Hartree

Universidade Estadual de Londrina
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Título: Procedimento de Hartree para determinação de proteínas
Procedimento de
Hartree para
determinação de
proteínas
Data: Nome Assinatura

Elaboração: 01.06.2019 Maykon César G. de Andrade
Verificação: 01.06.2019 César Tischer

1. SUMÁRIO
2. OBJETIVO ...................................................................................... 3
3. Campo de Aplicação....................................................................... 3
4. Definições, Siglas e Abreviaturas ................................................... 3
5. Procedimento.................................................................................. 3
5.1 Materiais necessários .................................................................. 4
5.2 Reagentes necessários ............................................................... 4
5.3 Metodologia de análise................................................................ 4
6. Representação dos resultados ....................................................... 5
7. Realização do ajuste linear ............................................................. 5


2. OBJETIVO
O objetivo deste POP é determinar a concentração de proteínas em uma

amostra pelo uso do método de Hartree.
3. CAMPO DE APLICAÇÃO
As aplicações para o método de determinação de proteínas de Hartree

são diversas, porém iremos utilizar o método para determinar a concentração de
Albumina em uma amostra.
4. DEFINIÇÕES, SIGLAS E ABREVIATURAS
Espectrofotômetro - instrumento que mede a intensidade de radiação para

cada comprimento de onda numa região do espectro eletromagnético, ger. no
espectro visível.
UV – Radiação ultravioleta (UV) é a radiação eletromagnética ou os raios
ultravioletas com um comprimento de onda menor que a da luz visível e maior
que a dos raios X, de 380 nm a 1 nm.
CuSo4.5H2O – Sulfato de Cobre
Na2CO3 – Carbonato de Sódio
Reagente de Folin-Ciocalteu - O reagente de Folin-Ciocalteu (FCR) ou
reagente de Folin-Denis é uma mistura de fosfomolibdato e fosfotungstato,
usado para a determinação de antioxidantes fenólicos e polifenólicos. Funciona
medindo a quantidade de substância analisada necessária para inibir a oxidação
do reativo.
5. PROCEDIMENTO


5.1 Materiais necessários
Tubos de ensaio
Pipeta volumétrica
Água destilada
Solução padrão de glicose
Reagente DNS
Banho maria
Estante para tubos de ensaio
Becker
Espectrofotômetro
5.2 Reagentes necessários
Solução A: Adicionar 2 g de tartarato duplo de sódio e potássio,100 g de

NaCO3 dissolver em 500 mL de NaOH 1 N e diluir em água para 1000 mL.
Solução B: Adicionar 2 g de tartarato de sódio e potássio, 1g de CuSO4 .5
H2O dissolver em 90 mL de água e 10 mL de NaOH 1 N adicionado por último.
Solução C: Diluir 1 volume do reagente de Folin Ciocareau 2 em 9
volumes de água destilada(1:10)
Solução padrão estoque de soroalbumin BOVIN de 1 mg/mL.
Observações para os reagentes preparados: Para a curva de calibração o
padrão de soroalbumin deve ser diluído 5 vezes (200ųg/mL); A solução C deve ser
preparada no momento da análise; A solução A e B podem ser utilizadas por 6 meses e
devem ser armazenadas em frascos de polietileno.
5.3 Metodologia de análise.


As amostras de proteínas devem ser diluídas para 1mL com água e tratadas com
0,9 mL de solução A. Um tubo branco e tubos padrões (20 a 200μg de proteína) devem
ser preparados da mesma maneira. Os tubos devem ser colocados em banho-maria a 50°C
por 10min e resfriados até a temperatura ambiente e tratados com 0,1 mL de solução B.
As soluções devem ser mantidas a temperatura ambiente pelo menos 10 min, e 3 mL da
solução C (diluida 1:16) devem ser adicionados rapidamente e misturados dentro de 1
segundo. Os tubos devem ser aquecidos novamente a 50°C por 10 min e resfriados até a
temperatura ambiente. A absorbância deve ser lida em 650nm.
6. REPRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS
Abaixo segue um quadro representativo da sequência de passos para

preparar as soluções que serão analisadas.
Concentração
Padrão H2O Solução Solução
Tubos Amostra Solução das proteínas
Proteínas Destilada A B
C (µg/mL)
(mL) (mL) (mL) (mL) - - -
Realizar Realizar
- - - - - - - -
Banho Manter em Banho
- - 1,00 - 0,90 0,10 3,00 -
Maria a Temperatura Maria a
1,00 0,10 0,90 - 0,90 0,10 3,00 20,00
50°C por ambiente 50°C por
2,00 0,20 0,80 - 0,90 0,10 3,00 40,00
10min e por 10min 10min e
3,00 0,40 0,50 - 0,90 0,10 3,00 80,00
esfriar esfriar
4,00 0,60 0,60 - 0,90 0,10 3,00 120,00
5,00 0,80 0,20 - 0,90 0,10 3,00 168,00
6,00 1,00 - - 0,90 0,10 3,00 200,00
Amostra - - 1,00 0,90 0,10 3,00 Desconhecida
Figura 1 - Quadro para ser utilizado como esquema durante o preparo das soluções.
Após o preparo descrito acima realizamos a medição dos valores de

absorbância e a partir desses dados iremos realizar a plotagem para realizar um
ajuste linear dos dados.
7. REALIZAÇÃO DO AJUSTE LINEAR


Com o auxílio do software Excel imputamos os valores lidos de

absorbância em uma planilha e as respectivas concentrações para cada leitura,
após isso inserimos um gráfico de dispersão e adicionamos uma linha de
tendência linear. Abaixo segue um exemplo de gráfico com ajuste linear.
Figura 2 - Modelo de gráfico de ajuste
Como agora temos a equação de ajuste, podemos utilizar a equação e

isolar a concentração, dessa forma conseguimos detectar a concentração da
amostra de interesse.


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