Steinkraus. 1976. Influence of the rate

ethanol production and accumulation on the viability of
Saccharomyces cerevisiae in rapid fermentation. Applied and
Environmental Microbiology, 31: 158–162.

6. Hansen E.H., P. Nissen, P. Sommer, et al. 2001. The effect of

oxygen on the survival of non-Saccharomyces yeasts during mixed
culture fermentations of grape juice with Saccharomyces
cerevisiae. Journal of Applied Microbiology, 91: 541–547.

7. Quintero R., Rodolfo. (1981). Ingeniería bioquímica. México 13,

D.F.: Editorial Alhambra Mexicana. (Biblioteca central, UNS)