Elaborarea unei metode analitice pentru

identificarea Aspergillus flavus pe baza

markerilor chimici utilizând HPLC-MS

Aspergillus flavus este o ciupercă saprotrofică, filamentoasă și patogenă cu o

distribuție cosmopolită. Este cel mai bine cunoscut pentru colonizarea boabelor de
cereale, a legumelor și a fructelor cu coajă lemnoasă și poate fi o sursă de
probleme de sănătate pentru oameni și animale.
În mod specific, infecția cu A. flavus provoacă putregaiul tulpiniilor de
porumb și mucegaiul galben în arahide, înainte sau după recoltare. Infecția poate fi
prezentă pe câmp, pre-recoltare, post-recoltare, în timpul depozitării și în timpul
tranzitului. Simptomele și semnele de agent patogen sunt adesea nevăzute.
Aspergillus flavus este unic prin faptul că este o ciupercă termotolerantă,
deci poate supraviețui la temperaturi pe care alte ciuperci nu le pot face. Boala
post-recoltare poate reduce randamentul total al culturilor cu 10-30%, iar în țările
în curs de dezvoltare, care produc culturi perisabile, pierderea totală poate fi mai
mare de 30%. În boabe și leguminoase, boala post-recoltare are ca rezultat
producerea de micotoxine. Cea mai mare pierdere economică cauzată de acest
agent patogen este rezultatul producției de aflatoxine.
Metodele tradiționale de identificare a fungilor se bazează pe caracteristici
morfologice, inclusiv culoarea, tipul de creștere, diametrul coloniei, mărimea și
ornamentarea conidiilor și conidioporilor, necesitând specialiști și consumând mult
timp. Dezvoltarea alternativelor analitice ar putea avea avantaje, cum ar fi o mai
mare eficiență, o mai mare reproductibilitate și un timp mai scurt de analiză.
Astfel, o metodă de analiză calitativă pentru detectarea Aspergillus flavus în
probele de hrană, pe baza identificării markerilor chimici fungici prin HPLC-MS
este foarte utilă.
HPLC cuplat cu spectrometria de masă (MS), combină separarea relativ
rapidă și eficientă cu detectarea sensibilă, specifică și universală. Prin urmare,
sistemul HPLC-MS este un sistem de separare/detectare foarte versatil, care
permite obținerea unui model de fragmentare caracteristic unui compus, care
reprezintă o informație importanta despre structura sa chimica.
Identificarea metaboliților secundari produși de Aspergillus flavus a fost
realizată folosind un HPLC fabricat in Japonia, model Shimadzu Maxis Impact
cuplat la un spectrometru de masa quadrupole cu timp de zbor accelerat ortogonal
de tip micrOTOF-Q, fabricat in Germania și echipat cu o sursă de ionizare de tip
electrospray (ESI). Separarea analiților a fost efectuată utilizând o coloană
XRODSIII (150 mm x 2 mm x 2,2 pm) de la Shimadzu. Detector spectrometrului
este cu multiplicator de electroni.
Apă deionizată acidificată cu acid formic 0,1% A) și acetonitrilul acidifiat
tot cu acid formic 0,1% (B) au fost utilizați ca faze mobile A, respectiv, B.
Gradientul a fost executat după cum urmează: 5% solvent B 0-2 min; s-a crescut la
90% B 2-15 min; 90% B până la 20 de minute; 5% B 20-21 min și 5% B până la
25 min.
Parametrii pentru analiză au fost stabiliți folosind modul pozitiv cu ioni (ESI
+), utilizându-se spectrele obținute pe un interval de masă de m / z 70-1300 . Datele
MS au fost prelucrate prin softul Data Analysis 4.0.
Acetonitrilul cu grad de puritate pentru HPLC și metanolul au fost
achiziționate de la Panreac. Apa deionizată a fost obținută dintr-un sistem de de
purificare a apei Milli-Q. Mediile de cultura folosite pentru cresterea fungilor au
fost Agar Czapek-Dox (CDA) și Agar de dextroză în cartofi (PDA)
Pentru extragerea metaboliților, mediile de cultura au fost înghețate la -80 ° C
pentru a putea slabii peretele celular, ulterior fiind sonicate cu metanol timp de
30 min.
Identificarea metaboliților secundari produși de A. flavus a fost efectuată
prin analizarea extractelor din cultura sa pe medii de cultură standard PDA și
CDA după 7, 14 și 21 de zile de incubare prin HPLC-MS / QTOF. Tehnologia
permite identificarea producției de toxine fungice deoarece MS / QTOF oferă
măsurarea exactă a masei ionilor moleculari, care poate fi identificată prin căutarea
unei baze de date cu mase exacte de metaboliți secundari relevanți
 A fost posibil să se extragă 14 compuși care pot fi utilizați
ca ciuperca markeri chimice: aflatoxină B1, aflatoxine G1, acidul aspergic,
aspirona, betaina, chrysogine, deacetyl parasiticolide A, flufuran, B gregatin,
acidul hidroxisidonic, acid nicotinic , fomaligina A, spinulozina.
Metoda cuprinde extracția metanolului urmată de analiza HPLC-MS și
identificarea a 14 metaboliți secundari fungici, și anume aflatoxina B1, aflatoxina
G1, acid aspergilic, aspirone, betaină, crizogină, deacetil parasiticolid A, flufuran,
gregatină B, acid hidroxidonic, acidul nicotinic, fomaligina A, spinulozina și
terreina.
În lucrarea prezentă, identitățile compușilor detectați au fost confirmate prin
analiza ionilor de fragment și a erorii de masă conform formulei:
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑒𝑡𝑖𝑐𝑎 − 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙𝑎
𝐸𝑟𝑟𝑝𝑟(𝑝𝑝𝑚) = ( ) 𝑥1.000.000
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑒𝑡𝑖𝑐𝑎
unde masa experimentală a fost obținută din analiză prin HPLC-MS / QTOF .

Bibliografie

Nayara C. Saldana, Rafaela T.R. Almeida, Alexandre Avíncola, Carla Porto

Marília B.Galucha; Development of an analytical method for identification
of Aspergillus flavus based on chemical markers using HPLC-MS, Food
Chemistry, Volume 241, 15 February 2018, Pages 113-121