La aplicación de microarreglos para el análisis de la expresión génica en el cáncer

Pascale F. Macgregor1 y Jeremy A. Squire2-

El diagnóstico molecular es un campo en rápido avance en la que conocimientos sobre los mecanismos de la
enfermedad están siendo dilucidados por el uso de nuevos biomarcadores basadas en genes. Hasta hace poco,
la evaluación diagnóstica y pronostica de tejidos y tumores enfermos en gran medida de indicadores indirectos
que permiten únicamente las clasificaciones generales en subtipos histológicas o morfológicas amplias y no
tomaron en cuenta las alteraciones en la expresión de genes individuales. El análisis de expresión Global
utilizando microarrays permite ahora para la interrogación simultánea de la expresión de miles de genes en una
forma de alto rendimiento y ofrece oportunidades sin precedentes para obtener las firmas moleculares del estado
de actividad de las células enfermas y muestras de pacientes. El análisis de microarrays puede proporcionar
información invaluable sobre la patología de la enfermedad, la progresión, la resistencia al tratamiento y la
respuesta a los microentornos celulares y, en última instancia, puede conducir a un mejor diagnóstico temprano
y enfoques terapéuticos innovadores para el cáncer.

© 2002 Asociación Americana de Química Clínica

La tecnología de microarrays apropiadas por PCR y se purificaron antes de la

Microarray métodos se desarrollaron inicialmente
para estudiar la expresión génica diferencial
utilizando poblaciones complejas de ARN (1).
Refinamientos de estos métodos ahora permiten el
análisis de los desequilibrios número de copias y la
amplificación del gen de ADN (2) y, recientemente,
se han aplicado al análisis sistemático de la
expresión a nivel de proteínas (3). Muchos de los
principios guía de análisis global utilizando
microarrays son, en principio, aplicable en el ARN,
ADN, o nivel de proteína. En esta revisión nos
centramos nuestra atención en las tecnologías de
microarrays aplicadas al análisis de ARN, con
énfasis en el estudio de los cambios de expresión
génica en tumores. Discusión cubriendo detalles
relativos a los métodos descritos a continuación, y
un glosario de términos que se utilizan comúnmente
en el análisis de microarrays están dentro de los
materiales complementarios a este artículo
(www.utoronto.ca/cancyto/CLINCHEM).
Fabricación de microarrays
detección en el soporte sólido.
Además de su precio más bajo y flexibilidad en el
diseño, manchas arrays ofrecen la ventaja de
permitir el análisis de la expresión simultánea de dos
muestras biológicas, tales como muestras de ensayo
y de control. Esta comparación directa de los perfiles
de expresión de dos muestras biológicas, tales como
las células no tratadas en comparación con las
células tratadas o tejido sano en comparación con el
cáncer, es una enorme ventaja para cualquier
análisis pairwise. Por otra parte, debido a que estas
matrices se pueden observar con miles de genes y
las tecnologías ecológicamente racionales de
función desconocida expresadas secuenciados,
ofrecen el potencial para el descubrimiento de
nuevos genes y la definición de su papel en la
enfermedad. Una desventaja de manchas arrays es
que proporcionan información únicamente sobre la
expresión génica relativa entre las células
específicas o muestras de tejido en lugar de
cuantificación directa de la expresión del ARN.

manchas arrays se fabrican utilizando robots xyz que

utilizan pasadores huecos para depositar cDNA
(productos de PCR) o oligonucleótidos cortos en
portaobjetos con un recubrimiento especial de
microscopio de vidrio (4). tamaños de punto oscilan
entre 80 y 150 m de diámetro, y las matrices que
contienen hasta 80 000 puntos pueden ser
obtenidos. Secuencias de genes que se vista se
seleccionan de entre varias bases de datos públicas,
que contienen recursos para acceder a genes bien
caracterizados y las etiquetas de secuencias Affymetrix GeneChipsTM se producen mediante la
expresadas (EST) 5 representante de genes de síntesis de decenas de miles de oligonucleótidos
función desconocida. Los clones seleccionados se cortos en situ en obleas de vidrio, un nucleótido a la
amplifican a partir de bibliotecas de ADNc vez, usando una modificación de la tecnología de
fotolitografía semiconductor (1, 5). Generalmente,
GeneChips están diseñados con 16-20
oligonucleótidos que representan a cada gen en la
matriz. Cada oligonucleótido en el chip se empareja
con una casi idénticas, que sólo difieren por una,
único desajuste base central. Esto permite la
determinación del grado de unión no específica
mediante la comparación de la intensidad de la unión
entre los dos oligonucleótidos socio de destino. La
principal ventaja de GeneChips Affymetrix es su
capacidad para medir la expresión absoluta de
genes en células o tejidos. Sus desventajas, además
de sus mayores costos, incluyen su incapacidad
actual para comparar simultáneamente, en la misma
matriz, el grado de expresión de dos muestras
biológicas relacionadas. Además, microarrays
basados oligonucleotide- requieren un conocimiento
a priori de las secuencias génicas y requieren
manipulación computacional complejo para convertir
las 40 señales de características en un valor de
expresión real. Más recientemente, las matrices de
oligonucleótidos se han desarrollado que combinan
algunas de las flexibilidades y ventajas cualitativas
asociados con el uso de matrices de sondas
sintéticas con los beneficios de análisis simultáneo
que ofrece la matriz de vidrio manchado (6). En
nuestros laboratorios, se utilizan los microarrays de
ADNc manchadas de 1700 o 19 200 genes y EST
fabricados en la Red de Salud de microarrays Centro
Universitario (http://www.microarrays.ca) para
estudiar la progresión tumoral y la respuesta del
paciente al tratamiento en varios sólidos humanos
tumores. Además, microarrays basados
oligonucleotide- requieren un conocimiento a priori
de las secuencias génicas y requieren manipulación
computacional complejo para convertir las 40
señales de características en un valor de expresión
real. Más recientemente, las matrices de
oligonucleótidos se han desarrollado que combinan
algunas de las flexibilidades y ventajas cualitativas
asociados con el uso de matrices de sondas
sintéticas con los beneficios de análisis simultáneo
que ofrece la matriz de vidrio manchado (6). En
nuestros laboratorios, se utilizan los microarrays de
ADNc manchadas de 1700 o 19 200 genes y EST
fabricados en la Red de Salud de microarrays Centro
Universitario (http://www.microarrays.ca) para
estudiar la progresión tumoral y la respuesta del
paciente al tratamiento en varios sólidos humanos
tumores. Además, microarrays basados
oligonucleotide- requieren un conocimiento a priori
de las secuencias génicas y requieren manipulación
computacional complejo para convertir las 40
señales de características en un valor de expresión
real. Más recientemente, las matrices de
oligonucleótidos se han desarrollado que combinan
algunas de las flexibilidades y ventajas cualitativas
asociados con el uso de matrices de sondas
sintéticas con los beneficios de análisis simultáneo
que ofrece la matriz de vidrio manchado (6). En
nuestros laboratorios, se utilizan los microarrays de
ADNc manchadas de 1700 o 19 200 genes y EST
fabricados en la Red de Salud de microarrays Centro
Universitario (http://www.microarrays.ca) para
estudiar la progresión tumoral y la respuesta del
paciente al tratamiento en varios sólidos humanos
tumores. oligonucleotide- microarrays basados
requieren un conocimiento a priori de las secuencias
génicas y requieren manipulación computacional
complejo para convertir las 40 señales de
características en un valor de expresión real. Más
recientemente, las matrices de oligonucleótidos se
han desarrollado que combinan algunas de las
flexibilidades y ventajas cualitativas asociados con el
uso de matrices de sondas sintéticas con los
beneficios de análisis simultáneo que ofrece la
matriz de vidrio manchado (6). En nuestros
laboratorios, se utilizan los microarrays de ADNc
manchadas de 1700 o 19 200 genes y EST
fabricados en la Red de Salud de microarrays Centro
Universitario (http://www.microarrays.ca) para
estudiar la progresión tumoral y la respuesta del
paciente al tratamiento en varios sólidos humanos
tumores. oligonucleotide- microarrays basados
requieren un conocimiento a priori de las secuencias
génicas y requieren manipulación computacional
complejo para convertir las 40 señales de
características en un valor de expresión real. Más
recientemente, las matrices de oligonucleótidos se
han desarrollado que combinan algunas de las
flexibilidades y ventajas cualitativas asociados con el
uso de matrices de sondas sintéticas con los
beneficios de análisis simultáneo que ofrece la
matriz de vidrio manchado (6). En nuestros
laboratorios, se utilizan los microarrays de ADNc
manchadas de 1700 o 19 200 genes y EST
fabricados en la Red de Salud de microarrays Centro
Universitario (http://www.microarrays.ca) para
estudiar la progresión tumoral y la respuesta del
paciente al tratamiento en varios sólidos humanos
tumores. matrices de oligonucleótidos se han
desarrollado que combinan algunas de las
flexibilidades y ventajas cualitativas asociados con el
uso de matrices de sondas sintéticas con los
beneficios de análisis simultáneo que ofrece la
matriz de vidrio manchado (6). En nuestros
laboratorios, se utilizan los microarrays de ADNc
manchadas de 1700 o 19 200 genes y EST
fabricados en la Red de Salud de microarrays Centro
Universitario (http://www.microarrays.ca) para
estudiar la progresión tumoral y la respuesta del
paciente al tratamiento en varios sólidos humanos
tumores. matrices de oligonucleótidos se han
desarrollado que combinan algunas de las
flexibilidades y ventajas cualitativas asociados con el
uso de matrices de sondas sintéticas con los
beneficios de análisis simultáneo que ofrece la
matriz de vidrio manchado (6). En nuestros
laboratorios, se utilizan los microarrays de ADNc
manchadas de 1700 o 19 200 genes y EST
fabricados en la Red de Salud de microarrays Centro
Universitario (http://www.microarrays.ca) para
estudiar la progresión tumoral y la respuesta del
paciente al tratamiento en varios sólidos humanos
tumores.
Diseño experimental y la elección de referencia.
El diseño cuidadoso al principio es crucial para el
éxito de los experimentos de microarrays. En la
investigación del cáncer, de casos y controles,
bloqueadas y diseños de perfiles al azar
predominan. En un estudio de casos y controles, dos
muestras de un solo individuo, por ejemplo, tejido
tumoral y tejido sano, se comparan directamente.
Debido a la variabilidad paciente y la heterogeneidad
genética son cuestiones clave en el análisis de datos
de microarrays, el diseño de casos y controles es
una solución excelente cuando sea factible. diseños
bloqueados se usan típicamente para estudiar el
efecto de un tratamiento o condición de crecimiento
en una muestra tal como una línea celular. Se han
utilizado con éxito para examinar líneas celulares
cultivadas bajo diferentes condiciones (por ejemplo,
cultivadas en presencia o ausencia de un
medicamento contra el cáncer) o diferentes líneas
celulares relacionados (por ejemplo, de tipo salvaje
vs mutante, las células no transfectadas vs células
transfectadas). diseños de perfiles al azar son
ampliamente utilizados en los experimentos de
microarrays cuando las líneas de células o muestras
de los pacientes se seleccionan y perfiladas. La
mayoría de los “papeles de perfiles” han utilizado
este diseño, que ofrece la posibilidad de utilizar los
datos de muchos individuos diferentes, pero no
ofrece ningún control intrínseco de sesgo en las
poblaciones de pacientes o poblaciones celulares
utilizadas.
En tanto los diseños de perfiles bloqueados y
aleatorios, la muestra se compara típicamente con
un común o de referencia “universal”, que debe tener
una representación adecuada de la mayoría de los
genes en la matriz se traza el perfil y ser fácilmente
disponibles. Disponible comercialmente de ARN de
referencia es a menudo una buena elección debido
a la representación gen amplia (por ejemplo,
Stratagene y Clontech). El uso de una referencia
común también ofrece la ventaja de permitir un
análisis comparativo longitudinal entre varios
proyectos de microarrays entre los diferentes grupos
de investigación interesados en un aspecto común
de la investigación del cáncer, tales como la
progresión del tumor o la resistencia a los fármacos
contra el cáncer. Recientemente, hemos utilizado
una piscina de 9 líneas celulares para establecer los
perfiles de expresión de una serie de 15 muestras de
cáncer de ovario (7).
La importancia de repeticiones no se puede
exagerar, porque la variabilidad puede ser muy alta
en los experimentos de microarrays. Muchos grupos,
incluyendo el nuestro, también elegir para llevar a
cabo los llamados “reversiones de tinte”, en los que
una matriz de duplicados se hibridaron con la
muestra experimental marcado con un fluoróforo y la
muestra de referencia con el otro colorante. La
matriz duplicado correspondiente se hibrida luego
con muestras experimentales y las muestras de
referencia marcado con los fluoróforos opuestas.
Esta estrategia genera datos replicados y equilibrar
la posible eficacia diferencial de la incorporación de
tinte entre las muestras de ARN.
Objetivo preparación y la hibridación.
Tanto el ARN total y el ARNm se pueden utilizar para
los experimentos de microarrays y permiten la
consecución de datos de alta calidad con un alto
grado de confianza. ARN de alta calidad es crucial
para el éxito experimentos de microarrays.
Diferentes metodologías de extracción de ARN
estándar se han utilizado con éxito, y la elección del
protocolo es en gran medida una cuestión de
experiencia personal. La evaluación cuantitativa y
cualitativa del ARN obtenido se puede llevar a cabo
por técnicas estándar, tales como electroforesis en
gel de agarosa, pero está limitada por las cantidades
relativamente grandes de muestra requerido. Más
recientemente, la evaluación de la calidad y la
cantidad de ARN se ha facilitado en gran medida por
el uso de dispositivos basados microcapillary- como
el Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies), que
puede ser utilizado con tan poco como 5 ng de ARN
total.
Una de las limitaciones actuales en la aplicación de
rutina de la tecnología de microarrays para muestras
de pacientes es suficiente disponibilidad de ARN.
Por lo tanto, ha habido un considerable interés en el
desarrollo de estrategias de amplificación de ARN
que facilitan la extracción de ARN a partir de
muestras de captura láser microdissected (LCM),
tales como biopsias con aguja fina. Para los
experimentos de microarrays estándar, el ARN
aislado es transcrito de forma inversa en ADNc diana
en presencia de fluorescente (generalmente Cy3-
dNTP o Cy5-dNTP) o desoxinucleótidos marcados
radiactivamente ([33P] - o [32P] -alfa-dCTP).
Después de la purificación y la desnaturalización, las
dianas marcadas se hibridan con las micromatrices
a una temperatura determinada por el tampón de
hibridación utilizado. Después de la hibridación, los
arrays se lavan en condiciones restrictivas para
eliminar unión a la diana no específica y se secan
por aire.
La adquisición de imágenes y cuantificación.
procesamiento de imágenes Microarray utiliza
diferenciales de excitación y emisión longitudes de
onda de los dos compuestos fluorescentes para
obtener una exploración de la matriz para cada
longitud de onda de emisión, típicamente como dos
imágenes TIFF en escala de grises de 16 bits. Estas
imágenes se analizan a continuación para identificar
los puntos, calcular sus intensidades de señal
asociadas, y evaluar el ruido de fondo local. La
mayoría de los paquetes de software de adquisición
de imágenes también contienen herramientas
básicas de filtrado a los puntos de bandera como
manchas extremadamente baja intensidad,
fantasmas puntos (donde el fondo es mayor que la
intensidad de punto), o puntos dañados (por
ejemplo, artefactos de polvo). Estos resultados
permiten una relación inicial de la intensidad del
canal canal / de referencia evaluados para ser
calculado para cada punto en el chip. Los productos
de la adquisición de imágenes son el
emparejamiento de imagen TIFF y un archivo de
datos cuantificados que aún no se ha
normalizado.http://oz.berkeley.edu/tech-reports/.
Bases de datos y normalización.
La cantidad de datos que se generan en un
experimento de microarrays normalmente requiere
un sistema de base de datos dedicada para
almacenar y organizar los datos de microarrays e
imágenes. El primer papel de una base de datos de
microarrays local es el almacenamiento y anotación
(descripción de los parámetros experimentales) de
experimentos de microarrays por el investigador que
diseñó y llevó a cabo los experimentos de
microarrays. Además, en la actualidad existe un
creciente interés mundial en la fabricación de
conjuntos de datos de microarrays a disposición del
público en un formato estandarizado. Esto permitiría
que otros investigadores puedan reproducir los
experimentos de microarrays publicados, para
verificar de forma independiente por lo tanto ellos,
para comparar los conjuntos de datos a través de
diferentes plataformas de microarrays, y esto es
importante, para interrogar a los conjuntos de datos
de microarrays publicados por el uso de diversas
herramientas bioinformáticas para explorar
diferentes problemas biológicos. Para responder a
esta necesidad, la información mínima sobre un
experimento de microarrays, o la norma MIAME, ha
sido propuesto por la organización MGED
(http://www.mged.org) como una serie de criterios
que deben utilizarse al definir parámetros del
experimento de microarrays. En nuestro grupo,
entramos en todos los microarrays de datos en una
base de datos de microarrays local (GeneTraffic;
Iobion Informática), que contiene todos los archivos
de datos de microarrays y las imágenes TIFF, así
como una anotación MIAME de apoyo de nuestros
experimentos.
Una vez que los datos se han cargado en la base de
datos, que se normalizan y se calculan las
estadísticas agregadas. La normalización es un
proceso que escala las intensidades de terreno de
tal manera que los coeficientes normalizados
proporcionan una aproximación de la relación de la
expresión génica entre las dos muestras. La
discusión de las diferentes estrategias para la
normalización de los datos de microarrays está más
allá del alcance de este artículo de revisión, pero la
elección de un método de normalización robusta y
adecuada es crucial para la calidad de los datos
obtenidos, según el diseño experimental del propio
experimento de microarrays. Una discusión de los
métodos de normalización se proporciona en
materiales complementarios a este artículo
(www.utoronto. ca / cancyto / CLINCHEM).
El análisis estadístico y la minería de datos.
El análisis de grandes conjuntos de datos de
expresión génica es una nueva área de análisis de
datos con sus propios desafíos. métodos de minería
de datos por lo general caen en una de dos clases:
supervisada y no supervisada. En el análisis no
supervisado, los datos se organizan sin el beneficio
de la información de clasificación externa. La
agrupación jerárquica (8), la agrupación Kmeans (9,
10), o mapas de auto-organización (11) son
ejemplos de enfoques de agrupamiento no
supervisados que han sido ampliamente utilizados
en el análisis de microarrays (8, 12-15). análisis
supervisado utiliza alguna información externa, tal
como el estado de la enfermedad de las muestras
estudiadas. análisis supervisado consiste en elegir
de todo el conjunto de datos un conjunto de
entrenamiento y un conjunto de pruebas y también
comprende la construcción de clasificadores, que
asignan clases predefinidas de perfiles de expresión.
Una vez que el clasificador ha sido entrenado en el
conjunto de entrenamiento y probado en el conjunto
de pruebas, que luego se puede aplicar a los datos
de clasificación desconocida. métodos supervisados
incluyen k-más cercana clasificación vecino,
máquinas de vectores de soporte, y redes
neuronales. Golub et al. (16) utilizaron una estrategia
vecino k-más cercana para clasificar los perfiles de
expresión de muestras de leucemia en dos clases:
leucemia mieloide aguda y leucemia linfocítica
aguda. Recientemente Su et al. (17) utilizaron a gran
escala de ARN de perfiles y algoritmos de
aprendizaje automático supervisadas para construir
una clasificación molecular de 10 carcinomas
(próstata, pulmón, ovario, colon y recto, riñón,
hígado, páncreas, vejiga / uréter y una estrategia vecino k-más cercana para clasificar
gastroesophagus). Del mismo modo, el análisis de
red neural ha sido utilizado por Khan et al. (18) para
delinear patrones consistentes de la expresión
génica en el cáncer. A continuación, se puede aplicar
a los datos con clasificación desconocida. métodos
supervisados incluyen k-más cercana clasificación
vecino, máquinas de vectores de soporte, y redes
neuronales. Golub et al. (16) utilizaron una estrategia
vecino k-más cercana para clasificar los perfiles de
expresión de muestras de leucemia en dos clases:
leucemia mieloide aguda y leucemia linfocítica
aguda. Recientemente Su et al. (17) utilizaron a gran
escala de ARN de perfiles y algoritmos de
aprendizaje automático supervisadas para construir
una clasificación molecular de 10 carcinomas
(próstata, pulmón, ovario, colon y recto, riñón,
hígado, páncreas, vejiga / uréter y páncreas, vejiga / uréter y gastroesophagus). Del
gastroesophagus). Del mismo modo, el análisis de
red neural ha sido utilizado por Khan et al. (18) para
delinear patrones consistentes de la expresión
génica en el cáncer. A continuación, se puede aplicar
a los datos con clasificación desconocida. métodos
supervisados incluyen k-más cercana clasificación
vecino, máquinas de vectores de soporte, y redes
neuronales. Golub et al. (16) utilizaron una estrategia
vecino k-más cercana para clasificar los perfiles de
expresión de muestras de leucemia en dos clases:
leucemia mieloide aguda y leucemia linfocítica
aguda. Recientemente Su et al. (17) utilizaron a gran
escala de ARN de perfiles y algoritmos de
aprendizaje automático supervisadas para construir
una clasificación molecular de 10 carcinomas
(próstata, pulmón, ovario, colon y recto, riñón,
hígado, páncreas, vejiga / uréter y
gastroesophagus). Del mismo modo, el análisis de
red neural ha sido utilizado por Khan et al. (18) para
delinear patrones consistentes de la expresión
génica en el cáncer. máquinas de vectores de
soporte, y redes neurales. Golub et al. (16) utilizaron
una estrategia vecino k-más cercana para clasificar
los perfiles de expresión de muestras de leucemia en
dos clases: leucemia mieloide aguda y leucemia
linfocítica aguda. Recientemente Su et al. (17)
utilizaron a gran escala de ARN de perfiles y
algoritmos de aprendizaje automático supervisadas
para construir una clasificación molecular de 10
carcinomas (próstata, pulmón, ovario, colon y recto,
riñón, hígado, páncreas, vejiga / uréter y
gastroesophagus). Del mismo modo, el análisis de
red neural ha sido utilizado por Khan et al. (18) para
delinear patrones consistentes de la expresión
génica en el cáncer. máquinas de vectores de
soporte, y redes neurales. Golub et al. (16) utilizaron
los perfiles de expresión de muestras de leucemia en
dos clases: leucemia mieloide aguda y leucemia
linfocítica aguda. Recientemente Su et al. (17)
utilizaron a gran escala de ARN de perfiles y
algoritmos de aprendizaje automático supervisadas
para construir una clasificación molecular de 10
carcinomas (próstata, pulmón, ovario, colon y recto,
riñón, hígado, páncreas, vejiga / uréter y
gastroesophagus). Del mismo modo, el análisis de
red neural ha sido utilizado por Khan et al. (18) para
delinear patrones consistentes de la expresión
génica en el cáncer. (17) utilizaron a gran escala de
ARN de perfiles y algoritmos de aprendizaje
automático supervisadas para construir una
clasificación molecular de 10 carcinomas (próstata,
pulmón, ovario, colon y recto, riñón, hígado,
mismo modo, el análisis de red neural ha sido
utilizado por Khan et al. (18) para delinear patrones
consistentes de la expresión génica en el cáncer.
(17) utilizaron a gran escala de ARN de perfiles y
algoritmos de aprendizaje automático supervisadas
para construir una clasificación molecular de 10
carcinomas (próstata, pulmón, ovario, colon y recto,
riñón, hígado, páncreas, vejiga / uréter y
gastroesophagus). Del mismo modo, el análisis de
red neural ha sido utilizado por Khan et al. (18) para
delinear patrones consistentes de la expresión
génica en el cáncer.
Tusher et al. (19) propusieron recientemente una manera diferente al tratamiento. En un estudio de la
estrategia llamada SAM (análisis de la importancia señal, Golub et al.
microarrays), que permite la determinación de genes
expresados diferencialmente de manera significativa
entre los grupos de muestras analizadas por arrays
de expresión. Hemos usado este enfoque para
reducir el análisis a un subconjunto de genes que
también fueron muestra que se expresó
diferencialmente cuando se analizaron por la
agrupación jerárquica bidimensional convencional.
Como veremos más adelante, hemos identificado
recientemente genes que muestran expresión
diferencial entre las primeras etapas del cáncer
epitelial de ovario (EOC), EOC en etapa tardía, y el Fig. 2. agrupación jerárquica bidimensional de datos
ovario sano (Fig. 2). de microarrays obtenidos con 22 muestras de tejido
de ovario. Las muestras incluyen 15 temprana o
De perfiles de expresión Aplicada a la Biología
tardía etapa EOC serosa y 7 ovarios sanos. A-
del Cáncer
Erepresentar distintos grupos de genes cuya
El cáncer es causado por la acumulación de cambios expresión permite la distinción entre principios de
genéticos y epigenéticos que resultan de la EOC, a finales EOC, y el ovario sano (normal).
secuencia alterada o expresión de genes
(16) aplicado la tecnología de microarrays para
relacionados con el cáncer, tales como oncogenes o
desarrollar clasificaciones innovadoras de
genes supresores de tumor, así como genes
leucemias, usando el análisis de microarrays basado
implicados en el control del ciclo celular, la
en “análisis de vecindad” y la utilización de los
apoptosis, la adhesión, la reparación del ADN, y
predictores de clase tumor. Esta estrategia fue capaz
angiogénesis. Dado que los perfiles de expresión
de distinguir entre la leucemia mieloide aguda y
génica proporcionan una instantánea de las
leucemia linfocítica aguda sin análisis de
funciones y procesos de las células en el momento
supervisión. Otros grupos también han utilizado el
de la preparación de muestras, análisis combinatorio
análisis de patrón de expresión génica a clasificar, a
integral de los patrones de expresión génica de miles
nivel molecular, los tumores de mama (20, 21),
de genes en células tumorales y comparación con el
linfoma de células B (14), melanoma cutáneo (22), y
perfil de expresión obtenido con las células sanas
el adenocarcinoma de pulmón (23, 24). Del mismo
deben proporcionar información relativa a cambios
modo, en un estudio reciente análisis de los perfiles
consistentes en la expresión de genes que están
moleculares de 50 muestras de próstata no
asociados con la disfunción celular del tumor y
neoplásicas y neoplásicas, Dhanasekaran et al. (25)
cualquier vías de regulación concomitantes. la
establecidos los perfiles de expresión de la firma de
tecnología de microarrays ha sido ampliamente
salud de la próstata, neoplasia benigna de próstata,
utilizado en los últimos 3 años para investigar la
cáncer de próstata localizado, y el cáncer de próstata
clasificación de tumores, la progresión del cáncer, y
metastásico.
la resistencia a la quimioterapia y la sensibilidad. En
esta sección ofrecemos tres ejemplos para sensibilidad a los fármacos.
demostrar que los arrays de expresión se pueden
utilizar para obtener una mejor comprensión de la A pesar de los considerables avances en el
biología básica, diagnóstico y tratamiento del cáncer. tratamiento del cáncer, la resistencia adquirida a los
fármacos quimioterapéuticos sigue siendo un
clasificación de tumores Molecular. obstáculo importante en el tratamiento del paciente
y el resultado global. resistencia a los medicamentos
Las mejoras en la clasificación de tumores son
contra el cáncer se cree que ocurre a través de
fundamentales para el desarrollo de nuevos e
numerosos mecanismos, y microarrays de ofrecer un
individualizados enfoques terapéuticos. Tumores
nuevo enfoque para el estudio de los mecanismos
histológicamente indistinguibles a menudo muestran
celulares implicados en estos mecanismos y en la
diferencias significativas en el comportamiento
predicción de sensibilidad a los fármacos y los
clínico y subclasificación de estos tumores en
efectos secundarios inesperados. La mayoría array
función de sus perfiles moleculares pueden ayudar a
studieshave ha llevado a cabo utilizando líneas
explicar por qué estos tumores responden de
celulares de cáncer que se hizo resistente a
medicamentos contra el cáncer comúnmente
usados. Por ejemplo, Kudoh et al. (26) monitoriza los
perfiles de expresión de las células inducida por la
doxorrubicina y cáncer resistente a en un intento de
obtener la huella dactilar molecular de
medicamentos contra el cáncer en células de cáncer.
Scherf et al. (27) analizaron un subconjunto de 1400
genes a partir de un estudio reportado por Ross et
al. (28) y estudiado de la correlación entre los perfiles
de expresión y el mecanismo farmacológico de
acción de un panel de 118 medicamentos contra el
cáncer. Obtener más penetraciones en el
mecanismo de acción de los fármacos contra el
cáncer y las diversas vías implicadas en la
resistencia a fármacos puede eventualmente ser
muy valiosa para el diseño de tratamientos más
estratégicas que son más apropiadas para un tumor
individual.
Identificación de marcadores moleculares
específicos de tumores.
Varios grupos de investigación se han centrado en la
identificación de subconjuntos de genes que
muestran expresión diferencial entre los tejidos
sanos o líneas celulares y sus homólogos tumorales
para identificar biomarcadores para varios tumores
sólidos, incluyendo los carcinomas de ovario (7, 29-
32), cáncer oral (33), melanoma (34), el cáncer
colorrectal (35), y cáncer de próstata (36). En
nuestro estudio reciente (7) realizado en una cohorte
de 13 pacientes con EOC, hemos identificado un
subconjunto de genes que muestran expresión
diferencial entre los ovarios sanos y tumores de
ovario (Fig. 2). Algunos de estos genes, tales como
metalotioneína 1G, que se encontró que ser de hasta
reguladas en muestras de tumores, están implicados
en la resistencia a la cisplatino medicamento contra
el cáncer y podría ser un indicador de la resistencia
de pretratamiento de estos tumores a cisplatino.
Otros genes identificados en nuestro estudio, tales
como el gen de la osteopontina, que fue fuertemente
hasta reguladas en algunas muestras de tumores y
que se ha demostrado (37) para ser secretada en el
suero de pacientes con cáncer metastásico, podría
ser un excelente candidato para biomarcadores de
la progresión tumoral en EOC. Uno de los retos más
importantes investigadores usando el análisis de
microarrays es determinar cuál de la plétora de
nuevos genes expresados diferencialmente es
biológicamente relevante para siendo estudiado el
sistema de tumor. Incluso cuando se hacen
esfuerzos rigurosos para reducir al mínimo el
número de variables en un estudio de microarrays,
puede haber un número inmanejable de los genes
expresados diferencialmente que contribuirán
valores de fondo excesivas. Por lo tanto, la
combinación de análisis de microarrays de expresión
con otros enfoques, en particular las técnicas de
citogenética, tales como cariotipo espectral y el
cromosoma y matriz de hibridación genómica
comparativa (CGH) (2), ofrece la posibilidad de
centrarse en subconjuntos significativamente más
pequeñas de genes de importancia directa para la
biología tumoral (7). Monni et al. (38) y Barlund et al.
(39) utilizaron recientemente una combinación de
arrays de expresión y técnicas de CGH array en
líneas celulares de cáncer de mama y se han
identificado un número limitado de genes que se
amplifican y tanto sobreexpresados. [Para una
revisión, véase Monni et al. (40), como se ilustra en
la Fig. 3]. (39) utilizaron recientemente una
combinación de arrays de expresión y técnicas de
CGH array en líneas celulares de cáncer de mama y
se han identificado un número limitado de genes que
se amplifican y tanto sobreexpresados. [Para una
revisión, véase Monni et al. (40), como se ilustra en
la Fig. 3]. (39) utilizaron recientemente una
combinación de arrays de expresión y técnicas de
CGH array en líneas celulares de cáncer de mama y
se han identificado un número limitado de genes que
se amplifican y tanto sobreexpresados. [Para una
revisión, véase Monni et al. (40), como se ilustra en
la Fig. 3].
Finalmente, la validación de la expresión relativa
obtenida a partir de análisis de microarrays de todo
el genoma es crítica. Varios enfoques pueden ser
elegidos, a partir de análisis de Northern de base o
semicuantitativa de transcripción inversa-PCR para
la hibridación in situ (ISH) usando micromatrices de
tejido. Mousses et al. (41) analizaron recientemente
la expresión de varios genes candidatos asociados
con cáncer de próstata que se habían identificado
previamente por análisis de cDNA microarray.
microarrays de tejidos construidos a partir de 544
biopsias histológicas fueron analizadas por ISH
usando sondas de ARN y / o por inmunohistoquímica
(IHC) utilizando anticuerpos. Hubo una excelente
correlación entre los resultados cDNA microarrays y
los resultados obtenidos con ISH y análisis de
transferencia Northern. Además, la expresión de
proteínas evaluadas por IHC también fue consistente
con la expresión del ARN. Del mismo modo,
Dhanasekaran et al.
Las aplicaciones prácticas y futuras de la
tecnología de microarrays.
El número de estudios basados en microarrays de
identificación de nuevos genes o vías moleculares
implicados en la clasificación de tumores, la
progresión del cáncer, o el resultado del paciente
están creciendo exponencialmente. Nos acercamos
a lo que se conoce como la “era postgenómica”,
durante el cual serán interrogados los genes, y
biomarcadores de pronóstico de respuesta al
tratamiento de diagnóstico identificados por el
cribado de microarrays para proporcionar una
gestión personalizada de los pacientes.
Fig. 3. Detección de genes amplificados y
sobreexpresados por técnicas de microarrays de
ADNc y CGH en la línea celular de cáncer de mama
MCF7.
(A), el número de copias perfil relación para el
cromosoma 17 obtenido a partir de análisis de CGH
convencional indica una gran región de la
amplificación de alto nivel en 17q23. (B), CGH
microarrays (arriba) y cDNA microarray (parte
inferior) Los análisis de la línea celular de cáncer de
mama MCF7. El mismo formato de micromatriz de
ADNc que contiene el cromosoma los genes y EST
17 específica se utiliza para ambos análisis.
Después de la hibridación con ADN marcado con
rojo tumor (CGH microarrays; parte superior) o de
ADNc (cDNA microarray; parte inferior) en contra de
una muestra de referencia con la etiqueta verde, los
genes que se amplifican y sobreexpresados se
visualizan como puntos rojos. Los recuadros
muestran tres regiones en la micromatriz de ADNc
con un aumento mayor, visualizando la amplificación
(paneles de la izquierda) y la sobreexpresión
(paneles de la derecha) de tres genes, MUL,
RPS6KB1, y APPBP2, que se encuentran en 17q23
por ISH de fluorescencia. Esto corresponde a la
misma región en la que la amplificación fue visto por
CGH. (D), de alto nivel de amplificación RPS6KB1
en las células MCF7 como se visualiza por ISH
fluorescencia interfase. De Monni et al. (40).
Fig. 4. Hepsin se sobreexpresa en el cáncer de
próstata.
(A), el análisis de transferencia Northern de hepsin
humana y la normalización con GAPDH. NAP,
próstata normal adyacente; PCA, cáncer de próstata
localizado. (B), microarrays de tejidos utilizados para
el análisis hepsina (tiñeron con hematoxilina y
eosina). (C), elementos representativos de un
microarray de tejido teñidas con anticuerpo anti-
hepsin. IHC demuestra tinción débil o ausente de la
próstata benigna y fuerte tinción en el cáncer de
próstata localizado. (D), las glándulas benignas de la
próstata demuestran una fuerte tinción de células
basales (panel 1) pero la expresión débil en las
células luminales secretoras (panel 2). De
Dhanasekaran et al. (25).
Los médicos serán capaces de utilizar microarrays
durante los primeros ensayos clínicos para confirmar
los mecanismos de acción de los fármacos y para
evaluar la sensibilidad al fármaco y toxicidad. Junto
con el análisis bioquímico más convencional, tal
como IHC y ELISA, microarrays serán utilizados para
los propósitos de diagnóstico y pronóstico. Un
ejemplo reciente de una posible traducción de este
tipo “banco a la cama”, fue publicado por Kim et al.
(42). El gen de la osteopontina, que codifica una
glycophosphoprotein calciumbinding, había sido
identificado por el análisis de microarrays de ADNc
como hasta reguladas en cáncer de ovario (43). En
su estudio, Kim et al. (42) mostraron que el cribado
de muestras de plasma de pacientes con cáncer de
ovario reveló que las concentraciones de proteína
osteopontina en plasma fueron significativamente
mayores en una mayoría de pacientes con cáncer de
ovario en comparación con los controles sanos. Este
estudio demostró el valor potencial de cDNA
microarray análisis en la identificación de genes de
biomarcadores en el cáncer y la viabilidad de
posteriormente pruebas de estos genes a nivel de
proteínas mediante ensayos bioquímicos
convencionales. Aunque los principales factores
limitantes para el uso rutinario en un entorno clínico
en la actualidad son el costo y el acceso a la
tecnología de microarrays, es probable que los
costos disminuirán en un futuro próximo y que la
tecnología será cada vez más fácil de usar y
automatizada.
Conclusión.
La gama de aplicaciones de la tecnología de
microarrays es enorme. Estudios recientes en el
cáncer humano han demostrado que microarrays se
pueden utilizar para desarrollar una nueva
taxonomía molecular de cáncer, incluyendo el
agrupamiento de los cánceres de acuerdo con
grupos de pronóstico sobre la base de perfiles de
expresión génica. La lista de posibles usos de esta
técnica no se limita a la investigación del cáncer. Por
ejemplo, el impacto temporal sobre la expresión
génica por las drogas, las toxinas ambientales, o
oncogenes puede ser dilucidado, y las redes de
regulación y los patrones de coexpresión entonces
puede ser descifrado. En los 6 años desde su
creación, la tecnología de microarrays se ha
convertido en una herramienta importante para la
investigación de la expresión génica global de todos
los aspectos de la enfermedad humana y en la
investigación biomédica.
Agradecemos al Dr. Jim Woodgett y Jason
Gonçalves para la revisión crítica de este
manuscrito.