Preparo de amostras e otimização de

reações de PCR

Natanael Farias
Quais os reagentes necessários para uma reação
de PCR?
 Enzimas utilizadas no mercado
Taq Pfu
DNA-polimerase (1U):
Thermus aquaticus Pyrococcus furiosus
Taq, Pfu, Bst etc. (Chien et al. 1976) (Stetter & Fiala 1986)
Erro: 8.0×10−4 Erro: 1.6 × 10−6
5’  3’ 5’  3’
5’  3’ exo 5’  3’ exo
PCR 3’  5’ exo
R$ 119,00 PCR de alta fidelidade
R$ 898,00

Fonte: Rittié & Perbal, 2008.

 Reagentes necessários para PCR

Tampão (1×):
MgCl2(2 mM) ou MgSO4 (2 mM)
pH 8.4, Tris-HCl e KCl.
 Reagentes necessários para PCR
dNTP (0,4 mM): Iniciadores (0,4 a 1 µM, cada)
dATP, dCTP, dGTP, dTTP. (senso e antissenso)

Água livre de DNase/RNase

DNA (100 – 1000 ng)

 Reagentes necessários para PCR
Considerar

• Validade.

• Número de congelamentos e descongelamentos.

• Contaminação.

• Quantidade:
• Pouca – pouca amplificação;
• Muita – pouca amplificação.
E agora, como fazer PCR?
Se você possui 8 amostras, como irá prepara-las?
 Como preparar um mix?
• Selecionar a quantidade de amostras +2 (C- e volume morto).

O que é o controle negativo?

O que é o volume morto?

 Como preparar um mix?
• Selecionar a quantidade de amostras +2 (C- e volume morto).

• Iniciar a pipetagem SEMPRE do volume MAIOR para o MENOR.

MIX:

1. Pipetar água livre de DNAse e RNAse. 5. Iniciadores (S)

2. Tampão. 6. Iniciadores (AS).
3. MgCl2. 7. Taq.
4. dNTP.

Quando colocar o DNA?

 Como preparar um mix?

MIX Reação 1 Reação 2 Reação 3 Reação 4

+ + + C-
DNA 1 DNA 2 DNA 3
 Como calcular os volumes necessários?
Volume final da reação: 10 µL.

C1 × V1 = C2 ×V2
Concentração Concentração Volumes Finais
Inicial Final para 1 reação
Tampão 10× 1×
MgCl2 50 mM 2 mM ?????
dNTP 10 mM 0,4 mM
Iniciador S 10 µM 0,2 µM
Iniciador AS 10 µM 0,2 µM
Taq* 5 U/µL 1 U/µL
Água - - qsp 9 µL
DNA - - 1 µL
 Prática
1. PCR para o diagnóstico molecular de parasitas do gênero Leishmania.

2. PCR para distinção da espécie de Leishmania: L. major e L. chagasi.

3. RT-PCR para a análise da expressão do gene ACTB (β-actina).

4. RT-PCR para análise da expressão do gene NOS (óxido nítrico sintase).

5. PCR para identificação de um alelo específico do gene DEF (defensina)

relacionado à resistência à leishmaniose.
Prática – calculando os volumes necessários
Volume final da reação: 25 µL.
Concentração Concentração Volumes Finais
Inicial Final para 1 reação
Tampão 10× 1×
MgCl2 50 mM 2 mM
dNTP 10 mM 0,4 mM
Iniciador S 10 µM 0,2 µM
Iniciador AS 10 µM 0,2 µM
Taq* 5 U/µL 1 U/µL
Água - - qsp 20 µL
DNA - - 5 µL