UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA
CURSO: MICROBIOLOGÍA - LABORATORIO

INFORME DE PRÁCTICA N°2

Título: TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM
Integrantes:

ALUMNO CÓDIGO FIRMA

Fuentes Guevara, Dennisse Yeriot 20161438

Huachaca Vilca, Erick Bryan 20161444

Méndez Reyes, Yoselin 20170265

Yalta Aliaga, Anderson Alexsander 20161468

Ciclo: 2018-II
Especialidad: Ingeniería en Industrias Alimentarias
Horario de práctica: Lunes 11:00 am - 1:00 pm (B*)
Profesor de laboratorio: Juscamaita Morales, Juan Gabriel
Fecha de la práctica: 03/09/18
Fecha de entrega del informe: 10/09/18

LA MOLINA - LIMA - PERÚ

 1. INTRODUCCIÓN

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes y más útiles en el laboratorio
bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Esta tinción se
denomina así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de
su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram
negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico,
sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). Las bacterias Gram-
positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la
estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias
capas interconectadas de peptidoglicano (80%-90% de composición), así como algo de ácido teicoico.
La pared de la célula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada,
únicamente de peptidoglicano (10%-20% de composición) y está rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos y lipoproteínas. Las células Gram positivas, a causa de
sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al
disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo así el espacio entre
las moléculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared
celular. Para poner de manifiesto las células Gram-negativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la
coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram-positivas
permanecen azules (López, 2010).

2. OBJETIVOS

● Demostrar a través de la técnica diferencial de Gram la existencia de dos grupos principales de

bacterias.
● Reconocer las diferentes formas, tamaños y agrupaciones de bacterias Gram-positivas y
Gram-negativas.

3. RESULTADOS

3.1. Observación de Salmonella sp.

Figura 1. Bacterias Salmonella sp. en una lámina fija, preparada a partir de un cultivo microbiano.

3.2. Observación de Proteus sp.

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 Figura 2. Bacterias Proteus sp. en una lámina fija, preparada a partir de un cultivo microbiano.

3.3. Observación de Bacillus sp.

Figura 3. Bacterias Bacillus sp. en una lámina fija, preparada a partir de una muestra de
yogurt. La mayoría con forma de Streptobacillus, algunos de los cuales poseen esporas.

3.4. Observación de Streptococcus sp.

Figura 4. Bacterias Coccus sp. en una lámina fija,

preparada a partir de una muestra de yogurt.
La mayoría con forma de Streptococcus y Diplococcus.

4. DISCUSIONES

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Las bacterias Gram negativas pierden el colorante cristal violeta con mayor facilidad que las Gram
positivas. La razón es la menor cantidad de peptidoglucano de las paredes de las bacterias Gram
negativas.

Cuando se añade etanol a una mezcla de células Gram positivas y Gram negativas teñidas con cristal
violeta, las células Gram positivas quedan teñidas de violeta : no puede atravesar la gruesa capa de
mureína (pueden hacerlo si se prolonga excesivamente el contacto con el alcohol). La pared de las
bacterias Gram negativas debe su rigidez a una capa de mureína más delgada, a través de la cual el
alcohol extrae el cristal violeta de estas células. Su citoplasma queda incoloro y puede teñirse de
color rosa con el colorante de contraste: la safranina (Iañez, 2004).

En la práctica pudimos observar que los Bacillus sp. y los Streptococcus sp. obtenidos de una muestra
de yogurt, mantenían el color del cristal violeta lo cual nos indica que estas bacterias son del tipo
Gram + , deduciendo por tanto que tienen una gruesa capa de peptidoglucano lo cual dificulta su
decoloración. Por otro lado, la Salmonella sp. y el Proteus sp. obtenidos de los cultivos microbianos,
perdieron el color violeta y adquirieron el color rosa de la safranina lo cual nos indica que estas
bacterias son del tipo Gram - , deduciendo que su capa de peptidoglucano es más delgada lo cual
genera que se decolore con mucha facilidad y rapidez generando la posibilidad de teñirse de nuevo
con otro colorante.

Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior
formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son
desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos,
etc.) formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la
célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora
germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años.

Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales
adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio óptico como
estructuras refringentes y de difícil tinción (Pujol, 2003).

En la práctica pudimos observar que dentro de algunos Bacillus sp., una parte de su estructura interna
no mostraba tinción frente al cristal violeta, estas eran las endosporas que las bacterias habían
producido.

La tinción de esporas o de Wirtz-Conklis es posible, y requiere de dos colorantes: verde malaquita y

safranina (Pujol, 2003).

5. CONCLUSIONES

● Se demostró a través de la técnica de Gram (tinción diferencial) la existencia del grupo de las
bacterias Gram-positivas(coloración final púrpura) y Gram-negativas( coloración final rosa).
● Se lograron reconocer las diferentes formas, tamaños y agrupaciones del grupo de bacterias
Gram-positivas (Bacillus sp. y Streptococcus sp.) y Gram-negativas(Salmonella sp. y Proteus
sp).

6. CUESTIONARIO

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● ¿Bajo qué circunstancias la tinción diferencial de Gram podría resultar errática?
La razón por la cual la tinción gram puede ser errática es debido a varios factores, entre ellos
la edad de la bacteria, como ejemplo el caso de las gram positivas en la cual existe la
posibilidad de que puedan perder capas de peptidoglicano y de este modo distorsionar el
resultado esperado.Otro factor es el medio en el que se encuentre, las bacterias deberán tener
un ambiente neutro para que puedan mantener su carga para que así el colorante sea efectivo.
El tiempo que se le de a la decoloración de la bacteria constituye otro factor de error, pues
mostraría por ejemplo que las gram positivas se tiñan de gramnegativas.

● ¿Qué efecto traería reemplazar el lugol con otro agente oxidante?

La solución yodada actúa como mordiente. Esto es, el yodo aumenta la interacción entre la
célula y el colorante, de forma que aquélla se tiñe más intensamente. El reemplazar el lugol
con otro agente oxidante no traeria ningun efecto pues la función del lugol es justamente ser
un agente oxidante, así pues al intercambiarlo por otro, cumpliria la misma funcion.

● ¿Podría Ud. variar el colorante primario y el contrastante obteniendo los mismos

resultados?
Las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de
alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder
retener el complejo de cristal violeta que se formó previamente, y por lo tanto este complejo
se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas,
al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son
susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratandolos poros
cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta, y manteniendo la
coloración azul-violácea.El colorante de contraste (la safranina) solo puede teñir a las células
vegetativas (decoloradas por el agua).Si cambiamos el orden del colorante con del contraste
por ejemplo de la muestra de Streptococcus sp se obtendrían resultado la coloración del
contraste ya que las bacterias del Streptococcus sp son gram positivas y retendrían la primera
decoloración porque poseen una pared celular más resistente y con mayor proporción de
peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa
deshidratandolos poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse la primera
decoloración , y manteniendo la coloración primaria.

● ¿Cuál es la influencia del pH en la reacción de Gram?

La influencia en el ph es importante dentro del cultivo pues estas deberán mantener sus cargas
negativas para que se pueda dar una correcta coloración, es por ello que el ph del medio debe
ser neutro. Según esto: Los grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la
acidez. En tanto que los gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la
alcalinidad.

● Liste cinco ejemplos de bacterias Gram positivas y cinco de Gram negativas, señalando
su importancia.

GRAMPOSITIVAS:
● Staphylococcus aureus: Responsable de abscesos, dermatitis, infecciones localizadas
y posibles gastroenteritis.

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 ● Streptococcus faecalis: Usual en infecciones en vías biliares y urinarias, habita en el
colon humano.
● Streptococcus pneumoniae: Responsable de neumonías e infecciones en las vías
respiratorias, así como otitis, meningitis y peritonitis.
● Streptococcus sanguis: Causante de endocarditis, cuando ingresa al torrente sanguíneo
a través de lesiones en su hábitat, la boca y la mucosa dental.
● Clostridium tetani: Bacterias responsables de los tétanos, entran al cuerpo desde el
suelo por traumatismos en las extremidades.
● Bacillus antracis: Se trata de la conocida bacteria del ántrax, tanto en su versión
cutánea como en la pulmonar.
● Clostridium botullinum: Causante del botulismo clásico y el infantil, habita en el
suelo y en los alimentos mal conservados.
● Clostridium perfringes: Esta bacteria segrega toxinas que destruyen la pared celular, y
es responsable de las gangrenas gaseosas, la enteritis necrosante y la endometritis.

GRAMNEGATIVAS:

● Neisseria gonorrhoeae: Conocidísima por ser la causante de la gonorrea, común

enfermedad de transmisión sexual.
● Escherichia coli.: Habitante usual del colon humano, está involucrada en las llamadas
“diarreas del viajero”, así como en meningitis neonatal, sepsis e infecciones urinarias.
● Salmonella typhi.: Bacteria responsable de la enfermedad conocida como fiebre
tifoidea, suele transmitirse por vía fecal-oral: contaminación de aguas, mala
disposición de excretas o higiene defectuosa.
● Haemophilus influenzae. : Bacilo usualmente aerobio, es responsable de numerosas
meningitis, otitis, sinusitis, bronconeumonías, celulitis y artritis séptica.
● Bordetella pertussis. Causante de la enfermedad conocida como Tos ferina, de alta
mortalidad infantil.
● Brucella abortus. Ocasiona la brucelosis, una enfermedad del ganado que se transmite
al hombre por contacto con los animales o por ingesta de lácteos sin pasteurizar.
● Francisella tularensis. Responsable de la llamada “fiebre del conejo” o tularemia, se
transmite al hombre mediante vectores (ácaros u otro tipo de exoparásitos) de los
conejos, ciervos y animales semejantes.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

● López, A. 2010. Práctica 2: Tinción de Gram (en línea). Universidad Autónoma de Zacatecas.
México. Consultado el 03 septiembre 2018. Disponible en:
https://es.scribd.com/doc/43696269/Tincion-de-gram-Introduccion-desarrollo-e-
interpretacion-de-resultados-Practica-2
● Audesirk, G. y Byers, B. 2008. Biología la vida en la tierra. 9ª ed. España. Pearson Educación.
● Iáñez, E. 2004. Métodos: Tinción de Gram (en línea). Universidad de Granada. España.
Consultado el 03 septiembre 2018. Disponible en: https://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-
iii/pb-iii-3-gram.htm
● Madigan et. al. 2015. Brock: Biología de los microorganismos. 14ed. Madrid, España.
Editorial Pearson. 1136p.
● Moreno et. al. 2018. Microbiología Guía de laboratorio. Lima, Perú.

5
● Pujol, C. 2003. Técnicas de tinción. Fundamentos (en línea). Consultado el 03 septiembre
2018. Disponible en: http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
● Willey, JM, Sherwood, L, & Woolverton, C. J. (2008). Prescott, Harley, and Klein's
microbiology. New York: McGraw-Hill Higher Education.