Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
1 (2010) - curs
o 1. Date istorice privind microbiologia (MI Popa) - 3
o 2. Structura celulei bacteriene (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 17
o 3. Fiziologia bacteriană (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 31
o 4. Acţiunea factorilor fizici, chimici şi biologici asupra bacteriilor (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 47
o 5. Genetica bacteriană (Gabriela Loredana Popa) - 63
o 6. Antibiotice şi Chimioterapice (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 76
o 7. Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice – 100
o 8. Relaţiile microorganism - gazdă (Mara Mădălina Oanea, Gabriela Loredana Popa) - 112
o 9. Patogenitate şi Virulenţă (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 124
o Noţiuni de imunologie - 138
o 10. Organele cu rol în imunitate (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Roxana Micuț) - 142
o 11. Celulele imunităţii (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 151
o 12. Complexul major de histocompatibilitate (MHC); Sistemul HLA (MI Popa) - 165
o 13. Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi (A Muntean, MI Popa) - 172
o 14. Imunoglobulinele (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 185
o 15. Sistemul complement (MI Popa, Roxana Micuț) - 196
o 16. Antigenele (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 207
o 17. Răspunsul imun umoral şi celular (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) -221
o 18. Reacţiile de hipersensibilitate (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 233
o 19. Reacţii antigen - anticorp utilizate în microbiologie (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) -254
o 20. Reacţii de precipitare şi reacţii de aglutinare (Gabriela Loredana, MI Popa) - 260
o 21. Reacţii care utilizează sistemul complement (MI Popa) - 268
o 22. Reacţia de seroneutralizare (MI Popa) - 271
o
o
23. Inflamaţia
24. Reacţii Ag-Ac cu reactivi
şi procesul marcaţi(MI
infecţios (MI Popa)
Popa, - 273 Bara, Milena Tocuț) - 274
Andreea
o 25. Toleranța imună (A Muntean) - 291
o 26. Diagnosticul în bolile infecţioase – prima parte (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 302
o 27. Diagnosticul în bolile infecţioase – partea a 2-a (MI Popa, Anca Streinu-Cercel, Oana Streinu-Cercel,
Gabriela Loredana Popa) - 305
o 28. Prezentare generală a principalelor microorganisme studiate; necesitatea studierii microbiologiei (MI
Popa) - 316
o 29. Genul Staphylococcus (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Anca Streinu-Cercel, Oana Streinu-Cercel) -
318
o 30. Genul Streptococcus. Streptococcus pyogenes (Gabriela Loredana Popa, Marina Pană, MI Popa, Maria
Ghiţă) - 322
o 31. Streptococcus pneumoniae (Gabriela Loredana Popa, Marina Pană, MI Popa) - 342
o 32. Genul Neisseria. Neisseria meningitidis. Neisseria gonorrhoeae (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) -
345
o 33. Familia Enterobacteriaceae. Caractere generale. (Gabriela Loredana Popa) - 354
o 34. Genul Escherichia. Escherichia coli (Gabriela Loredana Popa, Codruța Usein, MI Popa) - 357
o 35. Genul Klebsiella. Klebsiella pneumoniae. (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, A Muntean) - 360
o
36. Genul Proteus (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 364
o 39. Genul Salmonella (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 366
o 40. Genul Shigella (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 369
o 41. Genul Yersinia (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 371
o 42. Genul Acinetobacter (Alina Neguţ) - 373
o 43. Genul Pseudomonas. Pseudomonas aeruginosa (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 373
o 44. Genul Vibrio (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 375
o 45. Genul Campylobacter. Genul Helicobacter. Helicobacter pylori (Gabriela Loredana Popa, Mădălina
Nodea) - 378
1
o 46. Bacilii Gram-pozitivi nesporulaţi. Genul Corynebacterium (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Cristiana
Cerasella Dragomirescu) - 383
o 47. Alţi bacili Gram-pozitivi nesporulaţi de importanţă medicală (Gabriela Loredana Popa, Alina Borcan,
MI Popa) - 385
o 49. Genul Clostridium. Clostridium tetani (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 386
o 50. Clostridium botulinum (Gabriela Loredana Popa) - 392
o 51. Clostridiile gangrenei gazoase (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 396
o 52. Genul Mycobacterium. Mycobacterium tuberculosis (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Henriette
Stavri, D Stavri) - 410
o 53. Germeni spiralaţi. Genul Treponema. Treponema pallidum (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 422
o 54. Genul Borrelia (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 436
o
2
Există organisme şi microorganisme vii care au dimensiuni atât de mici încât nu pot fi observate
decât la microscop (optic sau electronic). Între aceste microorganisme putem discuta despre
alge, fungi, bacterii, virusuri şi paraziţi. Relativ de curând au intrat în discuţie şi alte structuri
Se consideră că microorganismele sunt dintre cele mai vechi, numeroase şi diversificate forme
de viaţă. Pot fi identificate în mediul înconjurător, au rol în descompunerea materiei organice şi
menţin fertilitatea solulului. Majoritatea microorganismelor sunt utile global sau făcând parte
din flora normală a diferitelor gazde; o mai mică parte sunt implicate, în diferite grade, în
patologie. În acest caz, bolile infecţioase pot să afecteze o persoană, un grup de persoane sau o
întreagă comunitate. Pe măsură ce bolile infecţioase au fost identificate a apărut şi disciplina de
epidemiologie, născută din necesitatea studiului izbucnirilor epidemice. Datorită faptului că
iniţial nu era cunoscută etiologia epidemiilor, acestea au fost considerate drept fenomene ale
naturii, invazii asupra poporului (de la cuvintele grecesti epi -pe, peste, demos - popor). Există o
serie de documente istorice care atestă existenţa epidemiologiei ca ştiinţă privind patologia în
masă, precum tratatele lui Hipocrate (460-377 înainte de Iisus Christos), cele 7 cărţi „Despre
epidemii” şi „Despre aeri, apă şi locuri”.
Microbiologia a avansat continuu, de la nivelul unei ştiinţe relativ simple la un nivel care a
determinat progrese însemnate în diagnosticul, prevenirea şi tratamentul bolilor. În bună parte
datorită aplicaţiilor microbiologiei, speranţa de viaţă a crescut semnificativ. La începutul
secolului, se înregistrau frecvent decese datorită unor cauze infecţioase (difterie, oreion, pestă,
poliomielită, rubeolă, rujeolă, tifos exantematic, tuberculoză, sifilis, varicelă, variolă, etc).
Pentru poliomielită a fost stabilită ţinta eradicării, iniţial pentru anul 2000, ulterior pentru 2012.
Izbucnirea epidemică din 2010 ”a împins” această ţintă peste alţi ani (unica boală infecțioasă
eradicată rămâne variola).
Pentru alte maladii sunt propuse alte ţinte de prevenire şi control iar evoluţia gravă, letală,
survine numai în anumite situaţii (forme clinice avansate, atipice, neglijate).
3
sintetizeze structuri de tipul anticorpilor. Studiul bacteriologic a trecut de la un nivel morfologic,
celular la unul biochimic, molecular.
Microbiologia ca ştiinţă este strict necesară pentru sănătate, pentru menţinerea sănătăţii şi
prevenirea îmbolnăvirilor. Cunoaşterea modului de transmitere a diferitelor microorganisme
reduce numărul cazurilor de toxoplasmoză, tuberculoză sau gripă. Cunoaşterea noţiunilor
privind sterilizarea-antisepsia-dezinfecţia poate permite (în cazul aplicării corecte în practică a
acestor noţiuni) evitarea infecţiilor de spital sau a altor infecţii produse în unităţi sanitare cu sau
fără paturi. Cunoaşterea imunologiei şi imunopatologiei permite înţelegerea legăturilor şi
interrelaţiilor
supraveghereamicroorganism-gazdă, precum
aplicării acestora. Măsurile şi importanţa
generale aplicateprocedeelor de imunizare
pentru evitarea apariției şi
bolilor
infecțioase sau a transmiterii ulterioare trebuie bazate pe un nivel avansat de cunoștințe
microbiologice.
Studiul microbiologiei nu este dificil în cazul în care se înţelege faptul că microbiologia este o
ştiinţă foarte logică (cele mai multe principii pot fi învăţate prin simpla înţelegere a acesto ra). Pe
de altă parte, pe măsură ce reuşeşti să îi descifrezi o parte dintre taine poţi realiza că este una
dintre cele mai fascinante ştiinţe.
În 1665 Robert Hooke a observat pentru prima oară celulele, el a studiat o secţiune dintr-un dop
de plută şi a descoperit că structura plutei era formată din nişte „cutii” micuţe.
Antony van Leeuwenhoek (1632-1723), dorind să examineze ţesătura hainelor fine (deşi era la
bază un vânzător de mărunţişuri), se pare că a fost prima persoană care a văzut şi a descris
diferite microorganisme. Microscopul realizat de van Leeuwenhoek, instrument pe care l-a
construit singur, a constat dintr-o lentilă biconvexă într-un cadru metalic, cu o mărire de până la
270 de ori. Cu acest microscop a examinat iniţial diferite ţesături, însă manifestând o curiozitate
deosebită a dorit să studieze ulterior apa din bălţi, tartrul dentar, materiile fecale provenite de
la un pacient cu „dizenterie”, etc. A fost mirat să observe în toate aceste substanţe, mici
organisme sferice, altele în formă de „bastonaş”, spirale, unele aflate în mişcare rapidă, pe care
le-a numit „animalicule”. Desenele pe care le-a făcut probează că a observat cu adevărat
bacterii, protozoare şi alte microorganisme. Pornind de la condiţia sa iniţială, pe parcursul a
circa 4 decade, Antony van Leeuwenhoek a redactat 125 de scrisori traduse în engleză şi
predate Societăţii Regale din Londra. în plus, 27 dintre lucrările sale au fost publicate în
Memoriile Academiei Franceze de ştiinţe. Se pare că unul dintre microscoapele srcinale ale lui
van Leeuwenhoek se află în muzeul Universităţii din Utrecht.
În urma descoperirilor lui Leeuwenhoek s-a pus întrebarea „de unde au apărut aceste
organisme?”. Până la mijlocul secolului al nouăsprezecelea cea mai acceptată teorie a fost
„teoria generaţiei spontane”. Învăţaţii epocii credeau că bacteriile apăreau spontan din materie
anorganică. În 1858 Rudolf Virchof a introdus termenul de „biogeneză”. Această teorie susținea
faptul că un organism viu poate să apară numai din alt organism viu. Controversele între cele
două teorii s-au păstrat până în 1861 când Pasteur a infirmat ”teoria generaţiei spontane”.
4
Geniul lui Pasteur a demonstrat că aerul contaminat cu microorganisme poate cotamina o
soluţie sterilă, în schimb aerul steril nu poate să determine apariția unor bacterii.
Regulile principale (unele valabile şi astăzi) precum şi metodele ştiinţei microbiologice inclusiv
principiile imunizării, utilizarea microbiologiei în medicina preventivă, prevenirea şi controlul
bolilor infecţioase se bazează pe activitatea a doi cercetători înzestraţi atât cu geniu cât şi cu
tenacitate, probabil având şi şansa de a fi trăit în „perioada marilor descoperiri”, Louis Pasteur
(1822-1895) şi Robert Koch (1843-1910). Pe bună dreptate, perioada 1857-1914 e considerată
drept ”epoca de aur a microbiologiei”.
Louis Pasteur a fost un chimist francez devenit faimos prin descoperirea polarimetriei. Tot el a
demonstrat că fermentaţia şi putrefacţia sunt cauzate de organisme vii şi a notat o asemănare
între aceste procese şi bolile infecţioase luând în discuţie degradarea vinurilor şi berii ca şi „boli”
ale acestor produse. Pasteur a fost cel care a realizat un experiment prin care a arătat că, atât
cât era cunoscut pe baza datelor disponibile, organismele vii au luat naştere numai din
organisme vii, şi nu din materie moartă. În 1861 a descoperit fenomenul de anaerobioză şi
fermentarea butirică (produsă de Vibrion butyrique, numit ulterior Clostridium butyricum).
După elaborarea procedeului numit „pasteurizare”, a expus în 1877 teoria pasteuriană cu privire
la germeni desfiinţând (așa cum am mai menționat) „teoria generaţiei spontanee”. Utilizând
substanţe simple, de srcine naturală şi gaze, vapori şi arcuri electrice sub temperatură şi
presiune crescută, microbiologii şi biochimiştii pot sintetiza o serie de compuşi organici care au
fost descoperiţi iniţial doar în celulele vii. După studiul fermentării vinului, Pasteur a investigat o
boală transmisibilă la viermii de mătase şi ca rezultat a formulat teoria legată de implicarea
germenilor în producerea unor boli. În ceea ce priveşte maladiile umane, a insistat ca bandajele
să fie curăţate şi instrumentele din spital să fie fierte.
Louis Pasteur a demonstrat în anul 1857, la aproape o jumătate de secol după lucrările
redactate despre vaccinare de către Edward Jenner, legătura dintre infecţii şi microorganismele
susceptibile a fi cultivate şi studiate. în diferite experimente ingenioase, Pasteur a protejat de
antrax diferite ierbivore prin vaccinarea cu un preparat extras din Bacillus anthracis.
„Tratamentul profilactic” al rabiei a fost dezvoltat prin injectarea de material uscat obţinut din
măduva spinării de la animalele care au murit de rabie. Joseph Meister, un băiat muşcat de un
câine turbat, a fost primul om a cărui viaţă a fost salvată prin aceastăanaerobe
metodă fiind protejat de
injecţiile făcute de Louis Pasteur. Tot Pasteur a descoperit bacteriile şi a studiat
septicemia şi gangrena. Ca atare, a devenit posibilă punerea la punct a tehnicilor de distrugere
şi de control al diferiţilor germeni (stafilococi, streptococi, pneumococi etc). În 1880, Louis
Pasteur a demonstrat că putem fi protejaţi contra bolilor infecţioase prin injectarea unor
germeni atenuaţi.
Primul medic care a observat transmiterea infecţiilor în instituții sanitare a fost Ignaz
Semmelweis. Femeile ce nășteau acasă sufereau mai puține infecții comparativ cu cele ce
5
nășteau la spital. A impus spălarea riguroasă şi ”dezinfectarea” cu clor a mâinilor personalului
înainte de a aplica intra în sala de naștere sau de a consulta o femeie însărcinată.
Chirurgul englez Joseph Lister (1827-1912) a aplicat descoperirile lui Pasteur în chirurgie chiar
înainte ca bacteriile care determină infecţiiile chirurgicale (nosocomiale) să fi fost descoperite.
Lucrările lui Lister reprezintă baza tehnicii chirurgicale aseptice din ziua de astăzi.
Ferdinand Cohn (1828-1898) a fost unul dintre cei mai renumiţi microbiologi germani. El a
extins cercetările lui Pasteur lucrând cu bacterii, alge şi fungi. Fiind foarte interesat de
bacteriologie, a scris una dintre primele cărţi referitoare la bacterii, realizând una dintre primele
clasificări bacteriene în genuri şi specii. Cohn a reprezentat un mare sprijin pentru Robert Koch,
încurajându-l să îşi publice lucrările cu privire la antrax.
Cu două secole înainte de apariţia bacteriologiei, Robert Boyle a sugerat că anumite boli sunt
provocate de organisme vii. Anatomistul Henle a sugerat că bolile infecţioase ar putea fi
determinate direct de către microorganisme.
Robert Koch i-a fost student lui Henle; a asigurat toate datele necesare pentru a demonstra
„teoria microbiană a bolii”. Dezvoltarea metodelor pentru izolarea bacteriilor în cultura pură a
fost printre cele mai importante descoperiri ale tehnicilor microbiologice şi a fost în mare parte
opera lui Robert Koch. O cultură pură de microorganisme se dezvoltă atunci când pornim de la
un singur tip de microorganism care se dezvoltă în eprubetele test sau în plăcile cu mediu de
cultură (în colonii izolate). în condiţii naturale, mai multe microorganisme din specii diferite pot
coexista în acelaşi mediu. Spre exemplu, în materiile fecale ale unui pacient cu febră tifoidă,
Salmonella typhi se şi
bacteriene (aerobe află „amestecată”
anaerobe) cu un
sau chiar număr
şi alte extrem
forme de mare de celule
de microorganisme. Îndin alte specii
cadrul
diagnosticului medical microbiologic este importantă izolarea în cultură pură a germenilor
patogeni. În exemplul menţionat, pentru diagnostic este necesară folosirea metodelor care
permit izolarea S. typhi în cultură pură, singura care permite identificarea şi stabilirea
sensibilităţii / rezistenţei la antibiotice şi chimioterapice. în 1876 Koch a izolat în „cultură pură”
bacteria care determină antraxul. Pornind de la splina recoltată de la vite infectate şi procesată
pentru a permite obţinerea unui produs patologic; a fost capabil să infecteze şoareci de
laborator utilizând această cultură. Implicat în cercetarea etiologiei exacte a bolilor infecţioase,
Robert Koch a rezumat ceea ce a considerat că reprezintă datele esenţiale pentru a demonstra
că un anume germen este cauza unei infecţii. Aceste date sunt cuprinse în patru postulate,
denumite Postulatele lui Koch, respectiv:
2. Microorganismul trebuie să poată fi izolat de la victimele bolii, în cultură pură, pentru studiul
în laborator;
3. Când cultura este inoculată la un animal susceptibil, trebuie să reproducă boala (sau, cum s -a
stabilit ulterior, să inducă apariţia anticorpilor specifici la noua gazdă);
4. Microorganismul trebuie să poată fi izolat din nou în cultura pură din infecţia produsă
experimental.
6
Utilizând aceste reguli precum şi diferitele tehnici microbiologice, Koch a descoperit bacilul
tuberculos (bacilul Koch), bacilul holeric, etc., precum şi modul de transmitere pentru
numeroase alte boli infecţioase (Babessia, Trypanosoma, Plasmodium etc.). Descoperirile
menţionate au reprezentat debutul bacteriologiei, micologiei, virusologiei, parazitologiei şi
imunologiei ca ştiinţe. în doar aproximativ 15 ani (după 1880) au fost descoperite şi izolate în
cultură pură microorganisme implicate în multe dintre bolile infecţioase importante. Aceste
descoperiri au făcut posibilă stabilirea ca entităţi bine definite a medicinei preventive şi
respectiv a terapiei specifice (etiologice).
Ilia
prinMecinikov a evidenţiat
anumite celule care aumodul natural
proprietăţi de apărare
fagocitare şi aascris
organismului faţă de
în 1901 primul agenţii
tratat de infecţioşi
imunologie.
În şcoala germană apar o serie de nume celebre, cum ar fi Behring, care a studiat toxinele
bacteriene, imunitatea umorală şi seroterapia precum şi Paul Ehrlich (1854 -1915). Cercetările lui
Ehrlich stau la baza chimioterapiei antimicrobiene. Prin utilizarea derivaţilor arsenicali în
tratamentul sifilisului ipotezele sale au fost confirmate. Mai mult decât atât, în anul 1878 Ehrlich
realizează că există diferenţe de afinitate tinctorială faţă de coloranţii pe bază de anilină.
Această descoperire îl ajută să studieze efectul diferitelor substanţe chimice, dar stă şi la baza
apariţiei coloraţiilor în microbiologie.
Ehrlich arată că mycobacteriile au proprietatea de acido-rezistenţă iar doi ani mai târziu (1884),
cercetătorul danez Christian Gram pune bazele coloraţiei care îi poartă numele şi care are o
remarcabilă utilitate după aproape 125 ani de la această descoperire.
Deşi asistenţa
pământ, medicală
începuturile într-o anumită
nursing-ului formă aauexistat
profesional încă de la
fost realizate dedebutul vieţii umane
către Florence pe
Nightingale
(1820-1910), care a început munca sa cu mai bine de 140 de ani în urmă, în cursul războiului din
Crimeea (1854-1856). Descoperirile ulterioare, privind relaţia dintre microorganisme şi boală, au
necesitat dezvoltarea unor proceduri de nursing mai complexe şi mai rafinate decât cele
utilizate de „îngerii din Crimeea”.
7
metode pentru colectarea produselor şi raportarea specifică de laborator, astfel încât terapia să
demareze cât mai precoce. Descoperirea de substanţe chimice specifice (de exemplu
sulfonamidele, Domagk 1935) şi substanţe antibiotice (de exemplu penicilina, streptomicina,
tetraciclina şi cloramfenicolul) a contribuit la îmbunătăţirea modului de abordare medicală a
problematicii bolilor infecţioase. Primul medicament anti-tuberculos este descoperit în anul
1944 (streptomicina - Scharty, Bugie, Waksman).
sistemelor
acumulate deprinapă şi tratarea apelor
microbiologie poluate
în cursul suntsecol.
ultimului posibile numaimoduri
în multe datorităprofesiunea
cunoştinţe lor
medicală şi
fiecare latură a ei este dependentă de cunoaşterea, înţelegerea şi utilizarea informaţiilor din
microbiologie.
Victor Babeş s-a născut la Viena în anul 1854, a studiat la Facultatea de medicină din Budapesta,
apoi în Viena unde a fost numit preparator la catedra de Anatomie condusă de profesorul
Lauder. Ulterior este recomandat pentru a deveni asistent la catedra de Anatomie patologică la
Facultatea de medicină din Budapesta. A fost în acelaşi timp anatomopatolog şi microbiolog. A
fost atât elevul lui Robert Koch, cât şi al lui Louis Pasteur. A fost numit docent şi profesor la
Facultatea de medicină din Budapesta la o vârstă foarte tânără (27 ani). Cu p atru ani mai târziu,
în anul 1885, publică împreună cu A.V. Cornil primul tratat de bacteriologie medicală din lume
(în 1891 apare a treia ediţie a tratatului). A doua ediţie a acestui tratat se află în Biblioteca
Institutului Naţional de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie şi Imunologie „Cantacuzino”.
Victor Babeş a demonstrat importanţa introducerii tehnicilor microbiologice în
anatomopatologie. Ar putea fi menţionat şi faptul că pe parcursul celor 10 ani de activitate la
Facultatea din Budapesta, a dat indicaţiile necesare pentru construirea unui nou Institut de
anatomie patologică iar în cadrul acestuia a unei secţii dedicate bacteriologiei. A evidenţiat
proprietăţile neutralizante ale serurilor imune, a descoperit corpusculii metacromatici ai
bacilului difteric (Babeş-Ernst), o nouă metodă de preparare a serului antidifteric etc. în 1886 a
fost numit profesor de anatomie patologică şi bacteriologie la Facultatea de Medicină din
Bucureşti. Este fondatorul Institutului de Bacteriologie pe baza căruia s-a dezvoltat actualul
Institut „Victor Babeş”. În 1889 a preparat vaccin antirabic, ţara noastră fiind a treia ţară din
lume care a reuşit să prepare acest vaccin. A condus institutul creat până aproape de sfârşitul
zilelor sale, care a fost la puţin timp după pensionarea sa.
Din păcate, în ciuda monumentalității sale, ”nu a fost posibil” să fie găsit un spațiu în care să -şi
poată continua cercetările şi după pensionare, lucru din păcate mult prea des întâlnit în istoria
medicinei noastre.
Cu privire la poziţia acestui mare cercetător precum şi la situaţii care par a fi foarte
asemănătoare peste ani, în ciuda trecerii timpului şi a speranţei că evoluţia societăţii noastre
este într-o direcţie pozitivă, vom prezenta în continuare un fragment din discursul profesorului
Victor Babeş, ţinut la Universitatea din Cluj în anul 1919. „Astăzi lumea civilizată aşteaptă deci
8
lucruri mari din partea noastră; nu îmbogăţirea oligarhiei politice în afaceri, certuri politice,
persecuţiuni şi denunţuri infame pentru interese egoiste şi înguste, ci păstrarea şi sporirea celor
mai valoroase achiziţiuni ale omenirii: sănătatea, prosperitatea, forţa, justiţia, instrucţiunea şi
ştiinţa, spre a asigura pacea şi progresul şi prin ele forţa şi fericirea poporului român, servind de
exemplu popoarelor din Orient.
Dar politica noastră de până acum n-a făcut decât să ne ducă în cea mai mare desorganizare,
desbinare şi dezastru economic, permiţând prin egoism şi nepăsare ca ţărănimea să fie azi
degenerată, analfabetă, lipsită şi îndatorată peste măsură; politicienii noştri au reuşit să oprime
toate valorile,
nepotismul înlocuindu-le
la culme; prin noştri
politicienii clientela lor politică;loraupentru
în nepăsarea adus funcţionarismul, birocratismul,
interesele ţării au lăsat armata la
începutul războiului aproape nepregătită în clipele cele mai periculoase prin care a trecut ţara şi
din care nu ne-a scăpat decât vitejia fără pereche a soldatului român.
Trebue să ne întrebăm dacă nu acest politicianism este cauza tuturor relelor şi dacă nu este o
datorie patriotică să întrebuinţăm toate mijloacele necesare ca să-l nimicim şi să-l înlocuim cu o
altă putere care să ne garanteze regenerarea şi progresul.
În adevăr trebue să fim profund îngrijaţi şi să ne întrebăm înainte de toate cum vom putea să
eşim din acest dezastru şi cum vom putea face faţă creanţei mari pe care am contractat-o faţă
de lumea civilizată.
Publicul care, până deunăzi, a observat la guvernanţii noştri aceleaşi viţiuri politice, aceeaşi
nepăsare pentru interesele reale ale ţării, acelaşi nepotism, aceeaşi venalitate, acelaşi egoism
Faţă de aceste adevăruri ar fi trebuit să ne aşteptăm ca România nouă să pună piciorul în prag şi
să rupă odată pentru totdeauna cu vechiul politicianism. Însă ce vedem spre profunda noastră
descurajare; că aceeaşi principii dezastruoase, egoiste, aceeaşi fraze goale domină şi politica de
astăzi şi că mergem orbi înainte spre un dezastru sigur. În loc ca întinderea şi bogăţia acestei ţări
binecuvântate să ne asigure un loc de frunte şi stare economică briliantă, ne găsim astăzi în
deplin faliment, expuşi ruinei şi foametei şi mai mult decât oricând sub dependenţa şi
exploatarea nemiloasă a naţiunilor mari.”
Ion Cantacuzino a avut o personalitate cu totul deosebită, imposibil de cuprins într -o trecere
atât de sumară prin istoricul microbiologiei. A studiat la Paris Filozofia şi Literele, ştiinţele
naturale şi Medicina. Pregătirea în microbiologie a desăvârşit-o pe parcursul a 9 ani, în
laboratorul lui Ilia Mecinikov, la Paris. A cunoscut mai multe limbi străine, inclusiv latina şi
greaca. A studiat la Paris şi a revenit în ţară pentru satisfacerea stagiului militar (genişti, Jilava).
A continuat studiile în Franţa (ştiinţe naturale 1886, medicină 1887). Lucrează în Institutul
Pasteur începând cu 1892, devine doctor în medicină în 1894 şi este numit profesor suplinitor
de Morfologie animală la Facultatea de Ştiinţe din Iaşi (1894). A fost numit profesor la
Facultatea de Medicină din Bucureşti în anul 1901 şi a grupat în jurul său un mare număr de
tineri medici, care au devenit la rândul lor îndrumători şi creatori de şcoală (Al. Slătineanu, C.
9
Ionescu-Mihăieşti, M. Ciucă, Al. Ciucă, D. Danielopolu, D. Combiescu, N. Gh. Lupu, I. Bălteanu, I.
Nicolau, Lidia şi I. Mesrobeanu şi mulţi alţii).
combaterea epidemiilor
prepararea serurilor de holeră, tifosşiexantematic,
antimeningococic febră
anti gangrenos (în recurentă.
LaboratorulÎnde
1920 începe
Medicină
experimentală) iar în data de 4 iunie semnează în calitate de prim delegat, Tratatul de la
Trianon. Un an mai târziu se înfiinţează Institutul de Seruri şi Vaccinuri, în 1926 începe
vaccinarea BCG în România iar în 1928 înfiinţează „Archives Roumaines de Pathologie
Expérimentale et de Microbiologie”. Din păcate, în momentul de faţă „Romanian Archives of
Microbiology and Immunology” (numele actual al revistei, care a ajuns la volumul cu numărul
69) nu apare listată între publicaţiile recunoscute oficial în ţara noastră, cu toate că începând cu
anul 2005 a existat un reviriment, comitetul editorial străduindu-se să refacă prestigiul revistei,
ca o datorie morală faţă de înaintaşi.
În perioada 1931-1932 face parte din Guvernul prezidat de Nicolae Iorga, în calitate de ministru
al sănătăţii publice. Lucrează la elaborarea unei noi legi sanitare. Cu numai nouă zile înainte de a
înceta din viaţă prezidează Congresul de Tuberculoză şi propune înfiinţarea Ligii contra
Tuberculozei.
Pe lângă şcoala pe care a format-o, una dintre cele mai mari realizări ale Profesorului
Cantacuzino a fost înfiinţarea în anul 1921 a Institutului de Seruri şi Vaccinuri, numit astăzi
INCDMI „Cantacuzino” (Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie şi
Imunologie), centru de cercetare ştiinţifică fundamentală şi aplicativă, centru de învăţământ de
specialitate, instituţie care a preparat şi prepară seruri, vaccinuri şi alte produse biologice utile
în diagnosticul bolilor transmisibile.
10
Alexandru Ciucă (1880-1872) a absolvit facultatea de medicină veterinară din Bucureşti.
Activitatea lui s-a îndreptat mai ales spre organizarea producţiei de seruri hiperimune pentru
tratamentul tetanosului, difteriei etc. A fost al treilea director al Institutului Cantacuzino.
Dumitru Combiescu (1887-1961) a cercetat capitole majore ale patologiei infecţioase (febra
tifoidă, febra recurentă, dizenteria, tetanosul, antraxul, gangrena gazoasă etc). A avut
contribuţii deosebite în domeniul rickettsiozelor şi leptospirozelor. În timpul primului război
mondial a organizat măsuri de prevenire a tifosului exantematic.
Matei Balş (1905-1989) a fost cea mai proeminentă personalitate a secolului XX, în România, în
domeniul bolilor infecţioase. A făcut un stagiu de microbiologie la Institutul Pasteur din Paris şi
ulterior a intrat între personalităţile cu formaţie „cantacuzinistă”, lucrând alături de Ion
Cantacuzino, Mihai Ciucă, I. Bălteanu. Deşi era un foarte bun clinician a devenit şi întemeietorul
şcolii moderne de bacteriologie clinică. Tehnicile şi metodele de diagnostic imaginate i-au adus
numeroase brevete şi inovaţii care îi poartă numele atât în ţară cât şi în străinătate.
Şcoala astfel întemeiată a avut o activitate cu rezultate excepţionale pentru ştiinţa românească,
pentru microbiologie şi pentru sănătatea publică.
Cercetările lui au cuprins descrierea rolului şi structurii mai multor organite (mitocondria în
detaliu cu structura membranei și a cristelor, a definit rolul reticulului endoplasmic, sistem
tubular ce este prezent in orice celula animală sau vegetală). Într-un articol publicat în 1955,
Palade a prezentat o fotografie de microscopie electronică ce reprezenta reticulul endoplasmic
rugos şi a explicat legătura între cele 2 structuri şi rolul lor în eliberarea produşilor de secreţie).
Cea mai importantă a fost descoperirea rolului corpusculilor citoplasmatici, denumiţi iniţial
”corpusculii lui Palade”. A precizat compoziția lor esențială (acizi ribonucleici) rezultând altfel
denumirea de „ribozomi”.
În 1974 realizările sale sunt încununate cu premiul Nobel pentru Medicină şi Fiziologie.
11
Datorită eforturilor depuse, incidenţa şi prevalenţa anumitor boli infecţioase a scăzut. Trebuie
avută însă în vedere emergenţa şi re-emergenţa diferitelor maladii.
instituţiile
de urgenţăunde sunt îngrijiţi
(de exemplu în cazcopii mici sau
de război foarte
sau mici, cum produse
alte calamităţi pot fi modificate
de om sauacestea în condiţii
calamităţi
naturale) şi cum trebuie făcută informarea pacienţilor, populaţiei, de exemplu referitor la
imunizări. Un membru antrenat al echipei medicale poate să diferenţieze adevărul de
interpretarea greşită şi / sau dezinformarea din aşa-zisa „literatură medicală” scrisă pentru
publicul larg şi poate recunoaşte erorile apărute în mass media, dacă are noţiunile necesare de
microbiologie.
Persoanele care lucrează în domeniul sanitar dar şi orice altă persoană realmente interesată,
constată sau pot constata că în aproape orice activitate cotidiană există o aplicabilitate a
cunoştinţelor microbiologice.
S-a născut într-o veche familie de medici. A fost coleg la Facultatea de Medicină cu Nicolaus
Copernicus (astronom şi medic). S-a ocupat atât de medicină cât şi de astronomie, matematică,
poezie, geografie, muzică etc.
Poate fi considerat un bun diagnostician; este primul medic care a făcut diferenţa între ciumă şi
tifosul exantematic (au existat 2 izbucniri epidemice de tifos, analizat e de această minte
luminată, în 1505 şi în 1528). Se poate spune că a descris corect din punct de vedere
epidemiologic, în lumina datelor cunoscute la acea vreme, ciuma, variola, febra tifoidă şi tifosul
exantematic.
A scris mai multe lucrări în domeniul medical, care cuprind informaţii incredibil de corecte,
dintre care unele au fost confirmate ulterior aproape în totalitate.
Prima dintre aceste lucrări a fost scrisă în versuri şi se pare că a fost publicată la Veneţia
[Syphilis sive morbus Gallicus (Sifilisul sau boala galică), 1530, trei volume; numele se datorează
faptului că se presupune că sifilisul ar fi fost răspândit în Italia de trupe franceze asediatoare]. În
primele două volume, Fracastoro descrie cu bune amănunte sifilisul; a descris şi luesul c a
entitate în cadrul acestei patologii, a discutat modalităţile de debut şi chiar diferenţele între cele
trei stadii ale bolii. Apar menţionate şi informaţii despre modalităţi de diagnostic şi „tratament”
(vapori de mercur, mixturi din sulf, mercur şi extracte vegetale etc). În această scriere sunt
discutate chiar şi metode de prevenţie. În al treilea volum, Girolamo Fracastoro prezintă date
12
privind călătoriile lui Columb în Indiile de Vest (se pare că boala era foarte răspândită printre
băştinaşi) dar şi o poveste din mitologie, povestea păstorului Syphil (numele sifilisului are, se
pare, o vechime foarte mare) care a fost pedepsit de zeul Apollo, tocmai prin această boală.
„miasmelor
căreia bolilemorbigene”
contagioaseasunt
lui Hipocrate
transmiseeste
princombătută
intermediuliarunor
Fracastoro emite ipoteza
„fiinţe invizibile” conform
[Seminaria
morborum (seminţele bolilor)]. După mai mult de 130 de ani, Antony van Leeuwenhoeck
utilizează microscopul pentru a studia câteva dintre microorganisme. În plus, Girolamo
Fracastoro discută căile de intrare a „seminţelor bolii” în organism: a. pe gură, b. prin respiraţie,
c. prin răni, d. direct prin piele. Mai mult decât atât, clasifică „contagiul” drep t fiind de trei
feluri: a. prin contact direct (ex. în tuberculoză, lepră, sifilis); b. prin contact indirect, prin
fomites (haine, aşternuturi, farfurii) şi c. la distanţă („seminţele morbigene” fiind purtate la
distanţă de către vânt, ploaie, apa râurilor etc., ca în cazul ciumei). Cu toate că a oferit incredibil
de multe explicaţii, cu toate că teoriile sale au fost în bună parte confirmate ulterior, la acea
vreme nu au fost acceptate iar teoria „miasmelor morbigene” a fost pentru încă mult timp
considerată ca fiind valabilă.
revenire sus
Alături de Louis Pasteur poate fi considerat “părintele bacteriologiei”. În 1905 meritele sale au
fost recunoscute, primind premiul Nobel, acordat pentru cercetările în domeniul tuberculozei.
S-a născut în 1843 în Clausthal. A studiat medicina la universitatea din Gottingen şi Hanovra iar
în 1866 a absolvit facultatea şi a fost numit medic de circumscripţie. A practicat medicina în mai
multe localităţi germane. În 1868 s-a stabilit în Wolstein (astăzi această localitate se află în
Polonia). În timpul şederii la Wolstein a studiat Bacillus anthracis într-un laborator improvizat în
propria locuinţa. Aici a creat celebrele postulate.
Bacillus anthracis a fost descoperit de Pollender, Reyer şi Davaine dar Robert Koch a fost cel ce a
demonstrat că această bacterie e cauza îmbolnăvirilor cu antrax “cărbune” (nume dat datorită
culorii închise a leziunilor din această boală). Prin studiile amănunţite a descoperit fenomenul
de sporulare şi a fost primul cercetător care a folosit tehnica fotografiei în microbiologie, el
fotografiind câmpurile microscopice.
În 1880 a fost angajat în ministerul sănătăţii unde şi-a continuat cercetările avându-l colaborator
printre alţii pe Lofler. În 1891 s-a înfiinţat Institutul pentru Studierea şi Combaterea Bolilor
13
Infecţioase din Berlin, instituţie care la 30 de ani de la descoperirea bacilului tuberculozei a
primit numele marelui savant.
Infecţia cu Mycobacterium era o mare problemă în secolul 19. Unul din 7 oameni suferea de
această boală, multe dintre îmbolnăviri evoluând nefast, spre deces. În 1881 Robert Koch a
izolat bacilul cauzator şi a reuşit să îl cultive pe medii artificiale. În 1901 la congresul britanic
despre tuberculoză, savantul a dăruit organizatorilor 5 eprubete în care se aflau colonii
provenite din cultivarea succesiva de 435 de ori a bacililor pe care îi identificase cu 20 de ani în
urmă (în 1891 Heinrich Gunther, un muncitor de 32 de ani, a fost internat şi după câteva zile a
murit,
bioptic,sea pare, datorită
inoculat iniţialunei tuberculoze
pe animale miliare; bacteriile
de laborator la necropsie Robert Koch
provenite a prelevat
din acest material
material, ulterior
reuşind să le cultive şi în vitro; în 24 martie 1882, Robert Koch a făcut publice descoperirile sale
privind izolarea şi identificarea agentului patogen al tuberculozei).
Cercetările nu s-au oprit aici, Robert Koch continuând să aprofundeze studiul mycobacteriilor
dar abordând şi alte microorganisme. După succesul identificării bacilului tuberculos a urmat o
perioada mai puţin fastă, el încercând să folosească iniţial ”Alt-Tuberkulin” ulterior ”Neu-
Tuberkulin” (un filtrat de cultură bacteriană) ca şi tratament. Insuccesul i -a adus numeroase
critici dar experimentul a avut şi o parte bună, aceste încercări reprezentând momentul de
pionierat pentru evidenţierea hipersensibilităţii de tip IV, tuberculinică, iar tuberculina va fi
ulterior utilizată în diagnostic și studii epidemiologice.
revenire sus
Institutul Cantacuzino a existat cu mulţi ani înainte de a fi primit prin legea din 1921 o
confirmare pe tărâm administrativ. Încă din anul 1904, doi ani după chemarea profesorului
Cantacuzino la Catedra de Medicină Experimentală de la Facultatea de Medicină, laboratorul
său, destinat iniţial exclusiv învăţământului şi cercetărilor pur experimentale, instalat în câteva
încăperi din institutul de Patologie şi Bacteriologie condus de profesorul Victor Babeş, a fost
însărcinat de către Direcţia Sanitară să studieze metodele de preparare şi valoarea practică a
două ”seruri curative” de mare interes pentru medicină, serul antistreptococic şi serul
antidizenteric. Primele încercări de aplicare la bolnavi s-au arătat foarte încurajatoare; ca atare
s-a trecut de la faza experimentală la prepararea pe o scară mai întinsă și la utilizarea lor în
practică.
În perioada
şi holerei 1910-1913 a început experimentarea şi prepararea vaccinurilor contra febrei tifoide
asiatice.
Rezultatele obținute convingeau şi pe cei mai sceptici. Consiliul sanitar a adoptat întrebuinţarea
acestor metode în combaterea epidemiilor de febra tifoida şi holeră, iar Serviciul Sanitar al
armatei a decis aplicarea consecventă a vaccinării antitifoidice la recruţi realizând prin aceasta
dispariţia aproape completă a cazurilor de febra tifoidă din armată.
14
Toate aceste fapte au fost realizate cu mijloace improvizate, într-un modest laborator de
învăţământ, în care încăperea cea mai impunătoare - sala de lucrări practice pentru studenţi -
nu putea primi deodată mai mult de 25-30 de persoane. Conducerea profesorului crea o
atmosferă de munca entuziastă şi dezinteresată, o motivaţie admirabilă printre colaboratori.
Personalul tehnic se întărea, numărul asistenţilor benevoli de asemenea. Prin activitatea
practică, laboratorul putea pune la îndemâna studenţilor mijloace de lucru care nu puteau fi
găsite într-un simplu laborator universitar. Institutul Cantacuzino, exista de fapt. Războiul din
1916-1918 a demonstrat imperios promovarea unei legi dedicate înființării, așa cum am
menționat. De altfel, istoria ”nu se schimbă”; în ultimii 20 de ani aproape fiecare pas realizat în
dezvoltarea sistemului de sănătate publică din România a ”beneficiat” de câte o problemă de
sănătate care a demonstrat autorităților (cel puțin pentru o perioadă de timp) că este necesară
o intervenție concretă.
Prin Legea din 1921, grație guvernului de atunci, s-a creat o instituţie având următoarele
scopuri:
- să prepare toate serurile, vaccinurile, precum şi alte produse similare, necesare în profilaxia şi
tratamentul specific al maladiilor infecţioase din țară;
- să facă toate lucrările necesare pentru cercetarea ştiinţifică a acestor maladii şi să stabilească
metodele tip pentru serologie şi de microbiologie;
- să servească drept organ de control pentru toate analizele bacteriologice şi să-și dea avizul în
ce priveşte introducerea în țară a serurilor şi vaccinurilor ”preparate aiurea”;
Institutul prepara şi da spre întrebuinţare numai serurile şi vaccinurile care făceau dovada
eficacităţii lor. În acelaşi timp, în laboratoarele institutului se cerceta şi se încercau metodele
noi de diagnostic microbiologic şi serologic, sau de tratament.
Una dintre remarcabilele realizări ale cercetărilor din institut a fost realizarea vaccinului BCG şi
începerea vaccinării tuturor copiilor. La acea vreme vaccinul BCG se mai producea numai în
cadrul Institutului Pasteur din Paris.
Astăzi în cadrul institutului există laboratoare naționale de referinţă (multe dintre acestea fiind
certificate internațional, de către Organizația Mondială a Sănătății), inclusiv un laborator foarte
performant de biologie moleculară. Producţia încă mai continuă, chiar dacă preparatele pentru
uz uman includ în principal (doar) vaccinul gripal sezonier. Anul trecut, INCDMI ”Cantacuzino” a
15
fost una dintre puținele instituții la nivel mondial care a reușit să producă în timp util vaccinul
gripal pandemic.
În clădirea principală se găseşte sala de curs și lucrări practice în care se predă bacteriologie,
noțiuni de imunologie și micologie, pentru studenţii de anul doi ai facultății de medicină. La
parter există sala de curs și seminarii pentru studenţii din anul cinci, epidemiologie.
Institutul Cantacuzino rămâne cel mai important centru de cercetare din România. În ceea ce
privește capacitatea de producție, existența acestuia este indispensabilă (oricărei țări). Avem
speranța că în ciuda anumitor ”evenimente” din ultimii ani, nu vom vorbi niciodată despre Acest
Institut la timpul trecut, ci doar la prezent și viitor.
16
Bacteriile se pot clasifica după mai multe criterii, însă o variantă utilă de clasificare este
clasificarea în funcţie de structură şi aspectul peretelui bacterian, bacteriile putând fi:
- rigide, cu perete dens, imobile sau mobile; unele dintre aceste bacterii pot forma micelii (ex.
bacterii din genurile Mycobacterium, Actinomyces, Streptomyces, Nocardia); dacă majoritatea
bacteriilor studiate sunt cultivabile pe medii artificiale există şi bacterii care pot fi denumite ca
paraziţi strict intracelulari (ex. genurile Rickettsia, Chlamydia);
- flexibile, cu perete celular subţire (ex. spirochetele, Treponema spp, Leptospira spp.);
Celula bacteriană este o celulă procariotă şi are caracteristici structurale diferite în comparaţie
cu celula eucariotă
a). formă cocoidală, cu diametre egale sau inegale (coci), dispuse izolat sau grupat. Majoritarea
steptococilor şi stafilococii sunt sferici, enterococii sunt ovalari, pneumococii sunt lanceolaţi,
gonococii şi meningococii pot fi reniformi.
Modul de dispunere poate fi considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru unele genuri
de bacterii, de ex.:
- stafilococii sunt coci sferici dispuşi în grămezi („ciorchine”);
- pneumococii sunt coci lanceolaţi dispuşi doi câte doi, eventual înconjuraţi de o capsulă
comună (în diplo);
17
b). formă de bastonaş (bacili, „rods”), drepţi cu capetele uşor rotunjite (enterobacterii), drepţi
cu capetele tăiate drept (Bacillus anthracis), fuziformi, cu ambele capete ascuţite
(Fusobacterium nucleatum), dispuşi uneori într-un mod caracteristic (de exemplu „în palisade”,
ca şi scândurile dintr-un gard - bacilii pseudodifterici);
d). actinomicete, care în culturi tinere formează filamente lungi, ramificate (asemănător
mucegaiurilor); aceste filamente se fragmentează şi rezultă aspecte bacilare (ex. Actinomyces
israelli);
Unele bacterii, chiar şi atunci când rezultă prin multiplicarea unei singure celule „mamă”
prezintă un pleomorfism deosebit de accentuat (de exemplu Proteus spp.).
În culturi vechi sau sub influenţa unor factori fizici, chimici, biologici, sub tratament cu
antibiotice etc., pot apărea forme modificate: filamentoase, umflate, ramificate etc., care pot
crea confuzii de diagnostic pentru examinatorul fără experienţă sau care nu face o examinare
ţinând cont de context. Dacă are loc repicarea acestora pe mediu de cultură proaspăt iar
examinarea ulterioară se face la timpul potrivit (având în vedere durata optimă de multiplicare)
vor rezulta forme „tipice” pentru specia respectivă.
Dacă în 1993 a fost pusă în evidenţă Epulopiscium fishelsoni (60-800 µm / 200-500 µm), cea mai
mare bacterie cunoscută astăzi este Thiomargarita namibiensis, o proteobacterie Gram
negativă, potenţial vizibilă cu ochiul liber (dimensiuni între 100–300 µm şi până la 750 µm).
(1999)
Datorită dimensiunilor mici, bacteriile pot fi vizualizate numai cu ajutorul microscopului, fie
clasic, cu lumina transmisă direct, atunci când utilizând un ocular cu o mărire de 10× şi un
obiectiv (de imersie) cu o mărire de 90-100 X, se realizează o amplificare a dimensiunilor
bacteriene de circa 900-1.000 X, fie utilizând alte tipuri de microscoape. Spre exemplu,
utilizarea preparatelor colorate prin metode în care marcajul se face cu subtanţe fluorescente
va creşte puterea de rezoluţie iar numărul de câmpuri investigate poate fi mai redus în
18
comparaţie cu investigarea unui preparat colorat clasic (a se vedea capitolul referitor la genul
Mycobacterium).
Atât din punct de vedere structural cât şi funcţional, există o serie de asemănări între celula
procariotă şi celula eucariotă. Bacteriile prezintă atât elemente structurale interne cât şi
structuri externe care pot şi merită a fi studiate având implicaţii în relaţiile dintre celula
bacteriană şi organismul gazdă. Există două tipuri de elemente structurale, unele dintre acestea
fiind întâlnite la toate speciile de bacterii (constante), altele fiind întâlnite numai în anumite
condiţii şi doar la anumite specii sau tulpini bacteriene (facultative).
- perete,
- membrană citoplasmatică,
- nucleu.
- N-acetil-glucozamina (NAG).
19
Fiecare moleculă de NAM are substituit un tetrapeptid alcătuit din D şi L -aminoacizi. Se
consideră că aminoacizii în formă D conferă un grad de protecţie faţă de enzimele proteolitice.
Între tetrapeptidele substituite, la lanţurile polizaharidice alăturate, se stabilesc legături
peptidice prin gruparea terminală COOH a unui tetrapeptid şi grupări terminale libere ale
tetrapeptidului vecin. Astfel se formează structuri bidimensionale, destul de complicate, sub
forma unor straturi care înconjoară întreaga celulă bacteriană.
reţele suplimentare
de ribitol cu specificitate
fosfat şi glicerol antigenică,
fosfat), legat de regulăalcătuite
covalentdelaexemplu din acid
peptidoglican. În teichoic (polimer
cazul în care
structurile fosfat se găsesc în cantităţi limitate sau nu pot fi sintetizate, la nivelul peretelui
bacterian putem întâlni acidul teichuronic. Dintre bacteriile Gram-pozitive se pot aminti
stafilococul, streptococul, enterococul, bacilul difteric, bacilul listeriozei, actinomicetele, bacilul
antraxului, clostridiile etc.
În cazul bacteriilor Gram-negative se descrie un perete celular în general mai subţire dar mult
mai complex. Peretele este alcătuit dintr-un strat fin de peptidoglican (circa 10-20% din
structura peretelui) care este acoperit de o membrană externă. Spaţiul dintre membrana
citoplasmatică şi membrana externă (include peptidoglicanul) reprezintă spaţiul periplasmic. Din
punct de vedere chimic, membrana externă este alcătuită din fosfolipide, proteine şi cantităţi
variabile de lipopolizaharide. Alte proteine importante care se află la acest nivel sunt porinele.
Lipopolizaharidul (endotoxina) are în componenţă două structuri esenţiale: lipidul A şi
polizaharidul O. Bacteriile Gram-negative se decolorează cu alcool-acetonă şi se recolorează cu
fucsină diluată (au culoare roşie la coloraţia Gram). Dintre bacteriile Gram-negative am putea
aminti meningococul, gonococul, enterobacteriile, vibrionul holeric, bacilul piocianic, cocobacilii
Gram-negativi (ex. Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella abortus) etc.
Bacteriile acid-alcool rezistente (de exemplu, mycobacteriile sau nocardiile) conţin o cantitate
substanţială de lipide la nivel parietal. Rezistă decolorării cu acid -alcool (au culoare roşie pe fond
albastru la coloraţia Ziehl-Neelsen); această coloraţie continuă să reprezinte o etapă esenţială în
diagnosticul bacteriologic al tuberculozei, indiferent de cele mai recente descoperiri privind
tehnicile moderne de laborator (inclusiv utilizarea sondelor nucleotidice sau amplificarea
genetică). În afară de mycobacterii (în special M. tuberculosis, dar şi numeroase mycobacterii
„atipice” (non-tuberculous mycobacteria, NTM), ex. M. avium, M. intracellulare, M. kansasii),
există şi alte specii bacteriene care pot apărea colorate asemănător după utilizarea metodei
Ziehl-Neelsen, spre exemplu bacilul difteric (C. diphteriae).
- asigură rezistenţa bacteriei (de exemplu la variaţii ale presiunii osmotice şi la presiuni
interioare care pot ajunge până la 20 atm.);
- flexibilitatea peretelui celular la unele bacterii (ex. spirochete) poate fi explicată atât prin
flexibilitatea membranei cât şi prin grosimea redusă a peptidoglicanului;
20
- are rol antigenic (carbohidratul C la streptococ, antigenul O - polizaharidic, în cazul bacteriilor
Gram-negative etc);
- lanivelul
la bacteriile Gram-negative
membranei este asociat cu numeroase enzime (situate în spaţiul periplasmic şi
externe).
Anumite bacterii produc autolizine (enzime hidrolitice care degradează peptidoglicanul, spre
exemplu glicozidaze, amidaze, peptidaze). Este probabil ca aceste substanţe să aibă un rol în
creşterea şi multiplicarea bacteriană.
Formele L
În 1935 s-a observat prezenţa unor germeni modificaţi structural. Au fost numite forme „L”,
după numele Institutului Dr. Lister unde au fost descoperite. Nu sunt microorganisme noi, ci
variante ale unor microorganisme cu peretele bacterian modificat. Utilizându-se lizozim sau
penicilină ca agenţi inductori s-au putut obţine forme „L” de la majoritatea bacteriilor. Este
posibil ca aceste forme „L” să explice, prin prezenţa lor în organism, anumite infecţii cronice (de
exemplu infecţii ale aparatului urinar).
Între perete şi citoplasmă există membrana citoplasmatică având grosimea de 7-10nm; poate
reprezenta circa o zecime din greutatea uscată a peretelui bacterian. Electronomicrografic
apare formată din 2 straturi întunecoase separate de un strat mai clar. Este considerată un
„mozaic fluid”, compusă dintr-un film fosfolipidic în care flotează proteine globulare cu
extremităţile polare hidrofile expuse spre spaţiul intracelular, extracelular sau ambele. Aproape
10% din proteinele celulei bacteriene, peste 200 de feluri de proteine, sunt localizate la nivelul
membranei citoplasmatice. Fosfolipidele, dispuse în dublu strat, au extremităţile polare,
hidrofile, expuse contactului cu apa pe ambele feţe ale membranei şi extremităţile nepolare,
hidrofobe, orientate spre stratul mijlociu al membranei. Nu conţine steroli (excepţie
Mycoplasma spp).
21
Rolurile membranei citoplasmatice sunt de:
- barieră osmotică;
- a fi sediul majorităţii activităţilor enzimatice ale celulei bacteriene (de exemplu intervine activ
în procesele de biosinteză);
Mezozomii sunt structuri care se formează prin invaginarea membranei citoplasmatice de care
rămân legaţi. Sunt prezenţi în special la bacteriile Gram-pozitive. Au structura chimică a
membranei citoplasmatice şi aceleaşi funcţii în permeabilitate şi respiraţie. Cu un capăt se po t
fixa de materialul nuclear, favorizând distribuirea în mod egal a genomului între cele două celule
fiice. Au rol şi în formarea septului transversal.
Particulele citoplasmatice studiate sunt: ribozomii, incluziile, vacuolele; în citoplasmă pot exista
şi elemente facultative, plasmidele (formate din ADN extracromozomial).
La celula tânără citoplasma este intens colorată, omogenă, conţine ARN în cantitate mare, este
clară în timp ce la celula „bătrână” citoplasma are aspect granular.
Ribozomii au formă aproximativ sferică, pot fi văzuţi la microscopul electronic. Mărimea lor
(circa 10-20 nm) depinde de concentraţia ionilor Mg2+ şi K+. Unii ribozomi sunt liberi în
citoplasmă, în timp ce alţii apar legaţi de faţa internă a membranei citoplasmatice. Din punct de
vedere chimic conţin circa 65% ARNr (ribozomal). Au constanta de sedimentare de 70 unităţi
22
Swedberg dar sunt constituiţi din două subunităţi de câte 30S şi respectiv 50S. În subunitatea
mică intră o singură moleculă de ARNr, 16S şi 21 de tipuri de proteine ribozomale. În
subunitatea mare intră mai multe tipuri de molecule de ARNr (ex. ARNr 23S). Între cele două
subunităţi se formează canalul prin care trec moleculele de ARNm (mesager) în cursul sintezei
proteice. Se apreciază că într-o bacterie cu dimensiuni medii, aflată în faza de creştere activă, se
sintetizează circa 500 ribozomi / minut, metabolismul bacterian fiind foarte intens.
Cu toate că secvenţa de aminoacizi din structurile proteice este „dictată” de secvenţa de baze
azotate din ADN, pentru că nu există afinitate şi posibilitate de cuplare între ADN şi aminoacizi
este necesar ca o altă structură să permită poziţionarea aminoacizilor în lanţul viitoarei
proteine.
Iniţial are loc transcrierea informaţiei genetice pe ARNm (mesager), care va transporta această
informaţie de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare. Gena este
segmentul de ADN care deţine informaţia genetică pentru sinteza unei proteine. Segmentul de
ADN care controlează sinteza unui polipeptid poartă numele de cistron.
ARNm care deţine informaţia genetică pentu sinteza unei singure catene de polipeptid poartă
numele de ARNm monocistronic.
La bacterii, de obicei, o moleculă de ARNm trebuie să poarte informaţia necesară pentru sinteza
mai multor catene diferite şi în acest caz ARNm poartă numele de ARNm policistronic. Această
situaţia particulară este datorată dimensiunii mici a acestor procariote precum şi
metabolismului intens care are loc în cursul procesului de creştere şi multiplicare. Spre exemplu,
la E. coli, pentru metabolizarea lactozei sunt necesare potenţial 3 enzime diferite, iar mesajul
genetic pentru sinteza acestora se află deţinut de o singură moleculă de ARNm policistronic.
De regulă, numai o catenă de ADN este folosită drept matriţă pentru ARNm. Transcrierea
mesajului genetic este selectivă (se desfăşoară între promotor şi semnalul de terminare) şi este
controlată de ARN polimeraza ADN-dependentă.
Pentru traducerea mesajului genetic este necesară intervenţia la nivel ribozomal a moleculelor
de ARNt (de transfer). Acestea au o dublă specificitate (pentru fiecare dintre cei 20 de
aminoacizi există una sau mai multe molecule de ARNt; în acelaşi timp există enzime specifice
fiecărui tip de aminoacid care controlează legarea corectă a aminoacizilor activaţi pe ARNt
corespunzător). La nivelul fiecărui ARNt există trei nucleotide (anticodon) complementar
codonului care corespunde aminoacidului.
23
ARNt nu are niciodată la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU şi în aceste condiţii ne
putem explica motivul pentru care codonii UAA, UAG şi UGA sunt codoni stop.
Succesiunea specifică a nucleotidelor este transpusă într-o secvenţă specifică de aminoacizi care
intră în constituţia lanţului polipeptidic din proteina în curs de formare.
Incluziile sunt formaţiuni care apar în citoplasmă la sfârşitul perioadei de creştere activă.
Dimensiunea şi forma incluziilor citoplasmatice pot varia în funcţie de condiţiile externe. Pot
conţine polimeri anorganici (de exemplu, corpusculii metacromatici ai genului Corynebacterium,
la a căror descoperire a avut un rol important Profesorul Victor Babeş), substanţe anorganice
simple, polimeri organici (rezervor energetic mai ales la germenii sporulaţi aerobi), lipide,
cristale, granulaţii de sulf etc.
Vacuolele sunt formaţiuni sferice care conţin diferite substanţe în soluţie apoasă. Au o
membrană lipoproteică numită tonoplast. Au fost descrise în mai ales la bacteriile acvatice şi ar
putea avea un rol în plutirea acestora.
Masa nucleară vine în contact direct cu citoplasma. Este localizată în partea centrală a celulei.
Conţine ADN, nu are nucleoli. Are afinitate pentru coloranţii bazici, dar pe preparatele colorate
uzual este mascat de bazofilia intensă a citoplasmei bogată în ARN.
Unicul cromozom bacterian este alcătuit dintr-o singură moleculă de ADN dublu catenar, cu
aspectul unui fir lung (1.000-2.000 µm), închis într-un inel şi replicat pe el însuşi, superspiralat.
Mărimea cromozomului poate să difere în funcţie de specia bacteriană (şi respectiv numărul de
perechi de baze); cea mai mică celulă bacteriană ar fi cea de Mycoplasma spp., la care
dimensiunea este de 4.700 kpb, în timp ce cromozomul de E. coli poate avea o dimensiune de
circa 3 ori mai mare. Având în vedere că dimensiunea bacteriilor este de circa 1-2 mm în cazul
cocilor şi de câteva ori mai mare în cazul bacililor, pentru ca materialul genetic să poată fi
conţinut în acest spaţiu redus, acesta trebuie să fie compactat într-un mod remarcabil şi astfel,
rezultă nucleoidul bacterian care poate fi diferenţiat microscopic. Nucleoidul este format din
molecula de ADN asociată cu proteine şi o cantitate variabilă de ARN.
Relativ recent (1989) s-a descoperit că există şi bacterii care deţin cromozomi lineari (ex.
Borrelia burgdorferi). Toate speciile din genul Borrelia deţin şi plasmide lineare.
24
(în total 2 sau 4) nu aduc o informaţie genetică diferită pentru că ei sunt copii ale cromozomului
iniţial (identici cu acesta).
Din punct de vedere funcţional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de ADN
formează un codon. Codonii deţin informaţia genetică pentru a plasa într-o anumită secvenţă
un anumit aminoacid, în lanţul polipeptidic care va fi sintetizat la nivelul ribozomilor
Structurile facultative ale celulei bacteriene sunt reprezentate de capsulă, cili (flagelii), fimbrii
(pili) şi spori (forme de rezistenţă).
Numeroase bacterii sintetizează polimeri organici (de obicei polizaharide) care formează î n jurul
celulei o matrice fibroasă, numită glicocalix.
La unele bacterii glicocalixul aderă strâns de celula bacteriană şi reprezintă capsula. Există
bacterii care deţin o capsulă bine definită, cu structură polizaharidică (S. pneumoniae, K.
pneumoniae, unele tulpini de E. coli etc) sau cu structură polipeptidică (Bacillus anthracis etc).
La alte bacterii, glicocalixul formează o reţea laxă de fibrile care se pierde parţial în mediu şi
poate fi separată de corpul bacterian prin centrifugare, capsula flexibilă, care nu este vizibilă la
microscopul optic.
Roluri:
25
- barieră protectoare faţă de bacteriofagi, protozoare;
- conţine substanţe cu specificitate antigenică (de specie sau de tip) - antigenul K. Spre exemplu,
în cazul S. pneumoniae există peste 90 tipuri antigenice capsulare în timp ce la E. coli sau la
Klebsiella pneumoniae există peste 80 tipuri antigenice capsulare.
Cilii sau flagelii conferă mobilitate bacteriilor. Mobilitatea poate fi evidenţiată în preparatul
proaspăt (între lamă şi lamelă) sau pe anumite medii speciale (ex. MIU ). Mobilitatea germenilor
din genul Proteus este observată pe orice mediu de cultură solid pe care acest microorganism
foarte mobil se dezvoltă (fenomenul de „invazie”).
Flagelii sunt formaţiuni fine, alungite, flexibile, cu srcine la nivelul corpuscululu i bazal. Acesta
este alcătuit (de ex. la majoritatea bacteriilor Gram-negative) din patru discuri aranjate ca două
perechi pe o structură care trece prin mijlocul lor. Corpusculul bazal este plasat în perete şi
membrana citoplasmatică. Din punct de vedere chimic flagelul este de natură proteică
(flagelina).
Roluri:
- peritriche (cu mai mulţi flageli dispuşi de-a lungul suprafeţei bacteriene), de exemplu E. coli,
Proteus mirabilis, Salmonella typhi.
Sunt formaţiuni scurte, fine, nu au rol în mobilitate. De obicei pilii sunt mai subţiri decât cilii. Pot
fi foarte numeroase pe suprafaţa majorităţii bacteriilor; pot fi observate numai la microscopul
electronic.
26
Există pili comuni, cu următoarele roluri:
Există pili „F” (sexuali), determinaţi genetic de factorul de fertilitate F (episom). Aceştia
îndeplinesc rolul canalului de conjugare.
Fenomenul de sporogeneză este mai des întâlnit la Bacillaceae (genurile Clostridium şi Baci llus).
Pe sol, în condiţii de uscăciune, la adăpost de lumina solară directă, endosporii persistă zeci şi
poate sute de ani.
Materialul genetic este concentrat şi, împreună cu apa legată, lipide, Ca++, Mg++, este
înconjurat de un strat protector (membrana sporală, cortexul sporal, învelişurile sporale).
„Sâmburele” sporal împreună cu membrana citoplasmatică formează protoplastul sporal.
Roluri:
- formă de rezistenţă şi conservare a speciei (în condiţii favorabile un spor se poate transforma
într-o bacterie / forma vegetativă; procesul de formare a sporului ar putea fi considerată una
dintre cele mai primitive forme de diferenţiere, dar nu este un proces de reproducere celulară
- central sau subterminal, mai mic decât celula (ex. la Bacillus anthracis);
- central sau subterminal, mai mare decât celula (ex. la Clostridium hystoliticum etc);
Poate fi evidenţiat prin coloraţii speciale (de exemplu verde malachit) sau prin coloraţia Gram
(locul sporului rămâne necolorat).
27
În Scoţia, în perioada aprilie-august a anului 2000, s-a raportat un număr fără precedent de
îmbolnăviri în rândul utilizatorilor de droguri pe cale injectabilă. Au fost identificate 60 de cazuri
(23 confirmate şi 37 probabile), la subiecţi cu vârsta medie de 30 de ani, dintre care 31 erau de
sex feminin (51,66%). Toţi pacienţii erau consumatori de droguri administrate prin injecţie
intramuscular şi subcutanat (în acest caz a fost vorba despre un preparat compus din heroină şi
acid citric). 20 (87%) dintre cazurile confirmate au evoluat către deces. Din totalul pacienţilor,
15 au prezentat fasciită necrozantă, 22 au dezvoltat edem la locul de injectare, iar 13 au
prezentat pleurezie.
În 20 (54%)
familiale saudintre cazurile
sociale probabile
între subiecţi. şi 14 (61%)
Semnele dintre
clinice celedes
cel mai confirmate au existat
înregistrate au fost:legături
durere şi
edem marcat la nivelul locului de injectare; în câteva dintre cazuri, în afară de aceste semne,
pacienţii au prezentat insuficienţă multi-organică. O caracteristică a sindromului de afectare
multi-organică a fost reprezentată de reacţia leucemoidă, cu leucocitoză la valori foarte ridicate,
cu deviere la stânga a formulei leucocitare (numeroase leucocite tinere, nesegmentate).
Probe din heroina confiscată (pură şi în combinaţie cu acid citric), probe de sânge şi fragmente
tisulare (recoltate antemortem şi postmortem) au fost trimise către laboratoarele de referinţă
din Glasgow şi Londra, dar şi către laboratorul Centrului pentru prevenirea şi controlul bolilor
(CDC, Atlanta, SUA). Supoziţia iniţială (infirmată prin testele de laborator) a fost cea de
contaminare a drogurilor cu spori de Bacillus anthracis.
Pe lângă prezenţa sporilor, demonstrată prin tehnici de laborator, a fost utilizată testarea
efectului citopatic asupra culturilor monostrat de linii celulare Vero şi astfel s -a demonstrat
prezenţa alfa-toxinei produsă de C. novyi,tip A, în probele recoltate.
Alfa-toxina este eliberată la nivelul procesului infecţios (locul injectării drogului, unde prin
realizarea condiţiilor de anaerobioză, sporii trec în formă vegetativă se multiplică şi bacteriile
sintetizează exotoxina), în ţesutul subcutanat, conduce la instalarea unui răspuns inflamator
local intens, cu edem marcat. Alfa-toxina are o contribuţie patogenică şi în situaţiile cu evoluţie
spre insuficienţă multi-organică, asociat cu hipotensiune arterială, reacţie leucemoidă şi fasciită
necrozantă. Condiţiile de anaerobioză sunt atinse deoarece soluţia de heroină tamponată cu
acid citric produce necroză tisulară la locul injectării (în cazul în care soluţia ar fi fost injectată
intravenos, sporii ar fi fost distruşi de către mecanismele de apărare ale gazdei, la nivel sanguin).
28
În cazul în care ipoteza unei afectări datorită sporilor proveniţi de la bacterii anaerobe ar fi fost
emisă de la început şi dacă nu s-ar fi instituit (la o parte dintre cazuri) antibioterapia empirică cu
antibiotice / chimioterapice cu spectru larg anterior recoltării probelor, procentul de infecţii cu
etiologie confirmată ar fi putut să fie mai mare.
S-au emis mai multe comunicate de presă pentru a pune în temă populaţia şi pe ntru a alerta
comunitatea medicală şi pe eventualii consumatori de droguri.
Multe s-au scris despre Neisseria meningitidis, meningococul, răspunzător pentru izbucniri
epidemice de meningită, cu urmări îngrijorătoare (decese, sechele). Infecţiile meningococice
rămân încă o problemă de sănătate la nivel mondial iar înţelegerea mecanismelor prin care
Neisseria meningitidis eludează mecanismele de apărare ale gazdei este foarte importantă.
Meningococul determină boala prin invazivitate şi multiplicare, aderând la celulele umane şi
invadându-le însă după această etapă procesul rămâne, în mare parte, un mister.
Sistemul complement este unul dintre factorii de apărare foarte importanţi în protecţia
subiecţilor faţă de infecţia cu N. meningitidis; totuşi acest microorganism s-a adaptat şi a
dezvoltat mecanisme proprii de protecţie anti-complement.
Structurile bacteriene de genul capsulei polizaharidice precum şi cele care „imită” structurile
proprii (self) ale gazdei sau leagă molecule proprii organismului salvează germenul de la liză
celulară şi fagocitoză. Se pare că Neisseria meningitidis îşi foloseşte eficient proprietăţile, atât
extra- cât şi intracelular.
Prin inocularea de tulpini capsulate şi necapsulate marcate izotopic în culturi celulare de celule
fagocitare şi nefagocitare umane s-a încercat monitorizarea invazivităţii şi multiplicării
intracelulare. Rezultatele au fost surprinzătoare deoarece capsula, care diminuează capacitatea
de aderare la membrana celulară şi de intrare a germenului în celulă, este esenţială pentru
supravieţuirea intracelulară a microorganismului. Un posibil mecanism prin care se produce
această supravieţuire ar fi cel al rezistenţei capsulare la peptidele cationice antimicrobiene
(CAMPs – cationic antimicrobial peptides), componente ale sistemului imun înnăscut.
29
Gram-negativi. Experimental s-a măsurat rata de supravieţuire a meningococilor timp de 45 de
minute în diferite concentraţii de polimixină B. Rezultatele au confirmat că absenţa capsulei
scade viabilitatea microbiană în prezenţa polimixinei B. Acest model pe culturi celulare susţine
ipoteza conform căreia capsula N. meningitidis reprezintă un mecanism major pentru
supravieţuirea intracelulară a bacteriei din cursul infecţiei.
Examenul bacteriologic direct are o mare importanţă pentru diagnosticul de etapă, dar şi pentru
cel definitiv; poate schimba radical indicaţia de tratament precum şi prognosticul pentru
respectivul pacient. În cadrul examenului bacteriologic direct, examenul preparatului proaspăt
între lamă şi lamelă a rămas „ruda săracă”, fiind mai rar folosit (prea rar); informaţiile obţinute
pot fi însă foarte utile. La un pacient seropozitiv stadiul C3, cu diaree trenantă şi severă,
examenul citobacteriologic a arătat prezenţa unor formaţiuni rotund ovalare interpretate ca
levuri, probabil candidozice. În ciuda tratamentului antifungic pentru levuri diareea a rămas la
fel de severă şi starea gravă. La o nouă examinare a materiilor fecale, de data aceasta şi a
preparatului proaspăt între lamă şi lamelă, colorat cu albastru de metil, s -au văzut (datorită
colorantului) aceleaşi formaţiuni rotunde dar cu capsulă, ridicându-se suspiciunea unei infecţii
cu criptococ, care ulterior s-au identificat după culturi şi repicări repetate pe medii specifice.
Dar ce este de subliniat este că schimbarea imediată a tratamentului a condus la remiterea
simptomatologiei şi îmbunătăţirea stării pacientului.
1. Bader J, Albin A, Stahl U, Spore-forming bacteria and their utilisation as probiotics, Benef
Microbes 2012 Mar 1; 3(1):67-75
3. Salman V, Amann R, Girnth AC, Polerecky L, Bailey JV, Høgslund S, Jessen G, Pantoja S, Schulz-
Vogt HN, A single-cell sequencing approach to the classification of large, vacuolated sulfur
bacteria, Syst Appl Microbiol. 2011 Jun; 34(4):243-59
4. Segura M., Fisher Scientific Award Lecture - The capsular polysaccharides of Group B
Streptococcus and Streptococcus suis differently modulate bacterial interactions with dendritic
cells, Can J Microbiol. 2012 Mar; 58(3):249-60
30
c. Dimensiunile bacteriene sunt de ordinul micrometrilor şi din acest motiv bacteriile se pot
examina la microscopul optic
d. Aspectul “in diplo” este caracteristic pneumococilor
e. Există bacterii cu dimensiuni foarte mici (ex.: Chlamydia spp. şi Mycoplasma spp.) care nu pot
fi vizualizate la microscopul optic
2. Despre componentele structurale ale celulei bacteriene este adevărată următoarea afirmaţie:
a. Peretele bacteriilor Gram-negative nu conţine mureină
b. Membrana celulară este o structură facultativă
c. Nucleul bacterian este învelit de membrană nucleară şi conţine numeroşi nucleoli
d. Capsula bacteriană reprezintă un factor de virulenţă şi favorizează invazivitatea
e. Bacteriile cu flageli sunt imobile
3. Peretele bacterian:
a. Este o componentă constantă a bacteriilor din toate genurile
b. Este degradat cu uşurinţă sub acţiunea lizozimului (muramidazei)
c. Are aceeaşi grosime atât la bacteriile Gram-negative, cât şi la cele Gram-pozitive
d. Nu este sediu de acţiune pentru nici un tip de antibiotic
e. Conţine antigene capsulare
4. Care dintre enunţuri este corect în ceea ce priveşte structurile facultative bacteriene:
a. Sporii bacterieni au rol în replicarea ADN-ului
b. Mobilitatea bacteriilor este dată de fimbrii
c. Sporul este o formă de rezistenţă bacteriană
d. Capsula este ubicuitară la toate genurile bacteriene
e. O bacterie nu poate avea mai mult de un singur flagel
5. Sporii bacterieni:
a. Nu se distrug prin autoclavare
b. Sunt forme de rezistenţă ale bacteriilor şi se pot transforma în forme vegetative
c. Nu se vizualizează microscopic
d. Pentru orice tip bacterian, sunt localizaţi în acelaşi loc şi anume central
e. Sunt caracteristici tuturor speciilor bacteriene
31
Apa reprezintă peste 75-85% din greutatea umedă a bacteriei. Există apă liberă (mediu de
dispersie) şi apă legată fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au puţină apă, în special apă
legată. Bacteriile sunt fiinţe „acvatice” prin excelenţă. Vacuolele sunt formaţiuni sferice care
conţin diferite substanţe în soluţie apoasă. Au o membrană lipoproteică numită tonoplast. Au
fost descrise în special la bacteriile acvatice şi ar putea avea un rol în plutirea acestora.
Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti faptul că apa reprezintă un mediu de dispersie, este
reactiv în reacţiile metabolice, reprezintă etapa finală a unor reacţii oxidative etc.
Prin deshidratare (desicare) este posibilă prezervarea culturilor bacteriene timp îndelungat. O
metodă des utilizată datorită eficienţei sale este liofilizarea (criodesicarea). Studiile ştiinţifice au
arătat că, în general, germenii Gram-negativi rezistă mai puţin timp liofilizării decât cei Gram-
pozitivi, fenomen care a fost pus pe seama stratului mai subţire de peptidoglican. (1)
Substanţele minerale reprezintă 2-30% din greutatea uscată a bacteriei şi variază în funcţie de
specie, vârsta culturii, compoziţia chimică a mediului. Unele elemente intră în compoziţia
diferitelor structuri (exemplu sulful intră în structura aminoacizilor, fosforul în structura
fosfolipidelor etc).
Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti următoarele:
· favorizează schimburile cu mediul,
· participă la reglarea presiunii osmotice,
· pot stimula creşterea şi funcţia bacteriei (de exemplu fierul în cazul bacilului difteric, care
condiţionează şi producerea de toxine),
· activează unele sisteme enzimatice, contribuie la reglarea pH-ului şi a potenţialului de
oxido-reducere.
Aşa cum am menţionat anterior, la nivel ribozomal se găsesc Mg++ şi K+.
În structura bacteriană se pot găsi glucide simple cu rol în metabolismul intermediar glucidic,
precum şi glucide complexe, de exemplu poliozide. Acestea din urmă au o serie de roluri, spre
ex. participă la realizarea structurii peretelui celular, fac parte din capsula unor bacterii etc.
Există teste biochimice în care se urmăreşte utilizarea sau imposibilitatea utilizării unui anumit
zahar de către o bacterie. Aceste teste sunt utile pentru identificarea bacteriei respective (în
special în cazul enterobacteriilor folosind mediile TSI, MIU, sistemele API etc). Testările
biochimice sunt de mare utilitate şi în studiul fungilor (auxanogramă, zimogramă).
Există proteine simple (cu rol în metabolismul intermediar protidic) şi proteine complexe, cum
ar fi:
· mucoproteinele (ex. mucopolizaharidul de grup al S. pneumoniae, acidul hialuronic din
structuri de tip capsular),
32
· cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi),
· nucleoproteinele (ex. în acizii nucleici).
Este de remarcat prezenţa în structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul
diaminopimelic, precum şi a aminoacizilor în forma D (ceea ce reprezintă o adaptare biochimică
a bacteriilor faţă de acţiunea nocivă a enzimelor proteolitice).
Reprezintă mai puţin de 10% din greutatea uscată a bacteriilor şi variază cantitativ în funcţie de
specie, vârsta culturii (cresc în celulele „îmbătrânite”, reprezentând probabil un semn de
degenerescenţă) şi compoziţia mediului. La mycobacterii, sunt în cantitate mai mare (circa 20 -
40%), în special la nivel parietal şi determină o serie de proprietăţi specifice, inclusiv afinitatea
tinctorială. Lipidele se pot găsi libere în vacuole, combinate sau făcând parte din diferite
structuri ale celulei bacteriene (perete, membrană, mezozomi).
Dintre lipidele bacteriene putem aminti:
· acizii graşi speciali (ex. acidul mycolic la mycobacterii),
· cerurile (acizi graşi plus alcooli monovalenţi superiori), care se găsesc în cantitate mare la
bacteriile acid-alcoolo-rezistente (ex. în peretele mycobacteriilor, nocardiilor etc). Dintre
acestea, ceara D pare a fi implicată în inducerea hipersensibilităţii întârziate (de tip IV).
· fosfolipidele, cum este lipoidul ubiquitar (difosfatidil glicerol) din Treponema pallidum
(agentul etiologic al sifilisului) sau lipidul A din structura lipopolizaharidului bacteriilor Gram-
negative, cu activitate toxică.
33
Putem aminti și faptul că pigmenţii pot avea o serie de roluri, de ex.: rol de protecţie faţă de
radiaţiile UV (pigmenţi carotenoizi), rol antibiotic (exemplu piocianina elaborată de P.
aeruginosa faţă de B. anthracis) şi rol enzimatic.
Dintre vitaminele produse de bacterii putem aminti: biotina, care poate fi secretată de exemplu
de E. coli, B. subtilis, B. anthracis etc; tiamina (B1), care poate fi sintetizată de E. coli, riboflavina
sintetizată de B. subtilis, vitaminele B2 şi B12 sintetizate de B. megaterium etc. sau vitaminele
din grupurile B şi K, care pot fi sintetizate sub influenţa florei bacteriene intestinale umane.
Factorii de creştere sunt metaboliţii esenţiali pe care bacteria nu-i poate sintetiza pe baza
substanţelor care se găsesc în mediul extern. Factorii de creştere trebuie neapărat incluşi în
mediul de cultură în cazul în care dorim să izolăm microorganismul respectiv, numit
„microorganism pretenţios” (ex. factorii X şi V trebuie incluşi în mediul de izolare pentru
Haemophilus influenzae).
34
Bacteriile patogene sunt heterotrofe. Adaptându-se la viaţa parazitară, devin dependente de o
serie de astfel de factori de creştere (unele sunt atât de dependente încât nu pot fi cultivate „in
vitro”, de exemplu bacilul leprei - Mycobacterium leprae).
3. 2. Metabolismul bacterian
Majoritatea bacteriilor comensale, condiţionat patogene sau patogene importante pentru om,
sunt chimiosintetizante, heterotrofe. Se diferenţiază în funcţie de tipul respirator. Există şi
bacteriile paratrofe, a căror energie trebuie oferită de gazdă. Bacteriile paratrofe sunt parazite
strict intracelular (de exemplu microorganismele din genurile Rickettsia şi Chlamydia, care
depind nutriţional de o gazdă vie).
Creşterea microbiană necesită polimerizarea unor substanţe mai simple pentru a forma:
proteine, acizi nucleici, polizaharide şi lipide. Aceste substanţe se obţin fie din mediul de cultură,
fie sunt sintetizate de către celulele în creştere (sunt necesare diferite coenzime şi legături
macroergice de tipul celor din ATP). Substanţele necesare şi coenzimele implicate se pot obţine
dintr-un număr relativ redus de precursori metabolici.
Dacă o celulă bacteriană primeşte substanţele necesare, va sintetiza diferite macro molecule, iar
secvenţa aranjării componentelor în aceste macromolecule este determinată fie după un model
ADN-ADN (pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru proteine), fie cu un determinism
enzimatic pentru carbohidraţi şi lipide.
După ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansamblează, formând structuri
supramoleculare: ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei macromoleculelor şi activitatea
căilor metabolice sunt foarte bine reglate (există o permanentă balanţă a biosintezei).
Microorganismele reprezintă un grup de celule vii care utilizează o mare diversitate de căi
metabolice; de exemplu, mai multe căi diferite pot fi utilizate pentru asimilarea unui singur
compus simplu, benzoatul, iar o singură cale metabolică pentru benzoat poate fi reglată de mai
multe sisteme de control. Principiul determinant pentru căile metabolice este acela al
organizării unui număr relativ mic de tipuri de reacţii biochimice, într-o ordine specifică. Multe
dintre căile biosintetice se pot deduce având în vedere structura chimică de la care se porneşte,
produsul final şi eventual unul sau doi metaboliţi intermediari. Principiul determinant al reglării
35
metabolismului este acela că enzimele par a fi „chemate” în joc numai când activitatea lor este
necesară. Activitatea unei enzime poate fi modificată variind fie cantitatea ei, fie cea a
substratului pe care acţionează.
În unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuată prin cuplarea unor efectori specifici
(metaboliţi care modulează activitatea enzimatică).
De multe ori, activitatea unei enzime care catalizează o etapă metabolică iniţială este (poate fi)
inhibată de produsul final al căii respective. O astfel de inhibiţie nu poate depinde de competiţia
pentru situsul de legare al enzimei la nivelul substratului. Inhibiţia depinde de faptul că enzimele
reglatoare sunt allosterice. Fiecare enzimă are atât un situs catalitic de legare cu substratul, cât
şi unul sau mai multe alte situsuri de legare cu mici molecule reglatoare (numite efectori).
Legarea unui efector de situsul său duce la o modificare conformaţională a enzimei, astfel încât
afinitatea situsului catalitic scade (inhibiţie allosterică) sau creşte (activare allosterică).
Când o bacterie peritriche se mişcă, flagelii se asociază şi se mişcă împreună, rezultând o
deplasare liniară. La diferite intervale de timp, bacteria îşi schimbă direcţia (flagelii „se dau
peste cap”). Acest comportament face posibilă chemotaxia: o celulă care se îndepărtează de
sursa atractantului chimic îşi schimbă sensul de mişcare mult mai frecvent în comparaţie cu una
care se apropie de atractant şi ca o însumare, bacteria se va deplasa înspre atractant. Spre
exemplu, prezenţa unui zahar sau a unui aminoacid este sesizată de receptori specifici localizaţi
pe membrana celulară (de multe ori acelaşi receptor participă şi la transportul membranar al
acelei substanţe). Celula bacteriană este prea mică pentru a fi capabilă să detecteze existenţa
unui gradient chimic (în spaţiu), dar s-a demonstrat experimental că detectează gradienţii în
timp (de exemplu, concentraţia unei substanţe scade în timp ce bacteria se îndepărtează de
sursă şi creşte în timp ce aceasta se apropie de sursă).
Anumiţi compuşi acţionează ca respingători (R), iar alţii ca atractanţi (A). Un mecanism care ar
explica răspunsul celulei faţă de A/R ar implica metilarea şi respectiv demetilarea unei proteine
specifice din membrană, care depinde de GMPc. Atractanţii produc o inhibiţie tranzitorie a
demetilării acestei proteine. Respingătorii stimulează demetilarea.
Mecanismul prin care o modificare în comportamentul celular se produce ca răspuns la o
modificare de mediu poartă numele de transducţie senzorială. Aceasta pare să fie responsabilă
de:
· chemotaxie;
· aerotaxie (deplasarea către concentraţia optimă de O2);
· fototaxie (deplasarea bacteriei fototrofe către lumină);
· deplasarea spre acceptorul de electroni etc.
Respiraţia reprezintă suma reacţiilor biochimice aerobe sau anaerobe producătoare de energie.
Mecanismul de bază este reprezentat de oxido-reducerea biologică (pierderea ionilor de
hidrogen sau a electronilor) de către o substanţă chimică (donor) şi transportul lor pe molecula
unei alte substanţe numită acceptor (prima se oxidează, a doua se reduc e: AH2 + B <=> A +
BH2). În funcţie de natura acceptorului final, respiraţia poate fi: aerobă sau anaerobă.
Respiraţia aerobă (oxibiotică)
În respiraţia aerobă, acceptorul final de electroni este reprezentat de oxigen. Respiraţia aerobă
necesită existenţa membranei celulare. Electronii sunt pasaţi de la un reducător la un oxidant
36
prin membrană cu ajutorul unui set specific de transportori. Substratul reducător frecvent
utilizat este NADPH-ul.
Enzimele catenei respiratorii sunt:
- nicotinice (cu coenzima NAD şi NADP);
- flavinice (cu gruparea proteică FMN sau FAD);
- ferice (grupul prostetic conţine Fe sub formă de derivaţi ai protohemului, spre exemplu
citocromi, citocromoxidază, peroxidază etc).
NAD (nicotin adenin dinucleotid), NADP (nicotin adenin dinucleotid fosfat), FMN (flavin
mononucleotid); FAD (flavin adenin dinucleotid).
Pentru sinteza ATP-ului se utilizează fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator) cuplată cu
partea terminală a lanţului respirator.
Respiraţia anaerobă (anoxibiotică)
În respiraţia anaerobă acceptorul final de electroni este reprezentat de orice substanţă
anorganică diferită de oxigen sau de orice substanţă organică (fermentaţia); fosforilarea se face
la nivelul substratului.
Tipul fermentativ este reprezentat de ansamblul acizilor care rezultă prin fermentaţia
zaharidelor şi reprezintă un caracter fiziologic stabil, foarte important din punct de vedere
taxonomic şi biochimic. Etapele fermentaţiei sunt mai reduse, câştigul energetic fiind mai mic.
De exemplu în cazul genului Clostridium, prin fermentaţie acetică se obţine 1 mol ATP, iar prin
fermentaţie butirică se obţin 0,5 moli ATP. Fermentaţia butirică a fost descoperită de Louis
Pasteur în anul 1861 (produsă de Vibrion butyrique, numit ulterior Clostridium butyricum). Rolul
biologic al fermentaţiei este reprezentat de producerea energiei şi nu de obţinerea unor produşi
finali.
Sinteza ATP-ului
Sinteza ATP-ului se realizează prin cuplarea reacţiilor de oxidoreducere cu reacţiile de
fosforilare.
În respiraţia aerobă se utilizează mai ales fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator) cuplată
cu partea terminală a lanţului respirator.
În respiraţia anaerobă fosforilarea se face la nivelul substratului, donatorii şi acceptorii fiind
metaboliţi anorganici (dar nu O2) sau organici (fermentaţia).
Energetica respiraţiei bacteriene
Prin fosforilarea oxidativă se pot obţine 38 moli ATP pentru 1 mol de glucoză.
Prin fosforilarea substratului se pot obţine circa 2 moli ATP pentru 1 mol de glucoză.
Energia este folosită apoi în procese metabolice de asimilaţie.
În raport cu utilizarea proceselor pentru obţinerea energiei şi de relaţia cu oxigenul din mediu,
bacteriile se pot grupa în 4 „tipuri respiratorii” principale (vezi și Tabelul nr. 1):
- strict aerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Bordetella pertussis) se dezvoltă numai în
prezenţa unei presiuni crescute a O2, care este folosit ca acceptor final unic. Aceste bacterii
posedă catalază, peroxidază, citocromi (de exemplu catalaza desface H2O2 toxic pentru celula
bacteriană; vezi Figura nr. 1) şi utilizează numai procese de respiraţie. Unele specii aerobe
(exemplu Pseudomonas aeruginosa) se pot dezvolta în medii lipsite de oxigen, dacă în mediu
sunt prezenţi nitratul sau nitritul;
37
- strict anaerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Clostridium tetani, Clostridium botulinum,
Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc) cresc numai în absenţa O2. Nu pot
supravieţui în prezenţa O2, care nefiind redus are o acţiune bactericidă. Nu au catalază,
peroxidază (care acţionează asupra ionilor de O2 sau asupra H2O2). Aceste bacterii folosesc
pentru obţinerea energiei numai procese de fermentaţie. Pentru cultivarea lor este necesară
utilizarea unui mediu cu potenţial redox foarte scăzut.
- aerob facultativ anaerob, atunci când bacteriile (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc) se dezvoltă
mai bine în mediile cu oxigen, prin procese de respiraţie, dar pot prezenta ambele tipuri
respiratorii, în funcţie de potenţialul redox. Majoritatea au catalază sau citocromoxidază, dar nu
au peroxidaze flavoproteice. În acest tip se încadrează majoritatea bacteriilor studiate.
- anaerob microaerofil, atunci când bacteriile (de exemplu Campylobacter) tolerează mici
cantităţi de O2.
Polizaharidele utilizabile de către bacterii nu pot pătrunde ca atare în celulă. Ele sunt degradate
de 2 categorii de enzime extracelulare: exohidrolaze (care scindează unităţile monozaharidice
din extremităţile lanţurilor polizaharidice) şi endohidrolaze (care hidrolizează unităţile interne).
Polizaharidele existente în celulă ca materiale de rezervă au o degradare diferită, prin
fosforoliză, rezultând hexozo-monofosfaţi.
Principalele căi metabolice (de catabolism) sunt:
a). calea hexozo-difosfaţilor (Embden-Meyerhof-Parnas), prin care în final pentru 1 mol de
glucoză se obţin 1 mol de acid piruvic şi 2 moli ATP;
b). calea pentozo-monofosfaţilor;
c). calea Entner-Doudoroff (pentru bacterii din grupul Pseudomonas).
Multe bacterii degradează trigliceridele prin lipaze exocelulare în glicerol şi acizi graşi liberi.
Activitatea lipazică poate fi cercetată pe medii care conţin glicerol-tributirat. Pentru degradarea
lipidelor unele bacterii, de exemplu Clostridium perfrigens, posedă enzime specifice (lecitinaza
D, fosfolipaza C). Prin degradarea fosfolipidelor din membrana hematiilor, fosfolipaza C conferă
bacteriilor proprietatea de hemoliză.
Acizii graşi sunt degradaţi preponderent prin procesul de beta-oxidare; acizii graşi reprezintă
surse de energie foarte utile (ex. 1 mol de acid palmitic generează 129 moli de ATP).
Bacteriile saprofite au proprietăţi lipolitice intense, participând la biodegradarea grăsimilor şi
uleiurilor (mai ales în mediul marin).
În lumea bacteriană mai răspândiţi sunt D-aminoacizii. Aceştia pot forma diferite polipeptide cu
activitate antibiotică (gramicidina, polimixina, bacitracina) sau de exemplu capsula bacilului
anthraxului. Participă de asemenea şi la formarea peretelui celular (de exemplu D-Ala).
Căile de degradare sunt reprezentate mai ales de:
a). transaminarea şi dezaminarea aminoacizilor (de exemplu, enterobacteriile au căi proprii de
catabolism, utile în identificare);
38
b). decarboxilarea aminoacizilor.
Sinteza peptidoglicanului se desfăşoară pe parcursul mai multor etape (vezi Figura nr. 3). Începe
prin sinteza în citoplasmă a UDP-acid N-acetil muramic-pentapeptid (NAM). Această structură se
ataşează de bactoprenol (un lipid din membrana celulară), după care urmează un lanţ de reacţii
biochimice. Legarea încrucişată finală se realizează printr-o reacţie de transpeptidare în care
terminaţiile amino libere ale pentaglicinei înlocuiesc reziduurile terminale ale D-Ala de la
peptidul învecinat. Reacţia este catalizată de transpeptidaze, un set de enzime numite şi PBPs
(penicillin binding proteins) care au atât activitate de transpeptidaze şi carboxipeptidaze, dar
controlează şi gradul de legare a peptidoglicanului (aspect foarte important în diviziunea
celulară). La nivelul lor se pot lega penicilinele şi alte medicamente beta -lactamice (Figura nr. 4).
Această cale de biosinteză are o importanţă particulară în medicină, oferind şi baza acţiunii
selective a unor antibiotice (peniciline, cefalosporine, bacitracină, vancomicină, cicloserină etc).
Spre deosebire de celulele gazdei, microorganismele sunt izotone cu fluidele organismului. În
interiorul lor presiunea osmotică este foarte mare şi viabilitatea lor depinde de integritatea
peretelui (peptidoglican) pe tot parcursul ciclului celular. Orice compus care inhibă o etapă în
biosinteza peptidoglicanului la o bacterie în creştere va putea produce liza bacteriană (efect
bactericid).
Capsula se sintetizează enzimatic din subunităţi activate. În sinteza capsulei extracelulare (poate
avea structură polizaharidică sau peptidică) nu sunt implicate lipide transportoare de
provenienţă membranară. Prezenţa capsulei este adesea determinată de condiţiile de mediu.
De exemplu, dextranii se pot sintetiza pornind de la sucroză şi acest lucru se va realiza doar dacă
există sucroză în mediu.
Când nutrienţii sunt în exces, bacteria poate converti o parte din ei în granule de rezervă
(vacuole), de exemplu glicogen, polihidroxibutirat, volutină, care diferă de la o bacterie la alta.
39
Populaţia reprezintă o multitudine de indivizi ai unei specii care convieţuiesc într -un anumit
biotop.
Clona este populaţia care rezultă dintr-o singură celulă prin înmulţire vegetativă (diviziune
binară).
Tulpina reprezintă populaţia microbiană alcătuită din descendenţii unei singure izolări în cultură
pură.
Temperatura de dezvoltare
În funcţie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi:
- mezofile, cu temperatura optimă de 30-37ºC;
- psichrofile, cu temperatura optimă în jur de 20ºC (unele acceptând temperaturi apropiate de
0ºC; Listeria spp. poate supravieţui sau se poate chiar şi multiplica la temperatura din frigider).
Ele sunt adaptate la acest mediu prin numărul mare de acizi graşi nesaturaţi conţinuţ i de
membrana plasmatică. Gradul de nesaturare al unui acid gras se corelează cu timpul de
solidificare sau stadiul de tranziţie termică (temperatura la care se topeşte sau se solidifică
lipidul). Acizii graşi nesaturaţi rămân în fază lichidă la temperaturi joase, dar sunt denaturaţi la
temperaturi moderate. Fie că acizii graşi din membrană se află în fază lichidă sau solidă, ei
afectează fluiditatea membranei, care afectează în mod direct capacitatea de a funcţiona.
- termofile, cu temperatura optimă de 50-60ºC (unele putând să se multiplice şi la temperaturi
apropiate de 95ºC, ca de ex. Thermus aquaticus). Bacteriile termofile sunt adaptate să reziste la
temperaturi de peste 60°C printr-o varietate de modalități. Acizii graşi din membrana bacteriilor
termofile sunt acizi grași saturaţi, permiţând membranelor să rămână stabile şi funcţionale la
temperaturi ridicate.
- extrem termofile sau hipertermofile, cu temperatura optimă de 80°C sau mai mare şi o
temperatură de dezvoltare maximă de 115°C. (2) Nu sunt patogene.
Bacteriile studiate de microbiologia medicală sunt în marea lor majoritate mezofile.
Creşterea oricărui organism are loc prin sinteza de noi molecule. Deoarece creşterea volumului
celular raportată la creşterea suprafeţei este mai mare, în cursul creşterii se ajunge la un punct
critic. Multiplicarea celulară este o consecinţă a creşterii. Se restabileşte raportul optim dintre
volumul şi suprafaţa celulei.
Multiplicarea majorităţii bacteriilor se face prin diviziune simplă (binară). Sporii nu reprezintă
forme de multiplicare (aşa cum se întâmplă în cazul fungilor sau paraziţilor).
Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecţii, trebuie ca din produsul recoltat de la pacient
să obţinem mai întâi respectivul microorganism în cultură pură, pentru ca ulterior să îi putem
studia diferitele caractere în vederea identificării.
Metodele de cultivare a bacteriilor urmăresc mai multe obiective:
· obţinerea unei populaţii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaţiile propuse,
· prevenirea contaminării produsului cercetat cu un microorganism străin şi
· izolarea fiecărei tulpini microbiene urmărite în cazul unui produs plurimicrobian în culturi
monomicrobiene denumite „culturi pure”.
40
Nu există un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricărei bacterii. Termenul „însămânţare”
defineşte operaţia de introducere a unei cantitaţi de germeni într-un mediu de cultură
artificială, în timp ce pentru culturile celulare, ouă embrionate şi mai ales animale de experienţă
folosim termenul „inoculare”.
Cultivarea se realizează prin însămânţarea bacteriilor pe medii de cultură. Mediile solide sau
lichide care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice necesare creşterii şi multiplicării
bacteriene se numesc medii de cultură.
Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea într-un mediu de cultură poartă numele de
cultură bacteriană.
Aceste medii se pot clasifica după starea de agregare, după natura ingredientelor, după
complexitatea ingredientelor (de exemplu medii speciale), după scopul urmărit (de transport,
de izolare, de identificare etc.), după conţinutul în apă, etc. Există medii de cultură simple (agar,
apă peptonată, bulion simplu etc) şi medii de cultură mai complexe (agar -sânge, bulion
glucozat, agar Muller-Hinton etc). (vezi anexa nr. 2)
Medii speciale
Mediul electiv conţine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltării unei anumite bacterii
(de exemplu mediul Lőffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric) (Figura nr. 5).
41
Prin conţinutul său în substanţe antimicrobiene, mediul selectiv inhibă dezvoltarea altor bacterii
decât cea a cărei izolare se urmăreşte. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea
bacilului difteric sau medii în care includem antibiotice (faţă de care bacteria care se doreşte a fi
izolată este rezistentă) (Figura nr. 6)
Mediul de îmbogăţire favorizează înmulţirea anumitor bacterii patogene, inhibând dezvoltarea
florei de asociaţie dintr-un produs patologic. Funcţionează concomitent ca mediu selectiv şi ca
mediu electiv (de exemplu, mediul hiperclorurat pentru stafilococ sau mediile de îmbogăţire
utilizate pentru izolarea Salmonella typhi).
Mediul diferenţial conţine un anumit substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate fi sau nu
metabolizat, determinând modificarea culorii sau aspectului culturii. De exemplu, agarul cu
albastru de brom-timol lactozat (AABTL) care diferenţiază bacteriile lactoză-pozitive (cum este E.
coli) de bacteriile lactoză-negative (Shigella, Salmonella). Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat
citrat lactoză), TSI (3 zaharuri şi fier), MIU (mobilitate indol uree). (Figurile nr. 7-10).
Pe medii solide, germenii însămânţaţi în suprafaţă produc colonii. Colonia este totalitatea
bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie este o clonă
bacteriană.
Coloniile izolate se pot obţine de exemplu prin tehnica însămânţării prin dispersie (cu ansa
bacteriologică sau cu tamponul). După prelevarea cu ansa a unei porţiuni din produsul
patologic, inoculul este dispersat pe latura unui viitor poligon; se resterilizează ansa; se verifică
temperatura, prin atingerea mediului într-o zonă neînsămânţată, cât mai periferic; cu ansa
sterilă se trasează a doua latură a poligonului; se resterizează ansa şi se repetă procedeul
descris până la realizarea a 4-5 laturi, fără a atinge prima latură. În acest mod, pe ultimele
„laturi” ale poligonului se vor putea observa după trecerea timpului necesar multiplicăr ii
bacteriene, colonii izolate, bine individualizate. (Schema nr. 1)
Incubarea constă în menţinerea mediilor de cultură însămânţate, în condiţiile necesare pentru
dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvoltă şi duc la apariţia unei cu lturi în
circa 18-24 de ore de incubare la temperatura optimă de dezvoltare (asigurată în termostat)
pentru că timpul de generaţie este de circa 30 minute. Mycobacterium tuberculosis are un timp
de generaţie de 12-27 ore şi în acest caz cultura devine pozitivă în 2-8 săptămâni. Pentru
bacteriile strict anaerobe este necesară incubarea în anaerobioză (ex. în medii la care s -au
adăugat ingrediente cu activitate reducătoare sau în anaerostat); dorim să subliniem că dacă
transportul nu se face în condiţii de anaerobioză, nu vom mai obţine nici un rezultat indiferent
de mediile utilizate (Figura nr. 11).
Culturile bacteriene sunt discontinue când se realizează în volum limitat de mediu, care nu este
reînnoit şi continue atunci când mediul de cultură este continuu reînnoit. O populaţie
bacteriană poate fi menţinută indefinit în faza de multiplicare exponenţială dacă se adaugă
continuu mediu de cultură proaspăt, cu omogenizare prin curent de aer steril şi evacuare a unei
cantităţi corespunzătoare de cultură (de exemplu în dispozitivul numit chemostat sau
turbidostat).
Chemostatul utilizează un mediu de cultură în care unul dintre nutrienţi, aflat în concentraţie
mai redusă decât ceilalţi, funcţionează ca factor limitant al creşterii. Mediul de cultură proaspăt
42
este admis în vasul de cultură în ritmul în care este consumat factorul limitant, iar cultura este
evacuată cu acelaşi ritm. Cultura este menţinută astfel la o valoare constantă şi submaximală
ratei de creştere, reglată prin factorul limitant. Chemostatele sunt foarte utile pentru obţinerea
de tulpini mutante pentru că după ce rata de multiplicare a fost determinată şansa de selectare
a acestor tulpini este mai mare (Figura nr. 12).
În laboratorul de microbiologie clinică, de regulă se utilizează culturile discontinue.
Populaţia care rezultă prin diviziunea unei bacterii creşte în progresie geometrică cu raţia 2.
Timpul necesar pentru dublarea populaţiei se numeşte timp de dublare sau timp de generaţie.
Timpul de generaţie în faza exponenţială şi în condiţii optime de cultivare este determinat
genetic. De exemplu, pentru E. coli este de circa 20 minute (ca şi pentru majoritatea bacteriilor
studiate). Pentru Mycobacterium tuberculosis timpul de generaţie poate avea o valoare între
12-27 ore.
Teoretic, dinamica unei populaţii bacteriene ar trebui să evolueze exponenţial. Dinamica reală a
populaţiei bacteriene în cultură discontinuă are însă o evoluţie caracterizată printr -o curbă la
care distingem patru faze: faza de lag; faza de multiplicare logaritmică; faza staţionară şi faza de
declin (Figura nr. 13).
43
bacterii pot persista 2-3 luni. În acest scop se pot activa mecanisme speciale de reglare şi se
exprimă o serie de gene care duc la sinteza unor proteine speciale care permit adaptarea pentru
o durată limitată de timp. La speciile sporogene, fenomenul de sporogeneză devine foarte
intens.
Aspectul culturilor pe medii solide
Condiţiile de cultivare şi aspectul culturii sunt caractere cheie în identificarea bacteriilor.
Aspectul coloniilor variază între diferitele bacterii, fără a permite diferenţieri definitive de specie
(dar au utilitate în contextul studierii tuturor caracterelor bacteriene şi în contextul general al
diagnosticului de laborator, care la rândul său trebuie să aibă loc într -un context în care punem
în balanţă şi alte elemente, clinice, paraclinice; colaborarea între medicii de diferite specialităţi
este esenţială). Se examinează:
· dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm şi mici, sub 1
mm),
· conturul (circular, lobat, zimţat),
· relieful (plat, bombat, acuminat, papilat),
· suprafaţa (lucioasă, granulară, rugoasă),
· culoarea (pigmentate, nepigmentate),
· opacitatea (transparente, opace),
· consistenţa,
· aderenţa la mediu,
· prezenţa sau absenţa hemolizei (pe medii de tipul geloză-sânge). (Figura nr. 14)
Colonia S (smooth) are suprafaţă bombată şi netedă, margini circulare şi adesea aspect
strălucitor. Germenii păstrează structura antigenică şi nu aglutinează spontan cu soluţie salină
fiziologică. Germenii capsulaţi îşi păstrează capsula. Virulenţa este conservată. Majoritatea
bacteriilor studiate formează colonii de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E. coli etc). (Figura nr. 15)
Colonia R (rough) este plată, suprafaţa ei prezintă rugozităţi, marginile sunt crenelate. Structura
antigenică nu este caracteristică. Nu păstrează capsula. Virulenţa nu este conservată (excepţii
Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphteriae). O bacterie care în
mod caracteristic duce la apariţia unei colonii de tip S (ex. o enterobacterie), în cazul în care
testele de identificare prin reacţii antigen-anticorp (ex. aglutinare pe lamă, folosind anticorpi
cunoscuţi) nu se efectuează la timpul potrivit ci mai târziu, prin „înbătrânire” va suferi anumite
modificări, coloniile vor deveni de tip R iar identificarea pe baza caracterelor antigenice nu va
mai fi posibilă. (Figura nr. 16)
Colonia M (mucoid) este mare, strălucitoare, mucoasă. Este dată de exemplu de bacteriile care
prezintă capsule mari (exemplu Klebsiella pneumoniae). (Figura nr. 17) Coloniile de
Streptococcus pneumoniae pot fi şi de tip S şi de tip M.
În cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus spp.) pe mediile obişnuite nu vom putea obţine
colonii izolate (a fost descris fenomenul de „invazie”). (Figura nr. 18) Cultura se întinde pe toată
suprafaţa plăcii în strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de „invazie” poate
fi inhibat prin incorporarea în mediu de acizi sau săruri biliare, tiosulfat de sodiu etc.
Aspectul culturilor pe medii lichide
Bacteriile şi fungii facultativ anaerobi se dezvoltă în toată masa de lichid, tulburându -l. Bacteriile
strict aerobe se dezvoltă preponderent la suprafaţa mediului. Ca un aspect particular, în apa
peptonată Vibrio cholerae se poate dezvolta şi formează un „văl” la suprafaţa mediului. În acest
caz, pH-ul mediului este 9-9,5.
44
Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbură omogen mediul
(majoritatea bacteriilor). (Figura nr. 19)
Variantele R realizează o tulburare mai puţin omogenă. Pot lăsa mediul limpede, formând
flocoane care se depun sau un strat (văl) la suprafaţa mediului (de exemplu bacilul difteric sau
bacilul tuberculos). (Figura nr. 20)
Alte informaţii privind mediile de cultură, diferitele tehnici de cultivare, examinarea culturilor
bacteriene şi diferitele tehnici de identificare fenotipice utile în diagnosticul microbiologic sunt
prezentate în anexa nr. 2.
Era prin anul 1928 când Alexander Fleming, investigând caracteristicile stafilococilor, a
descoperit în mod accidental penicilina printr-o „eroare de cultivare”. Fleming era deja cunoscut
drept un cercetător de excepţie prin activitatea deja desfăşurată, de ex. datorită descoperirii
lizozimului (1922); pe de altă parte, omul de ştiinţă demonstra un grad de neglijenţă în
activitatea de laborator.
Întors din concediu în septembrie 1928, a găsit câteva dintre plăcile cultivate anterior,
contaminate cu un fung din genul Penicillium şi a decis să le arunce într -o soluţie de dezinfectat.
Puţin mai târziu, vrând să arate unui coleg câteva dintre rezultatele activităţii sale, a găsit câteva
plăci care nu fuseseră încă „dezinfectate” iar de această dată a observat o mică zonă, la
contactul dintre cultura fungică şi cultura bacteriană, zonă în care bacteriile nu s -au dezvoltat.
Pornind de la această observaţie, Fleming a obţinut un extract din cultura fungică, cu proprietăţi
bactericide. Pentru că fungul făcea parte din genul Penicillium a denumit acest extras penicilină.
A publicat rezultatele acestei descoperiri în anul 1929.
Au mai trecut aproape 16 ani, timp în care s-a reuşit izolarea şi stabilizarea acestui extract, şi în
anul 1945 s- a înregistrat producerea antibioticului revoluţionar numit penicilină.
Pentru descoperirea sa, Fleming împreună cu biochimistul Ernst Chain şi farmacologul Howard
Florey au fost laureaţi cu Premiul Nobel pentru Fiziologie şi Medicină în anul 1945.
În 2009, o echipă de cercetători i-a oferit Coxiellei burnetii mijloacele de a „evada” din mediul
intracelular. Până la această dată, agentul etiologic al febrei Q era unul dintre exemplele
stereotipe de bacterie strict parazită, imposibil de cultivat pe medii artificiale.
Nu a fost una dintre acele descoperiri rapide, neaşteptate, ci a încununat o muncă minuţioasă
de studiere a necesităților metabolice ale acestor bacterii. Cercetările au evoluat progresiv: într-
o primă etapă, a fost obţinut un mediu de cultură artificial, care reproducea condiţiile de pH
acid din interiorul vacuolelor asemănătoare lizozomilor, în care Coxiella spp. se multiplică în
celulele gazdei. Pe acest mediu, denumit ulterior Complex Coxiella Medium (CCM), Coxiella
burnetii şi-a putut desfăşura activitatea metabolică timp de aproximativ 24 de ore.
Într-o a doua etapă, cercetătorii au reuşit să dovedească faptul că bacteria este microaerofilă.
Au adaptat mediul în consecinţă şi l-au numit ACCM (Acidified Citrate Cysteine Medium).
Cultivarea Coxiella burnetii pe medii de cultură artificiale ar putea permite studierea factorilor
de patogenitate, studierea structurii genetice și poate și realizarea unui model de abo rdare
pentru alţi germeni strict intracelulari. (3-4)
45
Vom prezenta mai jos câteva dintre direcţiile de cercetare actuală. Cititorul le poate evalua
deschizând următoarele link-uri:
- Economical Evolution: Microbes Reduce the Synthetic Cost of Extracellular Proteins,
http://mbio.asm.org/content/1/3/e00131-10
- The genome sequence of Rickettsia prowazekii and the srcin of mitochondria,
http://www.nature.com/nature/journal/v396/n6707/full/396133a0.html
- Engineering of Lactobacillus jensenii To Secrete RANTES and a CCR5 Antagonist Analogue as
Live HIV-1 Blockers, http://www.asm.org/images/Communications/hiv-aac.pdf
5. Pe ce mediu se produce modificarea culorii sau aspectului culturii datorită prezenţei unui
substrat?
46
A. Mediu electiv
B. Mediu selectiv
C. Mediu diferenţial
D. Mediu Lőffler
E. Mediu de îmbogăţire
47
înseamnă contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecţia unei
plăgi).
înseamnă lipsit de microbi, indiferent dacă microbii sunt patogeni sau nepatogeni.
Asepsia reprezintă ansamblul de metode prin care evităm contaminarea mediul ui ambiant cu
germeni microbieni sau prin care putem menţine „sterilitatea” ţesuturilor, mediilor de cultură,
medicamentelor injectabile etc.
distruge unele sau toate microorganismele condiţionat patogene sau patogene de pe suprafeţe
sau obiecte, astfel încât acestea să nu mai poată reprezenta o sursă de infecţie sau de
transmitere a infecției, iar obiectele sau suprafeţele să poată fi manipulate şi / sau utilizate în
siguranţă.
reprezintă totalitatea măsurilor pentru asigurarea sănătăţii publice.
presupune prevenirea multiplicării unor microorganisme în produse farmaceutice,
vaccinuri, alimente etc.
reprezintă utilizarea agenţilor fizici şi / sau chimici pentru a îndepărta murdăria
(materie organică şi anorganică) de pe suprafeţe (inclusiv tegument) sau obiecte, prin procedee
mecanice sau manuale, pregătind astfel suprafeţele sau obiectele pentru utilizare în siguranţă
sau, pentru trecerea la o altă etapă de decontaminare.
este un produs sintetic pentru curăţare. Detergenţii pot fi anionici, cationici,
amfoterici şi neionici. Nu prezintă acţiune antimicrobiană.
Detergentul enzimatic este un produs sintetic pentru curăţare care conţine o enzimă.
48
este un agent chimic care îndepărtează murdăria (materie organică şi/sau
anorganică) de pe suprafeţe sau obiecte, dar nu prezintă activitate antimicrobiană (bactericidă,
virucidă, fungicidă sau sporicidă) şi care nu reduce nivelul de contaminare microbiană.
este procedura prin care se elimină murdăria şi se reduce flora tranzitorie prin
acţiune mecanică, utilizând apă şi săpun (Figura nr. 1, Film nr. 1).
49
solid). Toate materialele utilizate în laboratorul de microbiologie trebuie să fie sterile înainte de
utilizare. Există o mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel încât şi metodele
de sterilizare sunt destul de variate, după cum urmează:
- Metode de sterilizare prin căldură (căldura uscată sau căldura umedă);
- Metode de sterilizare prin filtrare;
- Metode de sterilizare utilizând radiaţiile, dar şi
- Metode chimice de sterilizare.
Metodele de sterilizare care utilizează radiaţiile (cu excepţia radiaţiilor ultraviolete) şi metodele
chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilenă) sunt utilizate rareori în laboratorul de
microbiologie.
Sterilizarea va fi întotdeauna precedată de pregătirea materialului care urmează să fie ster ilizat,
respectiv: spălare, uscare, ambalare (în cazul materialelor curate, necontaminate) urmat de
autoclavare, spălare, uscare, ambalare (în cazul materialelor contaminate refolosibile).
Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc. trebuie curăţate perfect,
de ex. prin spălare cu ajutorul unor detergenţi. Dacă aceste materiale au fost contaminate cu
sânge, înainte de spălare se vor dezinfecta. Sticlăria de laborator este colectată în recipiente
speciale şi se sterilizează prin autoclavare; pipetele vor fi menţinute în amestec dezinfectant
până a doua zi. Instrumentarul metalic, seringile şi acele (deşi este necesară utilizarea pe scară
largă a seringilor şi acelor de unică întrebuinţare) contaminate se vor introduce în baie de
amoniac 1-2% timp de 15-30 minute, se vor peria în soluţie de 1-2% detergent cationic şi se vor
spăla cu jet de apă pentru îndepărtarea substanţelor chimice (Figura nr. 3).
Instrumentele de unică utilizare sunt, în general, destinate chirurgiei moderne. Pot fi izolate
(aparate de sutură mecanică toracică, abdominală, vasculară etc) sau pot fi furnizate în seturi de
instrumente de unică utilizare. Sterilizarea acestor instrumente se face industrial prin iradiere cu
raze gamma sau etilenoxid. Utilizarea instrumentelor de unică utilizare (”disposable”) conferă
un plus de siguranță, în pofida unui preţ relativ ridicat.
Există o serie de metode pentru a controla eficienţa sterilizării, prin indicatorii fizici (ex.
termometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus
stearotermophilus din genul Geobacillus). Pentru verificarea eficacităţii sterilizării cu ajutorul
radiaţiilor, pot fi utilizaţi spori de Bacillus pumilus, din genul Bacillus) (Figura nr. 4).
Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici, chimici sau biologici se pot traduce în principiu prin:
distrugerea microorganismelor (efect bactericid) şi respectiv inhibarea reversibilă a multiplicării
microorganismelor (efect bacteriostatic).
50
Prin acţiunea căldurii procesele chimice şi fizice sunt mult accelerate; distrugerea se produce
după atingerea temperaturii de 50-60ºC prin ruperea legăturilor intramoleculare, mai ales a
punţilor de hidrogen care menţin proteinele şi alte macromolecule în stare nativă. Ca urmare
protoplasma se denaturează. Celulele bogate în apă sunt mult mai sensibile la acţiunea căldurii
decât microorganismele care conţin puţină apă sau sunt liofilizate. Apa din compoziţia
microorganismelor absoarbe căldura proporţional cu volumul său. Sterilizarea prin căldura are
loc în două variante principale: prin căldură uscată și umedă.
Flambarea reprezintă trecerea prin flacără (de câteva ori) a unui obiect, fără a se atinge
temperatura de incandescenţă. Flambarea se aplică pentru portansă, gâtul unui recipient de
sticlă (tub, eprubetă, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur şi nu reprezintă
sterilizare.
cald se realizează în etuvă (pupinel, cuptor Pasteur) (Figura nr. 6). Etuva
este o cutie metalică cu pereţi dubli. Cu ajutorul unor rezistenţe electrice şi a unui termostat se
obţine şi menţine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii în interiorul
aparatului este realizată cu ajutorul unui sistem de ventilaţie (Schema nr. 1).
Pentru majoritatea materialelor care urmează a fi sterilizate, temperatura din etuvă trebuie să
atingă 180ºC, pentru o durată de 1 oră sau 160°C pentru o durată de 2 ore. Pot exista și alte
variante, de exemplu în funcție de dimensiunea obiectelor de sterilizat.
Sterilizarea cu aer cald este indicată pentru obiecte de sticlă, obiecte de porţelan, pulberi inerte
şi termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de
menţionat faptul că repetarea sterilizării, în timp, conduce la decălirea oţelului) etc.
Nu se vor steriliza în etuvă soluţiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vată,
bumbac, fibră sintetică, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator.
reprezintă arderea până la obţinerea de cenuşă (Figura nr. 7). Există anumite
reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. În cazul spitalelor,
în România au existat astfel de incineratoare în structura unităţii sanitare respective. Odată cu
procesul de aderare la Uniunea Europeană şi respectiv necesitatea aplicării unor reguli impuse
pentru toate ţările membre, majoritatea incineratoarelor de spital au fost închise. Modul în care
s-a realizat în perioada 2003-2004 negocierea privind stoparea activităţii acestor incineratoare
nu a ţinut cont de situaţia reală din ţara noastră. În lipsa unui incinerator propriu, unitatea
sanitară trebuie să încheie un contract de prestări servicii cu o firmă de profil. Din punctul de
vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse incinerării materiale de unică
folosinţă din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cadavrele animalelor de experienţă etc.
51
este cea mai eficientă metodă de sterilizare şi are ca
mecanism coagularea proteinelor şi degradarea enzimelor. Se poate folosi pentru diferite
substanţe în soluţie, sticlărie (cu excepţia pipetelor şi lamelor), instrumentar chirurgical
(metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de cultură, aparate de filtrat etc.
52
· deschidem robinetul pentru evacuarea aerului şi vaporilor (dacă rămâne aer în
cazanul cu presiune eficienţa sterilizării va scădea considerabil; vaporii de apă fiind mai uşori,
vor încălzi în special partea superioară a cazanului în timp ce aerul, care va atinge temperaturi
inferioare, fiind mai greu, va rămâne în partea inferioară a cazanului) ;
· închidem robinetul după evacuarea aerului şi apariţia unui jet continuu de vapori;
· presiunea din cazan începe să crească şi este urmărită cu ajutorul manometrului;
atunci când presiunea atinge valoarea dorită (de ex. 1 atmosferă), reglăm sursa de căldură în
aşa fel încât această presiune să fie menţinută pentru toată durata sterilizării (de ex. 30 minute)
;
· după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură şi lăsăm autoclavul să
se răcească până când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice;
· deschidem lent robinetul de vapori;
· deschidem sistemul de etanşeizare şi capacul autoclavului;
· lăsăm obiectele şi materialele să se răcească în autoclavul deschis;
· atunci când temperatura scade suficient de mult putem scoate materialele
sterilizate.
53
asemenea menţinute la temperatura frigiderului pentru o durată limitată de timp în vederea
prezervării şi posibilităţii de a repeta anumite teste de identificare etc.
În funcţie de viteza cu care are loc răcirea, întâlnim situaţii diferite, cu următoarele posibile
efecte asupra structurilor celulare bacteriene.
, la temperaturi mai mici -21,3ºC are efecte bactericide prin formarea de
cristale de gheaţă şi prin hiperconcentrarea salină cu denaturarea proteinelor;
la -70ºC are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea în masă a
apei fără apariţia cristalelor de gheaţă;
(criodesicarea) reprezintă congelarea bruscă concomitent cu desicaţia
(deshidratarea în vid). O suspensie microbiană în mediu protector, liofilizată, poate fi păstrată în
fiole închise timp îndelungat (de exemplu vaccinul BCG).
Microorganismele pot fi reţinute mecanic şi electrostatic în porii unui filtru. Trecerea unui lichid
printr-o substanţă prevăzută cu pori care va reţine microorganismele din lichidul respectiv
poartă numele de sterilizare prin filtrare.
De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porţelan, sticlă poroasă, azbest
impregnat cu caolin, pământ de infuzori) (Figura nr. 10). Actualmente se folosesc din ce în ce
mai frecvent membrane filtrante din acetat de celuloză cu porozităţi între 8 şi 0,025 mm (Figura
nr. 11). În vederea filtrării sunt necesare o serie de piese precum: un recipient în care se
introduce lichidul care urmează a fi filtrat, un recipient în care se va colecta lichidul sterilizat, o
pâlnie care se montează etanş între cele 2 recipiente, o pompă de vid care va aspira lichidul din
primul în al doilea recipient, prin membrana filtrantă. Toate aceste piese sunt sterilizate prin
autoclavare înainte de începerea filtrării.
Există şi alte variante tehnice. Cu o importanţă practică particulară ar fi de menţionat filtrele
pentru sterilizarea aerului din cabinetele de siguranţă biologică (clasa II şi clasa III), filtrele HEPA
(High Efficiency Particulate Air Filters) (Figura nr. 12).
Sterilizarea prin filtrare este utilizată pentru decontaminarea aerului, a unor medii de cultură
(care nu se pot steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la temperaturile
atinse în cazul sterilizării prin căldură etc.
54
Plasmoliza (pierderea apei, deshidratarea) în medii hipertone are efecte letale asupra unor
bacterii. În medii hipotone are loc acumularea de apă în celula bacteriană; aceasta devine
turgescentă şi peretele bacterian cedează.
Există o serie de substanţe chimice necesare creşterii şi multiplicării bacteriene. Alte substanţe
chimice (antibioticele şi chimioterapicele) au efect bactericid sau bacteriostatic selectiv.
sunt substanţe cu acţiune antimicrobiană neselectivă,
alterândstructuri şi funcţii comune microorganismelor şi organismelor superioare.
pot fi utilizate pe tegumente şi mucoase.
e pot fi utilizate numai pe suprafeţe şi structuri care nu sunt vii.
O parte dintre dezinfectante au efect sterilizant. Aşa cum am menţionat anterior, trebuie să
existe o etapă de pregătire a materialelor în vederea sterilizării. Materialele de laborator,
instrumentarul, materialele chirurgicale etc, trebuie curăţate perfect, de ex. prin spălare cu
ajutorul unor detergenţi. Dacă aceste materiale au fost contaminate cu sânge, înainte de
spălare se vor dezinfecta.
Substanţele antiseptice şi dezinfectante se pot clasifica în funcţie de mecanismul de acţiune,
după cum urmează:
55
cationici (săruri cuaternare de amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul
dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu propilenglicolul)].
soluţiile de hipoclorit se prepară periodic (se inactivează după mai mult de 24 ore),
concentraţia în clor activ este diferită în funcţie de scopul urmărit (ex. 2.500 ppm clor activ
pentru dezinfectarea pipetelor contaminate);
au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, sporilor bacterieni, fungilor (100
ppm în o oră), virusurilor (200 ppm în 10 minute);
efectul este diminuat considerabil în prezenţa substanţelor organice (în special proteine),
maselor plastice, detergenţilor.
56
nu poate fi folosită pentru suprafeţe, datorită vaporilor iritanţi şi timpului mare de expunere;
ideală pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o perioada mai
mare de timp în containere menţinute închise.
exercită activităţi bactericide prin alkilarea acizilor nucleici şi prin înlocuirea hidrogenului labil
printr-o grupare hidroxietil (-CH2CH2OH);
sporii de Bacillus subtilis nu sunt distruşi;
acest tip de sterilizare se utilizează pentru materiale care nu rezistă atunci când sunt supuse
acţiunii temperaturii sau radiaţiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament electronic
etc.);
· fiind o substanţă explozivă, etilenoxidul este utilizat în camere speciale în care se menţine
o presiune negativă, iar pentru a preveni o explozie dioxidul de carbon poate fi combinat cu
această substanţă în încăperi de oţel speciale; o altă variantă de protecție ar fi combinarea cu
hidrocarburi fluorinate.
există o serie de inconveniente în ceea ce priveşte acest tip de sterilizare (pot să apară efecte
carcinogenetice și afectarea sistemului nervos etc., dar e posibilă afectarea întregului organism);
Directiva 98/8/CE defineşte produsele biocide după cum urmează: „Substanţe active şi
preparatele conţinând una sau mai multe substanţe active, condiţionate într-o formă în care
sunt furnizate utilizatorului, având scopul să distrugă, să împiedice, să facă inofensivă şi să
prevină acţiunea, sau să exercite un alt efect de control asupra oricărui organism dăunător, prin
mijloace chimice sau biologice” (vezi directiva CE).
Din categoria produselor biocide sunt excluse produsele de curăţenie, detergenţii sub formă de
pulbere sau lichidă şi alte produse similare, ce nu sunt destinate a avea efect biocid.
57
Produsele biocide includ:
În această categorie ar putea intra şi substanţele sintetizate de Bacillus thuringiensis din genul
Bacillus, cu efect biopesticid.
Bacteriofagii sunt virusuri care parazitează bacteriile (de exemplu, bacteriofagii T1-T7 cu
specificitate pentru E. coli). Bacteriofagii (fagii) au fost descoperiţi în 1915. Prof. Mihai Ciucă
obţine în anul 1921 primele tulpini lizogene. În 1949 se înfiinţează în România un Centru
naţional pentru bacteriofagi. Fagii au o structură mai complexă decât cea a virusurilor obişnuite.
Se descriu (Figura nr. 14):
are structură proteică, simetrie helicoidală; are rol de adsorbţie, ajutând fagul
să penetreze bacteria. Se descriu următoarele formaţiuni:
- cilindrul axial;
- teaca cozii;
- placa bazală (cu croşetele de fixare);
- fibrele cozii (formând un strat în jurul tecii cozii).
58
Toate proteinele fagice pot conduce la apariţia de anticorpi, descoperire utilizată în studierea
înrudirii dintre diferiţi bacteriofagi.
Relaţii bacteriofag-bacterie
Între bacteriofag şi bacteria gazdă se pot stabili două tipuri de relaţii:
- de tip litic sau productiv (Figura nr. 15);
- de lizogenizare sau de tip reductiv (Figura nr. 16).
Relaţiile sunt strict specifice şi sunt mediate de receptori.
Fagul eliberează muramidaza care lizează mureina din peretele bacterian. Teaca
cozii se contractă şi antrenează cilindrul axial prin peretele bacterian, ducând apoi la injectarea
ADN-ului fagic în citoplasma bacteriană;
(ansamblarea) fagului
59
arii numindu-se plaje de bacteriofagie; plajele produse de bacteriofagii virulenţi sunt cl are, în
comparaţie cu plajele mai puţin clare produse de bacteriofagii temperaţi (fagii virulenţi sunt acei
bacteriofagi care nu pot evolua decât în ciclul litic)
· transducţia;
· conversia genetică (cu producerea de exotoxine de către unele bacterii lizogenizate, cum
ar fi toxina difterică, toxina scarlatinoasă, toxina botulinică de tip C etc);
· recombinarea genetică (atunci când o bacterie parazitată de doi fagi diferiţi, dar înrudiţi,
eliberează la sfârşitul ciclului litic pe lângă tipurile parentale şi tipuri de fagi care însumează
unele din proprietăţile celor doi fagi parentali) etc.;
· inducţia fagică (sub influenţa unor agenţi inductori, de ex. raze UV, sau spontan, profagul
îşi recâştigă virulenţa, devine fag virulent, şi produce liza bacteriei respective).
Bacteriile lizorezistente nu permit infecţia cu un fag fie datorită lipsei receptorilor specifici, fie
datorită unei stări de imunitate. Bacteriile lizogene sunt imune la fagii virulenţi omologi
profagului găzduit.
Fagul defectiv reprezintă profagul care persistă indefinit în stare latentă (nu se reactivează).
· fagii virulenţi sunt un element de echilibru ecologic în mediul natural de viaţă al bacteriilor
(în nişa ecologică respectivă);
· fagii temperaţi pot avea un rol deosebit în reasortarea materialului genetic al bacteriilor,
întrucât atunci când se detaşează (inducţie) de cromozomul bacterian pot antrena porţiuni din
ADN-ul bacterian;
· fagii se pot folosi pentru a descoperi gradul de poluare a apelor (datorită specificităţii
relaţiei fag-bacterie);
· anumite mutante ale fagilor se folosesc în ingineria genetică drept vectori ai ADN
recombinant (ex. fagii Charon Lambda);
· fagii reprezintă un model pentru studii teoretice şi practice privind virusurile şi
oncogeneza, precum şi alte aspecte ale biologiei moleculare;
· s-au evidenţiat tipuri fagice (lizotipuri) pentru tulpini bacteriene care biochimic şi antigenic
par identice. Lizotipia (stabilirea sensibilităţii la un anumit tip fagic) este una dintre cele mai fine
60
metode de diagnostic bacteriologic şi epidemiologic, pentru identificarea lanţurilor de
transmisie a germenilor şi pentru determinarea srcinii unei epidemii.
În 1991, în Peru, a izbucnit o epidemie de holeră. Boala nu este foarte frecventă pe continentul
american, motiv pentru care iniţial a fost dificilă stabilirea cauzelor.
Situaţia a apărut oarecum în paralel cu o dezbatere publică ce avea loc în SUA cu privire la
raportul risc / beneficii adus de clorinarea apei. Dintre „istoriile adevărate” aceasta ca şi istoria
epidemiei de difterie în fostele state sovietice arată cât de mult poate fi influenţată sănătatea
publică de către dezbateri, de către mass-media etc (de multe ori în mod negativ).
Este cunoscut faptul că prin clorinarea apei, pe lângă efectul de distrugere a unor
microorganisme ar putea să apară şi fenomene nedorite, datorită apariţiei unor produşi de tipul
trihalometanului. În USA se discută foarte mult despre efectul cancerigen al acestei substanţe.
Diverşi oficiali americani, având se pare relaţii în industria chimică, şi care doreau ca metoda
clorinării să rămână cea mai importantă metodă de antiseptizare a apei, au folosit multă vreme
exemplul acestei epidemii pentru a demonstra ce se poate petrece dacă clorinarea apei va fi
stopată. Pornind de la date reale (epidemia de holeră) dezbaterile au ajuns să prezinte o situaţie
foarte diferită (numeric) ajungându-se să se discute de 1,3 milioane de cazuri de holeră soldate
cu peste 11.000 de decese. În aceste dezbateri s-a afirmat că pentru a preveni apariţia unui
număr foarte mic de cancere (ipotetice) s-a precipitat apariţia unui număr extrem de mare de
cazuri de holeră şi respectiv a unui enorm număr de decese datorate infecţiei cu Vibrio
cholerae.
A fost criticată şi aşa-zisa „Teorie a precauţiei”, principial corectă, bazată pe următoarele idei
generice: a. stabileşte un ţel în cadrul unui proces decizional deschis, care să se adreseze
tuturor celor implicaţi; b. analizează toate modalităţile de a realiza ceea ce îţi propui şi alege
varianta care va conduce la cele mai puţine efecte nedorite; c. dacă nu eşti sigur de calea pe
care vrei să o urmezi, asigură-te că o alegi pe aceea care creează cele mai mici probleme
mediului, sănătăţii publice, comunităţii în general; d. monitorizează rezultatele şi asigură-te că
iei măsuri rapide de remediere, în cazul în care ar apărea o problemă şi e. consultă-te în
permanenţă cu cei asupra cărora vor avea un efect măsurile pe care le-ai stabilit.
Totuşi, nu aplicarea greşită a teoriei a fost cea care a provocat epidemia de holeră.
În final, reprezentanţi oficiali din Peru au afirmat că au decis să aplice clorinarea intermitent şi
nu continuu din motive economice (preţ prea mare pentru clorinarea continuă) şi nu au fost
influenţaţi de „teoria precauţiei”; nu au luat în calcul riscul apariţiei cancerului.
Investigaţia epidemiologică realizată împreună cu colegii de la CDC a demonstrat că epidemia de
holeră a avut o cauzalitate multiplă, factorii cei mai importanţi fiind reprezentaţi de: a.
clorinarea intermitentă a apei; b. diferite branşamente ilegale sau amatoristic făcute la linia de
aprovizionare cu apă a oraşului; c. conectarea instalaţiilor ilegale de irigaţie la liniile de
aprovizionare cu apă potabilă; d. perioade lungi în care apa a avut o presiune scăzută sau nu a
existat presiune deloc, situaţii în care colonizarea şi multiplicarea bacteriană este favorizată; e.
depozitarea apei potabile în butoaie, în condiţii neigienice sau „la limită” şi f. lipsa unor
61
canalizări construite corespunzător, care au permis refularea apei din zonele poluate în reţeaua
de apă potabilă etc.
Cu toate că la baza acestei epidemii au stat mai mulţi factori, cel mai important dintre aceştia a
fost lipsa clorinării (antiseptizării) corespunzătoare a apei potabile.
Datele reale cu privire la această epidemie sunt prezentate succint la punctul
44. 8. 2.
Holera se transmite cel mai frecvent prin consumul de apă contaminată cu tulpini de Vibrio
cholerae, în special în zonele cu educaţie sanitară precară. Datele epidemiologice şi de mediu
obţinute în urma unei izbucnirii epidemice („outbreak”) de holeră în Bangladesh, au sugerat
rolul bacteriofagului litic specific pentru V. cholerae, care ar putea limita gradul de severitate al
epidemiei prin efectul de distrugere a bacteriilor prezente în sursele de apă contaminată, sau
chiar şi în cazul unor persoane infectate.
Au fost emise două ipoteze privind rolul potenţial al bacteriofagilor specifici: a. în cadrul relaţiei
bacterie-bacteriofag, bacteriofagii lizează un număr mare de bacterii, ulterior densitatea
bacteriofagilor scade şi la un moment dat bacteriile se pot multiplica exponenţial şi densitatea
bacteriană atinge nivelul la care pot determina o izbucnire epidemică (severitatea izbucnirii
epidemice va fi cu atât mai mare cu cât densitatea bacteriofagilor rămaşi în sursele de apă
contaminate este mai mică); b. dacă izbucnirea epidemică este datorată multiplicării bacteriene,
necorelat cu diminuarea densităţii fagice, introducerea bacteriofagilor în sursele de apă ar
putea reduce amploarea izbucnirii epidemice şi ar putea duce chiar şi la declinul acesteia.
În ambele situaţii amploarea efectului bacteriofagilor depinde de balanţa care se stabileşte între
rata de multiplicare a vibrionilor şi de rata de distrugere a fagilor.
În timpul izbucnirii epidemice din Dhaka, Bangladesh, au fost cuantificate: a. incidenţa
infecţiilor, b. densităţile tulpinilor de V. cholerae implicate (serotipul O1, rezistent la
streptomicină) şi c. concentraţiile bacteriofagilor litici specifici pentru această tulpină (JSF4), atât
în scaunul pacienţilor spitalizaţi cât şi în rezervoarele de apă potabilă.
Studiul a fost posibil pentru că implica o singură tulpină, a cărei densitate a putut fi uşor
monitorizată prin susceptibilitatea/rezistenţa la streptomicină.
Pe baza observaţiilor în dinamică, studiul a sugerat că infecţiile sunt cauzate de consumul de
apă dintr-un rezervor comun, în care bacteria şi fagul se reproduc şi interacţionează
independent de populaţia umană. Iniţial, schimbările temporare climaterice au creat condiţiile
unei descreşteri a concentraţiei fagice, cu o multiplicare exponenţială a vibrionilor în sursele de
apă. Populaţia a început să se infecteze consumând apa respectivă, s-a creat un cerc vicios de
multiplicare bacteriană în rezervor prin recontaminarea rezervorului datorită igienei precare şi
astfel epidemia s-a amplificat. După un timp producţia de fagi a început să crească, datorită
concentraţiei mari de vibrioni din rezervor şi în persoanele infectate. Amplificarea densităţii
fagice a dus la un declin al densităţii bacteriene şi respectiv la scăderea numărului de persoane
infectate, până la dispariţia cazurilor.
Studiul (a fost realizat şi un model matematic foarte interesant) a sugerat şi posibilitatea ca
fagul să se dezvolte iniţial în gazdele infectate cu V. cholerae, şi abia apoi să ajungă în rezervor
(datorită lipsei de igienă). Această amplificare (numerică şi funcţională) a bacteriofagilor ar
putea reprezenta o importantă componentă în prevenirea / controlul epidemiilor de holeră.
62
Genetica bacteriană studiază ereditatea şi variabilitatea la bacterii.
Suportul material al eredităţii este reprezentat de ADN (acidul dezoxiribonucleic). Molecula de
ADN conţine codificată informaţia ereditară, care se exprimă prin sinteza unor proteine şi se
transmite prin replicare şi diviziune la descendenţi. Gena reprezintă unitatea funcţională a
eredităţii iar noţiunea de genă este cunoscută încă din anul 1909.
Dacă nu au loc modificări genetice, toţi descendenţii unei bacterii vor fi identici cu bacteria
„mamă” şi identici între ei. O celulă bacteriană inoculată pe un mediu de cultură (având la
dispoziţie nutrienţii necesari) va produce prin multiplicare în condiţii prielnice (de pH,
temperatură, umiditate etc.) o colonie bacteriană, o clonă.
Materialul genetic al unei celule bacteriene poate fi modificat fie prin incorporarea unui
fragment de material genetic exogen (prin procesul de recombinare genetică), fie prin apariția
spontană sau indusă a unei mutaţii care poate consta în adăugarea, pierderea, substituirea sau
inversarea ordinii unor baze în secvenţa ADN-ului.
63
morgani şi67% la Pseudomonas aeruginosa. Aşa cum a fost precizat de către diverși autori,
compoziţia de baze azotate este un index taxonomic. (1)
La celulele procariote ADN-ul este inelar, împachetat în nucleoidul din citoplasmă. La bacteria
intestinală E. coli cele 4,7 milioane de perechi de baze alcătuiesc o macromoleculă de 1,4
milimetri lungime, dar numai 2 nanometri lăţime. Aceasta conţine 4.400 de gene deja
secvenţiate. În ciuda lungimii sale, de peste o mie de ori diametrul celular, ADN -ul este extrem
de bine înfăşurat în nucleoid, în aproximativ jumătate din diametrul celular.
ADN-ul apare ca o macromoleculă formată din două catene polinucleotidice antiparalele şi
complementare răsucite în dublu helix. Cele două catene sunt unite prin punţi de hidrogen
formate între bazele azotate opuse (A=T şi G≡C). Modelul structural al ADN-ului a fost propus de
către Watson şi Crick în anul 1953. Complementaritatea bazelor azotate este cea mai
importantă proprietate a acizilor nucleici şi condiţionează toate proprietăţile ADN-ului, mai ales
cea de autoreplicare şi cea de transfer al informaţiei genetice.
Rolul genetic al ADN-ului a fost dovedit prin experienţe succesive, iniţial prin cercetările lui W.
Griffith (1928) privind fenomenul de transformare bacteriană, ulterior prin experienţe care au
confirmat rezultatele obţinute de Griffith, dar abia în 1944 Avery, MacLeod şi Mc Carthy
demonstrează faptul că ADN-ul este substratul chimic al eredităţii şi reprezintă materialul
genetic al oricărei celule (funcţie îndeplinită așa cum știm astăzi de ARN, la ribovirusuri).
La temperatura camerei ADN-ul este o structură stabilă în condiţii fiziologice normale, datorită
legăturilor intercatenare (2 între A şi T şi 3 între C şi G). Dacă temperatura depăşeşte 65ºC,
stabilitatea punţilor de hidrogen începe să cedeze, dublul helix începe să se desfacă şi rezultă
două catene complementare (proces numit denaturare termică). Denaturarea devine completă
la temperaturi care depăşesc valoarea de 90ºC.
Renaturarea („reannealing”) reprezintă refacerea structurii bicatenare a ADN-ului, iar prin acest
proces se poate stabili relaţia filogenetică între două specii (în funcţie de procentul de
renaturare). De exemplu dacă se utilizează ADN denaturat provenit de la E. coli şi ADN
denaturat provenit de la Salmonella spp., fiecare marcat cu acelaşi izotop (ex. C14), fracţiunea
de ADN marcată şi evaluată prin diferite tehnici va fi fracţiunea din ADN care este
complementară pentru cele două specii (aceste experienţe au stat la baza brevetării tehnicilor
de hibridare moleculară). Renaturarea este un proces mai lent decât denaturarea.
Denaturarea şi renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice importante, folosite fie în
tehnologia ADN-ului recombinant, fie în studierea relaţiilor filogenetice între diferite specii. Cu
cât speciile sunt mai înrudite, cu atât secvenţele de baze azotate au un mai mare grad de
similitudine (lanţurile lor monocatenare renaturează mai rapid).
64
- replicarea;
- transcrierea şi traducerea materialului genetic;
- protejarea materialului genetic propriu („self”);
- reglarea şi controlul activităţii celulare.
Transmiterea mesajului genetic se face prin dublarea cantităţii de material genetic urmată de
diviziune.
Replicarea ADN constă în sinteza unor noi molecule de ADN, identice cu molecula parentală şi
identice între ele, pe bază de complementaritate (replicare semiconservativă). După ruperea
legăturilor de hidrogen şi separarea celor 2 catene, fiecare catenă serveşte drept matriţă pentru
sinteza unei noi catene. Replicarea ADN este una dintre cele mai importante reacţii din lumea
vie. Watson şi Crick au fost primii care au propus modelul semiconservativ de replicare a ADN.
În celula care se dezvoltă rapid, există posibilitatea ca înainte de terminarea primei replicări să
se iniţieze încă o replicare. În acest caz celula bacteriană va putea fi merodiploidă (doar anumite
regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori decât în mod normal) sau chiar poliploidă
(tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori decît în mod normal).
În general, dacă replicarea cromozomială nu este succedată de diviunea celulei (aşa cum se
întâmplă în mod obişnuit), putem remarca în celula bacteriană existenţa cromozomilor
supranumerari. Cromozomii suplimentari (în total 2 sau 4) nu aduc o informaţie genetică
diferită, pentru că ei reprezintă copii ale cromozomului iniţial (deci sunt identici cu acesta).
In vivo se pot replica numai moleculele de ADN constituite într-o unitate de replicare
independentă numită replicon. Indiferent dacă celula are mai mulţi cromozomi (celula eucariotă
este diploidă) sau un singur cromozom (celula procariotă), tot genomul trebuie să fie replicat.
Repliconul bacterian este bicatenar şi circular, caracterizat prin:
- o secvenţă nucleotidică specifică marcând începerea replicării;
- gene care codifică sinteza unor proteine specifice numite iniţiatori;
- o secvenţă nucleotidică semnal pentru terminarea replicării.
Exemple de repliconi:
- cromozomul şi plasmidele bacteriene;
- genomul bacteriofagilor.
Cromozomul bacterian este unul dintre cele mai ilustrative exemple de repliconi. O genă
structurală din cromozom are toată informaţia necesară sintezei iniţiatorului replicării (o
proteină complexă). După ce replicarea a început, nu mai poate fi oprită până în momentul când
se ajunge la dedublarea cromozomului.
Cromozomul bacterian funcţionează ca un replicon, fapt dovedit de experienţa în care
fragmentele de ADN introduse într-o celulă bacteriană (de ex. prin conjugare) nu se pot replica
dacă rămân „libere” în citoplasmă, dar vor putea fi replicate odată cu întregul cromozom în
cazul în care sunt integrate în cromozomul bacterian.
65
Replicarea corectă este controlată de un mecanism foarte precis care „identifică” apariţia de
nucleotide libere, împerecheate eronat şi în momentul apariţiei unui astfel de eveniment
nucleotidul este „tăiat” iar polimerizarea se opreşte (corectitudinea citirii este realizată cu
ajutorul ADN-polimerazei I).
conceptul amplificării cantităţii de acizi nucleici a fost introdus în 1983 de către Mullis, dar anul
1955, odată cu descoperirea ADN polimerazei I, a reprezentat un moment crucial. Folosind
ADN-polimeraza şi două secvenţe scurte de ADN (oligonucleotide, primeri), s-a pus la punct un
test repetitiv de sintetizare a ADN-ului care a fost numit „Reacţia de polimerizare în lanţ”
(Polymerase Chain Reaction, PCR).
ADN-polimeraza este capabilă să conducă la sinteza unui al doilea lanţ de ADN, întotdeauna
orientat 5’-3’, folosind ca substrat patru nucleotide trifosfat, un lanţ de ADN ca „matrice”
(model) şi un fragment scurt de ADN complementar utilizat drept „primer” (amorsă). Pentru un
lanţ polinucleotidic, vom utiliza de fapt doi primeri, care sunt complementari pentru două
secvenţe specifice şi diferite ale ADN-ului ţintă.
Iniţierea sintezei de ADN va putea avea loc numai după ce ADN-ul dublu catenar este denaturat
(termic). Urmează o etapă de răcire, permiţând astfel ataşarea primerilor (care sunt furnizaţi în
exces) de fragmentele de ADN complementar. Sinteza de ADN mediată de ADN-polimerază va
produce două molecule dublu catenare. Dacă procesul se repetă, vor rezulta patru molecule de
66
ADN. ADN-ul se multiplică exponenţial (dublându-se de fiecare dată) ori de câte ori se repetă
reacţia. Teoretic, PCR poate amplifica un fragment scurt de ADN pornind de la o singură
moleculă la 1.000 de copii, dacă procesul se repetă de 10 ori şi la circa un milion de copii, dacă
procesul se repetă de 20 de ori. Acest proces poate avea loc automat într-un aparat numit
termociclor; aparatul repetă ciclul constând în denaturarea prin căldură (la 94-96ºC), ataşarea
primerilor (la 40-60ºC) şi sinteza ADN-ului (la 65-75ºC), folosind ADN-polimeraza termostabilă
(Taq-polimeraza) izolată de la o bacterie, care trăieşte în izvoarele termale din Yellowstone
National Park, Thermus aquaticus.
PCR a început să fie aplicată în numeroase domenii ale cercetării medicale fundamentale.
Succesul depinde de puritatea sursei de ADN, precum şi de metoda de extragere şi d e
recuperare a ADN-ului. Datorită sensibilităţii extrem de mari a procesului, contaminarea
datorată manipulării produselor de amplificare PCR obţinute anterior în acelaşi laborator poate
reprezenta o problemă deosebit de serioasă. Contaminarea se poate realiza fie între probe, în
timpul desfăşurării protocolului de lucru, fie datorită diferitelor manipulări. Prima variantă este
mai uşor de evitat, astfel încât sursa majoră de contaminare în laboratorul de biologie
moleculară rămâne eventuala contaminare a reactivilor. Verificarea acestei posibile erori este
obligatorie pentru orice reacţie PCR, printr-o reacţie de control (control negativ) la care nu se
adaugă ADN. Această problemă a contaminării nu este superpozabilă cu cea a rezultatelor fals-
pozitive. O contaminare între probe este mult mai dificil de identificat. Principalele măsuri de
precauţie ar fi reprezentate de: utilizarea unor camere de lucru separate pentru manipularea
produselor care conţin ADN şi respectiv pentru prepararea celorlalţi reactivi, folosirea
micropipetelor (două seturi de micropipete, pentru produse cu şi fără ADN), utilizarea conurilor
cu filtru, lucrul într-o nişă special amenajată şi dotată cu hotă cu flux laminar de aer.
Recent s-a demonstrat faptul că lumina ultravioletă are capacitatea de a inactiva ADN-ul dublu
catenar contaminant.
Alte modalităţi de a elimina (diminua) riscurile contaminării sunt reprezentate de: includerea
unei nucleotide modificate în PCR (înlocuirea deoxiuridinei-P cu deoxitimidină-3P) şi respectiv
folosirea enzimelor de restricţie pentru îndepărtarea ADN-ului contaminat din RT-PCR
(transcriere inversă).
PCR poate fi utilă în diagnosticul bolilor virale, bacteriene, fungice sau parazitare.
În infecţia cu HIV, PCR şi-a dovedit utilitatea atât în diagnostic (secvenţele HIV-1 sunt detectabile
în 100% din cazuri atunci când virusul este cultivabil şi în 64% din cazuri în situaţia unor culturi
negative), cât şi în stabilirea prognosticului. În cazul infecţiilor cu citomegalovirus (CMV), PCR
poate detecta ADN viral în sânge cu 7-10 zile mai devreme decât sunt identificate antigenemia
sau viremia. În mod asemănător, PCR este utilă în identificarea altor agenţi etiologici (în
contextul general epidemiologic, clinic şi paraclinic) precum virusurile hepatitei B şi C, virusurilor
papilloma, herpes virusurilor sau a unor enterovirusuri.
Diagnosticul infecţiilor bacteriene poate beneficia de asemenea de tehnicile moleculare prin
amplificare genică. Actualmente sunt puse la punct protocoalele de lucru utile identificării
67
agenţilor etiologici ai tusei convulsive (Bordetella pertussis), legionellozei (Legionella
pneumophila), pneumoniei atipice (Mycoplasma pneumoniae), tuberculozei (Mycobacterium
tuberculosis), proceselor inflamatorii pelviene (Chlamydia trachomatis), gonoreei (Neisseria
gonorrhoeae), sifilisului (Treponema pallidum), meningitei (Haemophilus influenzae, Neisseria
meningitidis), gastritelor şi ulcerului (Helicobacter pylori), febrei tifoide (Salmonella typhi),
dizenteriei bacteriene (Shigella dysenteriae), septicemiei cu E. coli (enterotoxigen), bolii Lyme
(Borrelia burgdorferi), leprei (Mycobacterium leprae) etc. Dacă în cazul majorităţii bolilor
enumerate există alternative bacteriologice sau imunologice clasice decisive, atunci când sunt
implicate microorganismele aparţinând genului mycobacterium (Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium leprae) se ridică anumite probleme. În tuberculoză, agentul etiologic se izolează
relativ dificil din produsele patologice, se multiplică lent, coloniile vizibile apărând pe mediile de
cultură după 2-8 săptămâni, iar testele necesare identificării fenotipice clasice necesită 2 -6
săptămâni suplimentare şi nu au relevanţă în 100% din cazuri. Pe de altă parte, Mycobacterium
leprae nu se multiplică pe nici un tip de mediu de cultură. Cu alte cuvinte, aplicarea unor
metode sensibile şi specifice este foarte necesară.
Sunt puse la punct protocoalele de lucru PCR utile în scopul diagnosticării infecţiilor grave
produse de Candida albicans, pneumoniei la pacienţi imunodeprimaţi (Pneumocystis carinii),
meningitei cu Cryptococcus neoformans sau al unor infecţii cu Coccidioides immitis (ex. la
persoane infectate cu HIV), pentru a enumera câteva din aplicaţiile biologiei moleculare în
domeniul afecţiunilor produse de fungi.
În domeniul parazitologiei, exemplele cele mai bine cunoscute sunt legate de diagnosticul
dizenteriei amoebiene (Entamoeba histolytica), altor diarei de srcine parazitară (de exemplu,
cele produse de Giardia lamblia), malariei (Plasmodium falciparum) sau diagnosticul
toxoplasmozei (Toxoplasma gondii).
Actualmente s-au pus la punct şi alte metode de amplificare genetică utile în diagnosticul sau în
identificarea agenţilor etiologici ai maladiilor transmisibile. În mod suplimentar dorim să
menţionăm faptul că dacă iniţial tehnicile de bază ale biologiei moleculare (hibridizarea
moleculară, utilizarea sondelor nucleotidice marcate radioactiv sau neradioactiv, amplificarea
genică) erau utilizate individual, majoritatea protocoalelor de lucru actuale cuprind combinaţii
de tehnici, din ce în ce mai complexe şi mai subtile. Pe de o parte, există şi o întregă serie de
variante tehnice ale reacţiei de amplificare genică, de ex. Invers-PCR (pentru amplificarea unei
regiuni la care nu este cunoscută secvenţa, dar zonele învecinate au secvenţe cunoscute); LCR
(ligase chain reaction) în care este necesar să cunoaştem integral secvenţa ADN-ului ţintă; RT-
PCR (PCR înainte de care are loc o revers-transcriere, pornind de ex. de la ARNm şi obţinând
ADNc); Nested PCR (în care are loc o amplificare dublă a acidului nucleic folosind 2 perechi de
primeri diferiţi) etc. Pe de altă parte, tehnica PCR este utilizată din ce în ce mai frecvent ca o
completare esenţială a unei alte tehnici (de exemplu RFLP, restriction fragment length
polymorphism; SSCP-PCR; DRE-PCR, double repetitive element PCR; DRV-PCR, direct variable
repeat-PCR; UP-PCR, single universal primer-PCR; spoligotyping etc).
Plasmidele
68
1. genele esenţiale, localizate în structura cromozomului bacterian şi
2. genele accesorii extracromozomale prezente în structura:
- plasmidelor şi
- elementelor genetice transpozabile.
Plasmidele sunt elemente genetice extracromozomiale, capabile de replicare fizic independentă
de cromozom (replicon), dar depinzând de factori codificaţi de nucleul bacterian. Conţin
informaţie genetică neesenţială pentru viaţa celulei bacteriene. Sunt transmise stabil de-a
lungul generaţiilor. Dimensiunea plasmidelor variază între 1kb şi circa 200 kb. Majoritatea sunt
alcătuite din molecule de ADN circular, dar există şi plasmide liniare (ex. la Borrelia burgdorferi).
Unele plasmide sunt ADN dublu catenar, dar există şi plasmide de ADN monocatenar (se
consideră că plasmidele de ADN monocatenar reprezintă de fapt o situaţie intermediară în
cursul procesului de replicare; au fost detectate de ex. la Staphylococcus aureus).
Unele plasmide (numite şi epizomi) pot exista alternativ în stare autonomă (libere în citoplasmă)
sau integrate în cromozomul celulei gazdă (de exemplu factorul F, bacteriofagul temperat etc).
Celelalte plasmide persistă indefinit numai în stare autonomă (de exemplu plasmida R, Col, F
etc).
5. plasmide care permit transferul genelor cromozomiale de la o celulă care deţine respectivul
plasmid (F) la alta, putând fi transmis inclusiv plasmidul (factorul) F;
69
Plasmidele R (de rezistenţă la antibiotice) conferă celulei purtătoare rezistenţa la unul sau la mai
multe antibiotice. Plasmidele R au o structură genetică complexă, fiind alcătuite din:
- gene care asigură proprietatea de rezistenţă la antibiotice;
- gene care formează „factorul de transfer al rezistenţei” (RTF).
Asigură capacitatea de replicare autonomă şi de transfer prin conjugare (cele două tipuri de
elemente pot exista independent sau se pot asocia).
Transferul plasmidelor R se poate face prin conjugare bacteriană sau prin transducţia mediată
de bacteriofagi.
Plasmidele „Col” codifică proprietatea unor bacterii de a elabora substanţe antibiotice de tip
special, numite bacteriocine (colicine, pesticine, vibriocine, piocine etc).
Plasmidele „Col” sunt transferabile de la tulpinile Col+ la tulpini Col- prin transformare genetică,
transducţie fagică sau prin conjugare.
Bacteriocinele sunt bactericide, au un spectru de activitate limitat (faţă de specia omologă), iar
biosinteza lor nu are efect letal pentru specia producătoare.
Bacteriile F-
Bacteriile F- sunt lipsite de factorul F. Sunt echivalente unor celule „femele” care se comportă
ca receptoare de material genetic.
Bacteriile F+
Bacteriile F+ deţin factorul F autonom în citoplasmă. Sunt echivalente unor celule „masculine”,
donoare de material genetic, capabile să transmită factorul F.
Bacteriile F’
Bacteriile F’ deţin o structură plasmidică de tip special (factor de fertilitate recombinant) care a
fost anterior integrată în structura unui cromozom şi s-a desprins din acesta, încorporând în
structura sa unele gene cromozomale. Aceste bacterii au caracter de „mascul” şi se comportă ca
donoare de material genetic (factorul F’).
70
O anumită secvenţă specifică de ADN constituie un element genetic transpozabil dacă îşi
menţine integritatea fizică, structurală şi genetică, funcţională în cursul translocaţiei de la o
poziţie la alta în acelaşi genom, replicon (intramolecular) sau în genomuri diferite
(intermolecular). De obicei fenomenul de transpoziţie poate avea loc la nivelul oricărui replicon,
la „întâmplare”, dar există şi situaţii în care un transpozon „are” anumite zone specifice unde se
va insera (zone „calde”).
Pe baza complexităţii lor, elementele care îndeplinesc această condiţie se pot grupa în trei
categorii:
- secvenţe de inserţie (IS);
- transpozoni (Tn);
- bacteriofagi.
Transpozonii (Tn)
Transpozonii diferă de secvenţele de inserţie prin complexitate şi prin faptul că poartă gene care
conferă bacteriilor funcţii noi, detectabile, de exemplu:
- rezistenţa la antibiotice;
- capacitatea de sinteză a unor enzime;
- producerea de enterotoxine;
- sinteza antigenelor bacteriene de suprafaţă (de exemplu K88 la E. coli);
- sinteza unor factori de colonizare intestinală etc.
Există transpozoni compuşi, care pe lângă funcţia de transpoziţie includ şi o serie de
determinanţi genetici şi transpozoni complecşi. Dintre aceştia din urmă, transpozonul Tn3 a fost
identificat la o tulpină de E. coli. El codifică 3 elemente: tnpA- cu activitate de transpozază,
rezolvaza tnpR şi beta-lactamaza (produsul genic notat „bla”) cu activitate beta-lactamazică.
Bacteriofagii
Spre exemplu bacteriofagul Mu (numele rezultă prin prescurtarea „mutator”, pentru că a fost
identificat ca factor mutagen la tulpini de E. coli) are un genom de 30kb şi o structură lineară.
După infectarea celulei bacteriene, bacteriofagul Mu se inseră în cromozom la „întâmplare” şi
ulterior în diferite poziţii ale cromozomului bacterian apar copii ale acidului nucleic Mu. Atunci
când structura genetică Mu va părăsi genomul bacterian va prelua o parte din structura
genetică bacteriană (circa 100-150 pb).
71
Bacteriile sunt microorganisme haploide (cu excepţiile prezentate anterior), au un singur
cromozom iar pentru remanierea prin recombinare a genomului este necesară transferarea de
material genetic de la o tulpină („donoare”) la tulpina receptor („acceptoare”). În mod clasic
poate avea loc un transfer „pe orizontală” între tulpini care fie fac parte din aceeaşi specie fie
fac parte din specii foarte înrudite, chiar dacă genotipic sunt diferite. Relativ recent a fost
demonstrată posibilitatea unor schimburi genetice între tulpini din specii diferite (ex. în
ecosistemul intestinal). Variabilitatea bacteriană presupune modificarea la un moment dat a
comportamentului celulei bacteriene sau a descendenţilor ei şi pot exista în principiu două
variante:
- variabilitatea fenotipică şi
- variabilitatea genotipică;
Mutaţia spontană
Mutaţiile care apar în condiţii de mediu obişnuite şi fără intervenţia unui factor decelabil se
numesc mutaţii spontane.
Mutaţia indusă
Mutaţiile care se produc sub acţiunea unor factori fizici (de exemplu raze UV, radiaţii ionizante
etc.) sau chimici (de exemplu agenţii alchilanţi), care acţionează ca agenţi mutageni, se numesc
mutaţii induse.
Rata mutaţiilor induse este semnificativ mai mare decât rata mutaţiilor spontane.
Mutaţia punctiformă are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui singur
codon.
72
Mutaţiile extinse reprezintă alterări care depăşesc limitele unui codon, putând afecta secvenţe
mai mari ale uneia sau mai multor gene (mutaţie poligenică).
Transformarea este un transfer genetic realizat atunci când bacteria acceptă ADN liber provenit
de la o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria receptor trebuie să fie „competentă” în a
accepta ADN-ul de la bacteria donor.
Prima transformare a fost descrisă în 1928 de către Griffith, în experimente referitoare la
virulenţa pneumococilor faţă de şoarecele alb.
Transformarea poate avea loc doar atunci când bacteriile intră în faza staţionară a ciclului
celular. Pătruns în celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate înlocui (prin
recombinare genetică) o secvenţă nucleotidică omologă, bacteria receptoare dobândind un
caracter genetic nou (de exemplu sinteza unei structuri capsulare/capsidice).
Unele bacterii sunt „competente” în mod natural. În cazul bacteriilor care nu sunt „natural
competente”, pentru a putea realiza fenomenul de transformare este necesară tratarea chimică
a acestora, de ex. cu ioni de calciu.
73
receptoare. Transducţia generalizată poate fi realizată de un mare număr de fagi neintegraţi în
cromozomul bacterian atunci când aceştia intră în ciclul litic.
74
Prin metode ale biologiei moleculare s-a demonstrat de exemplu că tulpina de B. anthracis
folosită în atacurile teroriste făcea parte din grupul Ames. Această încadrare a putut să fie
stabilită prin evidenţierea a 6 mutaţii specifice grupului Ames (4 la nivel cromozomial, una la
nivelul plasmidului pX01 şi una la nivelul plasmidului pX02).
Aşadar, iată cum, pentru o bacterie stabilă din punctul de vedere al unei posibile variaţii
genetice, se poate realiza o adevărată „muncă de detectiv” şi prin metode specifice de laborator
se poate stabili srcinea şi apartenenţa sa, pornind de la caracteristicile genetice .
75
Antibioticele şi chimioterapicele antimicrobiene reprezintă un grup de substanţe
medicamentoase capabile să distrugă sau să inhibe multiplicarea unor microorganisme
implicate etiologic în bolile infecţioase. Au o acţiune selectivă asupra celulelor
microorganismelor, exercitând acţiuni minime asupra celulelor organismului gazdă. Aceste
substanţe pot fi:
- antibacteriene,
- antivirale,
- antifungice,
- antiparazitare.
În mod clasic, în această grupă de medicamente au fost incluse şi antineoplazicele (ex.
dactinomycina, doxorubicina, bleomycina). Există și antibiotice folosite ca:
· inhibitori enzimatici (ex. Lipstatin, sintetizat de Streptomyces toxytricini),
· imunosupresori (ex. Ciclosporina, sintetizată de Tolypocladium inflatum),
· hipocolesterolemiante (ex. Lovastatin, sintetizat de Aspergillus terreus),
· insecticide,
· ierbicide etc (1).
(Figura nr. 1)
Antibioticele au revoluţionat lumea în multe aspecte. Nenumărate vieţi au fost salvate. Din
nefericire însă, există şi aspecte mai puţin plăcute legate în special de apariția și dezvoltarea
rezistenţei la antibiotice și chimioterapice precum și de înregistrarea diferitelor reacții adverse.
O bază de date recent întocmită arată prezenţa a mai mult de 20.000 de gene potenţial
rezistente (2).
Încă din 1820 chinina a fost folosită drept chimioterapic în tratamentul malariei, antimalaricele
de sinteză fiind introduse în practică o sută de ani mai târziu, în 1926. În acelaşi an (1926)
Fleming testează penicilina pentru efectul ei antimicrobian „in vitro”, pentru ca în 1946 să se
demonstreze în practică utilitatea acestui antibiotic (cu ajutorul penicilinei este vindecat un
pacient cu septicemie stafilococică). În 1935 sunt descoperite primele molecule de sulfonamide
(Domagk) iar rezistenţa la aceste molecule a fost raportată spre sfârşitul anilor 1930. Primul
medicament anti-tuberculos este descoperit în anul 1944 (streptomicina, Scharty, Bugie,
Waksman). În 1949 se pune în evidenţă în structura penicilinei nucleul betalactam, iar din acest
moment toate substanţele antibiotice cu o astfel de particularitate structurală au primit numele
de betalactamine. În 1950 sunt descrise betalactamazele, eveniment urmat începând cu 1977
de obţinerea inhibitorilor de betalactamaze (acid clavulanic, sulbactam, tazobactam). Din 1960
se folosesc deja penicilinele semisintetice antistafilococice, anul 1976 aducând cu sine utilizarea
în clinică a ureidopenicilinelor cu spectru ultralarg.
Sulfamidele (sulfonamidele) au fost medicamentele antimicrobiene utilizate aproape exclusiv în
perioada 1946-1950 (numită din acest motiv „era sulfamidelor”). Anul 1948 impune în
tratamentul antiinfecţios clasa tetraciclinelor, începînd cu clortetraciclina şi continuând cu
76
oxitetraciclina, tetraciclina, rolitetraciclina, minotetraciclina, doxitetraciclina. Primul
medicament din clasa macrolidelor, eritromicina, este obţinut în 1952. Cotrimoxazolul este
introdus pe scară largă în clinică începând cu anul 1969.
În 1979 este pus în evidenţă nucleul carbapenem, descoperire care duce la apariţia unei noi
clase de substanţe antibiotice: tienamicinele. Printre reprezentanţii acestei clase se numără
tienamicina, imipenemul, care este asociat în terapie cu cilastatina. Ulterior s-au realizat
structuri chimice rezistente la acţiunea dihidropeptidazei 1 renale, respectiv biapenemul şi
meropenemul.
În perioada 1979-1982 sunt descoperite fluorochinolonele (norfloxacina, enoxacina, ofloxacina,
pefloxacina, ciprofloxacina etc) iar în 1982 sunt produşi monobactamii, cu activitate pe germenii
Gram-negativi (ex. aztreonam).
La începutul secolului 21 se utilizau la nivel mondial peste 250 de molecule de antibiotice şi
chimioterapice antiinfecţioase diferite. Având în vedere utilizarea mai puţin raţională a acestor
medicamente, Organizaţia Mondială a Sănătăţii elaborează periodic o listă a medicamentelor
esenţiale, inclusiv antibiotice şi chimioterapice. În această listă apar medicamente
betalactamice (penicilină, amoxicilină, cloxacilină, piperacilină etc), medicamente
antituberculoase şi antileproase (clofazimină, dapsonă, ethambutol, izoniazidă, pirazinamidă,
rifampicină etc), alte medicamente antiinfecţioase (cloramfenicol, co-trimoxazol, doxiciclină,
eritromicină, gentamicină, metronidazol, spectinomicină, sulfadiazină etc), medicamente
„complementare” (ciprofloxacină, clindamicină, acid nalidixic etc) dar nu apar pe lista principală
nici cefalosporinele şi nici chinolonele ceea ce demonstrează cel puţin indirect recomandarea
de reducere a utilizării în exces a medicamentelor antimicrobiene, aceasă noţiune având o
legătură directă cu subiectul prezentului capitol. În acelaşi sens, este recomandată citirea unui
document relativ recent („How to improve the use of medicines by consumers”, OMS, 2007),
adresat atât specialiştilor în sănătate cât şi celor care utilizează diferitele medicamente, inclusiv
antibiotice şi chimioterapice. Interesul pentru acest subiect este dovedit şi de faptul că editarea
acelui manual a fost făcută cu asistenţă financiară de la Comunitatea Europeană.
77
c). Produşi de sinteză chimică integrală (chimioterapice antiinfecţioase), de exemplu acidul
nalidixic sau sulfamidele (sulfonamidele).
Deoarece în momentul actual o mare parte a medicamentelor antimicrobiene sunt produse prin
metode chimice, diferenţierea netă dintre antibiotice şi chimioterapice este mai rar întâlnită în
limbajul medical curent, cel mai frecvent toate aceste medicamente fiind numite „antibiotice”
(totuşi trebuie să cunoaştem că există această diferenţă).
a). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei peretelui celular; au efect
bactericid şi sunt reprezentaţi de antibioticele beta-lactamice (peniciline, cefalosporine,
carbapeneme etc), glicopeptidele (vancomicina, teicoplanina), bacitracina, cicloserina,
fosfomicina, izoniazida etc;
b). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea funcţiei membr anei celulare; au efect
bactericid şi sunt reprezentaţi de polimixine (polimixină B, colistin), gramicidină, tirocidină,
imidazoli, nistatină, amfotericină B etc (ultimele trei fiind medicamente antifungice);
c). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei proteice la nivelul ribozomilor;
de exemplu aminoglicozidele, tetraciclinele, cloramfenicolul, macrolidele, lincosamidele
(lincomicina, clindamicina), acidul fusidic, streptograminele etc;
d). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei acizilor nucleici, de exemplu
rifampicina, chinolonele, sulfonamidele, trimetoprimul, pirimetamina, novobiocina etc.
Antibioticele beta-lactaminice inhibă selectiv sinteza peretelui celular în mod diferit la bacteriile
Gram-pozitive faţă de cele Gram-negative (datorită diferenţelor dintre acestea în ceea ce
priveşte structura peretelui). Pentru realizarea acestei acţiuni este necesară legarea de
receptori celulari numiţi PBPs (penicillin-binding proteins). Beta-lactaminele inhibă de exemplu
reacţia de transpeptidare (de formare a punţilor peptidice) între lanţurile adiacente de
peptidoglican. Rezistenţa la beta-lactamice apare de ex. atunci când microorganismele produc
enzime numite beta-lactamaze, care „desfac” inelul beta-lactamic. Alte mecanisme de
rezistenţă sunt reprezentate de: alterarea porinelor din membrana externă (Gram-negativi)
ceea ce afectează transportul beta-lactaminelor către sediul de acţiune, mutaţii care afectează
structura PBSs şi respectiv afinitatea faţă de beta-lactamine etc.
Polimixinele (polimixina B, colistinul) acţionează selectiv pe membrana germenilor Gram-
negativi, printr-un mecanism asemănător cu cel al detergenţilor cationici deteriorând
membrana. Se leagă şi de lipo-poli-zaharid şi acţionează asupra membranei externe a microbilor
Gram-negativi. Nu se recomandă (de primă intenţie) pentru administrare pe cale generală.
Rezistenţa la polimixine apare rar.
78
Aminoglicozidele (streptomicina, kanamicina, gentamicina, spectinomicina, tobramicina etc) se
ataşează iniţial de o proteină receptoare specifică aflată pe subunitatea 30S a ribozomului
bacterian şi blochează ulterior activitatea normală a complexului de iniţiere necesar formării de
peptide. În final determină dezintegrarea poliribozomilor şi separarea lor în rib ozomi, incapabili
de sinteză proteică. Rezistenţa la aminoglicozide apare în special dacă există o modificare a
procesului de transport activ în interiorul celulei bacteriene. La streptococi, enterococi, germeni
anaerobi etc. nu există un astfel de sistem de transport şi în aceste condiţii aceste bacterii nu
sunt sensibile la aminoglicozide. În cazul bacteriilor sensibile, rezistenţa poate apărea de ex. prin
producerea de enzime care adenilează sau fosforilează grupul hidroxil de pe molecula
aminoglicozidului. Dintre cele mai redutabile reacții adverse putem aminti nefrotoxicitatea și
ototoxicitatea.
Ciclinele (ex. tetraciclina) se leagă de subunitatea 30S a ribozomilor bacterieni şi nu permit
introducerea de noi aminoacizi într-un lanţ polipeptidic în curs de formare. Rezistenţa este de
regulă mediată plasmidic, dar şi prin intermediul transposonilor, ducând de ex. la sinteza unei
proteine membranare care mediază un aflux excesiv de tetraciclină şi astfel nu se mai pot atinge
concentraţiile bacteriostatice. Ciclinele se absorb în stomac şi intestin. Sunt bacteriostatice.
Acţionează pe germeni gram pozitivi și gram negativi, spirochete, mycoplasme, rickettsii,
chlamydii. Printre reacţiile adverse amintim senzațiile de greaţă, voma, diareea, toxicitatea
renală şi hepatică, acumularea la nivel osos şi dentar.
Cloramfenicolul se leagă de subunitatea 50S a ribozomilor bacterieni şi inhibă peptidil -
transferaza, interferând cu legarea de noi aminoacizi în lanţul peptidic în curs de formare.
Rezistenţa poate apărea de ex. prin sinteza de către bacterii a unei acetil-transferaze sau a unei
nitrat-reductaze. Acţionează pe germeni aerobi şi anaerobi gram pozitivi și gram negativi. Este
un medicament bacteriostatic). Are indicații în abcesul cerebral, febra tifoidă, salmo neloze
sistemice, infecţii severe cu anaerobi. Printre reacţiile adverse cele mai grave la care poate să
ducă enumerăm anemia aplastică cu leucopenie şi agranulocitoză.
Macrolidele (eritromicina, claritromicina etc) şi lincosamidele (lincomicina și clindamicina) se
leagă de subunitatea 50S a ribozomului bacterian, interferând cu formarea complexului de
iniţiere pentru sinteza lanţurilor proteice. Rezistenţa poate apărea datorită unei alterări a
proteinelor ribozomale sau datorită sintezei unei enzime care metilează reziduuri de adenină la
nivelul ARNr. Macrolidele sunt bacteriostatice. Acționează pe cocii gram pozitivi și gram
negativi, bacili gram pozitivi și unii bacili gram negativi. Pot acționa pe specii de Mycobacterium.
Au efect asupra Treponema, Mycoplasma și Chlamydia. Sunt indicate în infecţiile strectococice
la bolnavii cu hipersensibilitate la betalactamine dar și în difterie, tuse convulsivă, pneumonii
atipice etc. Dintre reacţiile adverse amintim: greaţă, vomă, diaree, febră, rash, reacţii
anafilactice. Lincosamidele (bacteriostatice) acționează pe germeni gram pozitivi aerobi şi
anaerobi şi pe germeni gram negativi anaerobi.
Rifampicina inhibă creşterea bacteriană prin legarea de ARN-polimeraza ADN-dependentă.
Acţionează pe mycobacterii, coci gram pozitivi și gram negativi, unii bacili gram negativi,
germeni anaerobi gram pozitivi și gram negativi. Dintre indicații putem menționa tratamentul
tuberculozei, leprei, infecţiilor stafilococice meticilino-rezistente sensibile (testarea sensibilității
tulpinilor respective este necesară).
Chinolonele (de exemplu acidul nalidixic, norfloxacina, ofloxacina, ciprofloxacina) inhibă sinteza
ADN-ului microbian prin blocarea ADN-girazei. Acţionează pe unii bacili gram negativi și gram
79
pozitivi, coci gram negativi și gram pozitivi, micoplasme, chlamydii. Dintre posibilelel reacții
adverse am putea aminti: fotosensibilitate, cefalee, vertij, convulsii.
Sulfamidele (sulfonamidele) sunt analogi structurali ai acidului paraaminobenzoic (PABA) şi
inhibă dihidro-pteroat-sintetaza. Se formează analogi nefuncţionali ai acidului folic,
metabolismul celulei bacteriene fiind astfel inhibat. Rezistenţa apare prin alterarea
dihidropteroat-sintetazei scăzând capacitatea de legare a sulfonamidelor şi este mediată
plasmidic. Rezistenţa la un membru al familiei trebuie înregistrată ca rezistenţă şi faţă de
celelalte substanţe cu structură similară.
Trimetoprimul, omolog al acidului dihidrofolic, inhibă reductaza acestui acid.
Sulfamidele şi trimetoprimul pot fi utilizate separat pentru a inhiba creşterea bacteriană. Dacă
sunt însă utilizate împreună, vor produce o blocare dublă în secvenţa sintezei de ADN, rezultând
o creştere marcată a activităţii lor (sinergism). O astfel de substanţă, frecvent folosită în practica
medicală, este cotrimoxazolul (ex. biseptol), conţinând sulfametoxazol şi trimetoprim.
Pirimetamina, la fel ca şi trimetoprimul, inhibă dihidro-folat-reductaza.
Unele antibiotice, cum ar fi actinomicinele, sunt inhibitori eficienţi ai sintezei de ADN; dar
realizează această inhibiţie atât la nivelul celulei bacteriene cât şi la nivelul celulei animale,
nefiind suficient de selective pentru a putea fi utilizate în terapia antibacteriană.
Prin spectrul de acţiune antimicrobiană se înţelege lista grupurilor (speciilor) de bacterii asupra
cărora un anume antibiotic sau chimioterapic este activ. În practică, trebuie cunoscut nu numai
spectrul antimicrobian iniţial al fiecărui preparat antimicrobian, ci şi modificările ulterioare,
survenite în urma apariţiei germenilor rezistenţi.
Spectrul antimicrobian iniţial este stabilit pentru fiecare antibiotic în parte, o dată cu
introducerea sa în terapeutică.
Antibiotice cu spectru „îngust”
Aceste antibiotice pot fi subîmpărţite în două subgrupuri:
- antibiotice cu spectru „de tip penicilinic”, active pe bacili Gram-pozitivi, coci Gram-pozitivi şi
coci Gram-negativi. Din acest grup fac parte majoritatea penicilinelor, macrolidele,
lincosamidele etc;
- antibiotice cu spectru „de tip streptomicină”, active pe bacili Gram-negativi, coci Gram-
negativi, coci Gram-pozitivi. În acest grup sunt incluse aminoglicozidele, polimixinele etc.
Antibiotice cu spectru „larg”
Antibioticele din acest grup sunt active pe bacili Gram-pozitivi şi negativi, coci Gram-pozitivi şi
negativi. Sunt active şi pe spirochete, leptospire, rickettsii, chlamydii, mycoplasme. În acest grup
au fost incluse cloramfenicolul şi tetraciclinele.
La acest grup clasic de antibiotice cu spectru larg se pot adăuga alte antibiotice, cum ar fi:
penicilinele cu spectru lărgit (ampicilina, amoxiciclina etc), ureidopenicilinele, tienamicinele,
cefalosporinele din generaţiile II-IV, unele fluorochinolone, unele sulfamide etc.
1. Antibioticele betalactaminice
a). Penicilinele
- penicilinele naturale (de exemplu penicilina G);
80
-penicilinele penicilinazorezistente (de exemplu meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina,
flucloxacilina, nafcilina);
- aminopenicilinele (de exemplu ampicilina, amoxicilina);
- alte peniciline cu efect asupra enterobacteriilor (mecilinamul, pivmecilinamul, ciclacilina,
epicilina);
- peniciline stabile în prezenţa unor beta-lactamaze produse de enterobacterii (temocilina; în
această categorie ar putea intra şi ampicilina, amoxicilina, ticarcilina şi piperacilina);
- peniciline cu efect asupra Pseudomonas aeruginosa (carbenicilina, ticarcilina, azlocilina,
mezlocilina, piperacilina, apalcilina);
- alte peniciline şi inhibitori de beta-lactamaze (de exemplu acid clavulanic + amoxicilină /
ticarcilină, sulbactam + ampicilină, tazobactam + piperacilină);
b). Cefalosporinele
- din generaţia I (de exemplu cefalotina, cefaloridina);
- din generaţia a II-a (de exemplu cefamandola, cefoxitina, cefuroxima);
- din generaţia a III-a (de exemplu cefotaxima, ceftriaxona);
- din generaţia a IV-a (de exemplu cefepima, cefpiroma).
Cefalosporinele se mai pot clasifica şi în:
- cefalosporine de uz oral (cefacitril, cefapirin, cefazedon, ceftezol etc);
- cefalosporine de uz parenteral (cefalotina, cefaloridina, cefazolina, cefamandola etc);
- cefalosporine care prezintă o mai bună stabilitate în prezenţa beta-lactamazelor
(cefuroxima, cefoxitima, cefotetanul, cefixima etc);
- cefalosporine cu activitate faţă de Pseudomonas aeruginosa (ceftazidima, cefpiroma,
cefepima, cefoperazona, cefsulodimul etc).
c). Alte antibiotice beta-lactaminice
- monobactamii (de exemplu aztreonamul);
- penemii (de exemplu ritipenemul);
-carbapenemii (de exemplu imipenenul, meropenemul, imipenemul + cilastatina; cilastatina
este un inhibitor al dehidro-peptidazei);
- oxacefemii (ex. latamoxef);
- carbacefemii (ex. loracarbef).
d). Inhibitori de beta-lactamaze (ex. acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul).
3. Aminoglicozidele
- streptomicina (care este de fapt un oligozaharid);
- kanamicina, gentamicina, amikacina, spectinomicina, tobramicina, netilmicina etc.;
81
6. Macrolidele (ex. eritromicina, claritromicina, azitromicina, telitromicina); 7. Polipeptidele
ciclice (polimixina B, colistinul);
Chimioterapicele
Denumirea de „lantibiotice” a fost introdusă relativ recent, fiind vorba de un grup special de
substanţe antimicrobiene cu o serie de proprietăţi datorită cărora au fost clasificate între
antibiotice şi bacteriocine. Lantibioticele sunt sintetizate de bacterii Gram-pozitive (ex. din
genurile Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Streptomyces) şi prezintă un spectru de
activitate specific faţă de anumite bacterii Gram-pozitive. Din punct de vedere al structurii
chimice lantibioticele sunt polipeptide policiclice.
Masa moleculară a acestor substanţe se situează între 1.825 daltoni (mersacidina) şi 3.488
daltoni (Pep5). Pe baza structurii lor diferite, s-au descris două tipuri de lantibiotice: A şi B.
sunt lantibiotice produse de stafilococi, lactococi şi bacili Gram-pozitivi, de ex. nisina,
subtilina, epidermina, gallidermina şi Pep5.
Lantibioticele îşi au srcinea în proteine precursoare inacti ve (pre-lantibiotice) sintetizate la
nivel ribozomal, convertite enzimatic în polipeptide active din punct de vedere biologic. În
privinţa mecanismului de acţiune se ştie de ex. că nisina şi Pep5 au activitate bactericidă
depolarizând membrana citoplasmatică a celulei bacteriene, formând pori şi inducând autoliza
acesteia. Datorită faptului că există o specificitate a lantibioticelor faţă de anumite bacterii se
consideră că există şi alte mecanisme implicate.
82
Genele responsabile de sinteza lantibioticelor pot fi localizate cromozomial sau plasmidic. De ex.
în cazul nisinei, genele sunt localizate pe cromozonul celulei bacteriene (15) de Lactococcus
lactis, iar informaţia genetică pentru biosinteza epiderminei este localizată pe plasmidul pTu 32.
Utilizarea lantibioticelor în industria alimentară şi în practica medicală
Dintre lantibioticele cunoscute, nisina are cea mai largă aplicabilitate practică. Nisina inhibă
tulpinile din genurile Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Clostridium, Listeria la o
concentraţie ≥ 30 ml / ml, activitatea inhibitorie fiind maximă la pH < 5,5. Nisina inhibă
sporularea bacteriilor din genurile Clostridium şi Bacillus; nu are efect asupra bacteriilor Gram-
negative sau asupra fungilor. Nisina este folosită pe scară largă în industria alimentară drept
„conservant natural” pentru vegetale, fructe, brânzeturi proaspete şi procesate, carne, peşte,
cacao, băuturi alcoolice (vinuri). Nu prezintă dezavantajele nitraţilor şi nitriţilor (produc
nitrozamină cu acţiune carcinogenă). În practica medicală este utilizată în unguente cosmetice.
Este folosită şi ca agent terapeutic în medicina veterinară (în tratamentul local al infecţiilor
bacteriene).
Epidermina, produsă de Staphylococcus epidermidis, are acţiune antimicrobiană faţă de
germeni care pot acţiona patogen la nivel tegumentar: Propioniibacterium acnes, Streptococcus
spp., Staphylococcus spp. Astfel, epidermina şi gallidermina (sintetizată de Staphylococcus
gallinarum) constituie alternative terapeutice pentru derivatele de vitamina A şi eritromicină, de
ex. în cazurile de acnee juvenilă, eczemă, foliculite etc.
Dintre lantibioticele de putem exemplifica lanthiopeptina, care are acţiune antivirală faţă
de virusul Herpes simplex.
83
acţiunea medicamentului antibacterian (ex. producerea de enzime numite beta-lactamaze /
penicilinaze, cefalosporinaze etc).
Rezistenţa poate fi naturală sau dobândită.
84
este mult mai frecventă decât cea cromozomială,
reprezentând circa 90% din cazurile de rezistenţă. În acest caz, transmiterea materialului
genetic pentru rezistenţă se poate face transversal (orizontal), la toţi membrii populaţiei
bacteriene existente la un anumit moment dat, prin plasmide, material plasmidic sau
transpozoni.
Transferul materialului genetic se poate realiza prin:
- transducţie;
- transformare;
- conjugare;
- transpoziţie.
Transducţia apare prin intervenţia unor bacteriofagi care pot transporta ADN bacterian
încorporat în capsida sau genomul propriu. Dacă acest material genetic include gene pentru
rezistenţa la un antibiotic (factor R sau RTF), o celulă bacteriană infectată ulterior poate deveni
rezistentă la antibioticul respectiv şi este capabilă să transmită descendenţilor această
rezistenţă fără a veni în contact cu antibioticul respectiv.
Transformarea reprezintă un mod de transfer al informaţiei genetice care implică încorporarea
de ADN liber din mediu (rezultat de exemplu în urma lizei unor bacterii care-l conţin) într-o altă
bacterie.
Conjugarea reprezintă pasajul genelor de la o celulă la alta prin contact direct realizat prin
intermediul unui pil sexual (pil F). Acest mecanism este considerat foarte important în
răspândirea rezistenţei la antibiotice. ADN-ul astfel transferat poate codifica simultan pentru
germenul receptor rezistenţa faţă de mai multe antibiotice.
Transpoziţia este un transfer al unor secvenţe scurte de ADN (transpozoni, elemente
transpozabile) în interiorul unei celule bacteriene între două plasmide sau între o plasmidă şi o
porţiune a cromozomului bacterian.
85
Implicaţiile clinice, terapeutice, epidemiologice şi materiale ale fenomenului de rezistenţă
bacteriană la antibiotice şi chimioterapice sunt extrem de mari. Selectarea tulpinilor rezistente
prin antibioticoterapia excesivă, de multe ori abuzivă, exercitată în spitale, alte unităţi sanitare
sau în ambulator (inclusiv prin fenomenul numit „automedicaţie”), duce la variate aspecte
negative: infecţii cu germeni rezistenţi, apariţia şi transmiterea germenilor de spital,
devalorizarea şi pierderea unor medicamente antibacteriene etc. O problemă deosebită este şi
utilizarea medicamentelor antibiotice şi chimioterapice în domeniul veterinar. Se estimează că
anual se consumă circa 100.000 tone de antibiotice şi chimioterapice, o bună parte în ferme de
animale, piscicole etc (Levy 2002). Acest exces de utilizare produce şi un fenomen de „poluare”
a mediului cu substanţe de acest tip, prin excreţia acestora de către animalele „tratate”.
Atunci când vorbim de utilizarea raţională a antibioticelor şi chimioterapicelor ar trebui să avem
în vedere: utilizarea acestora în beneficiul pacientului; evaluarea clinică riguroasă însoţită de
teste de laborator sugestive sau care să confirme infecţia şi respectiv sensibilitatea la
medicamente a tulpinilor izolate; instituirea tratamentului în cel mai scurt timp posibil în cazul
pacienţilor cu infecţii severe, ameninţătoare de viaţă; tratamentul trebuie să fie „ţintit”, să fie
îndreptat strict către bacteria care a produs respectiva infecţie, să se utilizeze calea de
administrare cea mai potrivită, doza corespunzătoare, intervalul între doze, durata optimă a
tratamentului iar pacientului să i se explice toate elementele care vor permite ca acesta să fie
compliant şi să respecte indicaţiile medicale.
Este strict necesară supravegherea fenomenului de rezistenţă la antibiotice şi chimioterapice,
testarea sensibilităţii germenilor, notificarea şi evaluarea statistică, publicarea periodică a
datelor şi punerea lor la dispoziţia sistemului sanitar. Cu toate acestea, datele menţionate mai
sus nu sunt disponibile la nivel naţional. În România, profesioniştii din sistemul sanitar se
bazează fie pe experienţa proprie, fie pe datele statistice din literatura internaţională.
Se vorbeşte tot mai des în zilele noastre despre „superbugs”, şi anume, bacterii rezistente la
foarte multe antibiotice. Printre acestea amintim Acinetobacter baumannii, Burkholderia
cepacia, Campylobacter jejuni, Clostridium difficile, Enterobacter spp., Escherichia coli,
Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, M. tuberculosis, Proteus mirabilis,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae
etc. Termenul de „superbug” se refer la microbi care duc la o mortalitate şi morbiditate ridicată
datorită mutaţiilor multiple și respectiv rezistenței la antibiotice și chimioterapice rezultate.
Variantele terapeutice devin limitate iar spitalizarea este de durată mare şi poate duce la costuri
deosebit de mari. (3)
NDM (New Delhi metallo-beta-lactamase gene; blaNDM-1) este o genă nou descoperită.
Bacteriile care dețin gena devin ”impermeabile” pentru o serie de antibiotice și inactivează
carbapenemazele. Gena se găseşte la nivelul unei plasmide și din această cauză poate fi ușor
transmisă. A fost prima dată identificată în India; a fost ulterior recunoscută în Pakistan,
Bangladesh, UK, SUA, Canada, Australia, Belgia etc (4-7).
Utilizarea oricărui antibiotic în mod potențial duce la rezistenţă. De-a lungul anilor s-au realizat
și aplicat diferite strategii de către CDC, Organizația Mondială a Sănătății și mai de curând de
către ECDC, pentru prevenirea şi controlul rezistenţei la antibiotice, spre exemplu:
86
· controlul strict al folosirii acestor medicamente după o prescriere corectă (ex. nu pentru
un guturai sau altă infecție insensibilă la antibiotice anti-bacteriene)
· achiziţionarea antibioticelor și chimioterapicelor doar în baza prescripției medicale
· controlul strict al medicamentelor utilizate la animale şi în agricultură (multe dintre
moleculele de antibiotice și chimioterapice folosite în terapie la om se găsesc sub alte denumiri
comerciale şi în tratamentul animalelor)
· prevenirea bolilor infecţioase etc.
Rezistenţa la antibiotice datorată răspândirii utilizării acestora de către om şi pentru animale a
devenit o problemă tot mai mare în ultimele decenii. În 2001 ”European Union Ministers of
Health” a adoptat Recomandările legate de folosirea prudentă a antibioticelor în medicina
umană. Prima recomandare a fost ca statele membre să întocmească şi să întărească un sistem
de supraveghere pentru folosirea antibioticelor şi prevenirea rezistenţei la acestea. Din 1999,
Sistemul European de Supraveghere Antimicrobiană (European Antimicrobial Surveillance
System – EARSS) oferă date legate de prevalenţa şi răspândirea majorităţii bolilor cauzate de
bacterii rezistente la unul sau mai multe antibiotice. În raportul anual din 2007 EARSS afirmă că
„datele pe care EARSS le-a adunat de-a lungul anilor aduc un mesaj neplăcut dar important:
rezistenţa la antibiotice devine o problemă tot mai mare de sănătatea publica an după an şi
doar un efort cumulat poate schimba această situaţie”. (8)
Copiii sunt cei care primesc cele mai multe antibiotice în UE mai ales pentru infecţii ale tractului
respirator superior. Există date care arată că în acest caz apare și rezistenţa la antibiotice și
chimioterapice. Tulpinile rezistente sunt răspândite printre copiii care sunt duşi la creşă sau la
altă formă de educație preșcolară. La nivelul UE deşi au existat câteva iniţiative, s -a făcut mult
prea puţin în ceea ce priveşte această grupă de vârstă. Ar fi totuși de menționat înfiinţarea
Reţelei de Prescriere şi Rezistenţa la Antibiotice a Copiilor din UE (The Antibiotic Resistance and
Prescribing in European Children network – ARPEC) care are următoarele scopuri:
· să folosească metodologia şi datele oferite de celelalte sisteme de supraveghere pentru a
dezvolta un sistem de supraveghere a rezistenței la antibiotice, pentru copiii din UE
· să determine diferenţele legate de alegerea antibioticului, doza şi indicaţiile care apar
între diferite comunităţi şi spitale
· să pună la punct recomandări privind dozele de antibiotice și chimioterapice administrate
zilnic copiilor
· să colecteze date
· să initieze referinţe legate de rata prescrierii şi rezistenţei în colaborare cu Societatea
Europeană pentru Bolile Infecţioase Pediatrice (European Society for Paediatric Infectious
Diseases – ESPID)
· să trimită rezultatele obținute în cadrul fiecărui proiect către toate ţările membre. (9)
CDC a dezvoltat la rândul său un plan de acţiune cu privire la rezistenţa la antibiotice care
cuprinde patru mari puncte:
· Supraveghere,
· Prevenire şi Control,
· Cercetare şi
· Producţie. (10)
87
Instituirea şi continuarea unei terapii cu antibiotice pe o durată optimă (nici prea scurtă şi nici
prea lungă, existând recomandări specifice în funcţie de agentul etiologic şi respectiv în funcţie
de patologie) trebuie să urmeze întotdeauna parcurgerea unor etape minimale care să justific e
această opţiune terapeutică. În acest mod s-ar putea evita principalele erori în utilizarea
antibioticelor, erori extrem de frecvente în momentul actual, inclusiv la nivel mondial, erori care
favorizează în principal abuzul de antibiotice / chimioterapice şi permit selectarea de
microorganisme rezistente.
88
reducerea tensiunii arteriale maxime cu peste 40% faţă de nivelul obişnuit. Prezenţa sau
suspiciunea sepsisului, şocului septic sau a sindromului de disfuncţie multiorganică, chiar şi
atunci când nu sunt clar demonstrate, constituie un argument hotărîtor pentru administrarea
de antibiotice sau chimioterapice datorită gravităţii deosebite a acestor entităţi clinice. Totuşi,
chiar şi în această situaţie nu există nici un argument logic de a institui antibioticoterapia înainte
de a recolta produse pentru a fi examinate în cadrul diagnosticului bacteriologic direct.
89
Trebuie de asemenea să avem în vedere şi să decidem care este calea şi modul de administrare
pentru antibioticul ales în funcţie de gravitatea, localizarea infecţiei, caracterul acut sau subacut
al bolii, tipul antibioticului ales, toleranţa pentru acest antibiotic a pacientului tratat. Spre
exemplu, putem folosi penicilina V (de administrare orală) în infecţii de gravitate medie sau
chiar şi în unele infecţii grave, în funcţie de localizare, ca alternativă pentru penicilina G sau alte
preparate beta-lactamice, dacă bacteria izolată îşi păstrează sensibilitatea faţă de penicilină,
dacă gazda nu prezintă hipersensibilitate de tip I faţă de penicilină şi dacă vom reţine care este
procentul de absorbţie al acestui medicament şi în acest sens vom administra doze duble
comparativ cu dozele utilizate pentru administrarea parenterală şi „pe stomacul gol”.
În cazul în care analiza noastră a permis răspunsul la toate întrebările listate mai sus se vor
stabili dozele necesare, intervalele între administrări, durata tratamentului, precum şi
momentul opririi acestuia. Controlul terapiei antimicrobiene se va realiza pe tot parcursul
administrării incluzând metode clinice (de ex. ameliorarea semnelor şi simptomelor) şi metode
de laborator (examene paraclinice, dozarea antibioticelor în ser etc.).
Antibioterapia se află într-un impas constatat clinic prin diferite eşecuri terapeutice (în cadrul
tuturor specialităţilor atât medicale dar mai ales chirurgicale) şi confirmat de numeroase studii
de laborator (aceste studii sunt realizate în special în SUA şi Europa de Vest şi sunt mai puţine şi
mai puţin semnificative în ţara noastră; constatările diferitelor eşecuri există, chiar dacă sunt
prezentate de regulă „anecdotic” şi nu în publicaţii accesibile întregului sistem sanitar). În
străinătate, există o tendinţă de a atrage în echipe mixte microbiologi, farmacişti etc. cu scopul
de a monitoriza calitatea utilizării antibioticelor şi chimioterapicelor, mai mult, de a pregăti
specialişti pentru formarea de echipe multidisciplinare cu participarea managerilor unităţilor
sanitare, pentru limitarea problemelor legate de numeroasele erori comise în antibioticoterapie
(Arnold 2004).
Principalele cauze ale situaţiei actuale sunt un număr imens de prescrieri abuzive şi folosirea
iraţională a unor antibiotice; se estimează că 60% din antibioticele şi chimioterapicele produse
anual se risipesc inutil. Principalele „rezultate” sunt: apariţia de specii sau de tulpini („mutante”)
bacteriene cu rezistenţă la antibiotice, înmulţirea reacţiilor adverse la antibiotice şi
chimioterapice precum şi modificarea tablourilor clinice „clasice“ ale patologiei infecţioase.
Cel puţin teoretic soluţia ar fi descoperirea de noi antibiotice (însă din ce în ce mai multe
companii farmaceutice transferă interesul pentru descoperirea de medicamente antivirale şi
antifungice şi au tendinţa de a renunţa la cercetarea fundamentală în vederea producerii de
medicamente antibacteriene, Shlaes 2003) dar mult mai logic, mai corect şi mai la îndemână
este folosirea raţională a medicamentelor antimicrobiene deja existente şi evitarea erorilor
făcute în practica antibioticoterapiei.
90
doar „bănuiala unei infecţii”. Este incorect să decidem antibioticoterapia „la întâmplare” sau
„pe încercate” (cu o eventuală eroare suplimentară reprezentată de schimbarea succesivă a
antibioticului în „raţionamentul” că „poate de data aceasta va merge” fără să încercăm să ne
fundamentăm decizia pe criterii raţionale (cel puţin pe criterii de probabilitate). „Raţionamente”
simpliste de tipul febră = infecţie = antibiotice şi chimioterapice (deseori întâlnite în practică, din
păcate) nu pot conduce decât la eşec, la modificarea evoluţiei bolii şi la împiedicarea stabilirii
ulterioare a diagnosticului („mascare” clinică şi bacteriologică) şi tratamentului corec t. Cu privire
la criteriile de probabilitate este adevărat că în România nu există ghiduri şi recomandări privind
utilizarea corectă a antibioticelor, bazate pe studii actuale, realizate pe eşantioane
reprezentative statistic pentru România şi în aceste condiţii „referinţa” este reprezentată de
studiile făcute în SUA sau în Europa de Vest şi de manualul domnului profesor Mircea Angelescu
(1998).
91
Aşa cum am mai subliniat în cadrul acestui capitol, nu trebuie niciodată să absolutizăm datele
clinice, datele paraclinice, datele de laborator, luate fiecare în parte şi „scoase” din contextul
general. Nu există o prioritate pentru clinică sau o prioritate pentru laborator; datele trebuie
interpretate, integrate şi utilizate în contextul clinic, paraclinic şi de laborator general. Aceasta
reprezintă, după opinia noastră, un aspect esențial al medicinii pe care dorim să o practicăm la
cel mai înalt nivel, în favoarea pacienţilor pe care trebuie să îi tratăm.
92
, este incorect să nu studiem şi să nu acumulăm cunoştinţele necesare de
microbiologie, farmacologie, fiziopatologie, semiologie medicală, medicină internă, chirurgie
etc. care contribuie la evitarea erorilor în conducerea tratamentului sau / şi greşelilor în tehnica
de administrare; cunoştinţele acumulate ne permit să avem în vedere posibilele reacţii adverse
şi să evităm situaţii care pot deveni dramatice.
Circulaţia substanţelor antimicrobiene în organism din momentul resorbţiei şi până în
momentul eliminării (farmacocinetica substanţelor antimicrobiene) trebuie cunoscută atât
pentru evaluarea efectului terapeutic cât şi pentru prevenirea acumulării şi apariţiei
fenomenelor toxice (de ex. vom indica substanţe antimicrobiene la pacienţi cu insuficienţă
renală numai în condiţiile monitorizării valorii creatinei şi creatininei sanguine, a ureei sanguine,
a ratei de filtrare glomerulare, a ionogramei şi a sedimentului urinar).
Există anumite caracteristici farmacocinetice pentru fiecare substanţă antimicrobiană. Datele
farmacocinetice condiţionează „biodisponibilitatea” medicamentului în cazul concret al
bolnavului tratat. Aceste proprietăţi caracteristice privesc absorbţia de la locul de administrare,
difuziunea în organism (ţesuturi şi fluide), metabolizarea substanţei în organism, eliminarea (căi
şi forme de eliminare) etc.
După mecanismul patogenic reacţiile adverse la antibiotice şi chimioterapice ar putea fi
reprezentate de: a. efecte toxice directe, la locul administrării (fenomene iritative, flebite etc.),
sau la distanţă (hepatice, renale, hemopoietice etc.); b. reacţii de hipersensibilizare (erupţii, şoc
anafilactic etc.) şi c. efecte secundare (dismicrobisme de ex. prin utilizarea antibioticelor c u
spectru larg, inducerea de suprainfecţii, reacţii autoimune etc.).
Datorită conjuncturii actuale internaţionale, s-a concluzionat că probabilitatea unui atac terorist
cu arme biologice este din ce în ce mai mare. Având în vedere că prevenirea poate fi o mai bună
formă de apărare, specialiştii occidentali au hotărât să pună la punct un program naţional de
protecţie anti-bioterorism. În Statele Unite, acest program poartă numele de „BioShield”.
Iniţial au fost identificate structurile microbiene sau tulpinile care ar putea fi utilizate în cazul
unui atac biologic, cele mai importante fiind: toxina botulinică, Bacillus anthracis, virusurile
febrei hemoragice, Yersinia pestis, Francisella tularensis şi virusul variolic.
În afară de identificarea problemelor potenţiale a fost necesară găsirea soluţiilor de prevenire /
control / combatere.
În cadrul acestui capitol vom discuta numai subiectul legat de un antibiotic cunoscut, dar
condiţionat într-o formă specială, prezentând astfel o serie de avantaje. Gentamicina şi
respectiv mecanismul de acţiune al acesteia sunt elucidate. Condiţionarea în aşa fel încât
administrarea să poate fi făcută pe care inhalatorie prezintă o serie de avantaje, spre exemplu:
93
a. eliberare mai rapidă; b. biodisponibilitate mai bună; c. remanenţă mai bună; d. posibilitate de
dozare mai bună; e. capacitatea de a ajunge mai uşor şi mai direct la nivelul organelor afectate.
Atât în cazul tularemiei cât şi în cazul pestei, formele pulmonare sunt cele mai grave, cu cea mai
mare mortalitate şi cu cea mai mare contagiozitate, cu alte cuvinte tratamentul acestor forme
de boală reprezintă o prioritate.
Având în vedere toate aceste menţiuni, gentamicina administrată pe cale inhalatorie trebuie
avută în vedere atât pentru tratament cât şi pentru profilaxia post-expunere în cazul unui atac
bioterorist.
Aceste studii sunt foarte recente iar informaţiile au devenit disponibile în ultima parte a anului
2007.
Când administrăm antibiotic? Mai ales că, spre exemplu, administrarea unui antibiotic adecvat
la pacienţii cu sepsis diminuă mortalitatea într-un procent semnificativ cu cât se face mai
precoce (de ordinul orelor). Aşadar, administrarea de urgenţă a unui antibiotic depinde de
capacitatea de a recunoaşte bolnavul „critic”. „Legarea” ulterioară de etiologia infecţioasă a
stării critice nu face decât să confirme decizia. Dacă va fi incriminată, ulterior, o altă etiologie a
stării critice (IMA, pancreatita acută, HDS cu şoc etc) oprirea antibioticului nu afectează în sens
negativ evoluţia, aşa cum ar fi fost afectată de întârzierea administrării acestuia. La vârstnici,
infecţia urinară poate fi frecvent o cauză de sepsis. La un pacient vârstnic, febril, cu
hipotensiune, cu imagine EKG nespecifică pentru un IMA (posibil in primele ore), aşteptăm chiar
şi 4 ore fără să administrăm antibiotic, până la elucidarea modificărilor EKG, dar dacă sursa
hipotensiunii era un sepsis cu punct de plecare renal, sau altul, atunci mortalitatea poate creşte
de la simplu la dublu (17%-30%).
La pacientul care nu e critic, se pot monitoriza semnele clinice şi se poate aştepta cu
administrarea antibioticului până la determinarea posibilei etiologii infecţioase.
Dar pe de altă parte nu trebuie să uităm că nimeni nu ne opreşte, indiferent de decizia care va fi
luată, să recoltăm sânge pentru hemoculturi, urină pentru uroculturi sau alte produse, care pot
fi trimise către laborator înainte de începerea tratamentului antibiotic.
Vă aducem la cunoştinţă cazul pacientei în vârstă de 21 de ani, care s-a prezentat la medic
pentru o plagă tăiată la nivelul falangei distale a policelui mâinii stângi. Pacienta se tăiase în
marginea unei conserve pe care o desfăcuse de curând. Plaga era în aparenţă profundă şi
secţionase coronar pulpa degetului pătrunzând şi în patul unghial. Sângerarea abundentă şi
îndelungată a plăgii, dar şi durerea pulsatilă la nivelul policelui, apărută după aproximativ o oră,
au fost motivele prezentării la medic. Pacienta a menţionat faptul că acasă a aplicat apă
oxigenată pe plagă (a procedat corect, fiindcă apa oxigenată, prin efectul de spumare,
antrenează cheagurile de sânge şi resturile anorganice de la nivelul leziunii, dar realizează şi o
uşoară hemostază, oxigenând totodată plaga şi prevenind astfel dezvoltarea germenilor
anaerobi). De asemenea, a aplicat local un antibiotic sub formă de pulbere (ceea ce nu este la
fel de corect).
La spital, din cauza durerii intense care a cuprins între timp întreaga mână până la articulaţia
pumnului, medicul a evitat aplicarea unui prişnit alcoolizat, realizând hemostaza plăgii şi
efectuând în continuare toaletarea marginilor şi interiorului acesteia, aplicând şi apă oxigenată.
94
Leziunea s-a dovedit a fi minoră şi în mod cert nu necesita suturare. Totuşi, medicul curant
cunoştea faptul că pacienta este studentă la facultatea de medicină şi studiind în diferite spitale,
lua aproape zilnic contact cu bolnavii, cu echipamentul medical, dar şi cu celelalte cadre
medicale. În mediul spitalicesc, atât pacienţii cât şi membrii personalului sanitar se pot infecta
dacă există soluţii de continuitate şi dacă nu se respectă măsurile de prevenire şi control. În
acest context, medicul i-a propus pacientei iniţierea unei antibioterapii cu oxacilină
(menţionând că stafilococul alb şi auriu „răspund bine”), timp de cinci zile, pent ru a preveni
apariţia unei infecţii piogene a degetului. Un motiv de îngrijorare îl constituia durerea
chinuitoare, pulsatilă la nivelul mâinii (apare de obicei ca un fenomen însoţitor pentru un
panariţiu subcutanat pulpar, însă abia după 24 - 48 de ore; î n cazul de faţă durerea s-a instalat la
o oră de la lezarea zonei).
Deşi iniţial reticentă la ideea de a lua antibiotice în scop profilactic, pacienta a acceptat,
convinsă de către medic că riscul apariţiei unei infecţii era mare.
A doua zi, sfătuindu-se cu un medic din universitate, pacienta a „cântărit” mai bine acest risc,
ajungând la concluzia că antibioterapia pe care o urma nu era nici pe departe necesară. Medicul
de la spital a tratat leziunea ca pe o plagă chirurgicală pentru care antibioterapia ar fi putut să
fie instituită în scop profilactic (înainte de realizarea contaminării plăgii) sau metafilactic (în
contextul unei inoculări bacteriene prezumtive). O altă eroare, de această dată a pacientei, a
fost aplicarea locală de pulbere antimicrobiană imediat după lezarea zonei. Evident că riscul
apariţiei unei infecţii exista, la fel ca şi în „povestea drobului de sare”. Pacienta a decis să
urmeze antibioterapia timp de trei zile în loc de cele cinci recomandate; evoluţia a fost
favorabilă, iar plaga s-a cicatrizat fără complicaţii. Suntem convinşi că acest lucru a fost posibil
nu datorită antibioticelor administrate, ci datorită faptului că leziunea a fost minoră, precum şi
datorită capacităţii de răspuns a organismului. Pacienta a decis ca pe viitor, în situaţii similare, să
analizeze mai atent beneficiile şi riscurile administrării de antibiotice, acest caz constituind un
elocvent contra-exemplu.
În concluzie, chiar dacă fenomenul apariţiei rezistenţei la antibiotice este bine cunoscut şi
înţeles, iată că în România anului 2007 încă se mai prescriu antibiotice pentru orice „zgaibă”!
Nu doar fiinţele umane sunt supuse uzului iraţional al antibioticelor, ci şi animalele de fermă.
Situaţiile de necesitate, în care acestea chiar sunt bolnave, reprezintă numai o mică parte din
totalul situaţiilor în care le sunt administrate antibiotice. În majoritatea cazurilor,
medicamentele antimicrobiene sunt introduse în doze mici în hrana sau apa lor pentru efectul
biostimulant.
Încă din anii ’40, antibioticele au început să fie folosite în fermele din toată lumea pentru
capacitatea de a determina o creştere mai rapidă în greutate a animalelor. O altă consecinţă
este că acestea devin adevărate rezervoare de germeni rezistenţi, care pot fi apoi transferaţi
omului. Producţia de carne creşte spre beneficiul câtorva producători, dar creşte concomitent şi
ponderea bacteriilor rezistente la antibiotice, în dauna sănătăţii unei lumi întregi.
În UE, de la 1 ianuarie 2006 a intrat în vigoare o directivă a Comisiei Europene, care interzice
folosirea antibioticelor în scop biostimulant. Lista antibioticelor utilizate în alt scop decât cel
terapeutic s-a micşorat treptat, de la an la an, pentru ca în 2006 responsabilii europeni, pe
deplin convinşi de concluziile cercetătorilor în domeniul microbiologiei, să le interzică complet.
95
Fenomenul rezistenţei microbiene la antibiotice are o istorie aproape la fel de lungă ca și cea a
antibioticelor. În discursul rostit cu ocazia primirii Premiului Nobel, Alexander Fleming avertiza
în legătură cu uşurinţa cu care pot fi produse microorganisme rezistente la invenţia sa -
penicilina. Nu este nevoie de altceva decât ca acestea să fie expuse la doze mai mici decât doza
bactericidă. Aceasta se întâmpla în 1945. Foarte curând temerile sale s-au adeverit, începând să
apară primele tulpini rezistente.
În 2009 s-a dovedit clar transmiterea de la animal la om a unui germen redutabil - stafilococul
auriu rezistent la meticilină (MRSA).
Aşadar, în condiţiile eforturilor pentru prevenirea apariției și răspândirii germenilor rezistenţi,
sistarea abuzului de antibiotice în ferme ar trebui să se găsească în lista de priorităţi. (11)
Tot în 2009 câţiva cercetători s-au adunat şi au avut ca scop verificarea numărului de site-uri
care oferă antibiotice fără reţetă. Cu ajutorul motoarelor de căutare Google şi Yahoo au găsit
138 de astfel de site-uri. Dintre acestea, 36,2% vindeau antibiotice fără reţetă iar 63,8% ofereau
o reţetă online. Penicilinele erau disponibile pe 94,2% din aceste site-uri, macrolidele pe 96,4%,
fluoroquinolonele pe 61,6% iar cefalosporinele pe 56,5%. 98,6% exportau spre SUA.
Rezultatele descrise în acest studiu sugerează că există o sursă mare de antibiotice în SUA care
nu este afectată de iniţiativele legate de schimbarea prescrierii antibioticelor şi care poate
contribui la extinderea rezistenţei la antibiotice și chimioterapice.
Comunitatea medicală împreună cu instituţiile de sănătate publică şi companiile farmaceutice
trebuie să-şi extindă eforturile pentru a controla rezistenţa la antibiotice. În timpul anamnezei
medicul poate oferi informaţii legate de antibiotice, rezistenţa la antibiotice şi posibilele
interacţiuni între antibiotice. Pacienţii au nevoie să fie educaţi în acest sens! (12)
În SUA şi UK se estimează că un foarte mare procent din infecţiile nosocomiale cu S. aureus este
produs de tulpini meticilino-rezistente (MRSA) şi o bună parte sunt MDR. O mai mică parte din
aceste tulpini (şi totuşi numărul este în creştere) prezintă nivele joase de rezistenţă la
vancomicină. S-au descoperit noi antibiotice care pot fi utilizate în tratamentul MRSA şi chiar şi a
tulpinilor rezistente la vancomicina (ex. daptomicina) dar nu o să treacă mult timp până se va
dezvolta rezistenţa şi la ele. Este o soluţie inventarea continuă de noi antibiotice?
Unele tulpini de E. coli (una din cauzele comune de ITU) sunt rezistente la antibiotice din şase
clase diferite incluzând cele mai nou recomandate, fluoroquinolonele. Mai mult decât atât, în
sudul Asiei şi în China, 60-70% E. coli sunt rezistente la fluoroquinolone. (13)
Aşa că rămâne întrebarea - ce este de făcut?
Sau mai bine zis, ce va face cititorul după ce va citi aceste rânduri?
Care este atitudinea pe care o va adopta medicul curant, studentul viitor medic sau omul care
doreşte pur şi simplu să se informeze?
Am avea o propunere: în cazul în care nu va reuși să învețe sau să aplice noțiunile învățate
”secundum arte”, măcar să nu participe la ”implementarea” în practică a celor mai frecvente
erori în utilizarea antibioticelor și chimioterapicelor.
96
Vom prezenta mai jos câteva dintre direcțiile de cercetare actuală pe care cititorul le poate
evalua deschizând următoarele link-uri:
-Predicting resistance mutations using protein design algorithms
http://www.pnas.org/content/107/31/13707.full
-Rapid molecular detection of Tuberculosis and Rifampin resistance
http://www.nejm.org/doi/pdf/10.1056/NEJMoa0907847
- „Antibiotics Are Not Automatic Anymore”—The French National Campaign To Cut Antibiotic
Overuse
http://www.plosmedicine.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pmed.1000080
- Significant Reduction of Antibiotic Use in the Community after a Nationwide Campaign in
France, 2002–2007
http://www.plosmedicine.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pmed.1000084
- Prevalence and Antimicrobial Resistance Pattern of Bacterial Meningitis in Egypt
http://www.medscape.com/viewarticle/715718
- Global Health Advocates Call for Renewed Focus on Drug Resistance
http://www.medscape.com/viewarticle/727041
- CDC Issues Plan to Combat Extensively Drug-Resistant Tuberculosis
http://www.medscape.com/viewarticle/588332
- New Drugs and New Regimens for the Treatment of Tuberculosis: Review of the Drug
Development Pipeline and Implications for National Programmes
http://www.medscape.com/viewarticle/720268
- ID Society Calls for 10 New Antimicrobials by 2020
http://www.medscape.com/viewarticle/718786
-Despre antibiotice, rezistenta si testarea sensibilitatii
http://wwwn.cdc.gov/dls/master/ams/intro/open.swf
-Institutul National de Alergie si Boli Infectioase
http://www.niaid.nih.gov/topics/antimicrobialresistance/Pages/default.aspx
-European Antibiotic Awareness Day
http://ecdc.europa.eu/en/eaad/Pages/Home.aspx
- Alliance for the prudent use of antibiotics (a se citi si actiunile intreprinse in Romania si
planurile lor de viitor)
http://www.tufts.edu/med/apua/index.shtml
-Antibiotics for the prevention of malaria,
http://www.mpg.de/english/illustrationsDocumentation/documentation/pressReleases/2010/p
ressRelease20100721/index.html
97
A. nucleul betalactam
B. nucleul carbapenem
C. betalactaminele
D. betalactamazele
E. inhibitorii de betalactamaze
Liu B, Pop M, 2009, ARDB – Antibiotic Resistance Genes Database, Nucleic Acid Res., 37,
D443-D447
Demain AL, Sanchez S, 2009, Microbial drug discovery: 80 years of progress, J. Antibiotics, 62,
5-16 (e 16)
Davies J, Davies D, 2010, Origins and Evolution of Antibiotic Resistance, Microbiol. and
Molecul. Biol. Rev., 74, 417-433
98
DeNoon DJ, 2010, Extremely Drug-Resistant Infections Spreading Fast, Medscape
(http://www.medscape.com/viewarticle/726857)
Auwaerter PG, 2010, New Antibiotic Resistance Gene NDM-1: A Worrisome Peek Into the
Future?, Medscape (http://www.medscape.com/viewarticle/728039)
Kelland K, Hirschler B, 2010, New Superbugs Are Spreading From India, Medscape
(http://www.medscape.com/viewarticle/726720)
Goodman A, 2010, NDM-1 Gene Spreading to Multiple Bacteria Species, Making Them
Antibiotic-Resistant, Medscape (http://www.medscape.com/viewarticle/729202)
Kristinsson KG, Monnet DL, 2008, Increasing Multidrug Resistance and Limited Treatment
Options: Situation and Initiatives in Europe, Eurosurveillance, 13
Henderson KL, Müller-Pebody B, Johnson AP, Goossens H, Sharland M, 2009, First set-up
meeting for Antibiotic Resistance and Prescribing in European Children (ARPEC),
Eurosurveillance
***, CDC, 2001 Public Health Action Plan,
http://www.cdc.gov/drugresistance/actionplan/actionPlan.html
Smith TC, Male MJ, Harper AL, Kroeger JS, Tinkler GP, Moritz ED, Capuano AW, Herwaldt LA,
Diekema DJ, 2009, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strain ST398 is present in
midwestern U.S. swine and swine workers., Epub, 4(1), e4258,
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19145257)
Mainous AG, Everett CJ, Post RE, Diaz VA, Hueston WJ, 2009, Availability of Antibiotics for
Purchase Without a Prescription on the Internet, Annals of Family Medicine, 7(5), 431-
435(http://www.medscape.com/viewarticle/710060)
Levy SB, Marshall B, 2004, Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and
responses, Nature Medicine Sup., 10, S122-S129
99
Testarea sensibilităţii la medicamentele antimicrobiene se realizează (din punct de vedere
didactic) în ultima etapă a diagnosticului de laborator microbiologic, pentru majoritatea
microorganismelor implicate etiologic. Testarea este necesară datorită apariţiei şi extinderii
rezistenţei microorganismelor la antibiotice şi chimioterapice. Rezistenţa poate fi naturală sau
dobândită. Rezistenţa naturală este determinată genetic. Rezistenţa dobândită este
„achiziţionată” de anumite subpopulaţii dintr-o anumită specie microbiană, în circumstanţe
date, ex. prin „presiunea de selecţie” exercitată de antibiotic.
Noţiuni privind evaluarea sensibilităţii la agenţi antimicrobieni
În general, o tulpină poate fi considerată sensibilă atunci când germenii sunt în mod eficient
afectaţi de către antibiotic, iar efectul terapeutic poate fi obţinut cu doze şi pe căi de
administrare „obişnuite”. Tulpina va fi considerată moderat sensibilă dacă germenii sunt afectaţi
într-o măsură mai mică, iar efectul terapeutic nu poate fi obţinut decât în condiţii speciale (ex.
prescrierea unor doze mai mari decât cele „obişnuite”, calculate de exemplu pe kilogram/corp;
utilizarea unor căi de administrare speciale – injectare intravenoasă, intrarahidiană etc) (Figura
nr. 1, Figura nr.2). În mod absolut se consideră că o tulpină este rezistentă dacă rezultatul
testării sensibilităţii in vitro este negativ. Totuşi, trebuie să avem în vedere că între rezultatele
„in vitro” şi efectul „in vivo” pot exista diferenţe.
Deoarece între rezultatele testării „in vitro” şi efectul terapeutic „in vivo” pot exista anumite
diferenţe, metodele de testare a sensibilităţii pot fi diferenţiate în:
a. metode de testare a sensibilităţii „in vitro”;
b. metode „in vivo” (metode care ţin cont de relaţia agent terapeutic-infecţie).
Antibiograma face parte din prima categorie de metode menţionate. Reprezintă metoda de
laborator prin care se apreciază sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltaţi de la bolnavii
cu infecţii bacteriene, după cultivare pe medii îmbogăţite, care să permită dezvoltarea optimă a
microorganismului pentru care se efectuează testarea (de exemplu pe agar Mueller -Hinton).
Pentru antibiograme trebuie să folosim culturi pure (reprezentând o singură tulpină bacteriană),
chiar în cazul infecţiilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici sunt:
· Tehnicile calitative
o antibiograma difuzimetrică comună (cu discuri)
o antibiograma difuzimetrică comparativă
o antibiograma difuzimetrică standardizată
o antibiogramele difuzimetrice rapide
· Tehnicile cantitative
o metoda diluţiilor în mediu lichid
o metoda diluţiilor în agar
o metoda microdiluţiilor în agar
o metoda „punctelor de ruptură”
100
o testul „E”
o metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.
Din punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar Mueller -
Hinton) turnat în plăci Petri. Însămânţarea se poate realiza de exemplu prin „inundarea” plăcii
urmată de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui tampon (există şi alte
variante tehnice). După circa 20 minute (timp în care placa Petri se lasă cu capacul întredeschis
în vecinătatea becului de gaz, aprins) se aplică microcomprimatele în care sunt încorporate
antibiotice în concentraţie standardizată. Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu
ajutorul unei pense, în condiţii aseptice, sau cu ajutorul unui aplicator „automat” (la minim 30
mm distanţă între ele şi minim 15 mm de marginea plăcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite
pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm).
Microcomprimatele trebuie să vină în contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu ajutorul
unei pense le presăm uşor (după caz). După încă 15-20 minute, incubăm plăcile peste noapte în
termostat, la 28 sau 35-37°C, în funcţie de temperatura optimă de multiplicare a
microorganismului testat.
Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în mediu, realizând zone de inhibiţie în care
coloniile microbiene nu se dezvoltă (Figura nr. 3).
Cu cât zona de inhibiţie este mai largă, cu atât germenul va fi considerat mai sensibil. Dacă în
interiorul zonei de inhibiţie (chiar dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se dezvoltă
colonii, „mutanţi rezistenţi”, germenul va fi considerat rezistent (Figura nr. 4).
Această metodă, cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare, permite de fapt numai
eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor foarte active,
pentru că tehnica nu este standardizată.
101
Din punct de vedere tehnic se realizează asemănător cu prima metodă prezentată, dar este
standardizată, fiind singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional, care
permite obţinerea unor rezultate reproductibile şi corelabile între laboratoare diferite (Film nr.
1).
Elementele necesare standardizării sunt:
· mediul (în majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru că are o valoare nutritivă
corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune inhibitoare)
o există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor microorganisme
(ex. Mg2+ şi Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa, atunci când este testată
sensibilitatea la aminoglicozide);
o se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7,2 şi 7,4);
o există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării unor microorganisme
pretenţioase;
o grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm (25 ml de mediu/placă de 9 cm);
· inoculul, care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură) şi trebuie să aibă o
turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa 108 unităţi
formatoare de colonii/ml) în majoritatea cazurilor;
· timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C, nu mai mult de 2-3 plăci
suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;
· concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea
microcomprimatelor (6 mm diametru);
· alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;
· păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile, în pungi de
polietilenă, la +4°C);
· utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate;
· interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară
rezultatele cu cele din tabelele puse la dispoziţie de producători şi/sau centrele de referinţă).
Metodele difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentraţiilor eficace ale
antibioticului la nivelul focarului infecţios.
Acest tip de metodă oferă informaţii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate, faţă de
microorganismul testat. CMI = concentraţia minimă inhibitorie, reprezintă cea mai mică
concentraţie de agent antimicrobian, exprimată în micrograme/ml, care mai exercită o acţiune
bacteriostatică asupra germenului testat.
Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi cu bulion
Mueller-Hinton în concentraţii descrescânde (diluţii binare) pornind spre ex. de la 16
micrograme/ml şi până la 0,125 micrograme/ml, în total 8 tuburi, plus 2 tuburi martor, fără
antibiotic (cantitatea finală va fi de 1 ml în fiecare tub). Preparăm un inocul standardizat
turbidimetric şi în condiţii aseptice inoculăm toate cele 10 tuburi cu câte 1 ml de inocul. Agităm
pentru a omogeniza. Incubăm cele 8 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor timp de 16-20 ore la
35-37°C iar al doilea tub martor îl menţinem pentru aceeaşi perioadă la temperatura frigiderului
102
(Figura nr. 6). Pentru controlul de calitate utilizăm şi un şir de tuburi pe care le inoculăm cu o
tulpină de referinţă corespunzătoare. În ziua următoare citim şi interpretăm rezultatele.
Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egală cu cantitatea de mediu, concentraţia finală de
antibiotic se va înjumătăţi (de ex. în tubul în care diluţia iniţială a fost de 16 mg/ml, diluţia finală
va fi 8 mg/ml etc.). În tubul martor menţinut la +4°C ar trebui să nu fie prezentă creşterea, în
tubul martor menţinut la 35-37°C creşterea trebuie să fie prezentă (Figura nr. 7).
În tuburile inoculate cu tulpina de referinţă trebuie să avem rezultatul corespunzător datelor pe
care le cunoaştem privitor la respectiva tulpină.
În tuburile cu microorganismul testat, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea
microorganismului corespunde CMI. Se consideră (în general, pentru că CMI diferă în funcţie de
specia microbiană) că microorganismele în cazul cărora CMI este £ 3 mg/ml vor fi eficient
inhibate de către antibioticul respectiv şi in vivo.
CMI nu are aceeaşi valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. De ex. CMI la amoxicilină în
cazul unor tulpini sensibile este de 0,1 mg/ml pentru Staphylococcus aureus, 0,03 mg/ml pentru
Streptococcus pneumoniae, 0,25 mg/ml pentru Haemophilus influenzae, 2 mg/ml pentru E. coli,
16 mg ml (şi practic aceasta semnifică „rezistenţă in vivo”) pentru Bacteroides fragilis iar în cazul
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa sau Chlamydia trachomatis tulpinile sunt
rezistente.
Pornind de la rezultatul obţinut prin metoda diluţiilor în mediu lichid, se vor utiliza ca sursă de
inocul tuburile în care dezvoltarea microbiană a fost inhibată (Figura nr. 8).
Este necesară o placă Petri cu agar Mueller-Hinton care va fi împărţită în sectoare, numărul de
sectoare fiind corespunzător numărului de tuburi fără creştere microbiană. Însămânţăm în
condiţii aseptice din fiecare tub fără creştere microbiană, fiecare în sectorul de placă
corespunzător (Figura nr. 9). Incubăm pentru 16-18 ore la 35-37°C. CMB va corespunde ultimei
concentraţii de antibiotic care a distrus microorganismele însămânţate (sectoare de placă fără
apariţia culturii) (Figura nr. 10). Se consideră că antibioticul va fi eficient in vivo dacă în serul
pacientului se pot atinge concentraţii de antibiotic care să depăşească de 4 -8 ori CMB.
Determinarea CMI şi CMB este extrem de importantă pentru aprecierea eficacităţii
antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentul infecţiilor
severe (de exemplu endocardite, meningite, sepsis etc), precum şi la imunodeprimaţi ,
efectuarea acestei metode este indispensabilă.
Metoda este folosită în laboratoarele moderne de microbiologie şi este utilizată pentru a defini
sensibilitatea şi rezistenţa la antibiotice. Depinzând de metoda de testare rezultatele sunt
exprimate sub forma unei concentraţii (mg/l sau µg/ml) sau sub forma unui diametru (mm). (1)
Metoda este practicată de multe dintre laboratoarele din Europa de Vest, mai ales dacă volumul
de muncă este mare sau foarte mare. Prin această metodă se pot testa mai multe
microorganisme, în acelaşi timp. Antibioticele sunt incorporate în mediul de cultură, la o
anumită concentraţie „limită”, în funcţie de cunoştinţele şi datele acumulate în ceea ce priveşte
activitatea „in vivo” a respectivelor medicamente. Plăcile sunt inoculate simultan cu mai multe
tulpini bacteriene, în „spot”, folosind un inoculator construit special, sunt incubate în condiţii
corespunzătoare pentru 16-18 ore. În cazul în care tulpina sau tulpinile din diferitele specii
103
bacteriene nu se dezvoltă la această concentraţie „limită” de antibiotic (considerată ca fiind
eficace „in vivo”), bacteria izolată este considerată sensibilă. În cazul în care bacteria se dezvoltă
(apare cultură bacteriană), bacteria izolată este considerată rezistentă.
Această concentraţie limită (breakpoint) trebuie setată în funcţie de următoarele date:
distribuţia CMI, evaluarea raportului PK/PD (farmacocinetic/farmacodinamic) şi rezultatele
obţinute în clinică în tratamentul pacienţilor. PD reprezintă studiul efectelor medicamentului
de-a lungul timpului şi este în strânsă legătură cu PK care reprezintă modificările concentraţiilor
medicamentului în timp.
”Punctele de ruptură” trebuie stabilite înainte ca un antibiotic să fie folosit în clinică şi trebuie să
fie revăzute când apar cazuri de rezistenţă la antibiotice. Totuşi setarea de ”puncte de ruptură”
nu este perfectă. Metoda este utilă şi în realizarea unor studii epidemiologice în ceea ce
priveşte modificarea rezistenţei la antibiotice în anumite zone geografice. (1-2)
104
· benzi „E test” (a. cu agenţi antimicrobieni cu nucleu β lactam, b. cu alţi agenţi
antimicrobieni); se păstrează în congelator la -20ºC până în momentul utilizării (Figurile nr. 13-
14. Modul de prezentare a benzilor “E-test”); au o durată de utilizare de 1-2 ani (pentru prima
grupă) şi respectiv de 2-3 ani
· tampoane sterile;
· standard de turbiditate McFarland de 0,5 şi 1,0;
· pipete Pasteur sterile;
· foarfece;
· plăci Petri sterile cu diametrul de 90 mm şi respectiv de 150 mm;
· incubator cu atmosferă obişnuită reglat la 34-35ºC; incubarea în atmosferă îmbogăţită cu
CO2 este necesară în cazul testării anumitor microorganisme;
· sursă de lumină;
· aplicator „E test”şi bandă adezivă (opţional).
A. Benzile „E test”
· scoatem plăcile cu mediul de cultură şi benzile „E test”din congelator, le lăsăm la
temperatura camerei pentru echilibrare termică timp de 20 minute sau până când nu mai
observăm nici o urmă de umezeală
· înainte de a deschide folia care include benzile, inspectăm pentru a observa dacă există
perforări; dacă folia respectivă nu este intactă, atunci benzile din interiorul ei nu se mai pot
folosi; dacă nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai întâi tăiem cu o foarfecă de-a
lungul liniei întrerupte apoi între compartimentele ce conţin benzile
· scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete şi le punem în plăci Petri sterile; apoi le
putem aplica pe mediul de cultură care conţine inoculul microbian de testat
· păstrăm restul benzilor în tuburi în care introducem o substanţă desicantă pentru a le
proteja faţă de umezeală; este necesară protecţia şi faţă de căldură şi expunerea directă la
lumină (punem tuburile în congelator, la -20°C)
B. Inoculul bacterian:
· cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferăm mai multe colonii dintr-o cultură bacteriană
de 18-24 de ore într-un tub cu soluţie salină sterilă sau bulion; omogenizăm (există şi varianta să
transferăm mai multe colonii în bulion, să incubăm timp de 2-8 ore până când obţinem
densitatea dorită)
· ajustăm (vizual) densitatea folosind soluţie salină sterilă 0,85% sau bulion, la un standard
de turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta la standardul
dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizuală a turbidităţii inoculului nu garantează
numărul corect al unităţilor formatoare de colonii).
C. Inocularea plăcilor:
· introducem tamponul steril în tubul care conţine suspensia bacteriană de testat, rotim de
câteva ori, apoi eliminăm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereţii interiori ai
tubului;
105
· depunem inoculul pe suprafaţa plăcii cu mediul de cultură având grijă să acoperim
complet suprafaţa mediului (ex. inoculăm pe 3 direcţii diferite, rotind placa cu câte o treime);
· lăsăm placa timp de circa 10 minute, ca să se usuce, înainte de a aplica benzile „E test”.
E. Incubarea:
· timpul şi temperatura de incubare depind de variantele de microorganism-agent
antimicrobian ce urmează a fi testate;
· incubarea în atmosferă de CO2 modifică pH-ul mediului de cultură şi poate afecta
activitatea agenţilor antimicrobieni; se foloseşte numai în cazul în care microorganismele
supuse testării necesită pentru multiplicare CO2 (Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae,
Streptococcus pneumoniae etc).
Interpretarea rezultatelor:
· putem citi rezultatul în cazul în care creşterea bacteriană este confluentă sau aproape
confluentă (Figura nr. 15 - Interpretare rezultate E-test pentru E. coli);
· ţinem placa lângă o sursă de lumină (atunci când mediul este Mueller-Hinton); citim
valoarea CMI în punctul în care creşterea bacteriană intersectează banda „E test”; dacă am
utilizat agar Mueller-Hinton suplimentat cu 5% sânge de oaie, sau geloză-chocolate Mueller-
Hinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o sursă de lumină reflectantă şi
o lupă;
· pe geloză-sânge citim zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie a
hemolizei;
în cazul în care nu apare nicio zonă de inhibiţie, raportăm valoarea CMI ca fiind mai mare decât
cea mai mare concentraţie a agentului antimicrobian de pe banda „E test” (Figura nr. 16
Interpretare rezultate E-test pentru stafilococ); dacă zona de inhibiţie nu intersectează banda
106
(zona de inhibiţie se află sub banda „E test”), valoarea CMI se raportează ca fiind mai mică decât
concentraţia cea mai scăzută a agentului antimicrobian de pe banda „E test”;
· în cazul unei valori CMI situată între două marcaje ale gradientului benzii, rezultatul pe
care îl notăm va fi valoarea cea mai mare;
· raportăm rezultatul obţinut pentru tulpina studiată după ce verificăm rezultatul obţinut
pentru tulpina de referinţă (control de calitate);
· rezultatele CMI se interpretează conform criteriilor stabilite de NCCLS (National
Committee for Clinical Laboratory Standards) (Figura nr. 17 - Tabel NCCLS pentru
enterobacterii).
107
biologie moleculară pot fi foarte utile (chiar dacă costurile sunt mai ridicate). De ex. se cunoaşte
că agentul etiologic al tuberculozei se multiplică lent pe medii de cultură şi în aceste condiţii
rezultatele vor fi obţinute în circa 2 săptămâni prin metodele clasice. Se pot utiliza diferite
tehnici şi în final hibridizarea moleculară pentru a studia diferite mutaţii care pot să dea
informaţii cu privire la sensibilitatea/rezistenţa tulpinilor studiate. Spre ex. INNO-LIPA Rif. TB
(LIPA= Line Probe Assay), se realizează cu ajutorul unei truse comerciale puse la punct în USA.
Metoda permite concomitent identificarea M. tuberculosis precum şi testarea sensibilităţii la
rifampicină, după o amplificare genetică a unui material (ADN) provenit fie din culturi
mycobacteriene, fie chiar din produse clinice (Figura nr. 22).
Principiul INNO-LIPA este hibridizarea ADN-ului rezultat dintr-o amplificare prin PCR
(Polymerase Chain Reaction) cu sonde nucleotidice specifice, imobilizate sub forma unor linii
(benzi) paralele, pe fâşii de nitroceluloză. Sondele nucleotidice (S1 -S5) sunt biotinilate (cuplate
cu biotină). După hibridizare se adaugă streptavidină conjugată cu fosfatază alcalină, acest
conjugat ataşându-se de produşii de hibridizare rezultaţi anterior. Incubarea în prezenţa unui
reactiv cromogen conduce, în cazul existenţei hibridizării, la apariţia unor benzi colorate,
vizibile. În cazul testării rezistenţei la rifampicină, se urmăreşte apariţia unei/unor mutaţii la
nivelul genei care codifică pentru subunitatea β a ARN polimerazei (gena rpoB). (5-6)
Identificarea apartenenţei tulpinii testate la specia M. tuberculosis, este certificată cu ajutorul
unei oligonucleotide specifice, situată în poziţia a 3-a, după linia care marchează fiecare fâşie-
test şi respectiv linia care permite verificarea calităţii conjugatului (conjugate control).
Produsul unei tulpini sensibile la rifampicină deţine fragmente amplificate, care hibridizează cu
sondele specifice S1, S2, S3, S4 şi respectiv S5. Absenţa uneia sau a mai multor benzi
demonstrează că tulpina este rezistentă la rifampicină (Figura nr. 23).
Pentru tulpinile rezistente la rifampicină, trusa comercială INNO-LIPA permite suplimentar
aprecierea locusului mutaţiei. De exemplu, o tulpină poate prezenta o mutaţie în regiunea R5
(serină-leucină) în timp ce altă tulpină prezintă o mutaţie în regiunea R4a (histidină), aceste
mutaţii apărute la nivelul genei rpoB fiind dintre cele mai frecvente şi pot fi identificate prin
această metodă.
Eficienţa terapeutică poate fi apreciată clinic, paraclinic şi prin teste de laborator. Există unele
criterii nespecifice de laborator care sunt utile în aprecierea eficienţei terapeutice, precum
leucograma, examenul sedimentului urinar, examenul citologic al LCR, VSH, proteina C reactivă
etc.
Dintre metodele specifice utilizate pentru aprecierea eficacităţii terapeutice sau pentru
evaluarea eventualei nocivităţi a medicamentelor folosite, vom enumera:
· determinarea NEI (nivel de eficienţă inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte umori (Figurile nr.
24-26 - Citirea NEI din hemocultură sub terapie cu ertapenem; Film nr. 3);
· determinarea NEB (nivel de eficienţă bactericidă) pentru ser, LCR sau alte umori; puterea
bactericidă a serului celor trataţi (NEB) măsoară capacitatea diluţiilor din serul unui bolnav
tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul conţinând germenul infectant; se determină diluţia
cea mai înaltă de ser care mai manifestă capacitate bactericidă (Figurile nr. 27 -29);
108
· utilizarea acestor metode a fost indicată în cazul endocarditelor bacteriene,
osteomielitelor, fibrozei chistice sau sepsisului la pacienţi cu variate grade de imunodepresie;
produsele se recoltează de obicei la o oră după administrarea unei doze şi cu câteva minute
înainte de administrarea următoarei doze de antibiotic; (Film nr. 4 – Citirea NEI, Efectuarea NEB)
· determinarea nivelului de antibiotic realizat în sânge, LCR sau în alte umori (prin metode
microbiologice, enzimatice, HPLC etc).
109
MRSA. Acest nivel redus al meticilino-rezistenţei poate fi corelat, printre altele, cu numărul
mare de tulpini izolate din exsudat faringian, la care nivelul de meticilino- rezistenţă este mai mic
de 10%. Studiul a relevat faptul că macrolidele, ciclinele şi cotrimoxazolul constituie în prezent
alternative terapeutice compromise, rămânând active (pentru tulpinile identificate în institut) în
antibioterapie clindamicina, rifampicina şi aminoglicozidele. Procentul de tulpini de S. aureus
penicilino-rezistente raportat a fost de 26% (şi nu de 100% cum ar putea părea că este sugerat
atunci când, în relaţie cu o tulpină de S. aureus, penicilina este „uitată” complet).
Tulpinile de MRSA constituie o problemă de sănătate publică pe tot cuprinsul Europei. Totuşi,
faptul că în unele ţări (cum ar fi Cipru sau Turcia) incidenţa infecţiilor cu MRSA este în scădere,
reprezintă o speranţă în încercarea de a controla rata infecţiilor nosocomiale şi respectiv a celor
comunitare în care sunt implicate tulpinile de MRSA.
Conform unor studii recente s-a descoperit o nouă genă numită New Delhi metallo beta
lactamază sau NDM 1. Această genă se găseşte la nivelul plasmidelor şi astfel poate fi copiată cu
uşurinţă şi transmisă altor tipuri de bacterii. Pentru prima dată bacteria care purta gena NDM a
fost izolată de la un pacient suedez de srcine indiană care a avut infecţie urinară în timp ce
vizita New Delhi. Studiile arată că între 1 şi 4% dintre bacteriile Gram negative din sudul Asiei
poartă gena NDM.
NDM a fost identificată cu precădere la E.coli şi Klebsiella pneumoniae, tulpinile devenind înalt
rezistente la toate antibioticele cu excepţia tigecycline şi colistin. Dar există cazuri în care nici
aceste antibiotice nu sunt eficiente. În prezent nu există alte antibiotice pentru a distruge
bacteriile purtătoare ale acestei gene. Pot apărea infecţii obişnuite precum infecţiile tractului
urinar cauzate de microorganisme rezistente la antibiotice. O încercare pentru tratarea acestor
infecţii ar putea fi administrarea unor ”cocktail-uri” de antibiotice în sparanţa că acestea vor
avea un efect sau se pot folosi doze foarte mari dar există pericolul de intoxicaţie sau a altor
reacții adverse.
Din cauza turismului medical în general mai ales pentru proceduri precum chirurgia estetică
această nouă superbacterie se poate răspândi în întreaga lume. În urma unui studiu s-a constat
că NDM1 a fost identificată mai ales în Bangladesh, India şi Pakistan şi a ajuns în Marea Britanie
prin intermediul unor pacienţi care s-au întors din aceste ţări după tratament.
Rezistenţa la antibiotice trebuie considerată o problemă globală, mondială. (7)
1. Turnidge J, Paterson DL, 2007, Setting and Revising Antibacterial Susceptibility Breakpoints,
Clin. Microbiol. Rev., 20(3), 391-408.
2. Goue Denis Gohore Bi, Jun Li, Fahima Nekka, 2009, Antimicrobial breakpoint estimation
accounting for variability in pharmacokinetics, Theor. Biol. Med. Model., 6, 10.
3. Kuper KM, Boles DM, Mohr JF, Wanger A, 2009, Antimicrobial Susceptibility Testing: A Primer
for Clinicians, Pharmacotherapy, 29(11), 1326-1343.
4. Mandell, Bennett, Dolin, 2005, Principles and Practice of Infectious Diseases, 6th ed.
110
5. Cavusoglu C, Turhan A, Akinci P, Soyler I, 2006, Evaluation of the Genotype MTBDR Assay for
Rapid Detection of Rifampin and Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis Isolates, J.
Clin. Microbiol., 44(7), 2338-2342.
6. Morgan M, Kalantri S, Flores L, Pai M, 2005, A commercial line probe assay for the rapid
detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and
meta-analysis, BMC Infect. Dis., 5, 62.
7. Kumarasamy K, Toleman MA, Walsh TRR, Bagaria J, Butt F, Balakrishnan R, 2010, Emergence
of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological,
and epidemiological study, The Lancet Infect. Dis., 10, 597-602.
111
Fiinţa umană poate intra în contact cu microorganismele încă din perioada intrauterină, însă
acest contact se realizează numai în cazuri patologice (infecţioase, traumatice etc). În perioada
postnatală începe stabilirea relaţiilor operaţionale între fiinţa umană şi populaţia microbiană din
mediul înconjurător, fie prin colonizare saprofitică, fie prin agresiune ce devine evidentă.
Imediat după naştere, microorganismele se stabilesc treptat pe tegumente şi pe majoritatea
mucoaselor. Este vorba în principal de microorganismele care vor alcătui microflora normală a
organismului.
Aceasta joacă un rol important în protejarea gazdei faţă de o invazie microbiană ulterioară,
acţionând prin următoarele mecanisme:
- competiţia faţă de aceiaşi nutrienţi (interferenţă);
- competiţia pentru aceiaşi receptori de pe celulele gazdei (tropism);
- producţia de bacteriocine (colicine, piocine);
- producerea de acizi graşi volatili sau alţi metaboliţi;
- stimularea continuă a sistemului imun pentru a menţine un nivel scăzut (dar constant) al
exprimării moleculelor din clasa a II a de histocompatibilitate (DR) pe macrofage şi alte celule
prezentatoare de antigen;
- stimularea producerii unor factori imuni de protecţie încrucişată, ca de exemplu aşa-numiţii
anticorpi naturali.
Cu alte cuvinte, trebuie avute în vedere toate aceste aspecte atunci când se utilizează
Flora
a). La microbiană prezintă tropism pentru anumite regiuni anatomice. (Tabelul nr. 1)
nivelul tegumentului
În funcţie de contactul cu mediul înconjurător, flora bacteriană prezintă un grad marcat de
variabilitate. Mai frecvent, la nivel tegumentar se pot găsi Staphylococcus epidermidis,
Corynebacterium spp., Micrococcus spp., dar,temporar, tegumentul poate fi contaminat cu
germeni coliformi, chiar stafilococi potențial patogeni precum Staphylococcus aureus, însă fără
manifestări nete de agresivitate.
112
b). La nivelul conjunctivei oculare
Conjunctiva este puţin colonizată, deoarece secreţiile lacrimale conţin substanţe bactericide (ex.
lizozim), iar clipitul asigură îndepărtarea mecanică a corpilor străini, inclusiv a bacteriilor. Pot fi
totuși identificați Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium spp., Corynebacterium spp.
113
bactericidă prin lizozim. La femeile fără activitate sexuală predomină lactobacilii, pe când la
restul compoziţia florei este mixtă.
Cea mai puţin înţeleasă parte a organismului îndeplineşte funcţii esenţiale fiziologice,
nutriţionale şi de protecţie. Complexitatea acestui sistem ascunde mecanisme ce influenţează
anatomia, fiziologia, cât şi patologia umană. Flora normală intestinală cântăreşte aproximativ 1
kg şi conţine o bună parte din celulele corpului uman.
Speciile bacteriene ce colonizează sistemul intestinal sunt foarte variate. Flora normală este
unică, variind semnificativ de la un individ la altul, iar compoziţia ei se menţine constantă lungi
perioade de timp. Astfel a apărut noţiunea de „amprentă microbiană unică”.Aceste bacterii sunt
de 10 ori mai numeroase decât celulele eucariote ale corpului uman. În colon există cele mai
multe microorganisme comensale: 1011-1012 UFC/ml. Colonul este organul cel mai activ
metabolic din întreg organismul. (Figura nr. 1)
Înainte de naştere, în condiţii fiziologice, fătul este „germ-free” (nu prezintă microorganisme).
Apoi, întreg corpul uman și implicit şi tractul gastro-intestinal este colonizat de bacterii aerobe
ce aparţin microflorei materne, de ex. Escherichia coli sau Streptococcus spp.
După aproximativ o săptămână, încep să predomine bacteriile anaerobe.
În cazul în care nou-născutul este hrănit cu lapte matern, vor exista mai multe bacterii Gram-
pozitive, de tipul Bifidobacterium spp. sau Lactobacillus spp.
În cazul alăptării artificiale, situaţie nedorită şi nerecomandată pentru dezvoltarea sugarului, vor
predomina bacteriile Gram-negative, iar flora microbiană intestinală va deveni foarte
asemănătoare cu cea a adultului incluzând Enterobacteriaceae şi specii din genul Bacteroides.
Flora normală a adultului conţine reprezentanţi din toate cele 3 domenii de viaţă: Eukaryota,
Bacteria, Archaea, după cum urmează.
Din domeniul Bacteria, regăsim microorganisme din genurile Bacteroides (care reprezintă circa
30% din flora normală), Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus,
Peptostreptococcus, Bifidobacterium, Escherichia şi Lactobacillus.
Din domeniul Archaea, regăsim microorganisme din genul Methanobrevibacter.
Iar din domeniul Eukaryota, regăsim microorganisme din genurile Candida, Sacharomyces,
Aspergillus şi respectiv Penicillium.
114
Dintre toate structurile moleculare studiate, ARNr este cea mai puţin variabilă. S -a demonstrat
că anumite porţiuni ale secvenţei ADNr a diferitor organisme înrudite între ele sunt remarcabil
de similare. Astfel, se poate deduce următoarea idee: secvenţierea genelor unor organisme
apropiate filogenetic poate fi aliniată foarte precis, astfel obţinându-se o evaluare mult mai
exactă a diferenţelor existente. Cum? Prin compararea zonelor hipervariabile ale ARNr, extrem
de specifice unei anumite specii. Din acest motiv, genele care codifică pentru ARNr (ADNr) au
fost utilizate pentru a determina taxonomia, filogenia şi pentru a specifica ratele de diferenţiere
dintre speciile bacteriene. De asemenea, analiza după realizarea secvenţierii ARNr 16S oferă
numeroase informaţii asupra evoluţiei bacteriene şi asupra relaţiilor dintre specii. Iniţiatorul
acestor metode a fost Carl Woese, cel care a propus ulterior clasificarea microorganismelor în
sistemul celor trei domenii Archaea, Bacteria şi Eucarya.
Spre exemplu, într-un studiu s-a analizat prin secvenţierea ARNr 16 S (aparţine subunităţii mici
30 S ribozomale) acid nucleic bacterian provenit de la 50 tulpini. Astfel, s-au descoperit 1.250
secvenţe diferite, dintre care 85% nu au putut fi identificate. Majoritatea nu aparţin grupurilor
taxonomice cunoscute şi clasificate până în momentul de faţă, în timp ce mai mult de jumătate
nu au mai fost descoperite în nici un alt situs sau în afara organismului.
Până în prezent au fost identificaţi aproximativ 420 membri ai florei normale, făcând parte din
117 genuri diferite. Se presupune că există peste 1.000 d e specii bacteriene în sistemul nostru
intestinal.
Compoziţia florei microbiene normale este influenţată de numeroşi factori, precum stilul de
viaţă, dieta, starea de sănătate versus starea de boală, vârsta. Astfel, dacă este urmărită evoluţia
în timp a prezenţei speciilor de Bifidobacterium şi Enterobacteriaceae în sistemul intestinal, se
vor observa diferenţe semnificative:
Bifidobacterium spp. se află în cantitate maximă la copil, în cantitate medie la adult şi respectiv
în cantitate minimă la persoanele în vârstă, în timp ce Enterobacteriaceaele se află în cantitate
maximă tot la copil, în cantitate minimă la adult şi în cantitate medie la persoanele în vârstă.
(Schema nr. 1; Factori ce determină modificarea compoziţiei florei normale)
115
De-a lungul tractului gastro-intestinal se realizează o selecţie prin cooperarea dintre gazdă şi
diferitele bacterii. O serie de factori locali determină o distribuţie neuniformă a florei, dintre
aceştia putem aminti:
• temperatura;
• gradientul de oxigen (majoritatea speciilor bacteriene sunt anaerobe);
• peristaltismul intestinal (bacteriile se pot ataşa de mucoasă atunci când peristaltismul este
scăzut; iată şi unul dintre motivele pentru care medicamentele anti-peristaltice nu sunt benefice
în infecţiile digestive); (Tabelul nr. 2)
• fenomenul de competiţie între diferitele specii bacteriene etc.
În studiul unor cercetători de la Harvard Medical School au fost urmărite efectele colonizării cu
Bacteroides fragilis a unor şoareci „germ-free”(crescuţi în mediu steril). Dacă în lipsa bacteriilor
animalele prezentau timusul şi splina incomplet dezvoltate şi un număr al limfocitelor T CD4+
naive foarte mic, după colonizarea cu Bacteroides fragilis toate defectele au dispărut.
Mecanismul prin care flora determină o dezvoltare normală a sistemului imunitar se pare că
este următorul:
- bacteriile au la nivelul membranei externe un carbohidrat (PSA) cu o structură specială;
- PSA este recunoscut şi cooptat de celulele dendritice din mucoasa intestinală;
- celulele dendritice îl prezintă limfocitelor T naive şi determină proliferarea limfocitelor Th1, cu
adoptarea unui răspuns imun de tip celular .
Dacă în lipsa florei, organismul tinde spre un răspuns imun de tip umoral, realizat prin
limfocitele Th2, în prezenţa acesteia se echilibrează reacţia sistemului imunitar Th1-Th2.
Astfel, flora microbiană normală „educă” sistemul imun şi contribuie la dezvoltarea şi
funcţionarea normală a acestuia. Toleranţa faţă de bacteriile nepatogene, precum şi
sensibilitatea faţă de bacteriile patogene se dezvoltă începând cu primele zile de după naştere,
iar echilibrul dintre ele este esenţial. (Figura nr. 2)
116
Conform acestor explicaţii, în lipsa florei, sistemul imun tinde „să se orienteze” spre un răspuns
de tip umoral. Acest tip de răspuns imun poate fi implicat în apariţia stărilor de
hipersensibilitate (ex. de tip I), printr-o secreţie excesivă de imunoglobuline. Într-un studiu al
cercetătorilor de la University of Michigan Medical School, s-a observat o hipersensibilitate la
nivel respirator, apărută faţă de ovalbumină (un cunoscut alergen) la şoarecii cu flora normală
gastro-intestinală distrusă de antibiotice.
Un alt argument al implicaţiilor florei normale asupra sistemului imunitar este diferenţa
cunoscută dintre compoziţia florei normale a copiilor cu diversele forme de hipersensibilitate,
comparativ cu flora intestinală la copiii sănătoşi; copiii din prima categorie prezintă un nivel
crescut al speciilor de Clostridium difficile şi Staphylococcus aureus, în timp ce speciile din
genurile Bacteroides şi Bifidobacteria sunt în cantitate mică.
S-a descoperit faptul că Pseudomonas aeruginosa, ce aparţine florei normale la 3% din oameni,
deţine receptori pentru IFN-γ, mesager al sistemului imun, util în reglarea răspunsului imun,
inclusiv în cazul activării răspunsului imun anti-infecţios. Această citokină este „recunoscută”
drept o structură negativă şi, drept consecinţă, bacteria îşi activează genele de patogenitate. În
aceste condiţii, Pseudomonas aeruginosa reuşeşte să eludeze răspunsului imun, se multiplică,
selectează factori de rezistenţă la antibiotice, secretă toxine, sau poate penetra peretele
intestinal (P. aeruginosa a fost izolată în sepsis, iar unica sursă posibilă era reprezentată de flora
intestinală). În urma unor intervenţii chirurgicale majore a fost raportată o frecvenţă crescută a
sepsisului cu implicarea Pseudomonas aeruginosa.
Ipoteza foarte interesantă şi relativ recentă, care decurge din diversele studii realizate de
cercetători din universităţile americane este că bacteriile nu „simt” nevoia şi nici nu
„intenţionează” să descopere o oportunitate de atac, dar, atunci când se simt ameninţate,
dezvoltă un plan de reacţie.
117
Mecanisme ale gazdei
Organismul gazdă deţine sistemul PRR (pattern recognition receptor), care include familia TLR
(toll-like receptors) de receptori extracelulari şi NOD/CARD (nucleotide binding oligomerization
domain / caspase recruitment domain isoforms), familie de receptori intracelulari. (Figura nr. 3)
Celule implicate în procesul de diferenţiere sunt:
- enterocitele de suprafaţă;
- celulele M din foliculii limfoizi şi
- celulele intestinale dendritice.
Enterocitele deţin receptori PRR, iar la contactul cu bacteriile patogene eliberează IgA,
chemokine, citokine şi peptide antibacteriene. Celulele M transportă antigenele luminale către
celulele prezentatoare de antigen (celule dendritice, macrofage etc.) care le prezintă în
continuare limfocitelor T naive. Celulele intestinale dendritice deţin receptori PRR. Ele îşi trimit
dendritele către suprafaţă, recunosc antigenele, le cooptează şi le transportă către ganglionul
limfatic. Aici prezintă antigenele limfocitelor T naive. În ganglion este declanşat răspunsul imun
care poate fi efector, prin intermediul limfocitelor T helper (Th1, Th2), sau reglator, prin
limfocitele T cu rol în reglarea răspunsului imun.
La contactul dintre bacteria comensală şi receptori nu apare răspuns inflamator sau chiar poate
să apară un efect de protecţie, prin inhibiţia reacţiilor inflamatorii care ar putea fi declanşate de
bacteriile patogene.
Molecule precum TOLLIP (Toll interacting protein), SIGIRR (single Ig IL-1 R-related molecule) şi
NOD2 determină toleranţa faţă de flora normală gastro-intestinală, prin inhibarea TLR sau prin
blocarea cascadei inflamatorii. Limfocitele T reglatoare şi celulele intestinale dendritice deprimă
la rândul lor reacţia inflamatorie.
Mecanisme ale florei
Toleranţa faţă de flora normală nu este determinată doar de structurile gazdei. Bacteriile
comensale deţin mecanisme efectoare care le permit supravieţuirea în sistemul intestinal.
Astfel, ele pot prezenta pe suprafaţă molecule asemănătoare cu cele ale gazdei (ex. Bacteroides
spp.) sau pot secreta molecule care mediază eludarea mecanismelor de apărare ale gazdei.
Recent s-a demonstrat că secreţia se realizează prin sisteme de secreţie de tip III (injectarea
unor molecule în celulele eucariote, prin intermediul unui flagel) şi de tip IV (transportul ADN -
ului sau a unor proteine în celulele eucariote, asemănător mecanismului de conjugare),
mecanisme până acum descrise doar la bacteriile patogene. (Figura nr. 4)
Flora normală limitează semnalele inflamatorii declanşate de bacteriile patogene prin următorul
mecanism (Figura nr. 5):
- NF-kB (transcription factor nuclear factor) este un factor prin care bacteriile patogene transmit
semnale inflamatorii la nivelul celulelor epiteliale intestinale. Acest factor determină transcripţia
genelor p55-p65, cu producţia de chemokine şi citokine.
- flora microbiană intestinală activează PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) care
exportă p65 în citoplasma enterocitului. Astfel transcripţia este blocată, de asemenea şi cascada
inflamatorie.
Spre exemplu, flora intestinală normală scade răspunsul inflamator faţă de Salmonella
typhimurium.
118
Într-un organism gazdă sănătos, flora normală realizează un „strat protector” de-a lungul
sistemului intestinal. Bacteriile comensale ocupă situsurile de ataşare ale mucoasei şi consumă
factorii nutriţionali produşi de enterocite. La rândul lor, celulele intestinale secretă produşi anti -
bacterieni, chemokine, citokine şi IgA. (Figura nr. 6)
În anumite condiţii, spre exemplu atunci când:
- există o cantitate mai mare de tulpini din specii bacteriene patogene;
- este urmat un tratament îndelungat cu antibiotice (mai ales dacă au spectru larg);
- există factori care deprimă mecanismele de apărare ale gazdei (ex. o stare de imunosupresie, o
modificare a tranzitului prin peristaltism scăzut etc.);
- se exercită acţiunea unor factori externi (ex. radiaţii, arsuri, substanţe chimice etc.) flora
microbiană este afectată, iar bacteriile patogene pot invada mucoasa intestinală.
Într-un studiu realizat în anul 2006 pe şoareci „germ-free”, hrăniţi cu alimente bogate în
polizaharide, s-a observat că animalele colonizate doar cu Methanobrevibacter smithii şi cu
Bacteroides thetaiotaomicron au prezentat o depunere semnificativ mai mare de grăsime în
comparaţie cu animalele din alte grupuri de control. S-a demonstrat că:
- Bacteroides thetaiotaomicron intervine în dezvoltarea vascularizaţiei intestinale; induce
formarea reţelelor capilare şi stimulează absorbţia şi procesarea carbohidraţilor; în timp ce
- Methanobrevibacter smithii deţine funcţia unui reglator caloric în intestinul distal şi prin
sinergie cu B. thetaiotaomicron stimulează digestia zaharurilor şi creşte absorbţia caloriilor.
Mai recent, s-au descoperit numeroase mecanisme prin care flora microbiană normală intervine
în reglarea greutăţii corporale şi a depunerilor adipoase. (Figura nr. 7)
Primul dintre acestea ar fi influenţarea metabolizării nutrienţilor şi a reglării energetice. S -a
demonstrat faptul că bacteriile metabolizează polizaharide nondigerabile transformându-le în
produşi digerabili, astfel crescând extracţia energetică.
O altă ipoteză stabileşte o legătură între flora normală intestinală şi homeostazia metabolică. O
dieta bogată în lipide modulează populaţiile bacteriene dominante la nivel intestinal: cresc
bacteriile Gram negative şi scad bifidobacteriile, eubacteriile şi Bacteroides spp.
Această modificare determină creşterea nivelului plasmatic al lipopolizaharidelor (LPZ) care
induce un răspuns inflamator cronic de mică intensitate la nivelul ficatului, al ţesutului adipos şi
al hipotalamusului. Apare o creştere în greutate şi o acumulare excesivă a lipidelor la nivel
hepatic. În timp, creşte riscul apariţiei rezistenţei la insulină şi al dezvoltării diabetului zaharat de
tip 2. (Figura nr. 8)
Un al treilea mecanism este acela prin care flora normală induce reglarea unor gene ale gazdei.
Acestea sunt implicate în modularea depozitelor şi a consumului energetic.
Aceste descoperiri ar putea să aibă o mare importanţă atât în tratamentul obezităţii cât şi în
tratamentul celor subnutriţi. Ar putea explica de ce oameni care consumă aceeaşi cantitate de
hrană, prezintă modalităţi diferite de depunere a grăsimilor.
Totuşi ar rămâne un semn de întrebare: diferenţele observate în flora normală a pacienţilor
obezi este cauza sau consecinţa obezităţii?
119
Corpul uman nu deţine enzimele necesare fermentării polizaharidelor. Flora normală
îndeplineşte această funcţie. Prin fermentare zaharolitică, bacteriile produc acizi graşi cu lanţ
scurt de carbon şi gaz.
Microorganismele florei normale stimulează şi controlează dezvoltarea celulelor intestinale
(epiteliale şi ale ţesutului limfoid), prin furnizarea factorilor nutriţionali necesari. Bacteriile
previn lezarea mucoasei, aceasta constituind o posibilă funcţie anti-cancerigenă.
Acizii graşi cu lanţ scurt de carbon, produşi de floră, au ca efect scăderea pH-ului în lumenul
intestinal. Astfel este redus numărul bacteriilor patogene, deoarece acestea au o rezistenţă
scăzută la pH acid.
Prin fermentarea zaharolitică, flora are o importantă funcţie energetică, creşte reabsorbţia apei,
precum şi absorbţia unor nutrienţi (Ca, Mg, Fe).
Prin fermentarea proteolitică flora normală intestinală produce o serie de toxine şi substanţe cu
posibil rol în carcinogeneză. Cantitatea acestor substanţe este în relaţie directă cu cantitatea de
proteine ingerate.
Bacterii precum Streptococcus faecalis, Veilonella spp. metabolizează prin deconjugare sau
hidroliză acizii biliari dezoxicolic şi litocolic, cu producţie de cocarcinogeni. Lactobacillus bifidus
blochează acidul colic intracelular şi astfel împiedică formarea de cocarcinogeni.
Flora normală produce 50% din necesarul zilnic de vitamină K. Bacteroides fragilis şi Escherichia
coli participă la sinteza vitaminei K2.
Boala inflamatorie intestinală (boala Crohn şi colita ulcerativă) reprezintă un exemplu care
trebuie luat în discuţie şi aflat în relaţie cu flora intestinală normală. (Figura nr. 9)
Boala inflamatorie intestinală include:
- boala Crohn, în care procesele inflamatorii apar în principal la nivel intestinal, dar şi la nivelul
altor organe. Cel mai frecvent sunt afectate segmentele terminale ale intestinului subţire; în
cazul afectării colonice pot apărea fistule şi abcese în regiunea anală.
- colita ulcerativă include răspunsul inflamator la nivelul mucoasei ce căptuşeşte interiorul
rectului (proctita) sau la nivelul întregului colon (colită ulcerativă).
În momentul actual, nu a fost stabilită cu exactitate cauza apariţiei acestei entităţi patologice.
Totuşi, s-a observat că există anumiţi factori declanşatori, prezenţi la persoanele afectate:
- o predispoziţie genetică;
- lipsa alăptării la sân în perioada de sugar şi nou-născut;
- „igiena excesivă”în copilărie, cu o insuficientă dezvoltare a răspunsului imun;
120
- excese în consumul de grăsimi animale şi carbohidraţi;
- tratament cu antibiotice utilizat frecvent.
Se pare că unul dintre elementele de luat în consideraţie ar fi pierderea toleranţei faţă de flora
normală intestinală, cu apariţia unui răspuns imun aberant, cu stări de hipersensibilitate şi
reacţii autoimune. Apare o permeabilitate intestinală crescută. Compoziţia florei normale este
modificată (de ex. specii din genul Clostridium apar în proporţie mai mare faţă de normal), dar
nu s-a putut demonstra dacă aceasta determină boala sau dacă este doar un efect al inflamaţiei
intestinale.
Se pare că există şi o serie de alte boli în care este implicată flora normală, spre ex. neoplazii
(digestive sau în afara sistemului digestiv), infecţii produse în alte sisteme după modificarea
habitatului (ex. Escherichia coli în momentul în care ajunge la nivelul tractul urinar), obezitate,
stări de hipersensibilitate, autism, depresie etc.
121
pătrunse în organism stabilesc cu acesta relaţii de parazitism (de exemplu Clostridium tetani,
Clostridiile gangrenei gazoase, Salmonella typhi etc).
Rolul şi importanţa florei microbiene normale a organismului, sunt mai mult decât bine stabilite.
Rolul infecţionistului este, ca pe durata tratamentelor cu antibiotice pentru diverse afecţiuni, să
afecteze cât mai puţin această floră. O primă idee este utilizarea de antibiotice cu spectru cât
mai „ţintit” (îngust), cu efect asupra patogenului respectiv. Pe de altă parte „piatra de
încercare” a medicilor, credem, o reprezintă evitarea tratamentelor antibiotice inutile. Câţi
dintre medici nu recomandă scheme după scheme de medicamente anti-stafilococice doar
pentru că la exsudatul faringian se izolează un stafilococ, fie el chiar şi „auriu”? Mai toţi.
Încercăm „sterilizarea” de acel stafilococ, doar dacă pacientul urmează să primească un
transplant (ex. medular sau hepatic) sau dacă va primi un tratament intens imunosupresor,
altfel nici nu trebuie căutat! Iar pe de altă parte, rămâne o întrebare pe care o punem tuturor
generaţiilor de studenţi cu care lucrăm: în câte dintre cazurile de infecţii stafilococice întâlnite şi
raportate în foile de observaţie pe care le vor vedea este menţionat şi testul coagulazei? Însă,
revenind la subiectul acestui capitol, nu trebuie să uităm niciodată că utilizarea medicamentelor
antibiotice şi chimioterapice, în special a celor cu spectru larg, afectează uneori decisiv flora
microbiană normală a cărei utilitate este în momentul de faţă binecunoscută.
122
Descoperiţi răspunsul corect:
1. Unde există numărul cel mai mare de bacterii comensale?
a. Pe tegumente
b. În intestine
c. În orofaringe
2. Care sunt celulele implicate în ”educarea” sistemului imunitar de către flora intestinală?
a. bacteriile comensale, celulele dendritice, limfocitele T, limfocitele B
b. bacteriile comensale, celulele dendritice din mucoasa intestinală, limfocitele T
c. celulele epiteliale intestinale, limfocitele T, limfocitele B
3. Factorul ce stimulează dezvoltarea florei normale intestinale este:
a. peristaltismul redus
b. antibioticele
c. alăptarea
123
Agenţii cauzali ai bolilor infecţioase (microorganismele condiţionat patogene, dar mai ales
germenii patogeni) sunt foarte numeroşi. Ei se pot împărţi în următoarele grupe mari:
- virusuri = agent patogen care se reproduce numai în interiorul celulelor vii şi care provoacă
boli infecţioase numite viroze;
- chlamydii = bacterii Gram-negative, strict parazite, imobile, care se multiplică în citoplasma
celulelor gazdă printr-un ciclu de dezvoltare caracteristic;
- mycoplasme = cele mai mici microorganisme care pot trăi liber în natură şi care se pot dezvolta
pe medii artificiale îmbogățite;
- rickettsii = microorganisme care au dimensiuni mai mici decât bacteriile; de regulă nu se pot
cultiva în afara celulelor vii;
- bacterii propriu-zise;
- fungi;
- protozoare = grup de organisme unicelulare, din grupul protistelor;
- metazoare.
În ultimii 25-30 de ani se discută din ce în ce mai mult despre rolul jucat de prioni, constituiţi
dintr-o particulă de natură proteică având caracter infecţios, lipsită de acid nucleic, cu potenţial
patogen destul de subtil exprimat. Prionii rezistă la acţiunea a numeroşi factori fizici şi chimici
care inactivează virusurile. Sunt capabili de a se reproduce. Afectează atât oamenii cât şi
mamiferele.
spongiformăSunt implicaţi care
transmisibilă etiologic în maladii
include cu evoluţie
spre exemplu boalalentă, precum encefalopatia
Creutzfeldt-Jacob, insomnia fatală
familială etc, afecţiuni în care sunt prezente leziuni degenerative la nivelul SNC. Pornindu -se de
la encefalopatia spongiformă bovină, începând cu anul 1996 au fost descrise afecţiuni umane,
după consumul de carne de vită; maladia poartă numele de „Creutzfeldt-Jacob noua variantă”.
Principalele manifestări sunt reprezentate de: depresie, anxietate, alterarea ritmului somn-
veghe. La o treime din pacienți, manifestările oculare pot masca demența. Deteriorarea mentală
este rapid progresivă, de la descoperirea simptomelor până la deces trecând în medie 7-9 luni.
(1)
Microorganismul patogen este capabil să colonizeze diferite zone ale gazdei, producând un
proces infecţios în primul rând prin invazia şi penetrarea barierelor dermice şi ale mucoaselor,
multiplicarea ducând la distrucţia tisulară şi invadarea arborelui limfatic şi vascular (sepsis).
Aceste aspecte sunt influenţate în largă măsură de:
- factorii de patogenitate ai microorganismului;
124
Patogenitatea reprezintă capacitatea unui germen de a declanşa în organismul gazdă fenomene
morbide, patogene, modificări locale, generale şi „functio laesa”. Patogenitatea este un atribut
de specie şi este determinată genetic.
Virulenţa reprezintă gradul diferit de patogenitate exprimat în cadrul unei specii. Este un atribut
al tulpinii microbiene agresoare. Variabilitatea în exprimarea patogenităţii depinde de condiţiile
în care trăieşte microorganismul respectiv (de exemplu, o populaţie bacteriană care a pierdut
virulenţa în condiţii nefavorabile poate redeveni virulentă în anumite condiţii, aşa cum se
întâmplă cu tulpina vaccinală BCG la pacienţii cu infecţie HIV / SIDA). Virulenţa poate fi
cuantificabilă de ex. prin numărul de microorganisme necesare în condiţii standard pentru a
omorî 50% dintr-un grup de animale (acest număr este numit DL50, adică doza letală 50%).
Factorii care condiţionează patogenitatea şi virulenţa unei specii (tulpini) microbiene pot fi:
- multiplicarea şi invazivitatea manifestată de germenii patogeni;
- multiplicarea şi elaborarea de toxine de către germenii toxigeni (în general „exotoxine”).
125
Dintre bacteriile implicate în producerea de biofilme amintim: Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, streptococi α şi β hemolitici
etc. (2)
Poate fi luat în discuţie şi „tropismul”, care poate fi specific pentru anumite structuri ale gazdei
[ex. tulpinile de E. coli uropatogene aderă cu ajutorul unei adezine papG (pyelonephritis-
associated pili), numai la anumiţi receptori situaţi la suprafaţa celulelor epiteliale renale] sau ar
putea fi specific de specie (de ex. streptococul piogen din grupul A, meningococul sau gonococul
infectează numai gazda umană).
- pilii comuni (fimbriile), cu rol în aderare. Bacteriile pot produce unul sau mai multe tipuri de
pili, astfel că cele care produc pili specifici, vor fi asociate cu capacitatea de a infecta un anumit
tip de ţesut. De exemplu, E. coli uropatogenă prezintă pili de tip P sau Pap, având tropism
pentru tractul urinar. (3)
- lectinele (proteine care au tropism pentru carbohidraţi);
- liganzii (molecule care realizează legături specifice cu anumite molecule complementare de la
nivelul substratului);
- glicocalixul (componentă structurală externă a polizaharidului de la suprafaţa celulei
bacteriene);
- „noroiul” (un mediu vâscos peribacterian, constând dintr-o subclasă de substanţe polimerice
extracelulare ce conţin în general polizaharide şi mediază ataşarea nespecifică a bacteriilor într -
un strat vâscos);
- capsula (are proprietăţi antifagocitare şi uneori este implicată în aderare, spre ex. în cazul
Streptococcus mutans, cu efecte cario-genetice);
- adezinele (de fapt, toţi factorii enumeraţi mai sus pot fi definiţi drept „adezine”);
- substanţe componente ale peretelui bacterian
- proteina M a streptococului beta-hemolitic de grup A (Figura nr. 2); Proteina M este un dimer
ancorat în membrana citoplasmatică, ce va proemina la suprafaţa peretelui bacterian,
măsurând de la acest nivel 50-60 nm. Aceasta are rolul de a împiedica fagocitoza sau
opsonizarea de către PMN, în lipsa anticorpilor specifici; anticorpii se vor lega la capătul variabil
N-terminal al dimerilor.
- antigenul Vi de suprafaţă al unor bacili Gram-negativi (de exemplu, Salmonella typhi etc).
Antigenul Vi este un polizaharid capsular ce are capacitatea de a împie dica acţiunea
anticorpilor, are proprietăţi antifagocitare şi creşte rezistenţa la peroxid. Serotipurile care
prezintă acest antigen sunt: Typhi, Paratyphi C şi Dublin. Unele tulpini de Citrobacter freundii
produc un compus asociat bacteriei identic cu Vi al primelor două serotipuri, fiind sursa ideală
de antigen Vi, necesar preparării antiserului.
- polizaharidul A al S. aureus (un acid teichoic);
- antigenul O al bacteriilor Gram-negative (Figura nr. 3); Antigenul O face parte din
lipopolizaharid/lipooligozaharid (LPZ/LOZ), structură ce are rolul de a proteja bacteria de enzime
ce au capacitatea de a degrada peptidoglicanul (de exemplu, lizozimul) şi oferă rezistenţă
împotriva sărurilor biliare, complementului (diminuând activitatea MAC – membrane attack
complex) şi fagocitozei; prezintă şi activitate mitogenă, stimulând diferenţierea policlonală şi
multiplicarea limfocitelor B, determinând astfel secreţia de imunoglobuline, precum IgM şi IgG.
126
LPZ cuprinde 3 regiuni: lipidul A (regiunea I), o porţiune centrala rugoasă polizaharidică
(regiunea II) şi polizaharidul O / antigenul O (regiunea III).
- antigenele de tip K (cu structură polizaharidică sau polipeptidică - pentru Bacillus anthracis)
etc.
În ceea ce priveşte procesul aderenţei, se cunoaşte faptul că orice obiect aflat în imersie atrage
particulele suspendate, inclusiv microorganismele, la suprafaţa lui. Teoria coloidală DLVO (după
numele autorilor) menţionează că la nivelul suprafeţei de imersie există 2 poziţii de stabilitate
termodinamică, prin intervenţia gravitaţiei, chemotaxiei, forţelor de tip van der Waals, forţelor
electrostatice şi tensiunii superficiale (Schema nr. 1).
Contrabalansarea forţelor de atracţie şi repulsie conduce la împingerea dezordonată a
particulelor spre un „minim secundar”, poziţie ce se situează la suprafaţa de imersie. Acest
„minim secundar” corespunde fenomenului de adsorbţie sau reţinere (docking), proces
reversibil.
Ulterior sunt implicate şi alte forţe de legătură (covalente, de hidrogen, ionice, hidrofobe) care
vor duce la atingerea „minimumului primar”, când particulele devin legate ireversibil de
substrat. Aderenţa se produce atunci când particulele părăsesc „minimumul secundar” şi intră
în „minimumul primar”. Pentru unele bacterii (ex. V. cholerae, unele tulpini de E. coli, B.
pertussis, Helicobacter pylori) ataşarea este destinaţia finală, în timp ce pentru altele (ex.
Salmonella, Shigella, Yersinia) reprezintă doar o etapă, urmând penetrarea tisulară şi / sau
diseminarea în organism.
127
2. lecitinaza (distruge lecitina din structura membranei celulare, de exemplu Clostridium
perfringens, Bacillus anthracis);
5. proteaze, nucleaze ( DN-aze, RN-aze – cu activitate endo- şi exonucleazică asupra ADN şi ARN,
generând 3’-nucleotide), carbohidraze, lipaze etc;
6. hemolizine sunt enzime ce lizează hematiile din mediile de cultură cu sânge (streptococ,
stafilococ, unele clostridii) etc.
Germenii se multiplică la poarta de intrare şi elaborează exotoxine care produc alterări celulare
şi distrucţii tisulare la distanţă, prin inhibarea metabolismului celulei eucariote şi prin „functio
laesa” („toxikon” era otrava în care erau înmuiate săgeţile luptătorilor greci). Din punct de
vedere didactic trebuie menţionate următoarele noţiuni:
128
Exotoxinele sunt elaborate în general de microbi Gram-pozitivi lizogenizaţi (de exemplu bacilul
difteric, streptococul beta hemolitic de grup A, Clostridium botulinum) sau codificat plasmidic
(Clostridium tetani, Bacillus anthracis), dar şi de bacili Gram-negativi, prin mecanism
cromozomial (V. cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas aeruginosa) sau
sub control plasmidic (unele tulpini de E. coli). (Tabelul nr. 2)
Au structură proteică, fiind formate dintr-un domeniu B (bind) obligatoriu, necesar legării de
receptorii celulei gazdă şi internalizării ulterioare a porţiuni enzimatice A (active). Exotoxina nu
îşi exercită efectele toxice decât după ce porţiunea A este eliberată din structura iniţială. Sunt
secretate în timpul vieţii germenilor. Sunt difuzibile la distanţă. Toxicitatea lor este foarte mare,
doza letală fiind de circa 0,1 µg/kg corp (până la 1 ng/kg corp în cazul toxinei botulinice).
Au afinitate diferită în funcţie de specia care le-a elaborat (de exemplu pentru miocard, SNC,
rinichi în cazul bacilului difteric). Manifestările clinice apar după o perioadă de latenţă (când
toxina este deja fixată pe celulele ţintă).
Multe din bolile produse pot fi considerate toxiinfecţii şi reprezintă urgenţe medicale, toxina
putând fi neutralizată numai dacă este liberă în circulaţie.
Au putere antigenică mare, faţă de ele apărând anticorpi antitoxină.
Un alt exemplu important privind exotoxinele se referă la Tcd A şi Tcd B, produse de Clostridium
difficile și care acţionează asupra celulelor intestinului gros, fiind responsabile de o boală
diareică uşoară, până la colită fulminantă. Ele produc la acest nivel leziuni microscopice, dar şi
leziuni mari, asemănătoare unor plăgi; endoscopic, se vor identifica noduli.
Prin degradarea proteinelor Rho, Rac şi Cdc 42, responsabile de reglarea proceselor structurale
dependente de polimerizarea actinei, se poate observa la microscopul electronic alterarea
microfilamentelor de actină, rezultând marginalizarea nucleului, schimbări în morfologia
citoscheletului, dar şi alte modificări (alterarea suprafeţei celulare şi rearanjarea microvililor).
(Figura nr. 5)
Astfel, modificările produse de toxinele Tcd A şi Tcd B sunt: inflamaţia, creşterea permeabilităţii
ţesutului epitelial intestinal, stimularea producerii de chemokine şi citokine, acumularea de
neutrofile, producerea intermediarilor reactivi ai oxigenului, activarea mastocitelor, producerea
substanţei P, distrugerea directă a mucoasei intestinale, ruperea joncţiunilor strânse (Zonula
occludens), degradarea actinei F. Substanţa P este responsabilă de: activarea neuronilor din
submucoasă, eliberarea TNF-α, activarea macrofagelor din lamina propria; este implicată în
diareea inflamatorie.
129
de antitoxină). O alternativă ar fi administrarea de imunoglobuline umane specifice, dacă
acestea sunt disponibile.
Exotoxinele pot fi detoxifiate într-un anumit interval de timp sub acţiunea conjugată a
temperaturii şi formolului. Prin acest procedeu îşi pierd puterea toxică, dar îşi menţin puterea
imunogenă şi devin anatoxine. Anatoxinele se utilizează în profilaxia bolilor produse de germenii
respectivi (în cadrul vaccinurilor DTP, DT, dT, ATPA, ADPA etc), precum şi pentru
hiperimunizarea animalelor în scopul obţinerii de seruri antitoxice (antidifteric, antitetanic,
antibotulinic etc).
130
Apărarea organismului faţă de infecţii se realizează prin diferite mijloace nespecifice şi specifice.
Acestea exprimă împreună capacitatea normală de păstrare a homeostaziei organismului prin
rezistenţa faţă de aderarea microorganismelor de celulele ţesuturilor expuse, faţă de
colonizarea şi multiplicarea germenilor în organism, prevenind invazia agenţilor patogeni.
Principalele componente ale apărării antiinfecţioase sunt reprezentate de:
- Bariera hematoencefalică: este o barieră fiziologică între sistemul sangvin și sistemul nervos
central (SNC). Aceasta servește la menținerea unei homeostazii constante în SNC. Această
barieră are rolul de filtru, împiedicând pătrunderea în creier a unor substanțe toxice, germeni
patogeni, care se pot afla în sânge. În același timp bariera permite pătrunderea din sânge a
substanțelor nutritive necesare SNC.
- Tractul respirator: particulele inhalate pot supravieţui filtrării în tractul respirator superior şi
traheobronșic. Fluxul turbulent determină depunerea particulelor de dimensiuni mari la nivelul
mucusului tractului respirator, iar sistemul mucociliar le îndepartează din plămani. Efortul de
131
tuse ajută la eliminare. Secreţiile bronşice conţin substanţe precum: lizozim, β-defensine,
lectine. Când particulele inhalate ajung la nivelul alveolelor îndepărtarea este realizată de
macrofage şi histiocite. Toate aceste mecanisme de apărare pot fi învinse de microorganisme
prin cantitatea acestora sau prin expunere îndelungată. Poluarea aerului, prezenţa
traheostomei, agenţii ”alergici”, defectele genetice etc. pot diminua mecanismele de apărare
ale tractului respirator.
- Tubul digestiv: Bariera acestuia este reprezentată de aciditatea gastrică şi rolul antibacterian al
diferitelor enzime (pancreatice, intestinale, biliare). Peristaltismul şi descuamarea celulelor
epiteliale au şi ele rol în apărarea antimicrobiană. Salmonella spp. şi M. tuberculosis produc
infecţii la persoanele cu aclorhidrie, iar peristaltismul încetinit favorizează infecţia cu Shigella
spp. Pierderea joncţiunilor strânse dintre enterocite poate favoriza translocarea bacteriilor în
circulaţie.
- Tractul genitourinar: urina este în mod normal sterilă. Factorii care împiedică colonizarea
bacterienă sunt pH-ul, ureea, hipertonicitatea, glicoproteina Tamm-Horsfall (produsă de rinichi
şi excretată în cantitate mare în urină). Glicoproteina Tamm-Horsfall acţionează ca un burete,
bacteriile leagându-se de aceasta şi astfel împiedicând colonizarea ţesuturilor. Tractul urinar
inferior este spălat de fluxul urinar de 4-8 ori pe zi, eliminând organismele patogene. Retenţia
urinară este una dintre principalele cauze ale infecţiilor urinare.
132
- complexul major de histocompatibilitate (MHC); Link Capitolul 12
- imunitatea de specie (naturală, înnăscută);
- factorii nutriţionali (vitamine, fier, zinc etc): Scăderea fierului seric poate fi rezultatul
răspunsului inflamator. Bacteriile necesită fier pentru creștere. Transferina are rol în legarea
fierului şi transportarea sa în macrofage, scăzând astfel, cantitatea de fier pe care o pot folosi
bacteriile. Nivelul de zinc scade în timpul inflamaţiei. Acesta grăbeşte vindecarea rănilor, are rol
în sinteza proteică şi creşte responsivitatea limfocitelor. Persoanele malnutrite sunt predispuse
la infecţii severe. Cele mai importante vitamine (din acest punct de vedere) sunt vitaminele A şi
D. Anecdotic, anterior descoperirii ”tuberculostaticelor”, tuberculoza se trata prin dietă;
pacientul consuma până la 30 de ouă zilnic.
- factorii endocrini: vasopresina, insulina, glucagonul cresc cantitativ. Catabolismul proteic
produce aminoacizi care ulterior vor fi folosiţi la sinteza celulelor de apărare şi a proteinelor.
Estrogenii au rol în protecţie la nivel vaginal. Activitatea limfocitelor T este inhibată în timpul
sarcinii, astfel pot apărea infecţii severe cauzate de virusul poliomielitei, streptococii β
hemolitici de grup A, N. gonorrhoeae mai ales până în trimestrul al III-lea de sarcină.
- factori genetici: Susceptibilitatea, mortalitatea şi morbiditatea legate de infecţie sunt
influenţate de bagajul genetic. Cauzele pentru această susceptibilitate crescută sunt
polimorfismul genetic, defecte ale componentelor complementului, citokinelor, chemokinelor
sau ale receptorilor acestora.
- stresul: Stresul creşte susceptibilitatea organismului la infecţii.
- sistemul nervos central.
133
Testele de laborator efectuate (procalcitonină, proteina C reactivă) au fost intens pozitive.
Culturile din aspiratul gastric şi materii fecale au evidenţiat prezenţa E. coli. Hem ocultura a fost
negativă, ceea ce nu este surprinzător în contextul în care nou-născutul a primit tratament cu
antibiotice anterior recoltării probelor.
Pe parcursul următoarelor zile, copilul a dezvoltat simptome clinice şi paraclinice de CID
(coagulare intravasculară diseminată): sângerări la locurile de injectare, hemoragie pulmonară,
trombocitopenie, timp parţial de tromboplastină şi timp de protrombină crescute,
hipofibrinogenemie, prezenţa în cantitate mare a produşilor de degradare ai fibrinei). S -a
instituit terapia de urgenţă cu imipenem şi gentamicină (la care E. coli se dovedise a fi sensibil),
cu plasmă proaspăt congelată şi cu concentrat trombocitar. Starea copilului nu s-a ameliorat
sub tratament, hemoragia pulmonară agravându-se. S-a efectuat, ca ultimă alternativă, o
transfuzie de sânge izogrup şi s-a recurs la ventilaţie asistată în sistem IPPV – Intermittent
Positive Pressure Ventilation. Evoluţia copilului a fost în continuare nefavorabilă, hemoragia
pulmonară continuând să se agraveze şi ducând în final la stop cardiorespirator ireversibil la
manevrele de resuscitare.
Nou-născutul a decedat după 10 zile din cauza sindromului de CID.
Discuţii
Sursa infecţiei cu E. coli nu a putut fi precizată cu certitudine (medicii au suspicionat, totuşi, c a
sursă cea mai probabilă, lichidul amniotic infectat al mamei).
Detresa respiratorie, ventilaţia asistată şi cateterizarea venoasă centrală au constituit factori de
risc major în producerea enterocolitei ulceronecrotice. Necroza ţesutului intestinal a favorizat
diseminarea pe cale sanguină a E. coli existent la acel nivel. Astfel, s -a instalat sepsisul neonatal,
care s-a complicat ulterior cu CID.
Complexitatea cazului, prin multitudinea complicaţiilor apărute, a fost un factor de gravitate
care a condus în final la decesul copilului.
134
Examenul CT abdomino-pelvin evidențiază un abces la nivelul iliopsoasului de 6,6 pe 8,5 cm, iar
pe IRM-ul de coloană lombară se observă osteomielită la nivelul corpului vertebral L5 și a
procesului stâng transvers.
Abcesul a fost drenat, iar în culturi a crescut Staphylococcus aureus meticilino-rezistent.
Culturile în anaerobioză au fost negative. Hemoculturile nu s-au pozitivat.
A efectuat 6 săptămani tratament parenteral cu vancomicină, urmată 2 săptămâni de tratament
cu linezolid per os datorită dorinței pacientului de a merge la muncă. A primit apoi Biseptol încă
8 săptămâni.
După terminarea tratamentului VSH-ul a scăzut la 14 mm/h, cu o Proteină C Reactivă 0,7 mg/dl.
La 6 luni nu s- au înregistrat recăderi.
În afară de identificare bacteriei și antibiogramă s-a efectuat și latex aglutinare pentru
evidențierea PB2 (protein binding 2). Cu ajutorul tehnicii PCR a fost detectată fracțiunea genică
responsabilă de sinteza leucocidinei Panton-Valentine. (5)
135
1. Prionii sunt constituiţi din:
A. ADN-înveliş proteic
B. ARN-înveliş proteic
C. o particulă proteică
D. miez glucidic + înveliş proteic
3. Biofilmul:
A. reprezintă o populaţie bacteriană aparținând unei specii
B. cuprinde bacterii ce aderă doar între ele
C. se poate dezvolta pe un cord transplantat
D. cuprinde bacterii sensibile la penicilină
E. cuprinde bacterii și polimeri extracelulari
1. Gerald L. Mandell, John E. Bennett, Raphael Dolin, 2009, Principles and Practice of
Infectious Diseases, 7th edition, 37-47, 2423-2435.
2. Topley, Wilson, 2006, Microbiology and Microbial Infections 10th edition
3. Gerald L. Mandell, John E. Bennett, Raphael Dolin, 2005, Principles and Practice of
Infectious Diseases, 6th ed., 20-23
4. Dehority W., E. Wang, P. S. Vernon, C. Lee, F. Perdreau-Remington, and J. Bradley,
2006, Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus necrotizing fasciitis in
a neonate, Pediatr. Infect. Dis. J., 25, 1080-1081
136
5. Salliot C., V. Zeller, X. Puechal, V. Manceron, S. Sire, N. Varache, J. Etienne, N.
Desplaces, J. M. Ziza, 2006, Panton-Valentine leukocidin-producing Staphylococcus aureus
infections: report of 4 French cases, Scand. J. Infect. Dis., 38, 192-195
6. Linares L., C. Cervera, F. Cofán, M. J. Ricart, N. Esforzado, V. Torregrosa, F.
Oppenheimer, J. M. Campistol, F. Marco, and A. Moreno, 2007, Epidemiology and outcomes of
multiple antibiotic-resistant bacterial infection in renal transplantation, Transplant. Proc., 39,
2222-2224
137
Imunologia este o ştiinţă care a apărut relativ recent, iniţial ca un domeniu al Microbiologiei,
studiind mecanismele de apărare a organismelor (uman şi animal) faţă de agresiunea din cursul
procesului infecţios.
În Imperiul Roman „immunitas” însemna scutirea de anumite obligaţii.
În primul secol după Iisus Christos, descriind rezistenţa la veninul unor şerpi veninoşi, Lucanus a
considerat că „immunitas” înseamnă „scutit de a te îmbolnăvi”.
Observaţiile medicului englez Edward Jenner privind faptul că o parte dintre persoanele care
mulgeau vacile nu s-au îmbolnăvit în cursul epidemiei de variolă, dar şi faptul că pustulele care
apăreau pe ugerul vacilor, ca şi pe tegumentul mâinii persoanelor care mulgeau se asemănau,
au dus la concluzia că între aceste fenomene există o legătură. În 1796, Jenner a realizat una
dintre primele experienţe pe om (a inoculat secreţie din pustulele de la vaci la un copil; ulterior
a inoculat secreţie de la pacienţi cu variolă, iar copilul se pare că nu s-a îmbolnăvit de variolă).
Cu toate acestea, reacţiile în „mass-media” vremii nu au întârziat să apară. (Figura nr. 1) –vacile
din poza de la RM
Imunologia a fost fundamentată de studiile realizate de către marii cercetători Pasteur şi
Metchnikoff. Louis Pasteur a „vaccinat” găini împotriva holerei aviare, a „vaccinat” oi împotriva
antraxului şi a reuşit prevenirea infecţiei cu virusul rabic. Pasteur a decis să denumească
procedeul de inoculare cu germeni atenuaţi, urmat de protecţia faţă de boală, vaccinare
(probabil pentru că Jenner a obţinut primele sale rezultate recoltând şi inoculând produsul
obţinut de la vaci). Ilia Metchinikoff a descoperit fagocitoza. Emil von Behring şi S. Kitasato au
studiat fenomenul prin care se obţin antitoxinele şi ulterior au realizat experimentele c are au
stat la baza seroterapiei. Despre hipersensibilitate a început să se discute în 1902, iar termenul
de histocompatibilitate este cunoscut din 1946. Aceste studii şi multe altele, care ar merita
dedicarea unui volum întreg, mult amplificate în deceniile care au urmat sunt mai departe „în
continuă mişcare”, cu numeroase descoperiri chiar şi în prezent.
Relaţia între organismul gazdă şi sistemul imun (organe, celule, anticorpi, citokine etc) ar putea
fi asemănată cu relaţia stabilită între o ţară şi armata ţării respective, cu sisteme de control,
sisteme de comandă, reacţii „la nevoie” (uneori în „regim de urgenţă”) în care există implicare
importantă şi din partea altor sisteme (nervos, endocrin). Mai mult decât în exemplul privind
situaţia la nivelul unei ţări, „soldaţii” din sistemul imun (de ex. LT citotoxice, celulele NK) pot
avea atât o activitate efectoare cât şi de control şi retro-control (îşi „depăşesc” limitele de
„simpli soldaţi”).
S-ar putea ridica o întrebare şi anume: de ce avem nevoie de un sistem imunitar?
Să nu uităm faptul că în fiecare zi organismul nostru se întâlneşte cu nenumărabile
microorganisme: bacterii, virusuri, paraziţi etc. Unele microorganisme nu ne afectează în nici un
mod, altele au efecte benefice faţă de organismul nostru, în timp ce o mare parte dintre
microorganisme pot duce la apariţia unor îmbolnăviri. În acest context, sistemul imun „a fost
nevoit” să găsească modalităţi prin care să „lupte” împotriva microorganismelor patogene şi
condiţionat patogene.
Mai mult decât atât, chiar şi substanţe străine (non-self) neinfecţioase dar şi structuri proprii
modificate pot duce la un răspuns imun. S-a demonstrat şi faptul că mecanisme care în mod
normal protejează organismul de eventualele infecţii pot fi implicate în determinar ea unor
leziuni tisulare sau de organ.
138
Având în vedere toate aceste aspecte (dorim să subliniem faptul că realitatea este cu mult mai
complexă), o definiţie a imunităţii ar putea fi următoarea: imunitatea reprezintă o reacţie faţă
de orice structură non-self (fie microorganism sau o substanţă străină de tipul unei
macromolecule proteice, glicoproteice etc) sau faţă de o celulă sau structură proprie care a
suferit modificări.
Informaţiile privind sistemul imun sunt prezentate în cadrul mai multor catedre şi discipline.
Având drept ţintă o cât mai bună înţelegere a capitolelor pe care ne-am gândit să le introducem
în „Manualul de Microbiologie” dorim să facem o scurtă „trecere în revistă” a organelor,
celulelor, moleculelor şi mecanismelor implicate în imunitate.
Menţionăm faptul că nu veţi găsi aici toate definiţiile şi explicaţiile; pentru aceasta cititorul va
trebui să parcurgă fiecare capitol în parte. Etapele pe care le descriem au doar scop didactic; în
realitate fenomenele se petrec simultan şi sunt mult mai complexe decât pot fi explicate într-un
„simplu manual” sau chiar şi decât ar putea fi acestea explicate de oamenii de stiinţă, în acest
moment. Ceea ce noi cunoaştem este, de fapt, „o picătură într-un ocean”.
Astfel, ne propunem să luăm ca exemplu un microorganism oarecare - un antigen. în cazul în
care acesta reuşeşte să depăşească barierele naturale ale organismului (piele, mucoase etc) şi
să pătrundă în ”gazdă”, următoarea linie de apărare este reprezentată de imunitatea înnăscută.
Fagocitele reprezentate spre exemplu de macrofage şi granulocite recunosc microbii de orice fel
(recunoaşterea nu este specifică) şi încep procesul de fagocitoză. Apare şi răspunsul inflamator.
Ulterior intră în acţiune imunitatea adaptativă care se manifestă cu ajutorul limfocitelor.
Aceasta din urmă este specifică deoarece dezvoltă în timp (cateva zile) celule şi molecule
specifice pentru a „lupta” strict împotriva acestui antigen.
O altă deosebire majoră între cele două tipuri de imunitate este reprezentată d e capacitatea
limfocitelor de a se transforma în limfocite cu memorie după întâlnirea cu un anumit antigen.
Astfel, spre deosebire de macrofage şi granulocite, la o a doua întâlnire cu acelaşi antigen,
limfocitele îl vor recunoaşte iar procesul de apărare se va declanşa mult mai rapid.
Explicând puţin mai în în profunzime (menţionăm că explicaţii mai detaliate vor fi furnizate în
capitolul 11 şi în alte capitole care urmează) avem în vedere faptul că antigenul pătruns în
organism este captat de către celulele prezentatoare de antigen (APC) (macrofage, celule
dendritice, limfocite B etc).
Antigenul nu poate fi recunoscut ca atare de către sistemul imun deoarece doar o anumită
parte a lui numită epitop prezintă proprietatea de imunogenicitate la valoare maximă şi poate
declanşa un răspuns imun. Antigenul este endocitat de către APC, prelucrat în lizozomi iar
epitopii rezultaţi vor fi prezentaţi limfocitelor în complex cu moleculele sistemului major de
histocompatibilitate (MHC). MHC include molecule prezente pe celulele organismului uman
(vezi capitolul 12). Limfocitele vor declanşa un răspuns imun.
Există două tipuri principale de limfocite şi anume limfocitele T şi limfocitele B, după cum există
două tipuri de răspuns imun, umoral şi celular. Limfocitele T secretă citokine care pot activa
oricare din cele două tipuri de răspuns imun iar limfocitele B (după proliferare şi blastizare)
secretă imunoglobuline (anticorpi) implicate în răspunsul imun umoral.
Antigenele pot fi clasificate în mai multe grupe: exogene/endogene, timodependente/
timoindependente etc.
Răspunsul imun umoral este declanşat de antigene exogene timodependente şi independente
prezentate pe MHC II, iar răspunsul imun celular este declanşat de antigene endogene
timodependente prezentate pe MHC I.
139
În cazul în care ne întrebăm: cine produce aceste celule şi unde se desfăşoară răspunsul imun?
O parte a explicaţiei ar include existenţa organor limfoide primare precum măduva osoasă
hematogenă (sediul producerii limfocitelor T şi B şi maturării limfocitelor B) şi timusul (sediul
maturării limfocitelor T) şi organe limfoide secundare precum pulpa albă a splinei unde se
desfăşoară răspunsul imun umoral şi este iniţiat cel celular care se desfăşoară apoi la locul
infecţiei şi ganglionii limfatici (vezi şi capitolul 10).
Sistemul imun se poate confrunta cu o mare problemă, şi anume, aceea de a menţine balanţa
între un răspuns imun eficace şi limitarea apariţiei de leziuni tisulare (în cadrul unui RI exagerat).
Când această balanţă „se rupe” apar bolile autoimune şi stările de hipersensibilitate.
Povestire adevărată: Povestea vaccinului
Edward Jenner s-a născut pe data de 17 mai 1749 în Berkeley, Gloucestershire. Înca de mic el a
fost interesat de ştiinţe şi natură. Pe atunci circula zvonul cum că lăptăresele su nt protejate de
variolă, zvon pe care l-a auzit şi el.
La 21 ani a plecat în Londra şi a devenit studentul lui John Hunter, cel mai renumit chirurg din
Anglia şi un respectat şi cunoscut biolog şi anatomist. Între cei doi s-a închegat o prietenie
adevărată. Jenner a studiat geologia şi a făcut mai multe experimente cu sânge uman. A câştigat
experienţă în biologie şi bineînţeles, în chirurgie.
De-a lungul anilor, Jenner a tot auzit zvonul că lăptăresele erau protejate de variola. Punând
lucrurile în balanţă, Jenner a concluzionat că forma de ”variolă” făcută de vaci ar putea avea o
oarecare legătură cu un posibil mecanism de protecţie. În mai 1796 a găsit o tânără lăptăreasă,
Sarah Nelms, care avea leziuni nou apărute datorită ”variolei vacilor” pe mâini şi braţe. Pe data
de 14 mai 1796 a inoculat material din leziunile ei la băiatul unui servitor în vârstă de 8 ani,
James Phipps. Ulterior, băiatul a prezentat febră şi discomfort în zona axilară. La 9 zile a
prezentat simptomele unei răceli şi şi-a pierdut apetitul dar ziua următoare era iar bine. În iulie
1796 Jenner l-a inoculat iar pe băiat, de data aceasta cu material dintr -o leziune nou apărută de
variolă umană. Baiatul nu a dezvoltat boala aşa că Jenner a concluzionat că acesta era protejat
complet.
În 1797, Jenner a trimis un scurt comunicat spre Societatea Regală descriind experimentul şi
observaţiile sale. Totuşi, lucrarea a fost respinsă. În 1798, după ce a mai experimentat pe câţiva
oameni, Jenner a publicat o mică carte numită “O incursiune în cauzele şi efectele vaccinului
antivariolic, o boală descoperită în unele din ţările vestice ale Angliei, mai ales în Gloucestershire
şi cunoscută sub numele de variola vacilor”.
Cuvântul latin pentru vacă este “vacca” iar pentru variola vacilor este “vaccinia”. Jenner a decis
să denumească această nouă procedură vaccinare. În 1798 publicaţia avea trei părţi. În prima
parte Jenner prezintă viziunea sa legată de variola vacilor ca o boală a cailor transmisă la vaci.
Teoria a fost infirmată în timpul vieţii lui Jenner. Apoi a prezentat ipoteza că infecţia cu variola
vacilor protejează de infecţia cu variolă umană. În cea de-a doua parte sunt continuate
observaţiile critice relevante pentru testarea ipotezei sale. A treia parte a fost o discuţie lungă,
în parte polemică, legată de descoperirile şi problemele variate legate de variolă. Reacţiile la
această publicaţie au fost din cele mai diverse.
Jenner a plecat la Londra în căutare de voluntari pentru vaccinare. După trei luni nu găsise nici
măcar unul singur. El a pornit un studiu la nivel naţional în căutarea persoanelor care prezintă
rezistenţă la variolă în rândul celor care făcuseră variola vacii. Rezultatul acestui studiu i -a
confirmat teoria. În ciuda erorilor şi controverselor nenumărate folosirea vaccinării s -a răspândit
rapid în întreaga Anglie şi până în 1800 a atins majoritatea ţărilor Europene (Jenner a vaccinat în
140
1801 populaţia din Cluj şi Târgu Mureş, apoi această procedură s-a extins în întreaga ţară în
următorii 31 de ani (1).
Deşi a fost apreciat la nivel mondial şi i s-au acordat multe onoruri, Jenner nu a avut intenţia să
se îmbogăţească. În 1802, Parlamentul Britanic i-a oferit suma de £10,000 pentru descoperirea
sa, iar cinci ani ulterior i-a oferit înca £20,000. Pe de alta parte, el a fost şi subiectul ridiculei şi
atacurilor, nu doar al onorurilor. În ciuda acestor lucruri el şi-a continuat activităţile în slujba
vaccinării.
Lucrarea lui Jenner reprezintă prima încercare ştiinţifică de control a bolilor infecţioase prin
folosirea deliberată a vaccinării. Totuşi, nu el este cel care a descoperit vaccinarea, dar a fost
primul care a oferit un status ştiinţific acestei proceduri. Benjamin Jesty este cel care a vaccinat
primul împotriva variolei.
La sfârşitul secolului XIX s-a descoperit că vaccinarea nu conferă imunitate pentru toată viaţa şi
de aceea este nevoie de revaccinare. Mortalitatea datorată variolei era în scădere, dar
epidemiile arătau că boala încă nu era ţinută sub control. În 1950 s -au implemantat mai multe
măsuri de control şi variola a fost eradicată în mai multe zone ale Europei şi America de Nord.
Procesul de eradicare la nivel mondial al variolei a fost discutat atunci când Adunarea Mondială
a Sănătăţii a primit un raport, în 1958, legat de consecinţele catastrofale ale variolei în 63 de
ţări. În 1967 s-a început o campanie globală condusă de Organizaţia Mondială a Sănătăţii care a
dus la eradicarea variolei în 1977. În data de 8 mai 1980 Adunarea Mondială a Sănătăţii a
anunţat că lumea nu mai are variolă şi a recomandat ca toate ţările să înceteze vaccinarea. (2)
Nu am dorit să povestim totul legat de vaccinare în cadrul acestui capitol, ci doar să vă
introducem puţin în povestea acestei tehnici pentru a arăta evoluţia lucrurilor şi efectul benefic
pe care l-a avut această descoperire în întreaga lume. Aşa cum se ştie, vaccinarea rămâne
momentan singura metoda cu cel mai bun raport cost-eficienţă. Pe această cale dorim să
sensibilizăm studenţii la medicină şi cititorii acestei cărţi în ceea ce priveşte vaccinarea şi să
infirmăm teoriile greşite care au circulat și continuă să circule în ultimul timp.
1. Mihancea N., 1979, History of smallpox vaccination in Romania and source of the IC strains of
vaccinia virus, Rev Ig Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol Pneumoftiziol Bacteriol Virusol
Parazitol Epidemiol., 24(4), 247-52
2. Riedel S, 2005, Edward Jenner and the history of smallpox and vaccination, Proc. (Bayl Univ
Med Cent), 18(1), 21-25.
141
După secvenţa de intrare în funcţie şi rolul deţinut, se descriu trei tipuri de organe imune: stem,
primare şi secundare. (Tabelul nr. 1)
Organele care conţin celulele stem hematopoietice sunt active de-a lungul vieţii embrionare şi
fetale, într-o anumită succesiune. În primele săptămâni de viaţă, ele sunt situate în mezodermul
intra-embrionar şi extra-embrionar (sacul vitelin). La făt, celulele stem migrează şi se localizează
la nivel hepatic. În cea de-a zecea săptămână de viaţă intrauterină, apar primele celule stem în
os. după cea de-a 20-a săptămână, la fătul uman, hematopoieza devine exclusiv medulară.
Teritoriul hematopoietic (MOH) se reduce odată cu vârsta: la copil, toate oasele au funcţie
hematopoietică; la adult, teritoriul hematopoietic se restrânge la oasele trunchiului şi bazinului,
atingând un volum de circa 5 litri la un subiect de 60 kg; la persoanele vârstnice, funcţia
hematopoietică se menţine la nivelul sternului, vertebrelor şi al oaselor coxale.
organele limfoide primare, numite şi centrale, sunt situate în afara căilor de acces şi circulaţie
antigenică. În aceste organe diferenţierea apare precoce, în viaţa embrionară, înaintea celor
secundare. Proliferarea limfocitară este intensă şi independentă de stimularea antigenică.
Organele limfoide primare au următoarele roluri:
·hematogenă
permit multiplicarea
/ bone marrowlimfocitelor T (timodependente) şi B (dependente de măduva roşie
- la mamifere).
· găzduiesc primele stadii de diferenţiere, până la limfocitele T sau B mature, apte să
recunoască structurile antigenice şi să fie stimulate de antigene.
· efectorii imuni „învaţă” la acest nivel să recunoască şi să tolereze constituenţii propriului
organism (auto-recunoaştere şi toleranţă faţă de „self”).
142
Un limfocit T sau B matur care a părăsit timusul, respectiv măduva osoasă hematogenă, nu mai
revine niciodată la acest nivel, cele două organe fiind în afara căilor de recirculare a limfocitelor
antigen-specifice din organele limfoide secundare.
143
molecule CD2, CD3, CD4, CD8 şi TCR. Urmează o dublă selecţie, pozitivă şi negativă. În selecţia
pozitivă, timocitele care recunosc antigenele străine fixate pe moleculele MHC pot prolifera
(timocitele CD4+ recunosc moleculele MHC clasa II, timocitele CD8+ recunosc moleculele MHC
clasa I), în timp ce acele limfocite care nu şi-au dezvoltat receptori pentru antigene sunt
distruse. În selecţia negativă, timocitele care recunosc structurile self sunt distruse, eliminându-
se astfel timocitele puternic autoreactive, care ar conduce la apariţia unor fenomene autoimune
imediat după naştere. În timus are loc multiplicarea, diferenţierea şi selecţia limfocitelor T. Tot
la nivel timic are loc producerea celulelor de control, cu rol în prevenirea bolilor autoimune
(experienţele realizate prin înlocuirea limfocitelor proprii cu limfocite de la persoane sănătoase
a dus, pentru un timp, la dispariţia semnelor de boală, dovedind astfel existenţa acestor celule
timice). (Figura nr. 2)
· se realizează prin factorii timici peptidici umorali (timostimulina,
timopoietinele, timozinele, factorul umoral timic etc). Aceşti factori au funcţii diverse, unii
dintre ei influenţând diferenţierea limfocitelor T în ariile timodependente din organele limfoide
periferice. Acţionează atât la nivelul timusului cât şi la distanţă. Câteva informaţii despre factorii
timici:
Timozina are efecte asupra limfocitelor T, stimulându-le activitatea citotoxică şi crescând sinteza
de IL-6. In vivo, stimulează LH şi GnRH, iar in vitro Prolactina şi GH.
Timostimulina necesită Zn pentru a acţiona. Are efect asupra dezvoltării pro timocitelor în MOH.
Factorul umoral timic induce producerea de IL-2 (are potenţial antiviral).
Timopoietina intervine în procesul de diferenţiere a limfocitelor T.
144
Dezvoltarea organelor limfoide secundare, numite şi periferice sau efectoare, este tardivă faţă
de cea a organelor limfoide primare, atingând dezvoltarea deplină numai după stimularea
antigenică. Amintim ca exemple de organe limfoide secundare: ganglionii limfatici, splina şi
organele limfoide ataşate sistemului digestiv (apendice, amigdale, plăci Peyer) etc. La nivelul
acestor organe se cantonează limfocitele T provenite din timus şi limfocitele B provenite din
măduva osoasă hematogenă, migrate pe calea torentului circulator. În organele limfoide
secundare, aceste celule se vor activa în urma contactului cu antigenele.
În anumite zone ale organelor limfoide secundare, precum cele din ganglionii limfatici sau din
splină, se găsesc grupuri de celule, constituite în special din limfocite B, denumite foliculi sau
noduli limfatici. Înaintea stimulării antigenice, aceşti foliculi primari sunt în repaus, cu limfocite
mici apropiate unele de altele, determinând un aspect dens, caracteristic. Aceste limfocite
mature sunt denumite „naive”, deoarece nu au avut contact cu antigenul. După circa 3 -6 zile de
la stimularea antigenică, foliculii primari se transformă în foliculi secundari, cu un centru
germinativ clar, înconjurat de o zonă mai întunecată. În jurul foliculului există o zonă marginală
puţin vizibilă, constituită din limfocite B cu memorie. Foliculul secundar persistă câteva
săptămâni după care redevine folicul primar.
Organele limfoide secundare cuprind următoarele grupe:
Splina este cel mai mare organ limfoid secundar, având însă şi alte funcţii:
· joacă rolul unui „filtru” care în mod nespecific îndepărtează/elimină complexele antigen-
anticorp circulante, diferite microorganisme, eritrocite parazitate (ex. cu Plasmodium spp.,
Babesia microti);
· are o eficienţă remarcabilă în îndepărtarea/eliminarea microorganismelor slab opsonizate
precum şi celor capsulate (ex. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria
meningitidis, Capnocytophaga spp.);
145
· eliminarea hematiilor degradate, îmbătrânite;
· reglarea volumului sângelui etc.
Pe secţiune, splina are o culoare roşie, cu formaţiuni albe diseminate, numite corpuscu lii
Malpighi (foliculi splenici).
Splina este compusă din două tipuri de ţesuturi: pulpa roşie implicată în distrugerea hematiilor
şi pulpa albă, corespunzătoare ţesutului limfoid. Aceasta din urmă este organizată sub forma
unor grupări de limfocite T dispuse în imediata vecinătate a arteriolelor (manşoane de limfocite
T - teaca limfatică periarterială), iar spre periferia acestora se găsesc cordoane de limfocite B
(zona marginală). Se consideră că zona bogată în limfocite T este zona timo-dependentă, în timp
ce zona cu limfocite B este zona medulo-dependentă.
Vascularizaţia splinei are o serie de particularităţi. Artera splenică intră prin hilul splenic iar
ramificaţiile sale, arterele trabeculare, urmează cloazoanele conjunctive. Din aceste artere se
nasc ramificaţii, arterele centrale înconjurate de manşoane de limfocite T, vase care asigură
irigaţia foliculilor limfatici şi artere penicilate care intră direct în contact cu sinusurile venoase
ale pulpei roşii. Din arteriole se nasc capilarele, apoi venulele postcapilare situate în zona
sinusului marginal. (Figura nr. 3)
la nivelul zonei marginale are loc captarea antigenelor de către celulele reticulare. După 24 de
ore, antigenul se regăseşte la nivelul centrului germinativ al foliculului sau în zona timo-
dependentă.
La periferia foliculilor splenici se găsesc plasmocite. La acest nivel are loc sinteză de anticorpi (în
special după stimuli antigenici „solubili”, veniţi pe calea torentului circulator). După sinteză,
moleculele de anticorpi sunt antrenate sanguin şi pot ajunge în tot organismul. Splina reprezintă
un organ în care are loc sinteza anticorpilor de tip IgM şi diferenţierea spre LB cu memorie în
cadrul RI primar.
Splina are şi rol în sinteza unei enzime care desprinde tuftsina (tetrapeptid rez ultat din clivarea
enzimatică a porţiunii Fc din molecula de IgG) de pe molecula de IgG (tuftsina la rândul ei are rol
în creşterea funcţiei fagocitare a PMN şi în chemotactism).
Hipofuncţia splenică şi în special splenectomia favorizează apariţia unor infecţii grave, inclusiv
sepsis, cu microorganisme capsulate şi microorganisme care parazitează eritrocitele. Este
necesară aplicarea unei strategii de prevenire a infecţiilor, incluzând vaccinarea şi uneori
profilaxia cu antibiotice şi chimioterapice.
146
Structurile adenoide se inflamează frecvent în timpul copilăriei (după diferitele şi frecventele
infecţii respiratorii) şi deseori, crescând în dimensiuni, trebuie extirpate;
(GALT - gut associated lymphoid tissue) cuprinde
plăcile Peyer şi formaţiunile limfoide ale apendicelui (secretă IgA), limfocitele intra -epiteliale şi
limfocitele sub-epiteliale. Plăcile Peyer reprezintă aglomerări de celule limfoide (la nivelul
jejunului, duodenului şi ileonului). După infecţii bacteriene se măresc şi se pot uni în adevărate
„cordoane” limfoide. Nu au vase limfatice proprii;
(BALT - bronchus associated lymphoid tissue);
, prezent în special la nivelul vaginului;
· (mammary associated lymphoid tissue).
Laptele matern conţine IgA secretorie (sIgA) cu rol protector pentru noul născut faţă de
infecţiile digestive. IgA nu poate trece prin bariera hemato-placentară, dar sIgA poate fi primit în
timpul alăptării, asigurând protecţia nou-născutului şi sugarului faţă de o serie de patogeni, în
primele luni de viaţă.
În organele limfoide secundare, distribuţia limfocitelor şi a celorlalte celule imune este
controlată de citokine şi chemokine. Membrii familiei TNF (tumour necrosis factors) (citokine
implicate în reacţii inflamatorii) au un rol deosebit de important în dezvoltarea normală a
organelor limfoide. Celulele imune au receptori pentru aceşti mediatori, acest lucru fiind
demonstrat pe cobai la care s-au distrus o serie de receptori pentru a se pune în evidenţă care
este rolul lor.
Molecula MIP-3β face parte din categoria chemokinelor pentru care limfocitele T prezintă
receptori. Datorită acestei substanţe, limfocitele T se localizează cu stricteţe în zonele
timodependente. Receptorul pentru MIP-3β se numeşte CCR7, iar la cobaii la care receptorii
CCR7 au fost distruşi s-a observat absenţa marcată a zonelor timodependente şi un răspuns
imun primar extrem de slab. Celulele dendritice interdigitate produc chemokina MIP-3β şi
pentru că sunt prezente în zonele timodependente, atrag acolo limfocite T mature. Receptorul
CCR7 este prezent în proporţie mică şi la nivelul limfocitelor B, lucru care explică migrarea
acestora prin zonele timodependente către foliculii limfatici.
147
Inflamarea apendicelui (apendicită) este o afecţiune frecvent întâlnită în secţiile de chirurgie, iar
apendicectomia a devenit o procedură de rutină, având puţine riscuri (în general datorate
efectelor anesteziei). Studii recente afirmă că apendicectomia (desfăşurată în cazul unei
apendicite acute şi nu atunci când nu există de fapt această afecţiune) are efecte be nefice în
scăderea incidenţei dezvoltării colitei ulcerative. S-a constatat că la pacienţii suferinzi de
apendicită la vârste tinere care au fost supuşi operaţiei, a scăzut riscul de apariţie a colitei
ulcerative cu până la două treimi. Se pare că efectul este dat de o stimulare a limfocitelor T
supresoare ce survine în urma procedurii chirurgicale. Însă apendicectomia nu reprezintă o
soluţie în cazul celor la care boala s-a instalat deja.
Colita ulcerativă este o boală inflamatorie a intestinului caracterizată prin apariţia ulceraţiilor în
peretele colonului, diaree cu sânge şi crampe abdominale. Cauzele instalării bolii sunt multiple,
de natură genetică, cauză autoimună, alimentaţie necorespunzătoare. Un parcurs de 10 ani
netratat poate degenera în cancer de colon sau cancer rectal.
Chiar dacă apendicectomiile au devenit „floare la ureche” pentru mulţi medici chirurgi iar
pacienţii nu se tem de o operaţie „uşoară”, este de reţinut faptul că diagnosticul trebuie
instaurat corect de către medic care adesea uită că durerea la nivelul zonei inghinale drepte nu
este semnul patognomonic pentru apendicită şi nu se mai oboseşte să mai facă alte teste,
realizând uneori o operaţie inutilă şi netratând până la urmă suferinţa pacientului.
Cititorul care doreşte să aprofundeze unele dintre aspectele menţionate în acest capitol poate
să acceseze informaţiile oferite de site-urile de mai jos sau şi alte site-uri.
http://emedicine.medscape.com/article/207891-overview
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=imm&part=A869
http://www.jimmunol.org/cgi/content/abstract/183/4/2205
http://vet.sagepub.com/content/36/5/357.long
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ibd.20453/pdf
http://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/reprint/106/6/1901
148
Care este organul care pe lângă funcţia limfoidă, are şi funcţie hematoformatoare în
ansamblu?
splina;
ganglionul limfatic;
timusul;
măduva osoasă hematogenă.
1. Charles A Janeway, Jr, Paul Travers, Mark Walport, Mark J Shlomchik, 2001, Immunobiology
5th edition
2. Gerd-Rudiger Burmester, Antonio Pezzutto, 2003, Color Atlas of Immunology
149
3. http://ebooks.unibuc.ro/biologie/mihaiescu/index.htm
4. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman, Shiv Pillai, 2007, Cellular and Molecular Immunology
5. http://www.nejm.org
6. http://www.medscape.com
7. Lee Goldman, Dennis Ausiello, 2008, Cecil Medicine, 3rd edition
8. Jawetz, Melnick, Adelberg, 2007, Medical Microbiology, 24th edition
9. Junqueira, Carneiro, 2005, Basic Histology Text & Atlas
10. T. W. Sadler, 2006, Medical Embryology
150
Celula multipotentă, primordială, „suşă”, „stem”, „matcă”, se formează la circa 3 săptămâni de
la nidaţia zigotului, iniţial la nivelul peretelui sacului vitelin, ulterior în ţesutul hematopoietic din
ficatul embrionului. După naştere, celula „stem” ar mai putea fi pusă în evidenţă în măduva
oaselor late şi lungi (la copii) şi în măduva oaselor late (la adulţi); un număr foarte mic de celule
„stem” mai pot fi identificate în circulaţie.
Primul derivat al celulei „stem” este hemocitoblastul (hematopoietic progenitor), care seamănă
foarte mult cu celula „stem” dar deţine probabil un „semnal de orientare” către măduva roşie
hematogenă sau către timus. Există și un alt derivat, limfoblastul (lymphoid progenitor).
Celula „stem” se află la srcinea tuturor liniilor hematopoietice. În funcţie de gradul de
potenţialitate există celule „stem” totipotente (CFU-LM), pluripotente, multipotente (CFU-M,
GEMM), bipotente, unipotente (CFU-Eo, CFU-Baso, CFU-Mega). Prezintă capacitate de
autoîntreţinere („self-renewal”) şi generează descendenţi în lipsa stimulilor antigenici.
Răspunde la diferite mecanisme de control complexe. Din punct de vedere morfologic se
aseamănă foarte mult cu limfocitul imunocompetent. Este foarte uşor de distrus de către
radiaţii dar nu şi de către chimioterapice.
Descoperirea metodelor de izolare şi cultivare a celulelor stem (1998) a creat o nouă speranţă:
tratamentul cu celule stem ar putea ajuta la vindecarea unor boli grave (considerate astăzi ca
fiind incurabile). Celulele stem fiind progenitori nediferenţiaţi se pot divide şi dezvolta într -o
multitudine
estimează căde alte tipuri
aceste celuledearcelule,
putea putând duce
fi folosite, la formare
în viitor, derepararea
pentru ţesuturi şidiferitelor
organe. Cercetătorii
structuri
distruse sau în suferinţă, dar chiar şi pentru „sinteza” de organe. Totuşi, sunt încă destul de
multe probleme tehnice care trebuie surmontate. (Figura nr.1 – Evoluţia celulei „stem”)
Toate celulele sistemului hematopoietic intervin, în diferite măsuri, în imunitate. Aşa cum am
menţionat anterior, aceste celule acţionează ca nişte adevăraţi „soldaţi” (de ex. LT citotoxice,
celulele NK), care pot avea atât o activitatea efectoare cât şi de control şi retro-control
(„depăşindu-şi condiţia” de „simpli ostaşi”).
Limfocitele T şi B suntelementele centrale alerăspunsului imun specific.
Celulele NK sunt celule fundamentale (alături de fagocite) în imunitatea înnăscută.
Monocitele / macrofagele,
diferite momente neutrofilele,
ale răspunsului imun. eozinofilele, bazofilele şi mastocitele acţionează în
Plachetele sanguine intervin în lupta anti-parazitară iar globulele roşii participă la eliminarea
complexelor imune.
Celule pot reacţiona în mod nespecific, indiferent de natura agentului agresor (ex. granulocitele
PMN, eozinofilele, bazofilele, mastocitele, monocitele, macrofagele, celulele dendritice etc) sau
pot participa la o reacţie specifică, condiţionată de structura moleculelor antigenice, prin
intermediul receptorilor (ex. limfocitele).
151
Termenul generic de limfocite, include o multitudine de celule distincte, imposibil de diferenţiat
morfologic (în microscopia obişnuită sau chiar şi în microscopia electronică).
Pe baza caracterelor morfologice, este totuşi posibilă identificarea a două tipuri de limfocite:
- limfocitele mici (small lymphocytes), cele mai numeroase (circa 85% din numărul total al
limfocitelor); aici se încadrează majoritatea limfocitelor T, limfocitelor B, celulelor dendritice şi
rarelor celule stem hematopoietice aflate în circulaţie.
- limfocitele mari cu granulaţii (large granular lymphocytes), reprezentând circa 5-15% din
totalul limfocitelor. Dintre acestea amintim celulele NK (ucigaşe în mod natural / „natural killer”)
şi limfocitele T citotoxice.
Aspectul morfologic nu ne permite să apreciem care este starea de activare celulară. Dacă
folosim culturi celulare, în prezenţa unor agenţi mitogeni nespecifici [ex. fitohemaglutinină,
concavalină A, lipopolizaharide, lectine cum ar fi PWM (pokeweed mitogen) etc] sau a unor
antigene specifice, limfocitele T sau B aflate anterior „în repaus” cresc în dimensiuni, prezintă
modificări la nivelul nucleului (cromatină fină, citoplasmă mai abundentă şi mai albastră pe
frotiu), fiind denumite imunoblaste.
152
· diferențierea limfocitelor efectoare în limfocite cu memorie.
Așadar, avem de-a face cu trei tipuri de limfocite:
· naive – mature dar care nu au avut contact cu antigenul; acestea urmează să fie distruse
în cazul în care într-o perioadă de 1-3 luni nu au contact antigenic
· efectoare
· cu memorie - care vor reacționa mai rapid la a doua stimulare cu același antigen.
Limfocitele T sunt majoritare în circulaţia sanguină, reprezentând circa 70% din totalul
limfocitelor [2/3 sunt LT4 (CD4+) şi 1/3 sunt LT8 (CD8+)]. Limfocitele T sunt localizate la nivelul
organelor limfoide secundare în zone speciale: zona paracorticală a ganglionilor, manşonul
limfoid în jurul arterelor centrale splenice. Limfocitele T sunt implicate în principal în imunitatea
mediată celular. Pe de o parte participă la eliminarea structurilor străine dar şi a structurilor
proprii modificate (prin îmbătrânire, în urma unei infecţii, cu multiplicare neoplazică) iar pe de
altă parte cooperează cu limfocitele B în răspunsul imun umoral. De fapt, funcţiile exercitate de
LT sunt mult mai complexe.
Cea mai importantă funcţie a limfocitelor T este inducerea unui răspuns sau a unei reacţii imune
specifice la antigene, prin recunoaşterea unor peptide antigenice fixate pe moleculele MH C
(complex major de histocompatibilitate). În acest scop pe limfocitul T există un receptor pentru
antigen (TCR), asociat întotdeauna cu un complex molecular transductor CD 3.
Linia limfocitară T se maturează în două organe: (a) măduvă osoasă şi (b) timus.
Din celula stem hematopoietică multipotentă (CD34+, CD38-), prima diferenţiere conduce la
apariţia CFU-L (colony forming unit-lymphocyte) comună limfocitelor T şi B (CD34+, CD45RA+,
CD10+) din care rezultă protimocitul. Protimocitul părăseşte măduva roşie hematogenă şi se
cantonează în corticala timică.
Maturizarea timocitelor nu a putut fi studiată la om, astfel încât datele se obţin prin
extrapolarea informaţiilor obţinute experimental, la animale de laborator. Protimocitele şi apoi
timocitele imature se găsesc în corticala timică (subcapsular), în contact cu celulele epiteliale şi
cu macrofagele (rare) de la acest nivel. Aceste celule tinere au o capacitate foarte mare de
multiplicare. Se deplasează prin cortex spre joncţiunea cortico-medulară şi vin în contact cu
celulele dendritice şi cu macrofagele. La acest nivel are loc o nouă multiplicare relativ intensă.
Este de remarcat faptul că în cursul acestui proces, doar 1-5% din celulele tinere ajung limfocite
T mature. Restul, de cel puţin 95% din celule, mor prin apoptoză.
Activarea unui limfocit T specific se face printr-un mecanism dublu: 1. contactul (direct) celulă -
celulă, cu o celulă prezentatoare de antigen (APC); 2. stimularea (indirectă) de către citokine: IL-
1, IL-6, IFN-g şi IL-2. Limfocitul produce la rândul său atât IL-2 cât şi lanţul a al receptorului Il-2,
contribuind la activarea altor LT specifice.
LT sunt activate doar de către antigenele timodependente (vezi Cap. 16, paragraf 16.1.2.);
procesul se desfășoară la distanță de locul de pătrundere al antigenului, și anume în organele
limfoide secundare unde o APC îi prezintă structurile antigenice. Consecința activării LT este
transformarea acestuia în limfoblast T.
153
Limfocitele T ajutătoare (T helper, CD4+) (LTh/Th)
Limfocitul Th este un veritabil „coordonator”, orientând răspunsul imun (RI) către RI celular sau
către RI umoral. Există cinci subtipuri de LTh (Th0, Th1, Th2, Th3 și Th17):
- limfocitele Th0 sunt limfocite tinere (sub influenţa unor stimuli moleculari, ex. IL-4, IL-
12, se vor transforma în limfocite Th1 sau în limfocite Th2);
- limfocitele Th1 sintetizează limfotoxină, IL-2, IFN-γ, TNF-α și TNF-β
o au rol foarte important în apărarea anti-virală, şi anti-neoplazică (dar și în apărarea anti-
fungică și anti-bacteriană),
o sunt implicate mai ales în RIC,
o stimulează switch-ul izotipic spre IgG2 și IgG3,
o amplifică rolul citotoxic al macrofagelor și stimulează proliferarea LTc;
- limfocitele Th2 sintetizează IL2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13;
o au rol mai ales în RIU,
o sunt implicate în reacţiile de hipersensibilitate,
o stimulează proliferarea LB și secreția de anticorpi;
o sunt stimulate de semnale venite de la bazofile și eozinofile (papaina duce la sinteza de IL-4
de către bazofile care duce la stimularea răspunsului Th2) (1).
- limfocitele Th3 (limfocitele T reglatorii) deprimă funcția altor limfocite (CD4+, CD8+,
LB, NK); secretă Il-10 (inhibă Th1 și Th2, deci RIU și RIC) și TGF- β (inhibă răspunsul imun); sunt
CD4+ și CD25+;
- relativ recent au fost identificate limfocitele Th17; acestea se găsesc la interfaţa dintre
mediul extern şi mediul intern (ex. la nivelul tegumentului, de-a lungul tractului gastro-
intestinal); sintetizează IL-6, IL-17 și TNF -α;
o au rol de protecţie la nivelul acestor suprafeţe,
o studii recente au aratat că sunt implicate în inducerea și exacerbarea autoimunității și
inflamației (datorită IL-17),
o activează RIC (importante în RI prin recrutarea neutrofilelor și macrofagelor la locul infecției),
o sunt în relație cu LT reglatorii care previn fenomenele inflamatorii și mediază toleranța imună
(2),
o secreția lor este stimulată de IL-23,
o LTh-17 cu memorie reacționeaza față de antigenele Candida albicans (3).
Limfocitele T citotoxice (Tc, CD8+)
Se referă în principal la LT CD8+, cu toate că această proprietate a fost observată şi la unele LT
CD4+, cu următoarele diferențe:
· LTc CD8+ pot liza oricare dintre celulele organismului care exprimă molecule HLA I (HLA -
human leukocyte antigen system)
· LTc CD4+ îşi limitează funcţia la celulele care exprimă molecule HLA II.
Au mai multe roluri, de ex. realizează „supravegherea imunologică” prevenind multiplicarea
anarhică a celulelor. Dacă de ex. apar antigene tumorale, LTc au capacitatea de a le recunoaşte,
de a se multiplica/activa şi de a le distruge. În această „supraveghere”, LTc sunt ajutate de
celulele NK.
Distrugerea antigenelor este indusă prin două mecanisme:
· inducerea apoptozei prin intermediul unui receptor al ”morții celulare”, ceea ce duce la
fragmentarea ADN-ului celulei țintă;
154
· ”atacul” asupra celulei țintă prin perforine (proteine ce rup membrana plasmatică sau
lizozomală) și granzine (serin proteaze care lizează substraturi sau activează diverse proteaze)
sintetizate și eliberate de către LTc.
LTc au un rol important în apărarea împotriva celulelor infectate viral. Activitatea lor este
intensificată de IFN-g.
Importanța activității litice a LTc a fost demonstrată atât experimental (pe modele animale) cât
și la pacienți care prezentau defecte ale citotoxicității. Există sindroame genetice transmise
autozomal recesiv în cadrul cărora este afectată citotoxicitatea sau prezentând mutații la nivelul
genei ce codifică informația pentru sinteza de perforine. Aceste sindroame au fost asociate cu
imposibilitatea controlării infecțiilor virale, mai ales cu CMV, EBV și HSV (4).
Sunt celule care secretă IL-2 şi în acelaşi timp IFN-g, activatoare pentru alte limfocite T,
macrofage şi celulele NK.
Limfocitele T γδsunt sechestrate la nivelul barierelor epiteliale sau la nivelul focarului inflamator
și manifestă citotoxicitate față de diverse ținte.
Sunt activate direct de antigen (non-peptide de dimensiuni mici) fără a fi necesară prezentarea
în conjuncție cu MHC.
Reacționeaza față de extractele mycobacteriene. Sunt stimulate de grupările fosfat din diverși
compuși precum NTP (nucleotid trifosfat din ADN și ARN). Teste efectuate pe animale de
laborator care au fost infectate cu Listeria spp., Leischmania spp., Mycobacterium spp.,
Plasmodium și Salmonella spp. au arătat un nivel de protecție mediu realizat de aceste
limfocite.
Se acumulează la nivelul focarului inflamator în boli cu implicare imună precum artrita
reumatoidă sau sarcoidoza (cauza nu este cunoscută).
Sunt implicate atât în imunitatea înnăscută cât și în cea adaptativă, prin
· secreția de citokine și chemokine
· abilitatea de a ajuta LB să se transforme în limfocite cu memorie.
Limfocitele T NK (NKT cells)
Limfocitele T NKintervin în RIP și produc cantități crescute de IL-4. ”Împrumută” proprietăți atât
de la LT cât și de la NK.
155
Limfocitele B reprezintă 5% până la 15% din limfocitele din sânge (300 până la 600
elemente/mm3) şi constituie majoritatea celulelor din foliculii limfatici, ganglioni şi splină. Rolul
lor esenţial este sinteza anticorpilor, în cursul RIU specific. Au fost denumite astfel deoarece s-a
descoperit că la păsări LB se dezvolvă în bursa lui Fabricius. La om LB se dezvoltă în măduva
osoasă hematogenă (bone marrow).
Limfocitele B provin (la om şi la mamifere) din celulele stem hematopoietice (CD34+, CD38-).
Toată linia limfocitară B (celule imature sau mature) are markeri specifici de suprafaţă CD19 şi
CD20, utilizaţi pentru identificarea celulelor B (ex. în citometria în flux); identificarea prin
aceeaşi metodă a markerului CD10 permite încadrarea în stadiul de limfocit matur.
Limfocitul B părăseşte măduva osoasă şi trece în „zonele B” din organele limfoide secundare
(ganglioni limfatici, splină etc). LB „naiv” (virgin) este pregătit pentru a răspunde stimulului
antigenic, deşi se găseşte în stare de repaus, în aşteptarea primei stimulări antigenice. În acest
stadiu, LB are următoarele caracteristici:
· exprimă la nivelul membranei imunoglobuline din clasele IgM şi IgD;
· exprimă receptori pentru interleukinele IL-1 şi IL-4;
· exprimă receptori pentru complement CR1 (CD35) şi CR2 (CD21). Ultimul recunoaşte
fragmentul C3d, component degradat al fragmentului C3 al complementului. Acesta contribuie
la activarea limfocitului B.
· exprimă receptori pentru anumite lectine (ex. PWM) utilizate in vitro pentru transformarea
limfoblastică a limfocitelor B, dar şi receptori pentru endotoxine bacteriene (LPZ).
Transformarea unui LB naiv într-un LB activ şi apoi în plasmocit necesită intervenţia succesivă a
citokinelor (ca într-o „cascadă”).
Activarea are loc datorită recunoaşterii antigenice dar şi datorită secreţiei de IL-1 de către celula
prezentatoare de antigen (APC) şi respectiv secreţiei de IL-4 de către Th2. Limfocitul B activ
exprimă receptori pentru alte interleukine, în special IL-5 şi IL-6 şi lanţul a al IL-2. LB se va divide
şi va da naştere la numeroase celule identice în foliculul limfoid secundar.
Limfocitul B se diferenţiază progresiv într-un limfoblast sau imunoblast care secretă IgM. Sub
acţiunea diferitelor citokine are loc comutarea izotipică (isotypic switch) de la IgM la IgG, IgA sau
IgE; în urma acestei comutări plasmocitul va secreta IgG, IgA sau IgE. De exemplu, sub acţiunea
IL-4 are loc comutarea izotipică a IgM în IgG sau IgE iar sub acţiunea IL-5 în IgA.
Există şi limfocite B active care nu se transformă în plasmocite ci persistă sub formă de limfocite
B cu memorie, cu o durată de viaţă lungă (asigurând spre exemplu protecţia faţă de o nouă
îmbolnăvire, de ex. după scarlatină/infecție cu streptococul piogen de grup A, lizogenizat).
Limfocitul B are următoarele funcţii: 1. Prezentarea antigenelor către LT; 2. Sinteza
imunoglobulinelor (anticorpilor). În cazul antigenelor timo-dependente, are loc trecerea de la
răspunsul primar cu secreţie predominentă de IgM, la un răspuns secundar cu predominenţa
IgG sau mai rar a IgA sau IgE. În cazul antigenelor timo-independente, se menţine sinteza
anticorpilor din clasa IgM.
Limfoblastul (lymphoid progenitor) dă naștere la trei linii celulare (LT, LB și NK). Există o genă
(Pax5) care este esențială pentru maturarea LB (5).
156
Numele de celule NK a fost dat acestei populaţii celulare datorită puterii lor citotoxice spontane,
fără a avea nevoie de un stimul imun sau de prezenţa MHC (complexul major de
histocompatibilitate). Numite iniţial celule de clasa a III-a (nefiind LB sau LT), ulterior celule nule
(pentru că pe suprafaţa lor nu fuseseră, încă, puşi în evidenţă receptori), în final au fost numite
celule NK („ucigaşe în mod nativ”, „natural killer”).Fac parte dintre limfocitele mari cu granulaţii
(large granular lymphocytes).
Se găsesc în măduva osoasă hematogenă, splină și în sângele periferic.
Celulele NK reprezintă o linie primordială de apărare a organismului (imunitatea înnăscută), pe
care îl ajută să elimine celulele modificate datorită unor infecţii, sau celulele modificate
neoplazic, în special în neoplazii hematologice (ex. leucemie).
Spre deosebire de limfocitele Tc
· celulele NK nu au TCR (au însă, de ex., receptori pentru molecule de IgG),
· în cazul celulelor NK nu există răspuns imun secundar (de memorie).
Capacitatea de a prezenta antigene limfocitelor Th, iar prin aceasta de a induce un RI specific,
este asigurată de două categorii de celule prezentatoare de antigen (APC):
- celulele profesionale / specializate
· celulele dendritice,
· monocitele / macrofagele și
· limfocitele B;
- celulele ocazionale (îndeplinesc funcţia doar în anumite condiţii de activare celulară)
· neutrofilele,
· celulele endoteliale şi
· celulele epiteliale.
) au următoarele funcții (Figura nr. 3):
· recunosc antigenele T dependente prin receptorii membranari, le endocitează și
prelucrează,
· transportă antigenele native de la țesuturi la organele limfoide secundare,
· prezintă antigenele native LT urmând selecția clonei de limfocite specifice acelui antigen,
· activează fie LTc fie LTh.
se găsesc în aproape toate țesuturile organismului, incluzând sângele și
organele limfoide. La nivelul țesuturilor periferice formează o rețea care se extinde și în spațiile
dintre celulele parenchimatoase astfel încât pot detecta orice microorganism aflat în acea zonă.
Celulele dendritice posedă două sisteme de supraveghere imunologică:
· macropinocitoză (în fiecare oră ingeră echivalentul volumului lor; nu așteaptă pasiv
apariția antigenului care să le stimuleze),
· au pe membrană mai multe tipuri de receptori pentru mai multe tipuri de particule.
Sunt clasificate, în funcţie de distribuţia în organism şi de particularităţile fenotipice, în trei mari
clase și şase tipuri:
157
a). Celule dendritice tisulare
· celule Langerhans – CDL, care la nivel cutanat formează un strat continuu între derm și
epiderm (dar le găsim și la nivelul tubului digestiv și organelor genitale),
· celule interstiţiale - CDI, care se găsesc în interstițiul țesuturilor;
b). Celule dendritice limfoide (din organele limfoide secundare)
· celule interdigitate - CDID, în ariile T dependente din organele limfoide secundare,
· celule foliculare - CDF, în ariile B dependente din organele limfoide secundare;
c). Celule dendritice circulatorii
· celule sanguine - CDS, în vasele sanguine, aflate în tranzit,
· celule limfatice, „văluroase” - CDV, în vasele limfatice, aflate în tranzit.
Toate celulele dendritice au srcine medulară, provenind din aceeaşi entitate celulară - CDS (o
parte dintre CDS pătrund în ţesutul cutanat şi mucoase, iar altă parte în interstiţiu). Pot să
îndeplinească funcţia de APC deoarece prezintă receptori de tip CR, FcγR şi sintetizează
molecule MHC II (cu excepţia CDF).
Așadar, celulele dendritice sunt eliberate în circulație din măduva osoasă hematogenă și se
transformă în CDS. De aici pot urma două căi:
· în țesutul cutanat se transformă în CDL (captează antigenele opsonizate), apoi iau calea
vaselor limfatice transformându-se în CDV, ajung la nivelul organelor limfoide secundare unde
se transformă în CDID care prezintă pe membrana epitopi în conjuncție cu MHC II.
· în interstițiu se transformă în CDI, apoi fie iau calea vaselor limfatice (și urmează drumul
de mai sus), fie trec în circulație, se transformă din nou în CDS și ajung în splină unde fie
o ajung periarteriolar (zona cu LT) și se transformă în CDF care reprezintă filtre pentru
antigenele solubile,
o ajung în jurul zonei periarteriolare (zona cu LB) și se transformă în CDID.
Subliniem că este vorba despre aceeași celulă dendritică, în circulație prin organism; în funcție
de locul în care ajunge are alte caracteristici structurale și funcționale.
Celulele dendritice tipice (CDL, CDI, CDID) au formă neregulată, cu prelungiri numeroase, lungi şi
efilate (de unde vine şi denumirea lor). În citoplasma celulelor dendritice se găsesc numeroase
mitocondrii. CDF nu au atât de multe prelungiri și se dispun în grămezi. CDS au aspect rotund
ovalar iar CDL sunt celule văluroase.
Au rol important în maturizarea precursorilor LT.
Induc toleranța LT, eliminând LT autoreactive (cele care la nivel timic au interacționat cu MHC și
ar putea să reacționeze la fel de puternic și cu celulele somatice normale din organismul uman
și să genereze autoimunitatea). Astfel, CD elimina LT care au scăpat selecției negative (vezi Cap.
10, paragraf 10.2.1.).
Se pare că aceste celule intervin în declanşarea RI înaintea macrofagelor.
pot fagocita exo-antigenele într-o vacuolă numită endozom primar.
Fuziunea endozomilor secundari cu lizozomii permite degradarea antigenelor în peptide
imunogenice. Moleculele MHC II, produse la nivelul reticulului endoplasmic, pot „încărca”
aceste peptide. Fago-lizozomii fuzionează cu membrana plasmatică şi astfel, peptidul de pe
MHC II se exprimă la suprafaţa externă a macrofagelor.
Macrofagele reprezintă APC majoritare în organism, însă nu toate pot îndeplini funcţia de APC,
respectiv:
· cele care nu au capacitatea să funcţioneze ca APC vor rămâne implicate în răspunsul
inflamator,
158
· celelalte vor funcţiona ca APC în cinci etape
1. captarea Ag (proces imunologic nespecific, mediat de receptori);
2. endocitarea Ag captate (realizată doar de către macrofagele activate metabolic);
3. prelucrarea Ag native captate (are loc la nivel lizozomal iar la finalul ei, rămâne un epitop,
format dintr-o haptenă cu specificitate maximă şi o proteină „carrier”);
4. conservarea epitopilor în anumite sectoare subcelulare (în acest fel este asigurată
autoîntreţinerea RI în timp);
5. prezentarea epitopilor pe membrana APC, cuplaţi în permanenţă cu molecule MHC.
Sistemul MM exprimă molecule MHC II, mai ales după activarea prin interferonul gamma (IFN-
g). După contactul cu limfocitul T, macrofagele secretă IL-1 şi IL-6 şi TNF-a; TNF-a activează RI şi
procesul inflamator local.
pot funcţiona ca APC profesionale numai în condiţii de activare metabolică. Au
capacitatea de a recunoaşte epitopii conformaţionali ai antigenelor şi de a-i prezenta
(de peste 30 de ani a fost dovedit faptul că RI la antigenele timo-dependente
necesită cooperarea LB-LT). Prezintă pe suprafaţa lor receptori de tip CR şi FcγR şi pot sintetiza
molecule MHC II.
LB recunosc şi prezintă numai Ag solubile. Există studii care afirmă faptul că LB au o mai mare
eficienţă în procesul de prezentare al antigenelor în comparaţie cu macrofagele.
LB naive dar mature (încă nu au avut contact cu antigenul, dar au fost maturate în măduva
osoasă hematogenă) sunt stimulate de antigen. Ag este captat prin intermediul BCR (receptor
pentru antigen de pe LB). LB captează antigenul, îl procesează, prezintă apoi epitopii în complex
cu molecule MHC II spre LTh CD4+. Acesta din urmă trimite semnale către alte LB prin citokine şi
molecule de suprafaţă iar LB încep să prolifereze, se transformă în limfoblaste B, apoi în
plasmocite care vor secreta anticorpi.
159
splenice; macrofage peritubulare în rinichi; macrofage ganglionare, în măduva osoasă şi timus
(macrofagele din aceste organe nu trebuie confundate cu celulele dendritice, care pot avea, la
rândul lor, o capacitate fagocitară faţă de limfocitele în apoptoză).
Monocitele / macrofagele prezintăreceptori pentru carbohidraţi, receptori pentru M-CSF,
receptori pentru imunoglobuline şi complement.
În cadrul procesului de recunoaştere, fagocitare şi prelucrare a structurilor străine sau a
structurilor proprii modificate, spre deosebire de PMN care distrug complet structurile
fagocitate, sistemul MM produce un anumit grad de distrugere, cu conservarea grupărilor
specifice, necesare stimulării răspunsului imun.
Citotoxicitatea exercitată de macrofage poate fi
· directă (în cursul procesului de fagocitoză),
· în urma contactului cu membrana celulei ţintă sau
· prin citotoxicitate mediată celular, dependentă de anticorpi (ADCC) (în acest caz, anticorpii
se fixează cu capătul Fab pe epitopii celulei ţintă şi cu fragmentul Fc de macrofag).
Macrofagul produce substanţe litice cu care perforează membrana celulei ţintă (asemănător cu
acţiunea ADCC a celulelor NK).
Macrofagele secretă un număr foarte mare de substanţe:
· cea mai mare parte a factorilor sistemului complement,
· enzime proteolitice (ex. colagenaze, serinproteaze, hidrolaze),
· proteine cu rol în adeziunea celulară (ex. fibronectină),
· factori de coagulare,
· interleukine (IL-1, IL-6, TNF-a, factorul de creştere al trombocitelor/fibroblastelor, factorul
de stimulare al coloniilor de granulocite/granulocite-macrofage, endorfine etc) etc.
Etapele fagocitozei (Schema nr. 1):
1. Migrarea macrofagelor la locul infecției,
2. Aderarea macrofagelor la celula țintă,
3. Ingestia celulei țintă,
4. Formarea fagolizozomului,
5. Inactivarea intracelulară a celulei țintă,
6. Digestia intracelulara a celulei țintă.
Iată câteva studii interesante legate de funcţiile macrofagelor și modul în care acestea
interacționează cu diferitele microorganisme.
Lipoarabinomananul (LAM) este considerat unul din factorii de virulență ai Mycobacterium
tuberculosis. S-a demonstrat că LAM este incorporat în plutele lipidice din interiorul membranei
macrofagelor prin intermediul glicozil-fosfatidil-inozitolui ducând la reducerea maturării
fagozomilor şi protejând astfel celula fagocitată (6).
Toxina pertusis (TP) produsă de Bordetella pertussis este implicată în tusea convulsivă. S -a
studiat interrelația dintre TP și macrofagele alveolare în cursul procesului infecțios. La un lot de
șoricei s-au ”eliminat” macrofagele alveolare ceea ce a condus la intensificarea manifestărilor
procesului infecțios, cu toate că imediat s-a produs un influx de neutrofile la locul infecției. Mai
mult decât atât, lipsa macrofagelor a dus la declanșarea procesului infecțios chiar și cu tulpini
care erau deficitare în sinteza TP (7).
Endocardita poate fi cauzată de streptococii orali. Mecanismul nu este complet elucidat, dar se
pare că monocitele au un rol important. Deși celulele monucleare din sângele periferic
sintetizează titruri crescute de IL-12, monocitele tind să dispară. Acest lucru scoate în evidență
160
faptul că monocitele infectate streptococic se transformă în celule dendritice secretoare de IL-
12 și nu în macrofage. Celule sanguine mononucleare periferice de la subiecți sănătoși au fost
infectate cu șase tulpini de streptococi orali. S-a observat că monocitele stimulate de aceste
antigene exprimă fenotipul și funcția celulelor dendritice (8).
Mai multe studii au arătat că M. leprae activează puține macrofage și celule dendritice. S -a
demonstrat că la nivelul monocitelor naive M. leprae induce niveluri crescute de citokine ce
inhibă monocitele. M. leprae este implicat atât într-o stimulare cât și într-o inhibare a
monocitelor (9).
Eozinofilele reprezintă în mod normal între 1% şi 3-5% din leucocitele sanguine. Procentul
eozinofilelor creşte în alergii sau în infecţiile parazitare.
Funcţia lor fagocitară, prin receptorii de IgG şi IgE şi mecanismul ADCC, este relativ limitată.
Totuşi, eozinofilele pot fagocita fungi, complexe Ag-Ac, bacterii. Granulele lor conţin produşi
toxici pentru diferiţi paraziţi.
161
Pe de altă parte, eozinofilele produc histaminază şi arilsulfatază care inactivează histamina şi
respectiv leucotrienele produse de mastocite. Prin aceşti factori se reduce răspunsul inflamator
şi migrarea leucocitelor în focarul infecţios.
Mai multe studii au demonstrat rolul eozinofilelor în cadrul imunității înnăscute și adaptative
îndreptate împotriva infecțiilor cu paraziți. Nu a fost dovedit că eozinofilele ar iniția răspunsul
imun față de paraziți. Plecând de la ipoteza că eozinofilele ar putea fi celule prezentatoare de
antigen în infecțiile parazitare, eozinofilele au fost expuse la un anumit parazit și s -a examinat
expresia diferiților markeri de suprafață implicați în activarea celulară. S-a remarcat o creștere
de 6 ori a CD69 și MHC II, de 4 ori a CD86 (molecula costimulatoare pentru LT). Abilitatea
eozinofilelor de a prezenta antigenul a fost explorată și prin cultivarea lor împreună cu LTCD4+.
Eozinofilele au avut capacitatea de a transforma LT naive în LTh2 producătoare de IL-5 (11).
162
Prezentăm câteva dintre posibilele direcții de cercetare pe care cititorul le poate evalua
deschizând următoarele link-uri:
1. Human endometriosis is associated with plasma cells and overexpression of B lymphocyte
stimulator (http://www.pnas.org/content/104/30/12451.abstract?sid=053b0c70-97fc-4804-
ac6a-622ed823e269 )
2. CD8 tumor-infiltrating lymphocytes are predictive of survival in muscle-invasive urothelial
carcinoma (http://www.pnas.org/content/104/10/3967.abstract?sid=0d4f7416-7328-4a63-
8325-a06694781bf8 )
3. 3D visualization of HIV transfer at the virological synapse between dendritic cells and T
cells (http://www.pnas.org/content/107/30/13336.abstract?sid=71cd1eae-e84c-42db-8037-
18274860d243 )
4. γδ T cells turn professional(http://www.nature.com/nri/journal/v5/n7/full/nri1651.html)
5. Th17 cells and regulatory T cells: new light on pathophysiology of preeclampsia
(http://www.nature.com/icb/journal/v88/n6/full/icb201068a.html)
6. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer
(http://www.nature.com/nri/journal/v5/n4/abs/nri1592.html)
7. Lung inflammation: Disarming neutrophils in cystic fibrosis
(http://www.nature.com/nri/journal/v8/n1/full/nri2244.html)
8. Effect of Malnutrition on K+ Current in T Lymphocytes
(http://cvi.asm.org/cgi/content/full/12/7/808?maxtoshow=&hits=80&RESULTFORMAT=1&ando
rexacttitle=and&titleabstract=T+lymphocytes&andorexacttitleabs=and&andorexactfulltext=and
&searchid=1&FIRSTINDEX=0&sortspec=relevance&fdate=1/1/2005&resourcetype=HWCIT)
163
4. Una din următoarele celule nu este APC:
A. Celula Langerhans;
B. Celula dendritică;
C. Monocitul/macrofagul;
D. LT
5. Eozinofilele:
A. Procentul lor creşte în alergii sau infecţii parazitare;
B. Sunt majoritare în infecţiile bacteriene;
C. În mod normal reprezintă 50% din leucocitele sanguine;
D. Pot duce la o boală numită mastocitoză.
1. Bird L, 2008, Allergy and Asthma: Calling all TH2 cells, Nature Rev. Immunol., 8, 162
2. Bettelli E, Korn T, Oukka M, Kuchroo VK, 2008, Induction and effector functions of TH17
cells, Nature, 453, 1051-1057
3. Dong C, 2008, TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and
genetic programming, Nature Rev. Immunol., 8, 337-348
4. Trapani JA, Smyth MJ, 2002, Functional significance of the perforin/granzyme cell death
pathway, Nature Rev. Immunol., 2, 735 –747
5. Bell E, 2007, Turning B cells into T cells, Nature Rev. Immunol., 7, 838-839
6. Welin A, Winberg ME, Abdalla H et al., 2008, Incorporation of Mycobacterium
tuberculosisLipoarabinomannan into Macrophage Membrane Rafts Is a Prerequisite for the
Phagosomal Maturation Block, Infection Immunity, 76, 2882-2887
7. Carbonetti NH, Artamonova GV, Rooijen N, Ayala V, 2007, Pertussis Toxin Targets Airway
Macrophages To Promote Bordetella pertussis Infection of the Respiratory Tract, Infection
Immunity, 75, 1713-1720
8. Hahn CL, Schenkein HA, Tew JG, 2005, Endocarditis-Associated Oral Streptococci Promote
Rapid Differentiation of Monocytes into Mature Dendritic Cells, Infection Immunity, 73, 5015-
5021
9. Sinsimer D, Fallows D, Peixoto B et al., 2010, Mycobacterium leprae Actively Modulates
the Cytokine Response in Naïve Human Monocytes, Infection Immunity, 78, 293-300
10. Sawant KV, McMurray DN, 2007, Guinea Pig Neutrophils Infected with Mycobacterium
tuberculosis Produce Cytokines Which Activate Alveolar Macrophages in Noncontact Cultures,
Infection Immunity, 75, 1870-1877
11. Padigel U, Lee J, Nolan T et al.,2006, Eosinophils Can Function as Antigen-Presenting Cells To
Induce Primary and Secondary Immune Responses to Strongyloides stercoralis, Infection
Immunity, 74, 3232-3238
12. MacGlashan D, 2008, New roles for basophils, Immunol. Cell Biol., 86, 637-638
13. Sokol CL, Barton GM, Farr AG, Medzhitov R., 2008, A mechanism for the initiation of
allergen-induced T helper type 2 responses, Nat. Immunol., 9, 310-318
164
12. 1. Definiţie şi istoric
Complexul major de histocompatibilitate (MHC) uman, sau sistemul HLA, corespunde unor
moleculele exprimate pe membrana celulară.
Au fost descoperite ca alloantigene (alloantigen = antigen ce există în forme alternative = alele
în cadrul unei specii; alloantigenul induce răspuns imun atunci când este transferat la indivizii
din aceeaşi specie, cărora le lipsește respectiva formă a antigenului; exemplu: sistemul ABO al
grupelor sangvine) de care depindea compatibilitatea grefelor cutanate sau de organ.
Un fragment de ţesut recoltat de la o gazdă şi grefat la un receptor diferit, chiar dacă face parte
din aceeaşi specie, este de regulă eliminat. Dacă după eliminare se încearcă o nouă grefare, cu
acelaşi tip de ţesut, eliminarea este mai rapidă.
Pornind de la aceste observaţii s-a pus numele de antigene de histocompatibilitate [primul rol
identificat pentru acestea (dar existenţa lor nu este legată doar de fenomenul de
compatibilitate/respingere a grefelor de ţesut sau organ].
Eliminarea ţesuturilor este controlată genetic, de mai multe gene care codifică pentru sinteza
de proteine diferite la subiecţi diferiţi (gene de histocompatibilitate). Există antigene majore de
histocompatibilitate (MHC) şi antigene minore (situaţie în care eliminarea grefelor are loc, de
regulă, tardiv).
Înţelegerea acestor fenomene este legată de 3 descoperiri succesive:
· Complexul major de histocompatibilitate. Cercetările lui Gorer (1963) pe grefe tumorale
prelevate de la unsau
incompatibilitate şoarece şi grefate
tolerată la altul,
în caz de au arătat că grefaRejetul
histo-compatibilitate. este respinsă în caz de
sau toleranţa histo
sunt -
dictate
genetic. Aceasta a dus la descoperirea sistemului major numit H2 la şoarece şi a mai multo r
sisteme minore. Ulterior, existenţa MHC a fost confirmată la toate mamiferele, regiunea fiind
denumită în funcţie de specie (ex. H2 la şoarece, ChLA la cimpanzeu).
· Sistemul HLA. În 1958 se pune în evidenţă, în serul unui pacient cu aplazie medulară şi
politransfuzat, un alloanticorp care aglutinează leucocitele altor subiecţi. Aceasta stă la srcinea
descoperirii sistemului allotipic HLA (human leucocyte locus A), evidenţiat la nivelul leucocitelor,
apoi la majoritatea celulelor. Există o împărţire a sistemului HLA pe mai multe gene HLA-A, HLA-
B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP şi HLA-DQ. Studiul supravieţuirii grefelor cutanate, între donor şi
receptor HLA identic sau diferit a dovedit că sistemul HLA corespunde genetic şi funcţional cu
MHC uman.
· Răspunsul imun. Rolul fiziologic a fost descoperit ulterior. Proprietatea de a răspunde la un
anumit antigen depinde de genele MHC, numite din acest motiv gene ale răspunsului imun.
165
Genele HLA posedă trei caracteristici importante:
1 - fiecare genă este polialelică (cu excepţia HLA-DRA), fiind evidenţiate peste
50 de alele în sistemul MHC uman; aceasta este principala caracteristică a HLA ce face ca
organismul uman să fie capabil de recunoașterea a miliarde de antigene din natură prin
arsenalul de MHC cu conformație specifică fiecărui antigen.
2. - la un subiect heterozigot, sunt exprimate două alele diferite;
3 -toate genele situate pe acelaşi cromozom se transmit în bloc
descendentului, sub formă de haplotip.
Moleculele HLA aparţin superfamiliei imunoglobulinelor, modelul lor structural de bază fiind
motivul imunoglobulinic cu o punte disulfidică intramoleculară.
Sistemul HLA este împărțit în două grupe principale: HLA clasa I și HLA clasa II, denumirea
respectând cronologia descoperirii lor, și nu organizarea pe cromozom. Există și HLA clasa III (nu
este implicată în histocompatibilitate).
Aceste molecule sunt heterodimeri formaţi prin legătură noncovalentă între un lanţ greu
polimorf a şi un lanţuşor nonpolimorf β2m (Figura nr. 2)
· lanţul greu a (44 kDa) este o proteină transmembranară cu polimorfism alelic, codată de o
genă a sistemului HLA; cuprinde 3 domenii extracelulare, o porţiune transmembranară şi o
parte intracitoplasmatică scurtă;
· lanţul β2m (11,5 kDa) este codat de o genă de pe cromozomul 15 şi cuprinde un singur
domeniu; este extracelular, legat noncovalent de lanţul a.
Moleculele HLA-I sunt prezente pe majoritatea celulelor organismului, formând pe suprafața
acestora un receptor constitutiv. Dintre celulele anucleate, aceste molecule sunt adesea
absente la nivelul globulelor roşii dar prezente în cantitate mare la nivelul plachetelor sanguine.
Expresia lor pe celulele nucleate este variabilă, în funcţie de tipul celular: pe limfocitele T sau B
şi polimorfonucleare sunt exprimate 104-5´105 molecule/celulă în timp ce pe hepatocite sunt
slab exprimate iar pe celulele nervoase şi spermatozoizi aproape lipsesc.
Pentru HLA-I există 3 gene ce codifică antigene majore de histocompatibilitate: HLA-A, HLA-B,
HLA-C și 3 gene pentru antigene minore: HLA-E, HLA-F, HLA-G.
166
Moleculele clasei a II-a au fost descoperite şi la nivelul endoteliului vascular şi al celulelor
epiteliale ale intestinului gros.
În cazuri patologice, moleculele clasei a II-a au fost depistate la nivelul celulelor β din insulele lui
Langerhans în diabetul insulinodependent, al canalelor biliare în ciroza biliară primitivă şi al
celulelor tiroidiene în afecţiunile tiroidiene autoimune.
Expresia moleculelor este indusă de mediatori precum: IFN-g, TNF-a şi β, IL-4, IL-13 şi GM-CSF
cu rol esențial în răspunsul imun. Prostaglandina E2 inhibă sinteza lor pe monocite / macrofage.
Regiunea HLA-II conține gene ce codifică HLA-DR, DQ, DP, DM, și pe lângă acestea, câteva
molecule accesorii: PSMB8, PSMB9, TAP1, TAP2, BTNL2.
Au rol în principal în reacţia imună care implică intervenţia LTc. Moleculele HLA I prezintă un
peptid endogen sintetizat de o celulă contaminată de o bacterie/un virus/un parazit cu
dezvoltare intracelulară sau un peptid endogen rezultat din degradarea unor celule self
tumorale sau îmbătrânite către receptorul de antigen (TCR) al limfocitului T CD8+. Se va obţine
astfel un răspuns imun celular prin activarea şi multiplicarea LTc având ca rezultat liza celulelor
ţintă ce au prezentat antigenul prin HLA-I. (Figura nr. 4)
167
Ele intervin în principal în răspunsul imun în care sunt implicate APC şi LTh. Moleculele HLA II
prezintă limfocitului Th CD4+ peptide de srcine exogenă, provenite din proteinele endocitate şi
degradate de APC. (Figura nr. 5)
Etape:
a) Legarea antigenului exogen de molecula HLA clasa II:
1. Endocitoza - particulele antigenice (bacterii, proteine străine) sunt internalizate nespecific de
monocite / macrofage sau specific de limfocitele B prin IgM. Ele urmează calea endocitozei;
2. Generarea peptidelor antigenice - prin fuzionarea endozomilor cu lizozomii, proteinele sunt
degradate în peptide prin activarea proteazelor lizozomale la un pH acid;
3. Asocierea cu HLA II - moleculele HLA clasa II-a sintetizate în reticulul endoplasmic sunt
asociate, sub forma unui complex, cu o proteină accesorie, lanţul invariabil II. Aceasta împiedică
legarea peptidelor endogene de HLA-II prin blocarea situsului de legare în timpul si ntezei sale și
permite legarea peptidelor exogene prin distrugerea lanţului după terminarea sintezei;
4. Trecerea prin membrana celulară - ansamblul HLA-II-peptid exogen este exprimat la suprafaţa
APC. (Figura nr. 6)
a.) cu rol în imunitate şi inflamaţie: componentele complementului C2 şi C4, TNF, HSP (proteina
de şoc termic);
b.) cu rol enzimatic: CYP21
Orice celulă care prezintă un tip de HLA diferit de cel al organismului este considerată non-self,
un „invadator”, iar rezultatul este acela de rejecţie a ţesutului compus din respectivele celule.
Din cauza importanţei HLA în transplant, locusurile HLA sunt printre cele mai frecvent serotipate
sau analizate prin PCR faţă de oricare alte alele autozomale.
168
În diferite studii, s-a analizat importanţa compatibilităţii HLA în transplantul de inimă, rinichi,
celule stem hematopoietice.
Polimorfismul sistemului HLA este foarte mare şi de aceea probabilitatea ca organele donoare
să fie potrivite primitorului este foarte mică. În transplanturi a existat practica de a se aloca
organe fără a se lua în considerare compatibilitatea HLA donor-receptor. De aceea, în trecut, nu
a fost posibilă analizarea corespunzătoare a ratei de succes a transplantului cu organe
compatibile HLA. Într-un studiu realizat pe 8.331 de pacienţi, internaţi în 104 centre din 24 state
din USA, doar 128 subiecţi au primit câte o grefă cardiacă compatibilă HLA (A, B sau DR) sau
doar cu o singură incompatibilitate. S-a observat supravieţuirea ţesutului pe o durată de 3 ani,
iar rezultatele au fost dependente de sistemul HLA. Astfel, au avut succes: la compatibilitate
maximă 83±4% transplanturi faţă de 76 ±2% transplanturi la 2 nepotriviri. Aşadar,
supravieţuirea grefei în transplantul de cord este semnificativ influenţată de compatibilitatea
HLA.
Există două tipuri de incompatibilitate: a antigenelor (detectabilă serologic) şi a alelelor
(detectabilă prin metode de analizare a ADN-ului). Într-un studiu s-a testat ipoteza conform
căreia incompatibilitatea alelelor este mai puţin imunogenă decât incompatibilitatea
antigenelor şi, astfel, este mai puţin asociată cu rejecţia de transplant cu celule stem
hematopoietice. Peste 450 de pacienţi cu leucemie mieloidă cronică au primit transplant de
măduvă de la donori diferiţi. Prin secvenţierea ADN, s-au analizat alelele clasei I HLA (A, B, C) şi
s-au observat ratele de respingere a grefei la transplanturile fără nici o incompatibilitate, la cele
cu o singură incompatibilitate a alelelor sau a antigenelor sau la transplanturile cu 2 sau mai
multe nepotriviri. Rezultatele au confirmat ipoteza şi, astfel, riscul rejecţiei de transplant a fost
semnificativ mai mare la cei cu o incompatibilitate antigenică HLA, faţă de cei cu o
incompatibilitate alelică. Riscul a fost de asemenea crescut la cei cu mai multe nepotriviri HLA şi
la primitorii homozigoţi HLA în locusul de incompatibilitate. În concluzie, transplanturile de la
donori cu o singură incompatibilitate a alelelor HLA au un risc scăzut de rejecţie şi pot fi
realizate cu succes. În schimb, incompatibilitatea de antigene HLA, detectabilă serologic, creşte
riscul de respingere a ţesutului.
169
Pe de altă parte, genotipurile HLA pot guverna receptivitatea la anumite vaccinuri. Spre
exemplu, subiecţii care au alela HLA-DR3 sunt, într-o proporţie crescută substanţial, nereceptivi
la vaccinarea cu antigenul de suprafaţă al hepatitei B. Totodata, indivizii cu HLA -DRB1*03 sau
HLA-DQA1*0201 au o incidenţă crescută de seronegativitate la vaccinarea împotriva pojarului.
(3)
Un studiu realizat de curând pe cetăţeni americani caucazieni certifică faptul că homozigoţii
HLA-DR13-DQ6 prezintă risc crescut de asociere a distoniei cervicale. (4)
O altă boală cu caracter autoimun şi conexiuni certe cu sistemul HLA este scleroza multiplă. (5-
6)
Recent s-a fundamentat ideea conform căreia există o clasă nouă de LT care recunosc antigene
prezentate de molecule ce nu sunt MHC-I sau MHC-II. Una dintre aceste clase de LT foloseşte un
receptor pentru antigen ce recunoaşte antigene lipidice prezentate pe molecule CD1. CD1 sunt
asemănătoare structural cu MHC-I, însă lanţurile CD1 formează un situs ce poate acomoda
componente glicolipidice ale patogenilor microbieni. Astfel, complexele CD1-glicolipide servesc
drept ţintă pentru recunoaşterea de către LT ce au un tip special de receptor: γδ TCR. Această
prezentare a glicolipidelor microbiene pe molecule CD1 pare să fie responsabilă de
recunoaşterea independentă de MHC a mycobacteriilor. (3)
Cititorul care doreşte să aprofundeze unele dintre aspectele menţionate în acest capitol poate
să acceseze informaţiile oferite de site-urile de mai jos sau şi alte site-uri.
1. Early selection in Gag by protective HLA alleles contributes to reduced HIV-1 replication
capacity that may be largely compensated in chronic infection,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20810731
2. Additive contribution of HLA class I alleles in the immune control of HIV-1 infection.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20660184
3. The impact of HLA genotyping on survival following unrelated donor haematopoietic stem
cell transplantation, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20560963
4. Impact of human leukocyte antigen matching on hepatitis B virus recurrence after liver
transplantation, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20382583
170
E. imunogenicitatea.
1. Reveille JD., 2009, Recent studies on the genetic basis of ankylosing spondylitis, Current
Rheumatology Reports., 11(5), 340-8
2. Caillat-ZuchmanS., 2009, Molecular mechanisms of HLA association with autoimmune
disease, Tissue Antigens, 73 (1), 1-8
3. David D Chaplin, 2010, Overview of the immune response, Journal of Allergy and Clinical
Immunology, 125 (2 Suppl 2), S3-23
4. Deitiker PR, Oshima M., Jankovic J., Duane DD., Aoki KR., Atassi MZ., 2010, Association of HLA
Clas II alleles and haplotypes with cervical dystonia: HLA DR13-DQ6 (DQB1*0604) homozygotes
are at greatley increased risk of cervical dystonia in Caucasian Americans, Autoimmunity, Epub
ahead of print
5. Romero-Pinel L., Pujal JM, Martinez-Yelamos S., Gubieras L, Matas E., Bau L., Torrabadella M.,
Azqueta C., Arbizu T., 2010, HLA-DRB1: genetic susceptibility and disability progression in a
Spanish multiple sclerosis population, European Journal of Neurology, Epub ahead of print
6. Link J., Lorentzen AR., Kockum I., Duvefelt K., Lie BA., Celius EG., Harbo HF., Hillert J., Brynedal
B., 2010, Two HLA class I genes independently associated with multiple sclerosis, Journal of
Neuroimmunology, Epub ahead of print
171
Interacţiunile între celulele imunitare se realizează prin două mecanisme complementare:
· contactul celular strâns, care necesită prezenţa moleculelor de adeziune (direct);
· prezenţa factorilor stimulatori, citokine, secretate de una din cele două celule aflate în
contact sau, uneori, de o celulă aflată la distanţă (indirect).
Rezultatul va fi activarea sau inhibarea funcţiei celulare, ca urmare a transportului informaţiei
prin mesagerii secunzi spre organitele intracitoplasmatice, membrana celulară sau genele
nucleare.
Contactul între două celule nu se face spontan. Rolul moleculelor de adeziune este complex şi
nu se limitează la procesele imunologice.
Legăturile intercelulare asigurate de liganzi sunt reacţii chimice clasice specifice, saturabile şi
reversibile.
Clasificarea moleculelor de adeziune se poate face în două moduri, structural şi funcţional.
172
β2-integrinelor stimulează proliferarea limfocitelor T, la contactul cu celulele dendritice; cresc
sinteza de citokine (β1 şi β2-integrinele stimulează producţia de TNF-a şi β a celulei T; β2-
integrinele stimulează producţia de IL-1β a monocitelor, la contactul cu limfocitul T).
Integrinele au două stadii conformaţionale, cu specificitate diferită faţă de substrat (Figura nr.
1). Acestea sunt influenţate de procese celulare interne de fosforilare ce induc schimbări
conformaţionale, ca răspuns la factori din mediu (vezi secţiunea de integrare a cunoştinţelor:
recrutarea celulelor din torentul sangvin).
Caderinele sunt formate dintr-un singur lanţ polipeptidic şi sunt exprimate constitutiv pe
suprafaţa celulelor. Au rol în legarea intercelulară prin aderarea unora de altele, pe celulele
adiacente, printr-un mecanism calciu-dependent. Prin funcţia lor asigură integritatea epiteliilor.
Caderinele sunt clasificate în patru subfamilii:
· E-caderine (pe epitelii),
· V-caderine (pe endoteliu),
· P-caderine (placentare),
· N-caderine (în sistemului nervos central şi ochi).
Această moleculă este exprimată pe suprafaţa a 2/3 din LT mature circulante, definind subsetul
de LT CD4+. Molecula CD4 este prezentă şi pe suprafaţa celulelor dendritice cutanate şi pe
173
monocitele/macrofagele activate. Este o moleculă de 55-67 kDa, cu o parte extracelulară
compusă din 4 domenii din superfamilia Ig, care recunoaşte o parte constantă situată la nivelul
domeniului β2 a moleculei HLA II.
Această moleculă este exprimată pe suprafaţa a 1/3 din LT mature circulante. Defineşte
subsetul de LT cu activitate citotoxică şi unele celule NK (în proporţie mai mică) (Figura nr. 2).
Molecula CD8 este homodimerică (CD8a/CD8a) sau heterodimerică (CD8a/CD8b). Rolul său
primordial este să asigure interacţiunea cu o parte monomorfă a moleculei HLA I, pentru
recunoaşterea domeniului a3 al acestei molecule. Molecula CD8, ca şi molecula CD4, este
asociată cu tirozinkinaza.
NB. Pentru mai multe informații despre apoptoză, vezi capitolul Toleranţă Imunologică.
Molecula CTLA-4 nu este exprimată decât de LT CD4+ sau T CD8+, într-o proporţie mai mică
decât molecula CD28 dar cu o afinitate de 20 de ori mai mare pentru molecula B7. Interacţiunea
cu APC poate induce inhibiţie şi chiar apoptoză.
NB. CTLA-4 competiţionează cu CD28 pentru legarea moleculei B7, exprimată pe membrana
APC. Datorită efectelor discrepante – activatoare/inhibitoare – se pune problema înţelegerii
modului în care LT va traduce semnalul primit.
1). Dacă APC este activat de prezenţa în mediu a citokinelor pro-inflamatorii (ex. IL–2), va
prezenta un număr mai mare de molecule B7, favorizând legarea CD28, iar semnalul transmis va
fi activator (Figura nr. 4).
174
2). În cazul în care APC este puţin activat, va exprima pe membrana sa puţine molecule B7.
Acest fapt va oferi un avantaj de legare moleculelor cu afinitate mai mare, aşa încât majoritatea
moleculelor legate vor fi de tip CTLA-4 (CD80), iar semnalul transmis va fi inhibitor (Figura nr. 5).
Raportul semnalului activator/inhibitor transmis de aceste cupluri moleculare este modulat de
factorii de mediu şi decide comportamentul ulterior al LT (vezi capitolul „Toleranţă
Imunologică” pentru mai multe detalii).
· Molecula LFA1 corespunde integrinei aL/β2 (CD11a/CD18). Prezenţa sa este relativ difuză la
nivelul diferitelor leucocite (neutrofile, monocite, LT, LB şi LT de memorie).
· ICAM1 (CD54), ICAM2 şi ICAM3 sunt puternic exprimate la nivelul LT citotoxice şi permit
activarea lor. ICAM1 se găseşte pe neutrofile în repaus, celule endoteliale, monocito/macrofage
şi LB activate.
Aceste două cupluri de adeziune permit recunoaşterea şi interacţiunea între LT CD4+ şi APC sau
între LT CD8+ şi celula ţintă, proces completat de specificitatea TCR. Conexiunea constituită
între LT CD4+ şi APC a fost numită „sinapsă imunologică”, subliniind transferul informaţional
implicat în recunoaşterea epitopului exprimat pe moleculele MHC II de către TCR (Figura nr. 6).
175
Citokinele sunt substanţe proteice, solubile, cu greutate moleculară mică, 8 -70 kDa. cel mai
frecvent sunt sintetizate de către celule după activare prealabilă, acţionând ca mediatori asupra
altor celule sau asupra lor însăşi, în cantităţi foarte mici, de ordinul pico sau nanogramelor. În
momentul de faţă au fost identificate peste 100 de molecule diferite de citokine. O parte dintre
citokine au în special efecte „chemotactice” şi din acest motiv au fost numite chemokine.
Termenii de limfokine (substanţe sintetizate de limfocite) sau de monokine (provenind din
monocite) nu se mai folosesc deoarece citokinele sunt sintetizate de o gamă mult mai largă de
celule. Termenul de interleukine, care indică o acţiune între două leucocite, a persistat şi
continuă să persiste în denumirea prescurtată, de la IL-1 la IL-35.
Termenul de citokine pare să fie cel mai adecvat. În unele cazuri, denumirea provine de la una
din activităţile care au permis descoperirea citokinei: TNF (tumor necrosis factor), IFN
(interferon), GM-CSF (granulocyte/monocyte-colony stimulating factor), G-CSF (granulocyte-
CSF), M-CSF (monocyte-CSF), TGF (transforming growth factor). În afara sistemului imun şi
hematopoietic au fost descoperiţi şi alţi factori de creştere: NGF (nerve growth factor), FGF
(fibroblast growth factor), EGF (epithelial growth factor) etc.
Citokinele acţionează datorită prezenţei receptorilor specifici, desemnaţi prin denumirea lor
engleză: IL-1R, IL-2R, TNF-R etc. Ei sunt prezenţi uneori pe aceeaşi celulă care a sintetizat
citokina (efect autocrin) sau pe alte celule (efect exocrin). O clasificare atotcuprinzătoare a
citokinelor este foarte dificilă, din punct de vedere funcţional, pentru motivele prezentate (şi
care reprezintă un „punct” din „cutia Pandorei” la care se face uneori referire, atunci când sunt
luate în discuţie aceste structuri). Din punct de vedere didactic (şi funcţional), vom încerca să
prezentăm în continuare o grupare a celor mai cunoscute dintre citokine.
În cadrul procesului infecţios, diferitele microorganisme care au sau dobândesc prin variabilitate
un efect de agresiune faţă de organismul gazdă, antrenează un răspuns la nivelul endoteliului
vascular; una dintre primele reacţii este reprezentată de mobilizarea leucocitelor
polimorfonucleare neutrofile (PMN). În această etapă intervin şi o serie de citokine.
TNF-α este produs de monocite / macrofage dar şi de diverse alte celule (limfocite T, limfocite B,
celule NK, fibroblaste, mastocite, bazofile, celule gliale etc), ca reacţie la contactul cu diferite
bacterii sau lipopolizaharidele din peretele germenilor Gram-negativi. Sursa cea mai importantă
pentru TNF-α rămâne însă sistemul monocito-macrofagic. TNF-α favorizează expresia
moleculelor de adeziune la nivelul endoteliului vascular şi al monocitelor; atrage către sediul
procesului infecţios alte monocite şi leucocitele PMN. Are o activitate anti-virală, anti-parazitară
şi anti-tumorală. Stimulează lipoliza, glicoliza musculară şi reabsorbţia osoasă prin care poate
antrena apariţia caşexiei (TNF a fost numit iniţial caşexină). Induce formarea altor mediatori ai
inflamaţiei (leucotriene, PAF). Formarea sa este la rândul său indusă de IFN, IL-1, factori de
creştere sintetizaţi de monocit, endotoxinele bacteriilor Gram-negative, diferite virusuri,
bacterii, unele componente ale sistemului complement, leucotriene şi prostaglandine.
Eliberarea TNF-α este inhibată de glucocorticoizi, α2-macroglobuline, α2-antitripsină etc. TNF-β
176
este sintetizat de LT activate şi celule NK şi are acţiuni identice cu TNF-α, acţionând pe acelaşi
tip de receptori. În momentul de faţă este clasificat între limfotoxine (LT-α).
Sunt două citokine cu rol asemănător. Sunt produse de numeroase celule: monocite,
macrofage, LT, LB, celule endoteliale vasculare, keratinocite (din piele), astrocite şi celule gliale
(din creier) etc.
IL-1 se găseşte sub două forme: IL-1a fixată la membrană şi IL-1β secretată. Experimental a fost
demonstrat că stimularea cu orice structură microbiană a celulelor care î n mod potenţial
sintetizează IL-1 va duce la sinteza acestor molecule (IL-1a şi IL-1β). Ele sunt codificate de gene
diferite dar recunosc aceeaşi receptori: primul receptor IL-1R1 induce transducţia informaţiei la
nivel celular, în timp ce IL-1R2 nu induce un semnal celular. IL-1α are funcţie imunologică,
activând la nivel superior LTh, care se vor divide mitotic şi se vor diferenţia în diverse clase. IL-
1β, eliberată în spaţiul extracelular şi în sânge, exercită o puternică acţiune proinflamatorie.
Celulele care sintetizează IL-1 produc câteva ore mai târziu un antagonist al receptorului de IL-1,
numit IL-1Ra, care face ca acţiunea IL-1 să fie tranzitorie. IL-1 induce creşterea expresiei
moleculelor de adeziune; activează limfocitele T şi B; creşte sinteza proteinelor de fază acută la
nivel hepatic; creşte catabolismul celulelor musculare şi al osteoclastelor (rezorbţie osoasă);
activează sistemul nervos central cu febră, anorexie şi insomnie. Fiind şi prima interleukină
numită ca atare, IL-1 a fost considerată iniţial drept o moleculă piretogenă. Inocularea de IL-1 la
subiecţi umani conduce la apariţia febrei şi frisonului. Concentraţia de IL -1 din plasmă poate să
crească şi în condiţii fiziologice (ex. în stres nepatologic, exces de vitamină A, în timpul
menstruaţiei).
IL-6 are o acţiune atât asupra sistemului imun cât şi asupra unor celule care nu aparţin acestuia,
asemănătoare cu aceea a Il-1, cu o singură diferenţă: ea acţionează mai ales pe maturaţia
terminală a LB în plasmocite şi pe diferenţierea LT citotoxice. Ca şi IL-1, produce proteoliză
endogenă, induce sinteza proteinelor inflamatorii la nivel hepatic (fibrinogen, haptoglobină, α1-
antitripsină, proteină C reactivă etc) şi activează sistemul nervos central conducând la apariţia
febrei, anorexiei, somnolenţei etc. IL-6 induce sinteza de imunoglobuline; are şi rol în maturarea
celulelor pe linia megakariocitară. Sinteza IL-6 este stimulată de IL-1.
Limfotoxina (LTx) a fost identificată în urma efectului citotoxic exercitat de limfocitele activate,
ulterior a fost sintetizată şi caracterizată, dar s-a dovedit că nu există un singur factor de acest
tip, ci o serie de substanţe care ar putea fi grupate într-o „superfamilie”. Iniţial LT-α, o
limfotoxină solubilă, a fost definită drept factor de necroză tumorală (TNF-β). Dintre numeroşii
membri ai superfamiliei limfotoxinelor menţionăm LT-α şi LT-β, sintetizate în special de LT şi LB
activate, dar şi de către celulele NK sau celule LAK (lymphokine activated killer cells). Au rol în
etapele de iniţiere a inflamaţiei şi se pare că au un rol în realizarea unei protecţii faţă de
agresiunea microbiană.
Dintre efectele pro-inflamatorii ale IFN-γ amintim activarea macrofagelor (acest interferon este
probabil cea mai importantă substanţă care produce „trecerea” macrofagelor de la o stare „ în
aşteptare” la starea activă, bactericidă) şi astfel intervine în fazele iniţiale ale inflamaţiei dar şi în
177
diferenţierea clonelor de limfocite care reacţionează faţă de structurile bacteriene agresoare
(Figura nr. 7). Alte efecte vor fi prezentate în următoarele subpuncte.
Acţionează atât asupra celulelor hematopoietice cât şi asupra altor celule. Dacă iniţial s -a
considerat că are efecte pro-inflamatorii, în momentul de faţă se cunoaşte faptul că, prin
efectele inhibitorii asupra monocitelor, neutrofilelor, celulelor dendritice, este de fapt o
interleukină cu efect anti-inflamator. A fost numită şi „factor de inhibare al macrofagelor”.
Cunoscută drept o substanţă care induce sinteza de IFN-γ, IL-12 are şi alte efecte de stimulare a
răspunsului inflamator al gazdei, în urma unui proces infecţios. Sursa cea mai importantă de IL-
12 este reprezentată de celulele dendritice.
Iniţial a fost considerată o chemokină pentru LT Helper (CD4 +), dar poate exercita astfel de
activităţi şi faţă de alte celule implicate în procesul infecţios şi în inflamaţie. Sursa principală de
IL-16 este reprezentată de LT CD8+.
A fost considerată drept o moleculă care induce sinteza de IFN-γ. Ulterior s-a dovedit că singură,
nu duce la o stimulare eficientă, dar în asociere cu IL-12, efectul de stimulare al sintezei de IFN-γ
demonstrează sinergism. IL-18 este sintetizată în special de macrofagele activate şi de către
celulele dendritice, dar există şi alte celule producătoare de IL-18 (monocite, keratinocite, celule
epiteliale intestinale etc). Are efecte pro-inflamatorii, efecte în procesul infecţios declanşat de o
serie de bacterii (ex. Listeria spp.), paraziţi (ex. Cryptococcus neoformans) sau virusuri (ex.
virusul gripal), efecte anti-tumorale şi intervine în patogenia unor boli în care există inflamaţie
cronică sau în boli autoimune.
Este o citokină înrudită cu IL-10, dar cu puternice proprietăţi pro-inflamatorii. Într-un studiu pe
celule pulmonare, s-a demonstrat un răspuns semnificativ IL-22 mARN la 6 ore de la debutul
infecţiei cu Klebsiella pneumoniae. Răspunsul indus în celule cultivate în prezența aceastei
178
citokine, este de exprimare a moleculelor defensive în celulele epiteliale traheale. Unul din
efectele induse de această citokină este exprimarea moleculei lipocalin-2, cu rol în sechestrarea
fierului. Într-un model de infecţie colonică s-a demonstrat că lipsa IL-22 duce la instabiltatea
barierei epiteliale şi diseminare bacteriană.
Are efecte asemănătoare cu IL-12, exercitate în combinaţie cu IL-12. Este sintetizată mai ales de
celulele dendritice.
179
Citokinele cu rol în răspunsul imun celular au ca sursă de provenienţă limfocitele Th1. În această
categorie sunt incluse următoarele citokine.
este produsă în special de LT CD4+ de tip Th0 şi Th1 (cu rol în RIP de tip celular)
activate şi într-o mai mică măsură de celulele NK şi de celulele dendritice. Şi LT Th2 (cu rol în RIP
de tip umoral) pot sintetiza IL-2. IL-2 acţionează asupra diferitelor celule cu rol în imunitate
[asupra limfocitelor T acţionează printr-un mecanism autocrin, antrenând proliferarea şi
activarea spre subsetul Th1 dar şi Th2; transformă celulele Nk în celule LAK (lymphokine
activated killer cells); antrenează proliferarea limfocitelor B]. Acţionează sinergic cu IL-12 şi IFN-
γ stimulând activitatea citotoxică a celulelor NK. IL-2 a fost prima dintre interleukine care a fost
caracterizată până la nivel structural. Este o interleukină cu 133 aminoacizi, o greutate
moleculară de 15,5 kDa; gena care codifică sinteza de IL-2 se găseşte pe cromozomul 4.
este produs de limfocitele Th1; sursa esenţială pentru această interleukină este
reprezentată de celulele NK. Rolul principal al IFN-g este activarea macrofagelor, cu producerea
speciilor reactive ale oxigenului şi NO, cu efect bactericid asupra microorganismelor
intracelulare. Prin acţiunea sa anti-Th2, reduce răspunsul imun umoral. IFN-γ controlează funcţii
imune implicate în apărarea antibacteriană, antivirală şi antiparazitară.
Aceste citokine sintetizate de ex. de către limfocitele Th2 şi unele mastocite, orientează
răspunsul imun umoral spre diferitele clase şi subclase de imunoglobuline.
stimulează RIU la nivelul mucoaselor. Intră în acţiune mai târziu, alături de IL-2,
permiţând multiplicarea LB. IL-5 are rol de factor de creştere pentru leucocitele
polimorfonucleare eozinofile dar are efecte stimulatoare şi asupra bazofilelor. La fel ca şi IL-4 şi
IL-5, are rol hematopoietic. Stimulează sinteza de Ig A de către limfocitele B. Datorită efectelor
menţionate, un tratament novator al afecţiunilor datorate hipersensibilităţii de tip I ar putea să
se adreseze tocmai IL-5 (medicamente anti- „alergice” care să aibă drept ţintă molecula IL-5).
· Printre numeroasele sale activităţi, IL-6 este o citokină proinflamatorie, cu acţiune tardivă
în procesul de maturaţie a imunoblastelor în plasmocite.
180
induce diferenţierea iniţială a liniei de celule B. IL-10 inhibă citokinele proinflamatorii
şi sinteza de IFN-g, comportându-se ca o citokină reglatorie negativă pe subsetul Th1. Are de
asemenea şi rol stimulator, în cazul maturării mastocitelor, în cazul apărării antivirale şi
antitumorale, precum şi rol chemoatractant pentru limfocitele T (CD8+).
este produsă de LT Th2 activate (dar există şi clone de LT Th1, Th0 sau LT CD8+ care
pot sintetiza această moleculă). IL-13 inhibă sinteza citokinelor proinflamatorii şi, ca şi IL-4,
stimulează sinteza IgE.
Aceste molecule de adeziune cuprind aproximativ 50 de membri divizaţi în mai multe familii
(CC, CXC, XC, CX3C). Denumirea familiilor şi moleculelor aferente a fost standardizată în raport
cu structura chimică, pe baza numărului şi poziţionării grupărilor de cisteină. Numele
receptorilor chemokinelor (citokine cu rol în chemotaxie) se stabileşte pornind de la grupul de
litere prezentat, la care se adaugă litera R şi un număr, în timp ce liganzii conţin litera L şi un
număr. Ele prezintă o activitate chemotactică faţă de limfocite, monocite, eozinofile etc.
Neutrofilele, de exemplu, exprimă receptori CXCR1 şi CXCR2, în timp ce eozinofilele, bazofilele şi
monocitele exprimă receptori CCR1, CCR2, CCR3 şi CCR5. Aceste structuri există în permanenţă
pe suprafaţa celulelor normale circulante şi pot f i detectate prin metode de laborator.
Majoritatea liganzilor sunt molecule solubile, ce se secretă în torentul circulator, în timp ce unii
liganzi (CX3CL1, CXCL16) conţin o porţiune transmembranară, permiţând ancorarea celulelor de
endoteliul vascular în condiţii de flux fiziologic. Prin intermediul acestor receptori, celulele
menţionate vor reacţiona la stimulul primit de la celulele endoteliale sau de la alte celule
agresate de toxine bacteriene; un alt stimul este reprezentat de citokinele pro-inflamatorii (ex.
IL-1, TNF, IFN etc). Trebuie menţionat că studiile arată tot mai des rolul chemokinele în procese
patologice, precum ateroscleroză, scleroza multiplă etc.
Hematopoieza este controlată de către un sistem fiziologic autoreglabil, prin care se menţine un
compartiment de celule stem şi un compartiment de diferenţiere pentru toate liniile sanguine.
Sistemul necesită un echilibru între sinteza osoasă şi menţinerea unui spaţiu hematopoietic
medular graţie echilibrului între osteoblaste şi osteoclaste. În procesul de proliferare şi
diferenţiere a celulelor stem intervin numeroase citokine:
(stem cell factor) provine în principal din celulele stromale ale măduvei osoase. SCF
este produs atât în formă solubilă cât şi într-o formă legată de membrana citoplasmatică.
181
3 se află pe cromozomul 5. Rolul său este de-a stimula proliferarea şi diferenţierea celulelor
stem spre diferitele linii.
Stimularea celulară debutează prin interacţiunea unui număr mare de receptori membranari
celulari. Alături de moleculele de adeziune şi receptorii de citokine, mai trebuie amintiţi
receptorii pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor (FcR) şi receptorii pentru complement
(CR). Aceştia au o importanţă sporită în recunoaşterea patogenilor şi reprezintă startul
procesului de procesare antigenică în cadrul răspunsului imun înăscut.
Transducţia semnalului primit necesită intervenţia mesagerilor secunzi, care transmit informaţia
printr-o reacţie în cascadă, până la nivelul membranei celulare, al organitelor
intracitoplasmatice sau al nucleului. În acest ultim caz, este vorba de o acţiune asupra unor
gene, care va antrena sinteza unor proteine sau activarea ciclului celular (modificări
transcripţionale).
Întregul mecanism este complex şi necesită interacţiunea între partea intracitoplasmatică a
receptorilor membranari şi mesagerii secunzi. În unele cazuri, molecula receptor membranar
care primeşte semnalul extracelular comunică direct cu mesagerii secunzi printr-un motiv
intracelular (de exemplu, motivul activator ITAM). În alte cazuri, molecula receptor cu o parte
intracelulară limitată la câţiva aminoacizi, este asociată la alte molecule, fomând adevărat e
domenii de amplificare a semnalului (molecular scaffolds). Partea intracelulară astfel dezvoltată
poartă motivul de interacţiune cu mesagerul secund. În acest sens pot fi citate diverse exemple:
complexul CD3 al TCR, moleculele Iga şi Igβ ale BCR, moleculele gc ale receptorilor membranari
pentru interleukine. (Figurile nr. 9-10)
182
Primii mediatori ai inflamaţiei sunt molecule preformate, cu caracter nespecific ce apar ca
rezultat al agresiunii tisulare (reflex axonal – epinefrină, activarea mastocitelor rezidente –
histamină, sau ca urmare a activării cascadei coagulării – trombină). Aceşti mediatori sunt
responsabili de modificările reologice specifice inflamaţiei şi de recrutarea leucocitară prin
activarea celulelor endotelialiale adiacente.
Consecinţele sunt permeabilizarea patului vascular şi expunerea pe versantul circulator a
moleculelor de adeziune. P- şi E-selectinele sunt primele expuse, având rol în marginalizarea
leucocitelor din torentul sangvin (Figura nr. 11). Un antigen glicozilat de pe leucocite joacă rol
de ligand (Sialyl-Lewis X) pentru cele două selectine, ducând la contactul celulelor cu endoteliul,
cu rol în încetinirea leucocitelor – rolling leucocitar (adeziunea este insuficient de puternică
pentru a constitui o legătură fermă).
Citokinele (IL–1 şi TNF–a) duc la exprimarea pe endoteliul activat a moleculelor immunoglobin –
like (ICAM-1). Acestea sunt liganzi pentru integrine aflate pe suprafaţa leucocitelor (LFA -1 şi
Mac-1). Chemokine solubile din focarul inflamator (ex: IL-8) leagă receptori specifici de pe
membrana leucocitară (IL-8R). Ca urmare a semnalizării intracelulare determinată de citokine,
se induc schimbări conformaţionale în structura integrinelor (semnalizare „inside-out”).
Integrinele trec astfel de la stadiul conformaţional cu afinitate redusă la cel cu afinitate crescută
pentru ligandul lor. Rolul integrinelor este de a stabili o adeziunea fermă a leucocitelor la
endoteliu. Urmează reorganizarea scheletului celular şi diapedeza leucocitară mediată tot de
integrine (semnalizare „outside-in”).
Povestirea adevărată este preluată din literaură şi subliniază mai multe principii care merită
însuşite încă din anul al 2-lea de studenție. Introducerea în practica medicală curentă a unui nou
medicament reprezintă concomitent un maraton (întrucât durează în jur de 15 ani) cât şi un
concurs (între companii farmaceutice, echipe de cercetare). Există însă un proces riguros de
testare ce trebuie urmat cu strictețe. Studiile sunt coordonate astfel încât se efectuează studii
de siguranţă şi de eficacitate, pe modele celulare, apoi animale de laborator, iar abia în final pe
oameni (voluntari). De multe ori însă, rezultatele foarte promiţătoare ale studiilor preclinice
sunt ”dărâmate” de ineficienţa noilor substanţe în clinică. Aceste date conflictuale trebuie
foarte bine investigate şi trebuie efectuat un bilanţ riguros care să aibă drept scop binele
pacienţilor. Toate aceste faze trebuie foarte bine documentate şi supervizate.
Prima etapă a studiilor clinice, o reprezintă validarea siguranţei de administrare la tineri
voluntari sănătoşi.
Asemănător terapiilor cu anticorpi anti-CTLA4 sau cu IL-2 pentru activarea limfocitelor T,
investigaţiile preclinice au arătat un potenţial beneficiu în folosirea anticorpilor direcţionaţi anti-
CD28, cu acţiune de superagonişti şi rol de a activa şi expansiona numărul de limfocite T in vivo,
183
independent de stimularea receptorului TCR. În modelul murin, s-a demonstrat că un anticorp
cu aceeaşi specificitate a expansionat preferenţial sectorul CD4+CD25+, de limfocite reglatoare,
având un profil bun de siguranţă.
Noul anticorp, numit TGN1412, fost administrat la 6 voluntari tineri, sănătoşi. În decursul a 90
de minute, voluntarii au suferit evenimente adverse sistemice, polimorfe, ce au fost atribuite
unei descărcări masive de citokine (furtună citokinică/ ”cytokine storm”).
Fenomene asemănătoare au fost identificate într-un număr impresionant de patologii, existând
în continuare destul de multe necunoscute. Toţi pacienţii au prezentat răspuns inflamator
sistemic caracterizat prin eritem, hipertermie, scădere a tensiunii sistolice cu cel puţin 20 mmHg
şi tahicardie compensatorie. Majoritatea pacienţi au dezvoltat o suferinţă pulmonară însoțită
de permeabilizare vasculară şi infiltrare a spaţiilor alveolare cu lichid, ducând la suferinţă severă.
Toţi pacienţii au necesitat tratament suportiv cu intubaţie, tratament de stabilizare
hemodinamică şi dializă, iar tratamentul „specific”, imunomodulator, a constat în administrarea
de anticorpi anti-IL2 şi corticoterapie.
Conform protocolului de studiu, s-au monitorizat limfocitele şi citokinele circulante. S-a
constatat o creștere dramatică a TNF-α la o oră de la infuzia anticorpului cât şi a IL-2, IL-4, IL-10
şi IFN-γ în decurs de 4 ore. Pacienţii cu evoluţia cea mai gravă au avut nivele ridicate de citokine
circulante pentru o durată mai lungă de timp.
Toţi voluntarii au supravieţuit sindromului de răspuns inflamator sistemic (Systemic
Inflammatory Response Syndrome - SIRS). Analiza acestor reacții precum şi publicarea
rezultatelor a contribuit la o mai buna înţelegere a patofiziologiei furtunii citokinice. Mai mult,
urmărirea acestor fenomene, ca evoluţie naturală şi sub tratament a contribuit la înţelegerea
tratamentului. Merită admirat faptul că o poveste „de eşec” pentru o moleculă candidat a fos t
publicată şi a contribuit, în felul acesta, la „viitorul succes” în domeniu.
Cititorul care doreşte să aprofundeze unele dintre aspectele menţionate în acest capitol poate
să acceseze informaţiile oferite de site-urile de mai jos sau şi alte site-uri.
1. Charo IF, Ransohoff RM, 2006, The Many Roles of Chemokines and Chemokine Receptors in
Inflammation, N Engl J Med., 354, 610-621
2. Andersson U, Erlandsson-Harris H,Yang H, Tracey KJ, 2002, HMGB1 as a DNA-binding
cytokine, Journal of Leukocyte Biology, 72, 1084-1091
3. Cai B, Deitch EA, Ulloa L, 2010, Novel Insights for Systemic Inflammation in Sepsis and
Hemorrhage, Mediators Inflamm., Article ID 642462.
4. Lee WL, Slutsky AS, 2010, Sepsis and Endothelial Permeability, N Engl J Med., 363, 689-691
5. Suntharalingam G, Meghan RP, Ward S, Brett SJ et al., 2006, Cytokine Storm in a Phase 1 Trial
of the Anti-CD28 Monoclonal Antibody TGN1412., N Engl J Med., 355, 1018-1028.
184
1. Rolling-ul leucocitar este mediat de interacțiunea:
a. Receptorii pentru chemokine (CXCR) - Chemokine
b. Selectine – Antigen Lewis X
c. Integrine – Receptori de integrine
d. Integrine – Fibrină
2. Inducerea comutării izotipice IgM – IgG este realizată de:
a. TNF alfa
b. IL-1
c. IL-4
d. HMGB-1
3. Descrieţi cuplurile moleculare componente ale sinapsei imunologice.
4. Enumerati rolurile Interferonului Gamma.
5. Au efect imunoinhibitor (răspuns multiplu):
a. TLR
b. IL-4
c. IL-10
d. CTLA-4
e. IL-13
1. The INSIGHT–ESPRIT Study Group and SILCAAT Scientific Committee, Interleukin-2 Therapy in
Patients with HIV Infection. N Engl J Med., 2009, 361(16), 1548-1559
185
Imunoglobulinele sunt glicoproteine cu rol de anticorpi. Imunoglobulinele există în plasmă,
lichid interstiţial şi secreţii şi au capacitatea de a recunoaşte şi de a se combina specific cu
antigenul inductor al răspunsului imun. Lor li se adaugă proteinele patologice cu aceeaş i
structură dar fără activitate de anticorpi. De exemplu, în mielomul multiplu sau în
macroglobulinemia Waldenström's a fost identificată proteina patologică Bence-Jones (poate fi
identificată în sânge sau în urină; este vorba de o sinteză anormală de lanţuri uşoare; a fost
descrisă de H. Bence Jones în 1847). Termenul de imunoglobuline (Ig) îl înlocuieşte pe cel de
gama-globuline. Acest termen nu este corect, deoarece nu toţi anticorpii migrează
electroforetic în regiunea „gama”.
Toţi anticorpii sunt imunoglobuline. Imunoglobulinele pot fi anticorpi, dar au şi alte roluri.
Denumirea de anticorp se pare că a fost dată pentru substanţele „împotriva corpilor” bacterieni,
ceea ce nu este corect, deoarece există anticorpi şi faţă de alte structuri (inclusiv împotriva
structurilor proprii, în bolile autoimune) sau chiar şi în cazul bacteriilor, pot exista anticorpi
diferiţi faţă de structuri diferite ale aceleaşi bacterii (ex. anticorpi faţă de cele peste 90 de tipuri
capsulare ale Streptococcus pneumoniae).
Imunoglobulinele sunt diferite de alte structuri proteice:
- recunosc şi reacţionează specific cu structura antigenică din cauza căreia au apărut;
- au funcţie de anticorp, dar dacă sunt inoculate la un individ dintr -o specie diferită vor avea
rolul de antigene pentru respectivul individ;
- sunt singurele structuri proteice care sunt sintetizate după un stimul antigenic;
- pot activa sistemul complement etc.
S-a reuşit sinteza de anticorpi monoclonali „himerizaţi”, alcătuiţi dintr -o parte de moleculă
umană şi alta animală; fiind de izotip uman nu vor mai apărea ca şi structuri antigenice şi nu vor
mai fi „respinşi”.
Structura de bază a unei Ig monomer (ex. IgG1) cuprinde două lanţuri grele identice şi două
lanţuri uşoare identice, legate între ele prin punţi disulfurice: două punţi între cele două lanţuri
grele (în cazul IgG1) şi o singură punte între fiecare lanţ greu şi uşor.
Această schemă structurală a fost identificată în urma mai multor experimente (reducere şi
alchilare, acţiunea papainei, acţiunea pepsinei). Pepsina poate de ex. să degradeze enzimatic o
moleculă de imunoglobulină, acţionând la nivelul aminoacidului Leucină din structura lanţurilor
grele. Duce astfel la apariţia unui fragment cu greutate moleculară destul de ma re format la
rândul său din 2 fragmente Fab unite [acest fragment poartă numele de F(ab)2].
Fragmentele unei Ig sunt următoarele:
prima jumătate a lanţului greu şi întregul lanţ uşor, legate între ele printr -o punte
disulfurică, obţinute sub acţiunea papainei, prin scindarea înaintea regiunii balama, cu un singur
situs de legare;
: cele două fragmente Fab şi regiunea balama, care rezultă după acţiunea pepsinei,
constituie un fragment superior celor două fragmente Fab şi conţine două situsuri de legare;
jumătăţile terminale ale celor două lanţuri grele unite prin punţi disulfurice la nivelul
regiunii balama;
186
cuprinde fragmentele peptidice rezultate după acţiunea pepsinei, cu întregul domeniu
CH3 situat după aminoacidul 333 al lanţului greu;
corespunde primei părţi a lanţului greu după acţiunea papainei, cu formarea fragmentului
Fab, şi după reacţia de reducere-alchilare, pentru a extrage lanţul uşor;
corespunde părţilor variabile ale lanţului greu şi lanţului uşor (VH+VL).
Pentru Ig, noţiunea de domeniu se regăseşte la lanţurile grele în 4 exemplare (IgG, IgA, IgD) sau
5 exemplare (IgM, IgE) şi la lanţurile uşoare în 2 exemplare. Terminologia utilizată este
următoarea:
· Lanţurile grele:
- pentru fragmentul greu variabil (variable heavy), comună tuturor claselor şi subclaselor cu
aceeaşi specificitate.
pentru fragmentul greu constant (constant heavy), care conţine
diferenţele pentru fiecare clasă şi subclasă; de exemplu pentru IgG1 există fragmentele Cg11 ,
Cg12 şi Cg13 şi pentru IgM, fragmentele Cm1, Cm2, Cm3,Cm4.
· Lanţurile uşoare:
pentru fragmentul uşor variabil (variable light), diferit pentru lanţurile kappa şi lambda: Vk
şi Vl.
pentru fragmentul uşor constant (constant light), cu un singur lanţ Ck şi patru Cl
funcţionale.
Domeniile variabile VL şi VH formează locul unde anticorpul se cuplează cu determinantul
antigenic (epitop). Faţa interioară a situsului anticorpului (situs combinativ) vine în contact
direct cu epitopul şi se numeşte paratop. Faţa exterioară a situsului combinativ se numeşte
idiotip.
IgG (prototipul de Ac) reprezintă circa 75% din totalul imunoglobulinelor din ser şi are o
distribuţie aproximativ egală în vase şi ţesuturi. Există patru subclase de IgG (molecule cu
termorezistenţă mai mare), cu structură asemănătoare, o masă moleculară de 146.000
(excepţie făcând IgG3 cu o masă de 170.000), 3 domenii constante pentru lanţul greu şi un
procentaj de hidraţi de carbon de 2-3 %. Concentraţia sanguină a IgG este de ordinul 11 g/l, din
care IgG1 - 66 %, IgG2 - 23 %, IgG3 - 7% şi IgG4 - 4 %. IgG are receptori pentru sistemul
complement. Poate trece prin bariera hemato-placentară (după a 20-a săptămână de viaţă intra
uterină). Apare în RI secundar.
Sunt anticorpi aglutinanţi şi reprezintă cei mai eficace activatori ai complementului. Ac IgM sunt
caracteristici pentru RI primar, producţia lor fiind stimulată de către IL-4, care nu activează
mecanismul de switch izotipic.
IgM membranară (IgMm) este exprimată pe suprafaţa LB. Are structură monomerică şi se
termină prin aminoacizii 556-597, cuprinzând în mod particular o parte intramembranară
hidrofobă şi 3 aminoacizi intracitoplasmatici. Fiecare moleculă de IgMm este asociată cu 2
187
lanţuri Iga şi 2 lanţuri Igβ. Ansamblul formează BCR (B cell receptor), comparabil cu TCR-ul
limfocitului T.
IgM serică (IgMs) cuprinde un lanţ greu cu un domeniu variabil VH, 4 domenii constante Cm1 -
Cm4 şi un procent ridicat de hidraţi de carbon (12 %). Molecula î nsăşi este un pentamer cu un
prim inel al punţii disulfurice la sfârşitul lui Cm3, un al doilea la terminarea lui Cm4 şi un lanţ J
(joining chain). Masa moleculară este foarte mare (circa 970.000 D), cu un coeficient de
sedimentare de 19 S. Concentraţia serică este de 1,2 g / l. Reprezintă circa 5-10% din totalul
imunoglobulinelor din ser. Are 10 situsuri combinative dintre care numai 5 sunt funcţiona le. IgM
are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera hemato-placentară.
Apare în RI primar.
IgA serică. Sub forma IgA1 (80%) şi IgA2 (20%), ea se găseşte ca monomer (GM 160.000, 7 S) sau
ca dimer sau trimer, ultimele două forme cu lanţul J de joncţiune. IgA2 are o structură srcinală.
Lanţurile uşoare unite între ele printr-o punte disulfurică nu sunt legate printr-o legătură
covalentă cu lanţurile grele. Concentraţia sanguină a IgA este de 2,4 g / l. Nu are receptori
pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera hemato-placentară. Nu participă la
aglutinarea, precipitarea sau liza antigenelor corpusculare. Are activitate bactericidă mai mare
decât IgG şi decât IgM.
IgA exocrină sau secretorie cuprinde două subclase IgA1 şi IgA2. Masa moleculară este de
400.000, cu coeficient de sedimentare de 11 S. Molecula cuprinde două unităţi de IgA reunite
printr-un lanţ J. Acest ansamblu este înconjurat de unitatea secretorie sintetizată de celulele
epiteliale ale tubului digestiv.
Au rol important în apărarea la nivelul mucoaselor (digestivă, respiratorie etc) şi în reglarea
”compoziţiei” florei microbiene de la suprafaţa acestora. Este important ca nou-născutul să
primească de la mamă colostrul şi apoi să fie alimentat pe cale naturală pentru a primi IgA
(sinteza proprie începe după circa 1 lună de la naştere).
Are un nivel seric scăzut iar rolul său încă nu este pe deplin cunoscut. IgD se află, mai ales, la
suprafaţa limfocitului B în asociere cu IgMm unde ar putea juca rolul de receptor activ de
diferenţiere celulară şi memorie. Nu are receptori pentru sistemul complement. Nu poate
traversa bariera hemato-placentară. Concentraţia de IgD creşte în ser de la naştere şi până la
vârsta de 15 ani. Creşte în serul femeilor însărcinate.
Deşi concentraţia lor serică este infimă (0,0001 g/l), fixarea pe bazofile şi mastocite le conferă
un rol important în inflamaţie şi hipersensibilitatea de tip imediat. posedă, ca şi IgM, un al
patrulea domeniu constant, care îi conferă o masă moleculară de 190.000 D şi un coeficient de
sedimentare 8S, superior IgG. IgE se fixează pe receptor prin intermediul domeniilorCe2 şi
Ce3,într-o poziţie aproape orizontală.
Lanţurile uşoare
Acestea sunt în proporţie de 2/3 lanţuri kappa şi 1/3 lanţuri lambda, excepţie făcând IgD la care
lanţurile lambda sunt majoritare.
188
Imunoglobulinele inoculate la o specie diferită vor avea rol de antigene şi în această „calitate”
prezintă 3 tipuri diferite de determinanţi sau markeri antigenici.
Determinanţii izotipici sunt prezenţi la toţi indivizii aceleiaşi specii. Ei iau naştere în cursul
diferenţierii speciei. Anticorpii anti-izotip sunt obţinuţi prin injectarea Ig umane policlonale sau
monoclonale la animal (ex. iepure). Anticorpii anti-IgA apar uneori la subiecţii cu deficit de IgA
după transfuzia de sânge şi stau la srcinea şocului cu hipotensiune arterială. Ei pot fi
consideraţi anticorpi anti-izotip.
Caracterele antigenice prezente la unii indivizi dintr-o anumită specie, bazate pe deosebirea a 1-
3 aminoacizi, corespund variaţiei apărute în cadrul respectivei specii. În mod natural (în lipsa
unei injectări prealabile de sânge sau plasmă), se pot găsi anticorpi anti -allotipici la subiecţii care
nu au allotipurile corespunzătoare, la 1% din subiecţii normali şi la 3 -5% dintre bolnavii cu
poliartrită reumatoidă.
Diferitele sisteme cunoscute se notează folosind litera clasei de Ig şi litera K pentru kappa,
urmate eventual de numărul subclasei şi în final litera m pentru marker (ex. sistemul Gm,
sistemul A2m, sistemul Km).
În definiţia iniţială, acest caracter antigenic era propriu unei imunizări, la un animal care a
produs anticorpi. Oudin a obţinut primii anticorpi anti-idiotipici în modul următor: într-o primă
etapă a imunizat un iepure împotriva Salmonella spp. şi a obţinut un prim tip de anticorpi numiţi
Ab1 împotriva acestei specii. Apoi un al doilea iepure a fost imunizat cu acest imunoser şi s -au
obţinut anticorpi numiţi Ab2 sau anticorpi anti-anti-Salmonella sau anti-idiotip Ab1. Aceşti
anticorpi nu recunosc decât serul primului animal imunizat şi nu serul dinaintea imunizării sau
serul unui alt animal imunizat pentru aceeaşi Salmonella. Un anticorp Ab2 poate recunoaşte m ai
mulţi Ab1 de la animale diferite, recunoscând anticorpii cu aceeaşi specificitate anti -Salmonella.
Pornind de la Ab2 se poate imuniza un alt animal care sintetizează anticorpi Ab3, anti -idiotip
Ab2, aşa-zişi anti-anti-idiotip. Pentru anticorpii Ab2 se disting Ab2-a care nu inhibă reacţia
antigen-Ab1 şi Ab2-β care, dimpotrivă, inhibă această reacţie. Anticorpii Ab2-β sunt numiţi
„imagine internă“ a epitopului de plecare E1, ceea ce înseamnă ce au o structură imunologică
asemănătoare, recunoscută de Ab1. Determinanţii antigenici idiotipici se găsesc la nivelul
părţilor variabile ale lanţului greu şi lanţului uşor, şi uneori sunt constituiţi din cele două lanţuri.
Ei pot corespunde segmentelor hipervariabile, respectiv paratopilor imunoglobulinelor.
189
Termenul de clonă a fost împrumutat din bacteriologie, unde toate microorganismele care
derivă dintr-o bacterie sunt identice între ele şi cu prima bacterie. În imunologie, aceasta
desemnează toate celulele derivate dintr-un limfocit (cu o specificitate imunologică).
Un răspuns imun „obişnuit” corespunde unui răspuns policlonal cu imunoglobuline:
· de diferite clase şi subclase de imunoglobuline: IgM, IgG1 etc.;
· cu două allotipuri, dacă subiectul este heterozigot; de ex. Gm (1,2,17) / Gm (3);
· cu lanţuri uşoare kappa şi lambda;
· cu diferite specificităţi faţă de antigen, în recunoaşterea diverşilor determinanţi antigenici
iar pentru fiecare determinant antigenic, prezenţa unor epitopi diferiţi;
· cu diferite afinităţi.
Ansamblul sintezei determină o hipergamaglobulinemie difuză datorată heterogenităţii Ig
prezente, corespunzătoare numărului de clone limfocitare diferite, şi se traduce prin molecule
cu încărcătură electrică diferită.
Fătul este capabil să sintetizeze, din a zecea săptămână, cantităţi foarte mici de IgM şi cantităţi
importante din a 12-a săptămână. IgG materne nu traversează bariera placentară decât după a
20-a săptămână.
în absenţa unei infecţii congenitale (toxoplasmoză, sifilis etc), în sângele nou născutului se
găseşte o cantitate de IgM fetală care nu depăşeşte 10% din valoarea adultului. Nivelul IgG la
nou-născut este de 110% din nivelul adultului normal, ca urmare a transferului activ, de la
mamă la făt.
După scăderea nivelului IgG materne (care pot persista până în lunile 3-6 de viaţă şi chiar până
la 18 luni) se observă o sinteză activă a diferitelor clase: IgM are nivel normal la 1 an; IgG ajunge
la valori normale la 3 ani; IgA şi IgE au un nivel normal la 14 ani.
190
Fragmentul Fv participă singur la formarea situsului de legare al anticorpilor, cu intervenţia
egală a domeniului VH al lanţului greu şi al domeniului VL al lanţului uşor. Aminoacizii celor 3
regiuni hipervariabile ale fiecărui lanţ, situaţi la distanţă în structura primară, dar apropiaţi în
structura cuaternară, contribuie la formarea acestuia.
Legătura antigen-anticorp se realizează prin legături non covalente, reversibile.
Unele dintre aceste proprietăţi nu apar decât dacă anticorpul a fixat anti genul sau a fost alterat
de căldură, formând agregate. Acest aspect este valabil pentru fixarea complementului şi
recunoaşterea factorului reumatoid. În cazul subclaselor de IgG ordinea reactivităţii este
următoarea: IgG3 > IgG1 > IgG2 > IgG4.
Viteza de catabolizare depinde de regiunea CH 2 a diferitelor clase şi subclase de Ig. IgG (cu
excepţia IgG3) au un timp de înjumătăţire de 21 de zile.
Toate IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) traversează activ placenta, IgG1 trecând cel mai uşor. Aşa
cum am arătat mai sus, nou-născutul are o concentraţie a IgG de 110% faţă de cea maternă,
ceea ce indică prezenţa unui transfer foarte activ. IgM şi IgA materne nu traversează placenta,
Ig din aceste clase găsite la nou-născut fiind de srcine fetală. Cunoaşterea acestor aspect e este
foarte utilă pentru evidenţierea unei afectări intrauterine sau a unui simplu transfer de Ig
materne. În caz de suspiciune de toxoplasmoză congenitală, se indică dozarea IgM şi IgA anti -
toxoplasma în serul nou-născutului (au existat, din nefericire, recomandări de întrerupere a
sarcinii în cazul în care la mamă au fost identificaţi anticorpi anti -toxoplasma de tip IgG).
Fixarea complementului poate avea loc în calea clasică; IgG1, IgG2 şi IgG3 şi IgM au un receptor
ascuns în stare nativă pentru C1q, care va fi activat în timpul fixării anticorpului pe antigen.
Acest receptor se află în regiunea CH2 a IgG şi în domeniul CH4 al IgM. Teoretic, o singură
moleculă de IgM pentamerică este suficientă pentru activarea complementului, datorită celor
două situsuri apropiate. ştiind că IgG sunt de 1.000 de ori mai puţin eficace decât IgM, pentru
activarea complementului sunt necesare două molecule IgG, apropiate una de cealaltă. Calea
alternă poate fi activată de IgG sau IgA, prin fixarea pe C3b.
Receptorii pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor (Fc receptor, FcR) sunt molecule
membranare specifice pentru fiecare clasă de Ig, care induc o activare a celulelor purtătoare. Se
disting receptori cu mare afinitate Fc RI, care fixează un monomer de Ig şi sunt activaţi când
antigenul se leagă de anticorp formând o punte între doi receptori cu slabă afinitate Fc R II şi Fc
R III, care nu pot fixa decât complexe antigen-anticorp multivalente, formate în prealabil.
191
· eozinofilele şi plachetele au receptori de slabă afinitate Fc e RII. Plachetele au şi receptori
Fc g care le conferă o activitate antiparazitară;
· limfocitele au diverşi receptori de slabă afinitate.
(receptor Ig polimeric) permite fixarea de IgA dimerică sintetizată pe
plasmocite şi facilitează intrarea lor într-o vacuolă care traversează citoplasma celulelor
epiteliale intestinale. Este prezent şi la nivelul canalelor secretorii ale glandelor exocrine.
Un copil de sex masculin, în vârstă de 5 ani, se internează într -o clinică de pediatrie, datorită
faptului că în cursul internării într-un spital de nivel inferior nu s-a obţinut vindecarea
pneumoniei de care suferea.
Motivele internării au fost: stare generală alterată, lipsa evoluţiei favorabile în cursul internării
precedente.
Istoricul bolii a arătat că este vorba de un copil care a făcut în fiecare an mai multe infecţii
respiratorii joase (3-5 / an, în fiecare an) şi mult mai numeroase infecţii acute ale căilor
respiratorii superioare (IACRS). Boala a debutat în finalul anului precedent, cu simptome
respiratorii pentru care părinţii au administrat paracetamol şi picături cu un decongestiv nazal.
După 2 săptămâni, datorită intensificării semnelor respiratorii, medicul de familie recomandă
internarea în cel mai apropiat spital, diagnosticul la internare fiind pneumonie cu pleurezie. În
spital s-a administrat o asociere de ceftriaxonă cu gentamicină, dar semnele respiratorii s-au
menţinut, apărând în plus semne de insuficienţă respiratorie; în aceste condiţii copilul se
transferă în clinica de pediatrie. Examenul clinic la camera de gardă relevă o stare generală
foarte alterată, dificultăţi în respiraţie, respiraţii frecvente, tiraj intercostal, lipsa murmurului
vezicular la baza hemitoracelui stâng, submatitate la percuţie şi raluri crepitante însoţite de
frecătură pleurală la auscultaţie în treimea medie a hemitoracelui stâng. În clinica de pediatrie s -
a recoltat sânge pentru hemoculturi şi lichid pleural, produsele fiind trimise pentru diagnosticul
bacteriologic, direct. Hemoculturile au fost negative. Cultura din lichidul pleural a fost negativă.
Valorile celorlalte analize de laborator au fost următoarele: VSH = 85 mm/oră, număr de
leucocite = 28.000/mm3 (dintre care, peste 20.000/mm3 neutrofile, 72%), proteina C
reactivă=9,8 mg/dL. Dozarea imunoglobulinelor serice a arătat valori mari pentru Ig G (1.800
mg/dL), o valoare de 242 mg/dL pentru Ig M, în timp ce IgA a fost nedozabilă (0 mg/dl).
Fracţiunea C3 a complementului a fost dozabilă, în cantitate de circa 10 ori mai mare decât
valorile normale, cu complexe imune circulante dozabile, la valori mari.
192
Diagnosticul de pneumonie stângă cu pleurezie, probabil de etiologie bacteriană, în condiţiile
unui deficit absolut de IgA, a condus la instituirea tratamentului cu o asociere de medicamente
antibacteriene (ceftriaxonă, amikacină şi teicoplanină) alături de dezobstruante, menţinerea
permeabilităţii căilor respiratorii şi administrare de oxigen. S-au administrat de asemenea
imunoglobuline pe care intravenoasă.
Datorită faptului că în ciuda unei evoluţii favorabile din punct de vedere clinic, semnele fizice de
la nivel pulmonar s-au menţinut iar temperatura nu a coborât sub 38,1ºC, s-a administrat
suplimentar un medicament antifungic evoluţia fiind favorabilă. Tratamentul a fost continuat
timp de 3 săptămâni, după care copilul a fost externat cu recomandarea de a reveni la control
clinic, radiologic şi bio-umoral. La controlul efectuat s-a constatat că deficitul de IgA nu a fost
corectat şi s-a menţinut şi după vindecarea pacientului, fiind probabil o cauză a patologiei şi nu
un rezultat al acesteia.
Un copil de sex feminin, se internează la vârsta de 2 ani şi 6 luni într -o clinică de pediatrie, prin
transfer dintr-un spital de nivel inferior, datorită evoluţiei nefavorabile a unei pneumonii. S -a
născut prematur, după 8 luni de gestaţie, cu greutate de 1.100 g, Apgar 7. A fost îngrijită în
maternitate până la vârsta de 2 luni şi jumătate. Până la vârsta de 2 ani şi jumătate a făcut
repetate infecţii acute ale căilor respiratorii inferioare (IACRI) (minim 4 episoade / an).
Motivele internării au fost: febră, tuse şi dispnee.
Din discuţia cu părinţii s-a aflat că tusea şi febra au apărut cu 10 zile anterior internării; ulterior
copilul a început să respire din ce în ce mai dificil. A primit în ambulatoriu ampicilină (pe cale
orală), apoi cotrimoxazol (biseptol). Pentru că evoluţia a fost nefavorabilă, mama a fost sfătuită
să se prezinte pentru internare, la spital.
S-au prezentat la primul spital. Examenul clinic la internare a evidenţiat: febră (38,3°C), paloare,
număr ridicat de respiraţii/minut, tiraj (deprimare a structurilor suprasternale în timpul
inspirului) şi sindrom de matitate în treimea inferioară a hemitoracelui drept (la inspecţie,
auscultator şi la percuţie). La examenul radiologic s-a văzut opacifierea neomogenă a jumătăţii
inferioare a hemitoracelui drept. Din rezultatele celorlalte investigaţii se amintesc: VSH= 120
mm/oră, leucocitoză (12.400 / mm3) cu neutrofilie (75%), hipoxemie (cu scăderea presiunii de
oxigen). Imediat după internare s-a administrat ceftriaxonă, apoi amoxicilină-acid clavulanic în
asociere cu ciprofloxacină, fără ca evoluţia să fie pozitivă. În aceste condiţii, s-a recomandat
transferul într-o clinică de pediatrie, de nivel superior.
Diagnosticul la internare în clinica de pediatrie a fost: pneumonie dreaptă, sepsis bact erian.
Examenul clinic la internare a revelat o stare generală profund alterată, prezenţa unui facies
suferind, foarte palid, hipertermie (39ºC), deficit al stării de nutriţie (greutate = 10,7 kg), cianoză
peri-oro-nazală accentuată la plâns şi alte eforturi, polipnee (80 respiraţii / minut), bătăi ale
aripioarelor nazale, matitate cu absenţa murmurului vezicular în două treimi inferioare ale
hemitoracelui drept, raluri crepitante la baza hemitoracelui drept, ficat la 2,5 cm sub rebordul
costal, dureros la palpare. Radiografia pulmonară efectuată la internare a evidenţiat opacifierea
omogenă a hemitoracelui drept.
Celelalte investigaţii de laborator au avut următoarele valori: VSH = 75 mm/h, hemoglobină =
8,2 g/dL, leucocitoză (L = 24.800/mm3) cu neutrofilie (peste 15.600 neutrofile/mm3, 63%),
modificări ECG. S-a pus diagnosticul de pneumonie cu pleurezie dreaptă importantă,
insuficienţă respiratorie acută, insuficienţă cardiacă, anemie, hipotrofie ponderală. S-a realizat
193
puncţia pleurală (atât pentru a elimina această cauză de presiune mecanică asupra arborelui
cardiovascular cât şi pentru punerea diagnosticului etiologic şi stabilirea sensibilităţii la
antibiotice a agentului sau agenţilor etiologici). S-a recoltat şi sânge pentru hemoculturi, înainte
de administrarea altor medicamente antibiotice sau chimioterapice. Lichidul pleural era „sub
presiune”; s-au extras cu uşurinţă peste 375 mililitri de lichid opac, tulbure. Produsele au fost
trimise imediat către laboratorul de bacteriologie. Frotiul colorat Gram a pus în evidenţă rare
PMN (2-5 / câmp) şi rari coci Gram-pozitivi, aşezaţi unul câte unul sau în diplo. Coloraţia Ziehl-
Nielsen nu a pus în evidenţă bacili acid-alcoolo rezistenţi. Atât culturile din lichidul pleural cât şi
cele hemoculturi au rămas sterile. Prin reacţii antigen-anticorp s-a încercat punerea în evidenţă
a prezenţei antigenelor capsulare în lichidul pleural (pneumococ, H. influenzae, meningococ),
dar reacţiile au fost negative.
Dozarea imunoglobulinelor serice a arătat valori mari pentru Ig G (1.400 mg/dL), o valoare de
160 mg/dL pentru IgM, în timp ce IgA a fost nedozabilă (0 mg/dl). Fracţiunea C3 a
complementului a fost dozabilă, în cantitate mai mare decât valorile normale.
În condiţiile obţinerii acestor date clinice, paraclinice şi de laborator, s-au administrat antibiotice
în asociere [iniţial o combinaţie între un glicopeptid şi o cefalosporină de generaţia a III-a
(pentru 2 săptămâni), apoi o combinaţie între vancomicină şi amikacină (pentru încă 2
săptămâni)], în afară de drenajul lichidului pleural (sub control clinic şi paraclinic), administrare
de oxigen, administrare de lichide, electroliţi şi substanţe nutritive intravenos. Avându-se în
vedere rezultatul dozării imunoglobulinelor, s-au administrat şi imunoglobuline intravenos. Lent,
evoluţia din punct de vedere clinic a fost favorabilă. Pe partea dreaptă, radiologic s-a constatat
organizarea unui proces pahipleuritic. Copilul a fost spitalizat pentru o lună, iar înainte de
externare valorile bio-umorale au fost următoarele: VSH =12 mm/oră, număr de leucocite=
6.500/ mm3 (fără neutrofilie), hemoglobină = 10.2/dL, hematocrit = 34%, IgA = 0 mg/dL.
Discuţii
Cu excepţia vârstei, au existat o serie de asemănări între cele două cazuri. Ambii copii au avut în
antecedente episoade de IACRS şi IACRI, mai multe / an, în fiecare an, fără diagnostic etiologic,
pentru care au primit tratament la domiciliu, de regulă incluzând antibiotice sau chimioterapice.
Episodul infecţios discutat, datorită evoluţiei grave, a condus la recomandarea de internare şi în
fiecare dintre cele două cazuri internarea a fost realizată, succesiv, la două nivele spitaliceşti. În
ambele cazuri, la spitalul de nivel inferior, copii au primit tratament antibiotic înainte de
recoltarea produselor pentru punerea unui diagnostic etiologic. În aceste condiţii nu a fost
posibilă nici stabilirea sensibilităţii microorganismelor implicate şi tratamentul anti-infecţios a
fost condus „empiric”, ceea ce ar fi putut reprezenta un important factor de risc, inclusiv
pierderea pacientului.
În primul caz nu s-a putut emite nici o ipoteză privind etiologia (alta decât „bacteriană”) iar în al
doilea caz, elementele observate la studierea frotiului din lichidul pleural au permis
suspicionarea unei pneumonii de etiologie pneumococică.
Tratamentele conduse în ambulatoriu, auto-tratamentele stabilite de părinţi (în baza „amintirii”
unor recomandări medicale anterioare), lipsa unei culturi medicale care să ridice suspiciunea
privind o „cauză de bază” care să explice un număr de infecţii respiratorii, repetate, mai
numeroase decât în mod obişnuit, ne fac să realizăm motivele pentru care deficitul imun a fost
descoperit relativ tardiv (cu toate că în ambele cazuri a existat un deficit absolut în sinteza de
IgA, foarte probabil un deficit primar).
194
Pe de o parte, din aceste prezentări sesizăm, foarte concret, importanţa bunei funcţionări a
sistemului imun şi una dintre situaţiile care pot apărea în cazul existenţei unor deficienţe, iar pe
de altă parte este de subliniat că tratamentul bolilor infecţioase ar trebui realizat numai după
diagnosticul etiologic, cu testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice, singura variantă
corectă, care poate veni în sprijinul pacienţilor pe care trebuie să îi îngrijim.
195
Complementul, un complex multienzimatic format din circa 30 de componente, reprezintă unul
dintre principalii constituenţi ai apărării naturale, ai imunităţii umorale şi respectiv un element
important al reacţiei imune survenite ca urmare a formării complexelor antigen-anticorp (are rol
esenţial în răspunsul inflamator). Sistemul complement (C') reprezintă o componentă normală a
serului.
Sistemul complement are o serie de funcţii importante: apărarea nespecifică împotriva infecţiei
(liza virusurilor, liza bacteriilor, liza celulelor străine, favorizarea prin opsonizare a fagocitozei,
chemotactism pentru PMN şi sistemul MM etc); eliminarea complexelor imune şi a celulelor
apoptotice; reglarea fiziologică a RI, dar participă şi la creşterea permeabilităţii capilarelor,
stimularea contractilităţii musculaturii netede etc. În cele mai multe împrejurări, sistemul
complement are efecte benefice; totuşi sunt de menţionat şi unele efecte negative (ex.
participă la reacţiile anafilactice, este implicat în hipersensibilitatea citolitică-citotoxică etc).
Sistemul complement cuprinde circa 30 de componente celulare sau plasmatice. Componentele
sale suntsintetizate de hepatocite, macrofage, celule epiteliale intestinale etc. Substanţele
activatoare reprezintă 5% din suma proteinelor serice (circa 3 g/l); componenta C3 este
componenta care se găseşte în cantitatea cea mai mare (circa 1,3 g/l). (Tabelul nr. 1)
Sistemul C' se poate activa pe trei căi, respectiv calea clasică, calea lectinică şi calea alternă.
Activarea pe calea clasică este declanşată în primul rând de formarea complexelor imune (Ag-
Ac), dar şi de apariţia celulelor apoptotice, anumite virusuri sau de proteina C reactivă cuplată
cu anumiţi liganzi (Figura nr. 1).
196
(alternativă) converg către C3, apoi urmează o cale efectoare
comună, implicând ultimele componente ale sistemului complement (Figura nr. 3). În fiecare
dintre etape, intervin proteine activatoare, inhibitoare sau reglatoare precum şi receptorii
pentru complement. Aceste elemente se găsesc fie în plasmă fie la nivelul peretelui celulelor
autologe sau omologe.
În mod curent, sistemul complement este desemnat prin litera C. Pentru fiecare componentă
studiată şi bine delimitată în cadrul „cascadei de activare” se adaugă o cifră, de la C1 la C9, care
este eventual urmată de o literă (care reprezintă o anumită subdiviziune; spre exemplu, pentru
C1 există C1q, C1r şi respectiv C1s).
Ca urmare a activării sistemului C', unele componente (C4, C2, C3, C5), sunt fragmentate, aceste
fragmente fiind desemnate printr-o literă ataşată componentei iniţiale (exemplu C3a şi C3b). În
general componenta b este de dimensiuni mai mari (excepţie C2a, fragment înglobat într -un
complex proteolitic şi care are dimensiuni mai mari decât C2b) şi se fixează la nivelul structurii
ţintă, în timp ce componenta a este mai mică, este solubilă şi posedă o activitate anafilactoidă
sau chimiotactică.
Componentele C' se găsesc în ser, în stare inactivă. Pentru a declanşa activarea lor este necesar
un stimul. Pentru calea clasică, punctul de pornire este reprezentat de către complexele
antigen-anticorp (Figura nr. 1), unde anticorpii sunt de tip IgM (domeniul CH4) sau de tip IgG
(domeniul CH2) corespunzând subclaselor IgGl, IgG2 sau IgG3. Complementul poate fi activat de
o singură moleculă de IgM sau de către două molecule de IgG apropiate una de alta. Activarea
este posibilă şi în cazul unor molecule de IgG agregate.
În mod asemănător, calea clasică poate fi activată şi de către unele microorganisme sau diferite
substanţe chimice: bacterii Gram-negative (Salmonella spp., E. coli, Neisseria spp.),
retrovirusuri, glicoproteina anvelopei HIV, complexe heparină-protamină etc.
În cursul activării intervin următoarele proteine:
197
În sângele circulant există un complex plurimolecular ce conţine o moleculă de C1q
(moleculă ce aparţine familiei colectinelor, precum MBL), două molecule de C1r şi două
molecule de C1s, situate în jurul ionilor de calciu şi asociate inhibitorului C1, denumit C1inh. La
persoanele cu deficit congenital de C1 inh, complementul se activează cronic în mod spontan,
provocând episoade severe şi recurente de edem – edem angioneurotic.
Compusul C1q, cu o greutate moleculară de 400.000 Da, a fost comparat cu un buchet de 6
lalele. Fiecare „floare” este la rândul său compusă din 3 lanţuri de proteine alipite şi terminate
în mod globular. Fixarea C1q prin mai puţin de două părţi globulare periferice pe fragmentele Fc
ale imunoglobulinelor permite activarea sa cu eliberarea C1inh din complexul plurimolecular.
Acest fenomen antrenează pe de altă parte autoactivarea moleculelor C1r şi C1s. Componenta
C1s are o activitate serinesterazică, prin care poate să cliveze următoarele 2 componente: C4 şi
C2.
este clivată în C3a şi C3b de către C4b2a. C3a este o moleculă mai mică şi are, în mod
primordial, o activitate anafilactoidă şi chimiotactică, în timp ce subcomponenta C3b se fixează
pe structura ţintă datorită unei punţi realizate între un radical tioester şi o grupare ( -OH) sau (-
NH2) de pe suprafaţa celulară acceptoare. Pe de altă parte, C3b poate fi inactivat de factorul I
(rezultând C3bi), iar apoi clivat într-o moleculă mare C3c (liberă) şi o moleculă C3dg restantă pe
structura ţintă, care poate apoi să se transforme în C3d. C3b format permite constituirea C5
convertazei (C4b2a-C3b) pe calea clasică. (Figura nr. 1)
Calea clasică de activare a complementului poate fi amplificată foarte mult. Fiecare complex
antigen-anticorp leagă o moleculă de C1, iar C1s în stare activă clivează până la 100 molecule de
C4. Din acestea, doar 20 de fragmente C4b se ataşază complexelor antigen-anticorp. C3
convertaza căii clasice clivează mii de molecule de C3. Aceste lucru dovedeşte imensa
capacitate de amplificare a acestui lanţ de reacţii biochimice.
198
Această cale poate fi activată de către diferite microorganisme, de componente ale acestora, de
numeroase substanţe neimune, spre exemplu:
· bacterii Gram-pozitive (ex. Streptococcus pneumoniae) sau Gram-negative, virusuri (dar şi
celule infectate sau transformate de către virusuri), fungi (ex. Candida albicans), paraziţi (ex.
Schistosoma mansoni, Trypanosoma cruzi),
· endotoxine bacteriene,
· alte substanţe (insulină, hemoglobină, zymosan, fibre de azbest, gluten, prafuri, unele
substanțe de contrast utilizate în radiologie, venin de viperă sau veninul altor şerpi etc.).
Calea alternă poate fi activată de complexele imune care cuprind IgG sau IgA.
Printre componentele căii alterne se numără:
În plasmă, prin proteoliza spontană a C3, sunt formate în permanenţă mici cantităţi de C3b.
Moleculele de C3b se fixează de suprafeţele acceptoare, în particular de peretele
microorganismelor sau de celulele infectate şi alterate. Câteva bacterii, a căror structură este
bogată în acid sialic, pot evita acţiunea sistemului complement. La rândul său, C3b acţionează
asupra factorului B.
factor prezent sub formă activă în ser înainte de activarea C’, clivează factorul B,
ceea ce facilitează formarea complexului C3bBb.
Ansamblul factorilor activatori ai căii clasice şi alternative realizează o buclă de amplificare, care
permite transformarea numeroaselor molecule de C3 în C3b astfel încât C3b să acopere
(opsonizeze) peretele bacterian. (Figura nr. 2)
Calea finală comună mai este numită şi calea efectoare sau calea litică. Activarea începe de la
C5-convertaza căii clasice (C4b2a-C3b)n şi respectiv de la (C3bBb)n în cadrul căii alternative.
Activarea cuprinde de fapt complexul de atac al membranei (Membrane Attack Complex),
MAC):
Convertazele-C5 pentru calea clasică şi respectiv pentru calea alternă clivează C5 în C5a,
molecula mică, liberă şi C5b, molecula mare care se fixează pe structura ţintă. Atât C5a, cât şi
molecula care rezultă în urma transformării sale în C5-dezarginină, acţionează la nivelul
receptorului C5a-R al mastocitelor şi bazofilelor.
199
Această proteină are două proprietăţi: 1. de a se insera la nivel membranar, graţie unei feţe
hidrofobe; 2. de a polimeriza, formând astfel peretele unei soluţii de continuitate de circa 10
nm în diametru la nivelul membranelor celulelor ţintă (limfocitul T utilizează o substanţă numită
perforină, cu efect asemănător cu cel produs de C9). Formarea sau fixarea complexului C5b9 în
cantităţi sublitice la suprafaţa celulelor antrenează sinteza şi eliberarea mediatorilor inflamaţiei
(leucotriene, IL-1 etc). (Figura nr. 3)
Există o serie de mecanisme de reglare a activităţii sistemului complement, acestea fiind
mediate de proteine reglatoare care intervin la un moment dat în cursul cascadei de activare,
având capacitatea de a o limita sau chiar opri. (Tabelul nr. 2)
În general, aceste proteine inhibă formarea C3 convertazei sau promovează disocierea ei (când
aceasta deja s-a format). Decay Accelerating Factor (DAF) – „Factorul de accelerare a disocierii
C3 convertazei” este o proteină care poate dezactiva C3 convertaza căii clasice, dar are şi rolul
de a inhiba formarea ei, nepermiţând elementelor C2a şi C4b să interacţioneze. Împreună cu
CR1 (complement receptor 1), DAF competiţionează cu factorul B la legarea de
, prevenind astfel constituirea C3 convertazei căii alterne. Acest complex DAF-CR1 poate să
disloce Bb din compusul C3bBb, disociind C3 convertaza căii alterne.
Tot din categoria proteinelor reglatoare face parte şi Factorul I, o protează din plasmă care
clivează C3b în mai multe situsuri, inactivându-l. Iniţial rezultă C3bi, apoi C3c şi C3dg (fragment
ce rămâne ataşat membranei celulare).
Cei mai importanţi receptori recunosc C3b sau derivaţii săi C3bi şi C3d.
CR1 sau receptorul pentru C3b şi C4b este prezent pe hematii, trombocite, neutrofile,
eozinofile, monocite şi macrofage, limfocite B şi T4 precum şi la nivelul podocitelor glomerulare.
Acest receptor permite transportul complexelor imune prin intermediul globulelor roşii spre
macrofagele hepatice sau celulele Kuppfer. Pe de altă parte, fenomenul de aderenţă imună
realizat prin intermediul macrofagelor de particulele încărcate cu C3b, permite fagocitoza
complexelor şi eliminarea lor. Dacă sunt prezenţi şi anticorpii, această acţiune este decuplată,
graţie acţiunii conjugate a receptorilor de Ig. Ar mai fi de menţionat că CR1, prezent pe celulele
dendritice intrafoliculare, permite prezentarea antigenului situat în cadrul complexului imun
acoperit de componente ale complementului.
CR1 acţionează drept cofactor al factorului I, fiind una dintre componentele ce intervin în
reglarea acţiunii complementului. (2)
Variaţiile expresiei genetice a CR1 se corelează direct cu apariţia lupsului eritematos şi formelor
severe de malarie. În prezent este speculat scopul terapeutic pe care îl are CR1 solubil. (3)
200
Receptorul pentru C3dg sau C3d, este prezent pe limfocitele B, pe celulele foliculare dendritice
şi pe celulele mucoase din orofaringe. C3d antrenează stimularea şi proliferarea limfocitelor B
prin intermediul complexelor imune acoperite de C3d sau permite prezentarea antigenului prin
intermediul celulelor dendritice. Spre ex. penetrarea la nivel faringian şi respectiv infectarea
ulterioară a limfocitelor de către virusul Epstein-Barr se realizează prin intermediul acestui
receptor.
CR2 este implicat direct în inducerea răspunsului imun umoral primar.
CR3 sau receptorul C3bi se găseşte pe monocite, macrofage, neutrofile şi pe celulele foliculare
dendritice. El permite fenomenele de aderenţă imună precum şi fagocitoza particulelor
acoperite de C3bi sau citoliza bacteriei prin fenomenul de ADCC (antibody dependent cell-
mediated cytotoxicity).
CR3 permite de asemenea prezentarea antigenului prin intermediul celulelor dendritice.
Are un rol important în stabilirea adeziunii dintre leucocite şi endoteliu, fiind presuspus faptul că
CR3 este ligand pentru ICAM (Intercellular Adhesion Molecule) exprimat pe celula endotelială.
(4)
Există, de asemenea, receptori pentru fragmentele mici C3a (C3aR), C4a (C4aR) şi C5a (C5aR) la
nivelul mastocitelor, monocitelor, macrofagelor, neutrofilelor şi trombocitelor. Aceşti receptori
activaţi antrenează fenomene inflamatorii, activând aceste celule şi permiţând eliberarea
substanţelor inflamatorii sau atragerea neutrofilelor. Receptorul pentru C1q (C1qR) precum şi
receptorul pentru factorul H (HR) permit fagocitoza particulelor opsonizate.
În inflamaţie sunt implicaţi diferiţi compuşi solubili de talie mică. C3a şi C4a au o masă
moleculară apropiată de 10.000 Da şi sunt numite anafilatoxine. Ele pot să se fixeze pe bazofile
şi pe mastocite atrăgând eliberarea de histamină precum şi vasodilataţie, unul dintre primele
elemente ale răspunsului inflamator. C2b (kinina-C2) este capabilă să crească permeabilitatea
vasculară. C5a posedă o activitate chimiotactică pozitivă faţă de neutrofile şi conduce la
agregarea polinuclearelor, în urma activării complementului. Complexul C5b7 fixat pe
membrane sau pe complexele imune are de asemenea acţiune chimiotactică pentru
polinucleare.
201
atac ale membranei (componentele C5-C9) lizează diferite microorganisme: bacterii, virusuri sau
paraziţi. Aceasta reprezintă o activitate citolitică directă a complementului cu sau fără prezenţa
anticorpilor.
Prin mecanisme asemănătoare, agenţii infecţioşi pot fi acoperiţi de C3b sau C3bi care sunt
recunoscuţi de diferiţi receptori, prezenţi la nivelul diferitelor celule fagocitare esenţiale:
neutrofile şi macrofage. După aderare, acestea vor fagocita microorganismele. Diferite
microorganisme au dezvoltat mecanisme de rezistenţă la acţiunea complementului: ex.
prezenţa unei capsule care împiedică activarea căii alternative (S. pneumoniae, Haemophilus
influenzae), sintetizarea unor substanţe care fixează C3b sau antrenează o rezistenţă la inserţia
complexului de atac al membranei.
În reglarea răspunsului imun.Pe limfocitele B se găsesc receptori pentru C3d sau C3dg
(CR2).
202
Deşi sinteza elementelor care formează sistemul complement începe relativ repede, în perioada
fetală (între săptămânile 6 - 14 de viaţă intrauterină), concentraţia acestora la naştere nu
depăşeşte jumătate din cea de la adult.
Dintre efectele necesare ale sistemului complement, opsonizarea reprezintă o etapă esenţială în
cadrul unei fagocitoze eficiente. Componenta C3 a sistemului complement reprezintă „punctul
de convergenţă” între calea clasică şi calea alternativă (alternă). C3 favorizează fagocitoza prin
structuri care se ataşează suprafeţei bacteriene şi sunt recunoscute de anumiţi receptori. Pe
suprafaţa neutrofilelor sunt expuşi receptorii CR1 (CD35) - care se leagă de componenta C3b.
Neutrofilele prezintă şi receptori CR3. Comparativ cu configuraţia receptorilor la adult,
neutrofilele nou-născuţilor sunt deficitare în exprimarea CR3.
Un studiu recent a demonstrat că blocarea (la adult) receptorilor CR3 împiedică buna
desfăşurare a proceselor de opsonizare şi fagocitoză. Acelaşi studiu a emis ipoteza că
depozitarea unor anumiţi compuşi de clivare ai C3 pe suprafaţa streptococului de grup B ar fi un
factor important în apărarea gazdei împotriva agravării infecţiei.
Alte experimente au arătat că la şoriceii cu deficit de C3 eliberarea de TNF-α indusă de
streptococ este semnificativ redusă. În concluzie, calea alternă a complementului şi factorul C3
ar putea reprezenta cheia eliberării de TNF-α. Abilitatea streptococului de grup B de a activa
sistemul complement a fost demonstrată în vitro.
Deşi se ştie că nou-născuţii prezintă concentraţii relativ mici ale complementului, în mod
aparent calea alternă este suficient de activă încât să amplifice eliberarea de TNF-α în cazul
infecţiilor streptococice. Acest fapt a fost demonstrat de diferite studii care au certificat
creşterea marcată a eliberării TNF-α de către monocitele nou-născuţilor.
Având în vedere că eliberarea de TNF-α ca răspuns la infecţiile grave cu streptococ de grup B
pare să aibă o strânsă legătură cu fiziopatologia acestor infecţii, se consideră că terapia
adjuvantă imunomodulatoare administrată cu scopul de a reduce activitatea pro-inflamatorie a
streptococului ar putea fi eficientă. O astfel de terapie ar include şi modularea căii alterne a
complementului.
Sistemul complement este un complex de molecule care face parte din ansamblul imunităţii
nespecifice. De-a lungul timpului, s-au descoperit o serie de afecţiuni corelate cu deficienţe ale
acestor compuşi dintre care şi boli autoimune, dar şi reacţii de hipersensibilitate.
Un subiect îndelung studiat îl reprezintă deficitul de properdină şi predispoziţia persoanelor
care posedă această carenţă faţă de infecţiile cu specii din genul Neisseria.
Properdina este o glicoproteină reglatoare a căii alterne de activare a complementului, singura
care reglează pozitiv cascada enzimatică prin stabilizarea C3 şi C5 convertazei căii alterne.
Concentraţia serică fiziologică de properdină este de 5-15 μg/ml, fiind un amestec de
monomeri, dimeri, trimeri şi tetrameri în raport de 1:2:1.
În 1982, într-o familie suedeză, a fost descris primul caz de carenţă de properdină în asociere cu
o infecţie meningococică cu debut fulminant. Ulterior, studiindu-se această problemă, s-a ajuns
la concluzia că există 3 tipuri diferite de deficit de properdină (observate clinic la indivizi diferiţi).
Primul tip se caracterizează prin absenţa proteinei în plasmă. Cel de-al doilea se manifestă
printr-un titru foarte scăzut al properdinei, iar cel de-al treile tip presupune o concentraţie
serică normală, dar o variantă nefuncţională a proteinei.
203
Detectarea unei astfel de condiţii la un pacient este foarte dificil de făcut. Pe lângă testele de
laborator care sunt foarte laborioase, este necesar un istoric infecţios al pacientului şi al familiei
acestuia. Din pricina diagnosticului greu de stabilit, deficitul de properdină este rar întâlnit, însă
prezent în fază „ocultă” (nediagnosticată) în special în cadrul rasei caucaziene, nefiind reportate
cazuri la nici o altă populaţie. Formele de deficit de properdină sunt maladii genetice
transmisibile, X-linkate. Se cunoaşte deja, în toate trei tipurile bolii, care sunt mutaţiile c e survin
şi unde sunt acestea localizate.
Predispoziţia faţă de infecţiile cu Neisseria meningitidis apare ca manifestare clinică în toate
tipurile deficitului de properdină. Serotipurile cel mai des implicate în astfel de infecţii sunt W -
135 şi Y, mai puţin serotipul B, faţă de care s-a constatat că organismul uman şi-a dezvoltat
metode mai eficiente de apărare prin mecanisme de fagocitoză. Indivizii cu deficit de
properdină au un risc mai crescut de 250 de ori de a dezvolta o infecţie meningocociă decât
restul populaţiei sănătoase. Dacă la o persoană normală, şansele cele mai mari de a face infecţie
cu meningococ sunt la vârsta de 6 ani, la un individ cu deficit de properdină, vârful riscului
dezvoltării infecţiei este în jurul vârstei de 14 ani. Mortalitatea în astfel de cazuri este de până la
75%. Infecţiile recurente sunt extrem de rare în condiţiile date, fapt ce atestă că probabil
apărarea umorală devine mai eficientă la aceste persoane.
Pacienţii cu deficit de properdină au un răspuns umoral adecvat la vaccinul tetravalent
antimeningococic (care conţine antigene din serotipurile A, C, Y, W135), organismul generând
anticorpi anticapsulari ce devin eficienţi în combaterea instalării infecţiei. Partea bună este că
nu la toţi pacienţii la care este detectat deficitul de properdină se dezvoltă infecţii
meningococice. Acest lucru a sugerat că există şi alţi factori adiţionali care favorizează
predispoziţia către aceste infecţii. S-a constatat astfel că la o parte dintre indivizii cu deficit de
properdină, lipsea alotipul G2m(n) (alotipul reprezentînd o secvenţă aminoacidică de pe lanţul g
al moleculei de IgG2 specifică fiecărui individ). Se speculează că această combinaţie: deficit de
properdină – lipsa alotipului G2m(n) este un temei relevant care explică de ce indivizii afectaţi
prezintă un risc net superior de a se imbolnăvii de infecţii meningococice.
Cititorul care doreşte să aprofundeze unele dintre aspectele menţionate în acest capitol poate
să acceseze informaţiile oferite de site-urile de mai jos sau şi alte site-uri.
204
Urmatoarele întrebări au un singur răspuns corect.
1. C3 convertaza:
A. este o enzimă proteolitică, cu activitate anafilactoidă
B. se poate constitui pe două căi, rezultând 2 compuşi diferiţi structural, dar cu aceeaşi funcţie
C. scindează componenta C5 în C5a şi C5b
D. sub acţiunea sa, în membrana celulei atacate se formează MAC (Membrane Attack Complex)
E. nici un răspuns nu este corect.
205
Munthe-Fog L, Hummelshoj T, Honore C et al., 2009, Immunodeficiency associated with FCN3
mutation and ficolin-3 deficiency, N Engl J Med, 360, 2637-2644
Rochowiak A, Niemir ZI, Merkur Lekarski P, 2010, The structure and role of CR1 complement
receptor in physiology, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20369732
Rochowiak A, Niemir ZI, Merkur Lekarski P, 2010, The structure and role of CR1 complement
receptor in pathology, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20369733
Schwartz RA, Thomas I, 2010, Complement receptor deficiency,
http://emedicine.medscape.com/article/1051238-overview
Erdei A, Molnar E, Csomor E et al., 2004, Indirect effects of C3 on the adaptive responses, IN:
The Complement system. Novel Roles in Health and Disease
206
Antigenul se defineşte drept o substanţă recunoscută specific de către sistemul imun. Alţi autori
consideră că antigenul este o substanţă capabilă să inducă un răspuns imun (imunogenicitate) şi
să fie recunoscută de către sistemul imun (specificitate). Răspunsul imun (RI) tinde să
neutralizeze şi să elimine antigenul din cauza căruia s-a declanşat.
sunt Ag care declanşează activarea limfocitelor, însă RI este inhibat activ, imediat.
Orice bacterie trebuie văzută ca un ansamblu de antigene, din care nu toate sunt imunogene
(unele pot fihaptene altele tolerogene). Mecanismele de apărare împotriva microorganismelor
sunt diferite dar pot fi deduse în funcţie de structura şi caracterele de patogenitate ale
respectivei bacterii. Acesta este un alt exemplu care demonstrează faptul că între capitole
diferite există legături importante, iar noțiunile citite și înțelese ”la timpul lor” pot fi foarte utile,
ulterior.
Există 4 tipuri principale de perete bacterian (tip gram pozitiv, gram negativ, tip micobacterian și
spirochetal) iar patogenitatea poate varia între 2 ”extreme” (toxicitate fără invazivitate și
invazivitate fără toxicitate). (Figura nr. 1)
207
mai mari şi îndepărtarea filogenetică este mai importantă. Termenul izotip indică un caracter
comun tuturor indivizilor unei specii, şi, în acelaşi timp, corespunde unui xenoantigen pentru
celelalte specii.
sunt prezente la unii indivizi din aceeaşi specie. Alloanticorpii sunt obţinuţi prin
imunizarea intra-specie sau inter-specii, după absorbţia anticorpilor anti-izotip.
Răspunsul celular sau umoral timodependent nu se poate produce la un animal timecto mizat în
timpul vieţii intrauterine sau la naştere, la şoarecele nud, timectomizat sau la un subiect cu
maladia di George, caracterizată prin absenţa congenitală a timusului. Antigenele
timodependente sunt în general de natură proteică dar pot fi şi de natură glucidică. Ele induc un
răspuns primar iniţial slab, de izotip IgM, cu memorie, urmat de un răspuns secundar specific,
cu IgG, IgA sau IgE. Pentru obţinerea sa, sunt necesare 3 celule (o celulă prezentatoare de
antigen, un limfocit T helper şi un limfocit B) sau 2 celule (atunci când LB joacă şi rolul de APC).
Existenţa anticorpilor „naturali” şi a celor apăruţi în urma unui răspuns imun face necesară
divizarea antigenelor în două categorii:
Antigenele ABH ale grupului sanguin ABO sunt larg răspândite în natură.
Prezenţa lor în bacteriile intestinale saprofite duce la imunizare în primele luni de viaţă.
Răspunsul imun este de tip timoindependent. Anticorpii naturali anti-A şi anti-B sunt din clasa
208
IgM, uşor adsorbabili de substanţele A sau B salivare. Aceşti anticorpi, consideraţi alloanticorpi
în cazul transfuziilor sanguine, sunt de fapt heteroanticorpi.
Unele antigene sunt limitate la o singură specie şi la un singur tip celular (un
exemplu fiind antigenele sanguine Rh). Anticorpii apăruţi în urma răspunsului imun nu apar
decât după contactul cu hematiile unui subiect de grup diferit, după o transfuzie sau după
pasajul hematiilor fetale în sângele femeii gravide.
209
- Ag incomplete care nu pot declanşa RI dar pot reacţiona (in vitro) cu Ac; sunt de ex. epitopi
izolaţi, nelegaţi de grupări purtătoare (pot fi haptene).
210
repetitive, fie sub forma mai multor motive proteice diferite, recunoscute de către sistemul
imun.
Numărul determinanţilor antigenici care pot fi recunoscuţi de către sistemul imun constituie
repertoriul imun. Pe baza cunoştinţelor asupra structurii părţii variabile a imunoglobulinelor,
genomul uman codifică pentru aproximativ 107-108 tipuri posibile de anticorpi diferiţi. În plus,
mutaţiile frecvente în linia B aduc posibilităţi suplimentare, lărgind repertoriul imun. Acelaşi Ac
poate recunoaşte mai mulţi determinanţi antigenici diferiţi, cu afinităţi variabile.
Pe de altă parte, o moleculă de antigen are mai mulţi epitopi (10-20), valenţa antigenului fiind
dată tocmai de numărul acestora (de ex. dacă există 16 epitopi, valenţa este 16 şi ar putea fixa 8
molecule de anticorpi din clasa IgG, fiecare cu câte 2 situsuri combinative). Fiecare epitop este
recunoscut şi declanşează un RI şi sinteza de anticorpi care îl recunosc doar pe el.
Imunogenicitatea este capacitatea unui Ag de a induce un răspuns imun umoral sau celular.
O haptenă este o moleculă mică (naturală sau artificială), incapabilă să inducă singură un
răspuns imun dar care poate fi recunoscută de componentele sistemului imun. Termenul a fost
introdus de Landsteiner în 1930. Haptena are specificitate dar nu are imunogenicitate.
Termenul de haptenă nu este sinonim cu cel de determinant antigenic: haptena poate fi mai
mică, egală sau mai mare ca epitopul.
Purtătorul(carrier-ul) este partea Ag cu structură proteică, în general, care prin cuplare cu
haptena face ca aceasta să devină imunogenă.
Unele antigene sunt capabile să inducă producţia de anticorpi IgE şi prin aceasta să provoace o
reacţie de hipersensibilitate mediată umoral (tip I). Principalele alergene cunoscute sunt
polenul, veninul de viperă, praful de acarieni şi unele fragmente sau produse de srcine animală.
Un adjuvant poate creşte intensitatea răspunsului imun faţă de un antigen la care acesta este
asociat. Adjuvanţii pot fi utili atunci când antigenele sunt eliminate rapid şi nu există timpul
necesar pentru stimularea RI. Pentru ca Ag să persiste cât mai mult, ele sunt asociate cu aceste
substanţe numite generic adjuvanţi (ex. hidroxid de aluminiu, saponină, adjuvant Freund etc).
211
Pe lângă răspunsul imun specific, antigenele pot antrena o hipergamaglobulinemie globală,
stimulând diviziunea limfocitelor B. Aceasta se observă frecvent în cursul infecţiilor sau
inoculării de lipopolizaharide enterobacteriene.
Pot apărea şi alte modificări în organismul gazdă, care ţin de răspunsul imun. Persistenţa
activării macrofagelor într-un focar poate determina formarea granuloamelor. Acestea sunt
formate (concentric, dinspre interior spre exterior) din structuri proprii și antigene fagocitate
sau nu de macrofage, celule gigante multinucleate numite și ”celule epitelioide” (formate din
fuziunea macrofagelor activate), acumulare periferică de celule T, neutrofile și celule dendritice
printre fibrele de colagen. Ȋn cazul tuberculozei (TB) centrul granulomului este reprezentat de
cazeum. În cazul persoanelor diabetice, a persoanelor cu SIDA sau cu alte stări de
imunodepresie procesul de formare a granuloamelor poate fi afectat, infecţia nu trece în stadiu
latent ci rămâne activă. Un alt argument poate fi reprezentat de următoarea constatare:
adminstrarea de anticorpi blocanți ai TNF (de exemplu, ca tratament simptomatic în artrita
reumatoidă) reactivează rapid tuberculoza.
Răspunsul organismului la agresiunea bacteriană se poate solda și cu alte afectări și chiar
distrugeri la nivel tisular, şoc toxico-septic sau reacții de tip Schwartzman. Şocul toxico septic
este provocat de o producere excesivă de citokine în cursul sepsisului, în special în infecțiile cu
germeni Gram negativi și respectiv cu eliminare importantă de LPZ. Apar febră înaltă, colaps
circulator, CID (coagulare intravasculară diseminată), necroză hemoragică și eventual afectare
multiplă de organ (MOF - multiple organ failure). În mod paradoxal, pacienţii care îşi revin după
acest tip de şoc pot dezvolta ”paralizie imună”, fiind susceptibili unei infecţii secund are.
(Sanarelli-Schwartzman) poate să apară experimental atunci cȃnd,
injectând subcutanat o doză mică de endotoxină, rezultă inflamaţie uşoară; ulterior, la
injectarea intravenoasă după 24 de ore a endotoxinei, zona anterior inflamată devine
hemoragică în cȃteva ore. Această reacție poate apărea după infecții cu bacterii Gram negative,
streptococi, mycobacterii, Corynebaterium diphteriae etc.
O a doua injectare după încă 24 de ore de la prima injectare intravenoasă a
endotoxinei/bacteriei poate determina colaps circulator şi necroză bilaterală a cortexului renal.
Mai pot apărea necroze la nivelul pancreasului, epifizei, corticosuprarenalelor, tubului digestiv,
tromboze și CID. La nivel microscopic apar modificări endoteliale, depozite de fibrină, acumulare
de neutrofile și degranularea acestora. Titrul interferonului se corelează cu distrugerile tisulare,
iar titrul TNF se corelează cu manifestările sistemice. Aceasta reacţie Schwartzman ar putea să
se afle la srcinea rash-ul ce apare la copii cu meningita meningococică sau a şocului septico-
toxic.
Organismul uman reușește, de obicei, să mențină o balanţă și nu apar agresiuni (auto -agresiuni)
evidente în cursul infecțiilor bacteriene. Principalele citokine imunoregulatoare sunt IL-10 si
TGFβ. Există și bacterii care profită tocmai de această balanţă a organismului.
(factori de virulenţă ai B. pertussis) favorizează secreţia de Il-10, ceea ce
conduce la favorizarea persistenţa bacteriene în organism prin inhibarea TH1. O perturbare a
acestei balanţe o poate determina omul prin tratament antibiotic (auto -administrat sau nu)
212
soldat cu distrugerea masivă a bacteriilor. Poate rezulta un răspuns inflamator sever cu
distrugeri tisulare.
Dar care ar fiutilitatea clasificării antigenelor? Diferite categorii de antigene vor ”dirija” diferit
răspunsul imun şi vor încearca să îl ”păcălească”, fiecare in stil propriu.
Prima linie de apărare a organismului este reprezentată de piele şi mucoase, de acizii graşi
secretaţi la nivel dermic (toxici pentru majoritatea bacteriilor), de mişcările cililor traheali, de
fluxul urinar, de pH-ul acid stomacal sau vaginal etc. Bacterile comensale pot limita invazia
bacteriana prin producerea unor proteine antibacteriene numite colicine.
A doua linie de apărare este reprezentată de răspunsul imun înnăscut (innate), fără intervenţia
LT sau LB. Acțiunea este îndreptată împotriva aşa-ziselor Ag microbiene comune, reunite sub
denumirea de PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) şi cuprinde molecule ce în
literatura anglo-saxonă sunt grupate sub denumirea de „patern recognition molecules” (ex:
colectine, ficoline, TLR-Toll like receptor, receptorul manozei, proteinele NOD, proteina A din
213
surfactantul pulmonar, complementul, PCR - proteina C reactivă). Spre exemplu, LPZ-ul
bacteriilor Gram negative este unul dintre cei mai importanți reprezentanți ai PAMPs. LPZ se
cuplează cu TLR4, activȃnd astfel raspunsul imun, cu stimularea secreției de TNF alfa, Il -1,
creşterea adezivităţii celulare, secreţia de peptide şi amine vasoactive și scăderea consecutivă a
tensiunii arteriale. Bacteriile Gram pozitive posedă acid lipotechoic şi peptidoglicani
(polizaharidele nu au suficient potenţial imunogen). TLR-urile implicate sunt de data aceasta 1, 2
si 6. Ȋn recunoaşterea lipoproteinelor mycoplasmelor, mycobacteriilor şi spirochetelor intervin
LBP și TLR4. TLR4 se mai numește şi CD14.
Cum se prezintă aceste pattern recognition molecules? Majoritatea sunt exprimate la suprafaţa
celulelor organismului (in special de la nivelul porţilor de intrare) și sunt îndreptate împotriva
patogenilor extracelulari. Dar există și molecule pentru patogenii care au pătruns în celulă, care
se află nu la nivelul membranei celulare ci la nivelul fagozomilor (TLR 9) sau solubili în citosol.
(Figura nr. 2). Listeria spp., Helicobacter pylori şi Salmonella spp. generează PAMPs
intracelulare. (Film nr. 1)
http://www.youtube.com/watch?v=2LchUweyRx0
Răspunsul specific se bazează pe activitatea LB şi a LT. Are loc un proces complex de interacţii
celulare cu rol de amplificare a semnalizării iniţiale și de evitare a răspunsului imun la un semnal
fals. LB au în principal rolul de a secreta Ac și de a păstra o memorie a agresiunilor infecţioase.
Anticorpii pot fi suficienţi numai dacă patogenitatea este indusă de o singură toxină sau
moleculă de adeziune iar Ac produşi sunt directionaţi împotriva acestei molecule cu rol patogen.
Anticorpii opsonizanţi sunt importanţi pentru rezistenţa împotriva bacteriilor extracelulare.
Bacterile patogene pot eluda răspunsul în anticorpi, aşa cum se petrece în cazul Neisseria
gonorrhoeae, de aceea omul se poate infecta în mod repetat cu acest microorganism, însă în
sȃngele său să nu se găsească dovezi ale imunităţii protective. (Film nr. 2)
http://www.youtube.com/watch?v=23lSlwzXnKM
214
Antigenul O, avȃnd un lanţ polizaharidic lung, poate fixa complementul la distanţă de bistratul
lipidic, astfel încât acesta nu işi poate exercita acțiunea litică. E. coli, Salmonella spp. și
Pseudomonas aeruginosa fixează complementul dar îl ”taie” rapid de pe suprafaţa celulară. Alte
microorganisme exploatează mecanismele fiziologice ale organismului gazdă pentru a ”păcăli”
sistemul imun.
Cȃnd C3b s-a ataşat de o membrană celulară poate interacţiona cu factorul B, care va amplifica
activarea complementului sau poate interacţiona cu factorii H şi I, care vor inhiba
complementul. Prezenţa acidului sialic favorizează interacţia complementului cu factorii H şi I iar
celulele organismului uman reprezintă un mediu bogat în acid sialic. Prin acest mod se apără
Neisseria meningitidis, E. coli K1 dar şi streptococii beta hemolitici de grup B. Proteina M a
steptococcilor de grup A funcţionează ca un acceptor al factorului H (să nu uităm că acești
streptococi posedă şi o genă ce codifică sinteza unei C5a proteaze).
Ataşarea de antigenele bacteriene a macrofagelor se poate face direct, prin intermediul TLR,
manose receptor (MR), scavenger receptors și dectin-1b sau indirect, după opsonizarea
bacteriei cu Ac, fibronectină, vitronectină sau complement, prin intermediul CR1, CR3, CR4,
MBL, integrine, FcγRI, FcγRII, FcγRIII.
Macrofagele tisulare (alveolare, celulele Kupfer etc.) oferă o oarecare protecţie, însă necesită
intervenţia altor fagocite (leucocite, neutrofile) care vor fi atrase în focarul inflamator de
componente bacteriene, de componenta C5a a complementului, de chemokine şi citokine
sintetizate de macrofagele din ţesutul respectiv și de unele celulele epiteliale. Streptococcus
pyogenes va determina leziuni acute şi atragerea la nivelul focarului infecţios în s pecial a
neutrofilelor, în timp ce Mycobacterium tuberculosis determină leziuni cronice şi va atrage
macrofage, LT şi celule multinucleate derivate din macrofage.
După cum știți, macrofagele produc specii reactive de oxigen (foarte toxice pentru
microorganism, dar şi pentru celulele organismului gazdă). O specie reactivă de oxigen se
215
formează în principal pe calea anionului superoxid. O astfel de substanţă are adăugat un
electron, care o va face instabilă şi care va determina un şir de reacţii în lanţ în organism. Studii
recente pe neutrofile au demonstrat că speciile reactive de oxigen sunt bactericide şi indirect
(prin inducerea unui flux de Kîn fagozomi) activează producerea de proteaze. NO se formează
din L-arginină sub acţiunea NO-sintetazei, care poate fi indusă de IFNγ și TNFα, NO fiind tot o
specie reactivă de oxigen, formată pe altă cale decȃt a anionului superoxid.
Dar există şi metode oxigen-independente prin care fagocitele pot distruge bacteriile, de
exemplu, prin intermediuil proteinelor cationice. Defensina din granulele neutrofilelor se inseră
între lipidele membranei bacteriene şi crează un canal transmembranar care va duce la liza
respectivului microorganism. Microbii sensibili la defensină sunt Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Cryptococcus neoformans. Catepsina G şi azurocidina sunt
active pe bacteriile Gram negative. Fierul este foarte important pentru dezvoltarea bacteriilor
intracelulare, neutrofilele îngreunȃnd accesul microorganismelor la acest element. Ȋnsă,
organismul gazdă are nevoie crescută de fier de vreme ce este co-enzimă pentru generarea NO
şi pentru lanţul respirator. E foarte important de reţinut că neutrofilul are o viaţă scurtă dar este
foarte agresiv cu bacteriile, în timp ce macrofagul are o viață mai lungă, însă neactivat, este un
... prieten al bacteriilor. Cel mai important factor de activare a macrofagelor este IFNγ, iar acesta
este produs în cele mai mari cantităţi de TH1 (CD4+).
Există diferite metode prin care patogenii ”păcălesc” apărarea fagocitară. Listeria
monocytogenes, Shigella spp. şi Burkholderia pseudomallei eliberează enzime care distrug
membrana fagozomilor, împidedicând asfel unirea cu lizozomii şi formarea complexului fago-
lizozom.
M. leprae şi Salmonella spp. se îndreaptă spre celulele Schwann, hepatocite şi celulele
epiteliale, care au o capacitate mai redusă de apărare. Streptococcus pneumoniae şi C.
neoformans au un înveliş protector, care inhibă ataşarea macrofagelor de aceste bacterii.
Stafilococii posedă catalază, care scade stresul oxidativ. M. leprae se înconjoară cu un glicolipid
care absoarbe radicalii liberi. Micobacteriile, în general, eliberează lipoarabinoman, care scade
eficienţa IFN în activarea macrofagelor. Celulele gazdei infectate cu Salmonella enteritidis, M.
tuberculosis sau Chlamydia trachomatis nu işi exercită corespunzător funcţia de prezentare a
antigenelor. Yersinia spp. induce apoptoza celulei gazdă.
După internalizarea anumitor antigene urmează expunerea acestora la suprafaţa APC.
Recunoaşterea de către TCR (T cell receptor) a Ag impune ca acest Ag să fie legat de o moleculă
MHC (major histocompatibility complex). Ag endogene (peptide) vor fi prezentate pe MHC I, iar
Ag exogene (peptide derivate din proteine extracelulare, care au ajuns la nivelul APC prin
fagocitoză sau endocitoză, aşa cum este cazul antigenelor bacteriene) pe MHC II. Genotipic,
MHC I sunt codificate de genele HLA-A, HLA-B, iar MHC II, de HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR. CD1
este o moleculă asemănătoare MHC I care prezintă antigene lipidice (M. tuberculosis, H.
influenzae). (Film nr. 4)
http://www.youtube.com/watch?v=m0ShUtbPllY
LTc (CD8+) pot elibera microorganismele care s-au „ascuns” la nivelul celulelor gazdă. S-a
demonstrat că prăbușirea sistemului MHC I la şoareci duce la lipsa de răspuns din partea LTc şi
consecutiv, aceşti şoareci devin susceptibili la infecţia cu M. tuberculosis. Tendinţele actuale
sunt de a găsi un vaccin care să stimuleze formarea LTc (Figura nr. 3). S-a mai observat că pe
216
lȃngă dependenţa activării LTc de prezentarea MHC I-Ag, mai există şi o dependență de
activitatea litică a fagozomilor.
TCR (fie ei situaţi pe LT CD4+ sau CD8+) sunt de 2 tipuri: cu lanțuri αβ şi cu lanțuri γδ. Aceste 2
tipuri diferă prea puţin ca structură şi mai mult ca distribuţie. Consecutiv, cele 2 specii de
receptori vor avea funcţii diferite. TCR αβ se găsesc la nivelul sȃngelui periferic şi a timocitelor,
iar TCR γδ la nivelul pielii, mucoaselor, aparatului digestiv şi reproducător. De aceea s -a ridicat
ipoteza conform căreia LT î n care predomină TCR γδ să nu aibă neaparat nevoie de prezentare
MHC-Ag pentru activare (Unele LT γδ recunosc fosfoliganzi derivaţi din M. tuberculosis care le
determină activarea).
Superantigenele activează direct LT, fără a mai fi nevoie de prezentarea lor de către un APC pe
un MHC. Stafilococcii şi streptococcii posedă 21 de superantigene, probabil cu rol adaptativ. S-
ar putea ca motivul să fie o cât mai rapidă depleţie de LT a gazdei și inhibarea producerii de
anticorpi. Certa e însă toxicitatea determinată de eliberarea masivă de citokine. TSST -1 (toxic
shock syndrom toxin-1) aparţinȃnd stafilococcilor este un exemplu de superantigen. Și proteina
M a Streptococcus pyogenes formeză un complex cu fibrinogenul, complex care se leagă de
integrinele de pe neutrofile, determinȃnd eliberarea în cantităţi mari a mediatorilor inflamatori.
Dacă un antigen convenţional activează 0,01-0,1% LT, superantigenele activează 5-30% din
populaţia LT.
Datele din USA referitoare la TSS (toxic shock syndrome) publicate într-un articol în 2010 relevă
o incidenţa a infecţiilor GAS (group A streptococci) de 1,5 -5,2o/oooo/an, din care 8-14% au
dezvoltat TSS, cu o mortalitate de 30-70%. O epidemie de varicelă creşte riscul de TSS la
62,74o/oooo. La 50% din pacienţii cu TSS au avut afectări severe de ţesuturi moi, precum
fasciita necrozantă, miozită, celulită. (1)
HSP (Heat shock proteins) sunt proteine comune atȃt organismelor umane, cȃt si bacteriilor şi
au fost denumite astfel datorită faptului că s-a remarcat creşterea expresiei acestora în condiţii
de temperaturi ridicate sau față de alţi factori de stres (ex. un proces infecţios). HSP au rol în
asamblarea, formarea structurii cuaternare a proteinelor şi în transportul altor molecule. Ȋn
timpul unei invazii bacteriene, sistemul imun se îndreaptă şi împotriva HSP, atȃt a celor
autohtone, cȃt şi a celor bacteriene. HSP activează sistemul imun prin intermediul CD91, CD40,
CD14 şi anumiţi TLR. Datorită asemănării structurale între cele 2 tipuri de HSP se presupune că
aceste proteine ar avea un rol important în generarea bolilor autoimune.
Tot timpul ne aflăm sub influenţa antigenelor bacteriene. Unele asigură sau înlesnesc procese
fiziologice, aşa cum se întȃmplă la nivelul intestinului gros, altele, prin competiţie ne protejează
de germeni virulenţi, aşa cum se întȃmplă de ex. la nivelul foselor nazale. Dar există şi ”teoria
igieniei”, neconfirmată şi nu neapărat adevarată sau aplicabilă tuturor microorganismelor,
conform căreia şi infecţia uşoară şi tranzitorie (nu boala) cu bacterii patogene este de folos.
”Alergiile” (stările de hipersensibilitate), bolile inflamatorii ale intestinului subțire şi bolile
autoimune ar fi generate de un dezechilibru imun generat de igienă, vaccinuri și antibiotice.
Ideea este nu de a elimina aceste 3 modalități clasice de apărare împotriva infecțiilor, ci de a
afla cum, cȃnd și cȃt trebuie folosită fiecare ”armă” şi de a cunoaște cȃt mai bine adversarul
împotriva căruia o folosim.
217
Pacienta în vȃrstă de 25 ani, se prezintă la camera de gardă după 2 zile de rash cutanat şi o
durere surdă difuză în cadranul stȃng inferior al toracelui.
Ȋn urmă cu o săptămȃnă a fost diagnosticată cu faringita streptococică şi a primit amoxicilină. S-
a prezentat după 3 zile la serviciul de dermatologie datorită rash-ului, unde i s-a pus diagnosticul
de alergie la amoxicilină. Prin urmare, a fost întrerupt tratamentul cu amoxicilină şi s-a
recomandat prednison.
Este corectă atitudinea dermatologului?
Argumentaţi.
La efectuarea anamnezei pacienta acuză greață, vărsături, febră, fatigabilitate, dezorientare și
durerea surdă menţionată mai sus. Neagă să fi avut sȃngerări (melenă, hemoptizie, hemoroizi).
Examen și analize: TA=65/35 mmHg, AV=110-120bpm, FR=20/min, T:39,7°C, SO2=93%.
La examenul fizic: pacienta este palidă, cu starea generală alterată. Orofaringele clar, fără
exsudate sau eritem, crepitaţii difuze la auscultaţia pulmonară, fără sufluri supraadăugate sau
zgomote patologice cardiace, abdomen suplu, mobil cu respiraţia. În tabel sunt listate
determinările biochimice şi hematologice anormale (comparativ, valorile normale). (Tabelul nr.
1)
Se efectueaza o radiografie (Rx) cardio-pulmonară, care este în concordanţă cu explorările
paraclinice şi cu examenul clinic, punȃndu-se diagnosticul de etapă, ARDS (adult respiratory
distress syndrome). (Figura nr. 3)
La întoarcerea de la radiologie, pacienta devine iar hipotensivă, tahicardică, tahipneică; febra se
menţine în ciuda adminitrării de acetaminofen. Se decide intubarea pacientei datorită
insuficienţei respiratorii ce se agravează, se recoltează probe de sȃnge, urină, exsudat faringian
şi se face o puncție lombară. Se solicită titrul ASLO și TSST-1. Se iniţiază tratament cu
clindamicină, vancomicină și meropenem iar pacienta este transferată în serviciul de ATI.
Ȋn 1993 s-a ajuns la un consens privind TSS produs de streptococi, care presupune stabilirea
diagnosticului pozitiv dacă sunt îndeplinite concomitent următoarele condiţii:
1) Izolarea streptococcilor de grup A (GAS) dintr-o zonă în mod normal sterilă (sȃnge, fluid
cerebro-spinal, pleural, peritoneal)
2) Hipotensiune
3) 2 sau mai multe dintre următoarele:
· Insuficienţă renală (creatinina>2mg/dL sau valori de 2 ori mai mari decȃt în mod normal la
pacienţii cu boală renală)
· Coagulopatie
· Enzime hepatice crescute
· ARDS (adult respiratory distress syndrome)
· Rash maculo-eritematos
· Necroză de ţesut moale.
Introducerea vaccinurilor antivaricelă a scăzut incidenţa TSS de la 27% în 1993-1995 la 2% 1995-
2001. Utilizarea de medicamenteantiinflamatorii nesteroidiene (AINS) se pare că favorizează
TSS. Un articol din 1995 a Chuang șsi colab. arată că 92% din pacienţii cu TSS folosiseră anterior
AINS. Mai mult, AINS pot masca simptomatologia şocului toxico-septic.
Diferenţierea între TSS stafilococic şi steptococic este greu de făcut. Pacienţii cu infecție
stafilococică pot prezenta diaree, vomă, eritrodermie generalizată, insuficienţa conjunctivală,
218
mialgie severă. Pacienţii cu infecție streptococă pot prezenta necroză de ţesut moale (celulită,
fasciită, abces, miozită), simptomatologie influenza-like, varicelă în antecedente în cazul celor
nevaccinaţi.
Ȋn cazul TSS stafilococic, se pare că toxina TSST-1 este responsabilă de 75% din cazuri. Pentru
TSS steptococic, proteina M este responsabilă de 75% cazuri iar SPEs A, B, C sunt responsabile
de circa 13% (SPEs = Streptococcus pyogenes exotoxins). Specificitatea determi nării Ac anti
TSST-1 este de 90%, în timp ce pentru determinarea titrului proteinei M nu există teste fiabile.
Se poate folosi în schimb titrarea ASLO în dinamică.
Ȋn ciuda ambiguităţii privind etiologia, tratamentul rămȃne acelaşi:
· cristaloizi şi agenţi inotrop pozitiv contra şocului hipovolemic, cu monitorizarea TA şi a PVC
· antibiotice: penicilină, vancomicină şi clindamicină (penicilină sau alte beta-lactamine
pentru streptococ; vancomicină sau peniciline sintetice pentru stafilococ; clindamicina s-a
introdus pentru că are un efect mai îndelungat după administrare, facilitează fagocitoza
bacteriei, inhibă liza celulelor bacteriene cu eliberarea consecutivă suplimentară de citokine în
circulaţie).
· terapii adjuvante (încă în stadiu de cercetare): =imunoglobuline administrate intravenos,
O2 hiperbar, Ac antiTNF.
Evoluţia pacientei: Statusul respirator s-a îmbunătăţit, cu detubare la 48 de ore. Titrul Ac anti
TSST-1 s-a pozitivat după 2 săptămȃni, ASLO a rămas normal. S-a trecut pe antibiotice orale,
funcţia renală şi WBC au revenit uşor la normal, s-au efectuat radiografii toracice zilnice, care au
confirmat şi rezolvarea ARDS. Pacienta a fost externată după 14 zile de spitalizare.
Diagnosticul final: Şoc toxico-septic stafilococic, probabil post-pneumonic.
Cititorul care doreşte să aprofundeze unele dintre aspectele menţionate în acest capitol poate
să acceseze informaţiile oferite de site-urile de mai jos sau şi alte site-uri.
http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0014374
Analogii alfa-galactozil ceramidului - candidaţi pentru terapia antiinflamatorie
http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0015225
Antigenele cuplate cu lipozomi - posibile aplicaţii în fabricarea vaccinurilor
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21178114
Eliberarea de oxid nitric în cadrul infecţiilor virale poate influenţa funcţia de prezentare
antigenică ulterioară
http://www.biomedcentral.com/1746-6148/6/57
Modificările genetice şi antigenice H5N2 - impactul asupra supravegherii epidemiologice
http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0015227
Injectarea unor antigene ale E. coli în celulele umane, cu scop curativ
219
La întrebările următoare, alegeţi răspunsul corect.
1. Care dintre următoarele microorganisme au toxicitate dar nu şi invazivitate?
a) Klebsiella pneumoniae şi Vibrio cholerae
b) Corynebacterium diphteriae şi Vibrio cholerae
c) Escherichia coli şi Salmonella typhi
d) Corynebacterium diphteriae şi Mycobacterium tuberculosis
3. Ce este un granulom?
a) o marcă a RIC împotriva bacteriilor intracelulare
b) un tip de modificare anatomo-patologică acută
c) o marcă a RIU împotriva bacteriilor extracelulare
d) o marca a RIC împotriva bacteriilor extracelulare.
5.Iată 3 afirmaţii: (1) „cu cât structura chimică antigenică provine de la o specie mai îndepărtată
filogenetic, cu atât RI va fi mai slab”; (2) „structura chimică trebuie să fie cât mai simplă” și (3)
„greutatea moleculară trebuie să fie cât mai mare (de regulă peste 4-5.000 Da)”. Alegeţi
varianta corectă dintre urmatoarele:
a) (1) și (3) sunt false
b) (1) și (2) sunt adevărate
c) doar (3) este adevărată
d) doar (2) este falsă
220
În momentul în care un Ag pătrunde pentru prima dată în organism, sistemul imun nu posedă
decât un număr redus de limfocite T sau B specifice recunoaşterii porţiunilor peptidice
(epitopilor) acestui Ag. Astfel, dintr-un repertoriu preexistent de limfocite, Ag le va selecta
numai pe cele care sunt capabile să recunoască și să se combine cu Ag. În acelaşi timp (cu mici
excepţii) nu există nici o celulă sau moleculă capabilă să elimine Ag sau microorganismul care îl
poartă, motiv pentru care este necesară apariţia limfocitelor T citotoxice, secretoare de citokine
(imunitate celulară) sau a plasmocitelor anticorp-secretante (imunitate umorală).
Răspunsul imun (RI) include totalitatea evenimentelor care au loc după introducerea unui Ag, și
anume:
· activarea limfocitelor,
· eliberarea a diverse molecule,
· multiplicarea celulelor specifice,
· producerea de limfocite T citotoxice sau de anticorpi capabili să se fixeze pe Ag şi să
participe la
· eliminarea acestuia (direct sau indirect).
După acest prim contact (ca şi în cursul imunizării consecutive), sistemul imun produce
limfocitele T şi B de memorie, capabile să reacţioneze mai rapid, mai amplu, cu ocazia unei
reintroduceri ulterioare a aceluiaşi antigen.
Aşa cum a fost menţionat anterior, principala caracteristică a imunităţii este specificitatea.
Pentru a sugera cât de specific este răspunsul imun, o modalitate este de a discuta despre
„potrivirea dintre cheie şi broască”, între structurile Ag şi Ac. Acest exemplu are un grad de
sugestivitate, dar este incomplet în comparaţie cu realitatea. O altă modalitate de a sugera
specificitatea răspunsului imun ar fi „potrivirea dintre mâna aşezată în faţa oglinzii şi imaginea
din oglindă”.
Probabil, o modalitate şi mai sugestivă ar fi cea discutată la cursurile de imunologie din INCDMI
”Cantacuzino”: răspunsul imun este atât de specific, încât dacă ne-am închipui că Ag este
reprezentat de o pagină dintr-un manual, dacă am schimba nu o frază, un rând, un cuvânt ci
chiar o singură literă într-un cuvânt de pe o anumită pagină, această schimbare ar fi sesizată de
sistemul imun iar Ac produşi se vor „potrivi” cu această pagină în care a fost schimbată o singură
literă. Totuşi, aşa cum am menţionat la punctul 16. 2. 1., există şi reacţii încrucişate.
O altă caracteristică foarte importantă a RI, în condiţii fiziologice, este capacitatea de a discerne
între self şi non-self şi de a reacţiona numai faţă de moleculele care îndeplinesc definiţia de
antigen (vezi şi MHC/CMH).
Răspunsul imun poate fi de tip umoral, mediat prin anticorpi sau de tipcelular, mediat de către
celule. În cazul antigenelor timodependente (cea mai mare parte a antigenelor), se dezvoltă un
răspuns imun celular specific prin LT citotoxice şi unul umoral specific prin anticorpi. Diferite
citokine pot activa sau inhiba, în mod preferenţial, unul sau ambele tipuri de răspuns. În cazul
antigenelor timoindependente, răspunsul imun este umoral. În continuare vor fi prezentate în
mod schematic aceste două tipuri de răspuns imun umoral şi celular.
221
Răspunsul imun umoral (RIU) constă în producerea de Ac specifici şi este transferabil pentru o
perioadă de timp (3-6 săptămâni), prin ser, la un alt animal. Imunitatea umorală intervine în
distrugerea bacteriilor extracelulare, neutralizarea virusurilor, inhibarea toxinelor.
Natura antigenelor faţă de care se dezvoltă un răspuns imun umoral include poliozide, proteine,
substanţe sintetice, rareori lipide şi acizi nucleici sau anticorpi (în cazul proceselor autoimune).
Unele antigene („alergenii”) determină un RI cu anticorpi de tip IgE.
Introducerea antigenului pe cale subcutană, intramuscular sau intravenos determină un RIU c u
producerea de IgM și/sau IgG iar administrarea pe cale orală determină un răspuns preferenţial
cu IgA.
După o primă administrare intravenoasă, la un subiect care nu a mai venit în contact cu
respectivul antigen, Ag molecular parcurge următoarele etape succesive:
1. descreşterea cantitativă rapidă, datorată difuziei în spaţiile extravasculare;
2. dispariţia lentă, datorată catabolismului propriu al antigenului;
3. descreşterea rapidă după 8-10 zile, ca urmare a eliminării formaţiunilor imune (complexele
imune) rapid fagocitate.
În cazul antigenelor particulate (celule, bacterii, virusuri) sau al antigenelor sub formă de
agregate, eliminarea este mult mai rapidă, prin procesul de fagocitoză (care antrenează o
imunizare mai precoce).
În cazul utilizării căii subcutanate, antigenul rămâne, în parte, la locul de inoculare. Adăugarea
unui adjuvant menţine antigenul în acest loc şi favorizează o stimulare imunologică de durată
(eventual şi formarea unui granulom inflamator). În următoarele ore, antigenul migrează în
sinusurile subcapsulare ale ganglionilor corespunzători anatomic, apoi în zona medulară şi în
final (24 de ore) ajunge în regiunea corticală, la periferia foliculilor primari. În interiorul
organelor limfoide, antigenul se regăseşte în celulele fagocitare. În prezenţa anticorpilor
preformaţi şi a sistemului C', unele antigene se localizează la suprafaţa celulelor dendritice
intrafoliculare din centrii germinativi. Contactul cu antigenul antrenează importante modificări
histologice ale organelor limfoide: centri germinativi se dezvoltă în foliculi şi persistă mai multe
săptămâni; în paralel apar atât imunoblaştii şi plasmocitele, cât şi limfocitele de memorie; după
3-4 zile se pot detecta limfocite cu anticorpi membranari, apoi celule care sintetizează anticorpi
serici.
Înaintea primului contact cu un anumit antigen, nu există anticorpi „potriviţi” față de acesta.
Stimulul antigenic primar „selectează” LB care au receptori pentru respectivul Ag. După primul
contact cu Ag se dezvoltă RIP, cu următoarele caracteristici:
· Latenţa: reprezintă perioada de la contactul cu Ag până la prezentarea structurilor Ag către
LB (în conjuncţie cu moleculele MHC); variază în funcţie de natura antigenului, calea de
administrare şi doza administrată; durează între 2 şi 3 zile;
222
· Creşterea logaritmică: (sinteză activă de Ac, de către plasmocite) durează circa 3 zile; în
timpul acestei perioade, Ac devin decelabili prin reacţii Ag-Ac; urmează o fază de stagnare
(câteva zile), timp în care titrul anticorpilor serici se menţine relativ constant;
· Ulterior are loc scăderea progresivă a titrului anticorpilor serici.
De regulă, tehnicile imunologice uzuale permit identificarea Ac după 5 -14 zile de la stimulul
antigenic primar.
Natura anticorpilor:
· examinarea claselor de anticorpi produşi arată că primii anticorpi care apar sunt de tip IgM
(cei din clasa IgG apar câteva zile mai târziu iar nivelul lor creşte pe măsură ce nivelul IgM
scade);
· în următoarele 2-3 săptămâni, în ser predomină anticorpii de tip IgG;
· în următoarele luni, eventualii anticorpi care persistă sunt de tip IgG.
Răspunsul imun secundar apare după al doilea contact cu acelaşi antigen (sau după contacte
ulterioare). RIS are următoarele caracteristici:
· poate apărea chiar şi după administrarea unor doze destul de mici de antigen;
· latenţa este redusă la circa 24 ore; se ajunge repede, abrupt la faza de creştere
logaritmică;
· anticorpii sunt de tip IgG;
· titrul Ac produşi este mult mai înalt;
· persistenţa acestora este mai lungă (Ac produşi se menţin timp mai îndelungat, luni de
zile).
Diferenţa dintre RIP şi RIS este datorată în primul rând existenţei limfocitelor cu memorie. După
eliminarea Ag, în organism continuă să „circule” celule cu memorie, reacţia imună la al doilea
contact cu acelaşi Ag având caracteristicile de mai sus. Memoria imună se stabileşte din timpul
RIP şi este specifică.
Determinarea claselor IgM şi IgG are o dublă importanţă practică:
· face posibilă distincţia între o afecţiune recentă şi una mai veche şi
· permite recunoaşterea unei infecţii congenitale (cu anumite excepţii).
Cunoașterea caracteristicile RIP şi RIS are importanță practică. Ne permite să înţelegem şi
motivul pentru care reacţiile Ag-Ac trebuie făcute, de regulă, „în dinamică”.
223
După contactul cu antigenul și activarea completă, LTh se vor numi LThp (primitive), care
ulterior vor începe proliferarea și sinteza de IL2. Prin stimulări autocrine repetate LThp se vor
diferenția în LTh0 și apoi în LTh1 sau LTh2 în funcție de mediul citokinic din jur și de citokinele
produse (vezi și 11.3.1.).
Limfocitele Th2 sunt reprezentative pentru RIU (Figura nr. 1). LTh2 secretă IL-2, IL-4, IL-5 şi IL-6,
care activează LB și stimuleaza mecanismul de „switch” izotipic în genomul LB. Acest „switch” se
realizează prin rearanjarea ADN-ului, pentru sinteza Ac diferiți structural, dar cu aceeași
specificitate pentru antigen.
Limfocitele B pot fi activate şi direct, în cazul antigenelor timoindependente de srcine
polizaharidică, cu epitopi repetitivi. Aceasta se realizează prin formarea unor punţi între
receptorii de suprafaţă şi determină redistribuţia Ig pe suprafaţa membranei celulare. În lipsa
interleukinelor produse de LT, activarea LB este limitată la sinteza de IgM, fără „comutarea”
spre IgG.
Prima etapă constă în activarea limfocitelor B din stadiul G0 al ciclului celular spre stadiul G1
(celula sintetizează ARN şi creşte în volum); stimulul este reprezentat de contactul cu antigenul.
IL-4, secretată de limfocitele Th, poate transforma limfocitele B din stadiul G0 şi G1 şi creşte
expresia moleculelor MHC. În acest stadiu LB activat exprimă molecule noi: CD23, CD34 şi CD40.
Al doilea timp corespunde proliferării policlonale a celulelor B activate, care trec din stadiul G1
în fazele S şi M. Această fază necesită prezenţa IL-2 şi IL-5.
Ultima fază constă în diferenţierea în celule producătoare de anticorpi - plasmocite; secreţia de
IL-6 ajută procesului de maturizare iar diferitele interleukine permit orientarea izotipică spre
sinteza unei clase particulare de imunoglobuline.
Așadar, există o intensă colaborare între LB, LTh și APC atât prin contact direct cu ajutorul unor
molecule de adeziune, cât mai ales prin intermediul citokinelor, adevărați mesageri (”hormoni”)
ai imunității.
Teoria selecţiei clonale a fost propusă în jurul anului 1950 de către McFarlane Burnet. Această
teorie afirmă că la nivelul sistemului imun există un număr imens de „capi” de clone de
limfocite, fiecare dintre aceşti „capi de serie” corespunzând unei structuri antigenice (u nui
anume epitop); în cadrul aceleaşi teorii, Burnet a făcut estimarea că în lume ar exista circa 100
de milioane de tipuri de epitopi diferiţi. Clona, aşa cum se cunoaşte, este o populaţie de celule
identice din punct de vedere genetic, descendente ale un ei singure celule „mamă”.
Toate celulele unei anumite clone au la suprafaţă, molecule identice cu structură
imunoglobulinică; aceste imunoglobuline au rol de receptori pentru structurile antigenice
(pentru fiecare antigen diferit există un receptor diferit).
Structurile antigenice „selectează” din acest număr imens de limfocite „cap de serie” pe acelea
care au receptori complementari (configuraţie spaţială etc) şi astfel determină proliferarea şi
diferenţierea lor în celule producătoare de anticorpi. Celulele unei clone au aceeaşi specificitate
pentru structura antigenică datorită căreia au proliferat.
Clonele de limfocite care ar putea să producă anticorpi faţă de structurile proprii („self”) sunt
reprimate în timpul vieţii intra-uterine şi numai celelalte clone pot ajunge la maturitate. În lipsa
acestei represii apar boli autoimune grave, potenţial fatale.
224
Imunitatea celulară presupune în special dezvoltarea unui răspuns imun faţă de celulele
infectate cu virusuri, celulele infectate cu microorganisme cu multiplicare intracelulară
(mycobacterii, Listeria spp., Brucella spp. etc), paraziţi intracelulari, allogrefe, celule tumorale.
Un microorganism cu dezvoltare intracelulară penetrează în diverse celule şi în particular în
macrofage (aflate în stare de repaus şi neactivate) şi se poate divide fără ca acest proces să
inducă o reacţie imună celulară naturală şi specifică. Macrofagul care a fost infectat cu un
microorganism secretă o serie de citokine (IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-a şi TNF-β) care la rândul
lor vor acţiona după cum urmează (Figura nr. 2):
· TNF-a va activa macrofagul infectat;
· TNF-a, TNF-β vor activa macrofagele neinfectate încă;
· TNF-a, IL-10, IL-12 vor activa celulele NK.
Această primă fază va pune în mişcare celulele imunităţii celulare specifice şi astfel limfocitele
Th0 vor fi activate şi se vor diferenţia în Th1, datorită IL-12, secretată de macrofage şi a IFN-g,
secretat de celulele NK activate.
Antigenele proteice sunt transformate de către APC în peptide de 12-20 aminoacizi. Acest tip de
antigene induce o dublă imunizare celulară şi umorală. Nu a fost încă demonstrat, complet, RIC
faţă de antigenele ne-proteice.
LT CD8+ sunt selecţionate după specificitatea lor faţă de antigen şi activate de diferitele citokine
(IL-2, IFN-g) secretate de limfocitele Th1 activate în prealabil.
Prin citokinele secretate, imunitatea celulară permite recrutarea şi activarea unor celule care nu
sunt specifice antigenului:
¨ IL-2 - produsă numai de LT (în principal CD4+ şi numai într-o mică măsură de către
CD8+), are o acţiune autocrină asupra LT dar şi asupra monocitelor, macrofagelor, LT CD8+ şi a
celulelor NK;
225
¨ IFN-g - produs în principal de LT (CD8+ şi mai puţin din CD4+) dar şi de celulele NK,
activează macrofagul, creşte sinteza de molecule MHC II, recrutează celule NK şi le activează
funcţia citotoxică sub efectul TNF-a şi împiedică infectarea celulelor cu virusuri (acţiune
antivirală).
În stabilirea şi aplicarea tratamentului unui anumit pacient, nu trebuie niciodată uitat rolul
răspunsului imun (nici în plus şi nici în minus). De exemplu, pacientului imunodeprimat trebuie
să-i administrezi antibiotice bactericide și nu bacteriostatice.
Pacientul imunodeprimat, fiind sub tratament etiologic eficient, dar la care din diverse motive
se restaurează imunitatea, poate face reacţii cu impact fatal asupra evoluţiei. O infecţie cronică
cu VHB la un pacient cu tratament imunosupresor în diverse situaţii, nu ridică probleme
deosebite hepatice. Reducerea imunosupresiei, creşterea răspunsului imun, „găseşte” pacientul
într-o situaţie în care viremia este „înaltă”. Reacţia imună, recent restaurată, poate induce
leziuni hepatice severe, hepatită fibrozantă colestatică cu mortalitate uneori până la 90%. Un alt
exemplu ar fi pacientul cu infecţie HIV, aflat la debutul unui tratament antiretroviral. Ac esta,
datorită aceluiaşi proces de restaurare imună, poate să dezvolte afecţiuni nemanifeste până
atunci, numite sindrom de reconstrucţie imună, cu mortalitate foarte mare. Aşadar, este
necesară o atenţie deosebită atât în ceea ce priveşte imunodepresia cât şi în cazul revenirii
imunităţii.
Stresul este cunoscut ca având efect inhibitor al răspunsului imun, crescând astfel
susceptibilitatea la infecții și cancer.
Paradoxal, stresul este învinuit pentru exacerbarea astmului și a bolilor inflamatorii și
autoimune, deși astfel de boli ar trebui să fie ameliorate de un anumit grad de imunosupresie.
Mai mult, răspunsul de tip „fight-or-flight” este unul dintre mecanismele naturale de apărare
care prin activarea aparatelor cardiovascular si musculoscheletal promovează supraviețuirea, și
de aceea este puțin probabil ca acest răspuns la stres să suprime funcția imună, în momentul în
care este esențială pentru supraviețuire. Fără acest răspuns un tigru nu poate prinde o
căprioară, în timp ce căprioara nu ar avea nici o șansă de supraviețuire. Aceste observații
sugerează că stresul poate suprima funcția imună în anumite condiții și o poate întări în altele.
Așadar, efectele stresului pot fi atât benefice cât și dăunătoare.
Studiile au demonstrat că o serie de factori influențează direcția efectelor stresului:
1. durata stresului (acut vs. cronic): stresul acut exprimat în timpul activării imune stimulează
atât imunitatatea înnăscută cât și pe cea adaptativa; stresul cronic suprimă răspu nsul imun
scăzând numărul celulelor și/sau potențând mecanismele imunosupresoare (limocitele T
reglatorii). Stresul cronic poate perturba RI și prin promovarea răspunsului proinflamator.
2. distribuția leucocitelor: compartimentele cu un număr crescut de leucocite în timpul stresului
acut determină imunostimulare;
226
3. concentrația fiziologică vs. farmacologică a glucocorticoizilor și structura endogenă vs.
sintetică a acestora: hormonii endogeni în concentrație fiziologică au efect imunostimulant, în
timp ce hormonii endogeni în concentrații farmacologice și hormonii sintetici au efect
imunosupresor.
4. corelația timp de acțiune al agentului stresor – timp de activare a răspunsului imun:
imunostimularea se observă când agentul stresor acționează în stadii incipiente ale activării
imune, iar imunosupresia este asociată cu stadiile tardive ale RI.
Se consideră că stresul pe termen scurt induce o redistribuție a celulelor imune în organism,
funcția imună fiind semnificativ stimulată în organe pe unde leucocitele trec în timpul stresului
acut.
Un exemplu interesant este cel al unor parașutiști cărora li s-au măsurat nivelul plasmatic al
cortizolului și al celulelor LT și NK cu 2 ore înainte, și la 1 oră după săritură. Rezultatele arată o
creștere semnificativă în numărul celulelor imune înainte de săritură, urmată de o scădere
dramatică la 1 oră după, modificări concomitente cu creșterea catecolaminelor, respectiv
creșterea cortizolului plasmatic. (2)
Așadar, imediat după debutul unui stres (minute) sau în timpul unui stres de intensitate ușoară,
sau efort fizic catecolaminele determină ieșirea „soldaților” (leucocite) din tranșee (splină,
plămâni) și intrarea pe” bulevarde” (vase sangvine și limfatice). Ulterior, cortizolul induce
trecerea leucocitelor din sânge la „locurile de luptă” (piele, plămâni, tract gastrointestinal,
mucoase, ganglioni limfatici).
Stresul cronic, numit și distres are drept mecanism fiziopatologic persistența RI după încetarea
acțiunii agentului stresor sau activarea repetată.
Răspunsul la stresul acut are rol critic în adaptarea organismului, hormonii de stres pregătind
sistemul imun pentru eventuale provocări (ex. rănire, infecție).
Deși deprivarea de somn este considerată un factor de risc pentru sănătate, asocierea
consecințelor a fost dificilă, întrucât semnele clinice măsurabile, specifice acesteia, lipsesc. S -a
constatat însă că peste 64 de ore fără somn la persoane sănătoase au consecințe cognitive
marcate, dar numai câteva semne fiziologice și neurologice minore. Similar, 9 zile de deprivare
de somn au ca rezultat colapsul iarspitalizarea devine obligatorie.
Se știe că există o relație între somn și sistemul imun, însă natura acesteia nu este foarte clară.
Unele studii au sugerat că deprivarea de somn determină un dezechilibru cronic energetic,
deteriorarea graduală a sănătății, cu scăderea activității răspunsului imun, accelerarea
catabolismului, malnutriție putând conduce la deces, în cele din urmă. Cauza morții șobolanilor
deprivați de somn (3 săptămâni) a fost sepsisul cu bacterii facultativ anaerobe, prin multiplicare
excesivă (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus,
Streptococcus agalactiae și Corynebacterium jejikum). Translocarea bacteriilor și a toxinelor
extraintestinal, sangvin, reprezintă trigger-ul unei stări hipermetabolice și inflamatorie sistemice
având ca rezultat sepsisul fără a se putea pune în evidență un focar septic.
Semnele care certifică prezența unui status de imunosupresie includ absența ab ceselor în ciuda
colonizării cu S. aureus, absența febrei și bacteriemia primară indusă de microorganisme
oportuniste, similar cu patogenia sepsisului la pacienții imunocompromiși.
227
Evenimentul imunologic poate apărea după o infecţie (natural) sau după administrarea unor
vaccinuri (artificial). Avantajul imunităţii dobândite activ este faptul că, de regulă, protecţia este
de durată. Dezavantajul principal este reprezentat de faptul că instalarea răspunsului imun are
loc lent, mai ales în cazul RIP.
Imunitatea poate fi dobândită şi pasiv, preluând anticorpi produşi de către o altă gazdă. Spre
exemplu, administrarea de anticorpi anti toxină difterică / tetanică / botulinică (artificial) pune
la dispoziţia gazdei infectate, imediat, o cantitate importantă de antitoxină, în vederea
neutralizării cât mai rapid a toxinei implicate patogenic. În mod natural, fătul şi nou născutul
beneficiază de protecţie prin intermediul anticorpilor (IgG transplacentar, IgA prin colostru,
lapte) proveniţi de la mamă. Avantajul imunităţii dobândite pasiv este rapiditatea, în timp ce
dezavantajul este reprezentat, pe de o parte, de timpul scurt pentru care este oferită protecţia
iar pe de altă parte, de riscurile unei hipersensibilizări, atunci când sunt utilizaţi anticorpi
provenind de la o altă specie (ex. în cazul administrării de ser recoltat de la cal hiperimunizat).
Există şi posibilitatea dobândirii unei imunităţi activ - pasiv, atunci când se administrează
concomitent (dar în locuri diferite) ser imun şi un vaccin (ex. în suspiciunea infecţiei cu
Clostridium tetani).
Mult timp s-a considerat că cele 2 tipuri de imunitate acționează independent, imunitatea
înnăscută oferind prima linie de apărare împotriva microbilor invadatori, iar imunitatea
dobândită intervenind mai târziu, pentru a elimina infecția. Însă,
: imunitatea adaptativă profită de abilitatea imunității înnăscute
de a distinge între agenții patogeni, microbii benefici și factorii de mediu.
Cele 2 tipuri de imunitate sunt complementare, în (un adevărat exemplu
pentru studenți, medici sau orice membru al sistemului sanitar).
Existența celulelor NK întărește aceste considerente. Conform unor descoperiri recente, celulele
NK au o proprietate esențială, atribuită numai celulelor imunității – memoria; în plus, au fost
identificate celule NK în locuri atribuite în mod clasic imunității adaptative: timus și ganglionii
limfatici. (4)
228
Vaccinarea este definită drept o metodă profilactică, care urmăreşte creşterea rezistenţei
specifice a unei gazde, printr-o imunizare activă, cu stimularea răspunsului umoral sau celular,
după caz. De fapt, vaccinările incluse în programele naţionale de vaccinare (conform
recomandărilor Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii, OMS) reprezintă metodele profilactice cu cel
mai bun raport între cost şi eficienţă, în comparație cu orice altă metodă cunoscută.
Strategiile de vaccinare au în vedere mai multe aspecte, inclusiv statusul imun al gazdei
respective (imunocompetentă sau imunodeprimată).
Unele vaccinuri se pot administra şi în timpul unei izbucniri epidemice („outbreak”) sau a unei
epidemii, pentru prevenirea apariţiei de cazuri noi şi scurtarea duratei epidemiei.
Există şi posibilitatea administrării unor vaccinuri în scop curativ, gazda fiind deja infectată în
momentul inoculării (ex. vaccin HBV la persoanele cu hepatită cronică, cu HBV).
În funcţie de infecţia care se doreşte a fi prevenită, vaccinurile pot fi bacteriene sau virale.
În funcţie de modul de preparare există:
· (bacteriene, virale), incluzând, după caz, corpi vii atenuaţi sau
distruşi (inactivaţi) prin acţiunea unor factori fizici (ex. căldură) sau chimici (ex. mertiolat de
sodiu). Vaccinul BCG conţine bacterii vii atenuate, stimulează RIC şi se administrează pentru a
preveni tuberculoza. Vaccinurile poliomielitic (Salk) sau hepatitic A includ virusuri omorâte.
Vaccinurile poliomielitic (Sabin), rujeolos, rubeolos conţin virusuri vii, atenuate şi stimulează RIU
şi răspunsul imun la poarta de intrare.
, preparate prin inginerie genetică, au un grad superior de
siguranţă (vaccin hepatitic B, vaccin pertussis acelular).
· , purificate şi adsorbite pe suport mineral
(DTP conţine anatoxină tetanică şi difterică plus corpi de Bordetella pertussis omorâţi, DT, dT,
ADPA, ATPA/VTA).
În funcţie de numărul componentelor antigenice există:
(rujeolos/VVR, rubeolos, hepatitic A, hepatitic B, pertussis acelular,
BCG etc),
· , care conţin amestecuri de antigene (DTP, DT, dT, rujeolos-rubeolos
etc).
Date privind schema de vaccinare aflată în uz în ţara noastră la acest moment, precum şi
câteva informaţii privind substanţele imuno-modulatoare (ex. Cantastim) sunt prezentate în
anexa nr. 4.
Ianuarie 1993 ... un articol semnalează faptul că difteria, o boală practic eliminată în Europa de
Vest, capătă proporţiile unei epidemii, în Rusia.
229
Situaţia a fost de asemenea periculoasă în Ucraina, unde mai mult de 1.300 de cazuri au fost
raportate în primele zece luni ale anului 1992. Ameninţarea extinderii în alte state, foste
membre URSS, a fost reală. Eforturile uriaşe de a vaccina atât copiii cât şi adulţii au făcut, până
la urmă, posibil controlul epidemiei. Totuşi, în perioada 1990 -1998, peste 150.000 de cazuri de
difterie au fost raportate, din toate statele foste membre ale URSS, înregistrându- se şi un foarte
mare număr de decese.
Dar care a fost motivul şi de ce a apărut o epidemie de difterie după 1990 ?
Incidenţa difteriei în Rusia era foarte mare în prima jumătate a secolului 20; peste 750.000 de
cazuri au fost raportate doar în Rusia în anii ’50 (imunizarea împotriva difteriei a început în
anumite zone ale Uniunii Sovietice în 1920, însă abia în 1958 a fost statuată imunizarea
universală a copiilor, în toată Uniunea Sovietică). Este adevărat că în 1977, au început să fie din
nou raportate cazuri de difterie, în URSS, atingând o valoare maximă în 1984 (1.609 cazuri). Din
1978, pentru prima dată, majoritatea cazurilor au apărut la adulţi.
Mass-media a avut un rol extrem de negativ prin atitudinea adversă faţă de imunizare. Multe
dintre bolile prevenite de vaccin aveau o incidenţă scăzută şi în acest context a apărut o
„mişcare anti-imunizare” în presă, în contextul unei perioade (1985-1990) de profundă
neîncredere în guvern. După 1990, părinţii nu mai erau de acord să permită imunizarea copiilor
cu vaccinuri produse în Rusia fiind făcuţi să creadă că acestea le fac rău şi îi îmbolnăvesc. Chiar şi
membri ai comunităţii medicale au avut „ieşiri în presă” în care au exprimat părerea că aceste
vaccinuri dăunează.
În plus, o parte din părinţi considerau că amânarea (nerespectarea schemelor de vaccinare,
neprezentarea la medic atunci când erau invitaţi să o facă) sau evitarea vaccinării copiilor sunt o
nou-descoperită libertate, în cadrul democraţiei instaurate odată cu dizolvarea URSS.
Epidemia apărută în anii ’90 a îngrijorat comunitatea medicala internaţională în legătură cu
vaccinul produs în Rusia. Contrar opiniilor anecdotice, studiile realizate au demonstrat că
vaccinul era eficient [este totuşi posibil ca vaccinul să fi fost transportat în condiţii improprii şi
astfel să fi avut, în mod real, o eficacitate mai mică (presupunere care nu a fost demonstrată)].
Este adevărat că şi schemele de vaccinare din URSS au suferit în anii '80 unele modificări,
diferind de schemele recomandate de OMS (ex. conţinut mai mic de antigen, creşterea
intervalului între vaccinări, renunţarea la administrarea DT la intrarea în şcoală) iar preocuparea
pentru sănătatea publică a scăzut, din diverse motive. Rata vaccinării la copii a scăzut în anii ’80,
la mai puţin de 70% (mult sub recomandările OMS).
Reacţia faţă de această epidemie s-a concentrat iniţial asupra vaccinării a cât mai multor copii
dar şi a adulţilor din grupele de risc. Vaccinarea tuturor adulţilor a fost aprobată abia în 1993. S -
au făcut vaccinări la locul de muncă dar şi vizite la domiciliu pentru vaccinarea şomerilor. Pentru
a creşte rata imunizării la copii s-a diminuat lista contraindicaţiilor şi a început să se folosească
schema completă de vaccinare. În octombrie 1994, s-a reintrodus vaccinarea copiilor la intrarea
în clasa I. În 1995 - 1996, epidemia a început să fie controlată. Dar care au fost pierderile umane
şi materiale, reale, probabil că nu vom cunoaşte, vreodată.
În timp ce apariţia epidemiei a fost unul dintre cele mai spectaculoase exemple ale intervenţiei
negative a mass-media în problemele de sănătate publică, controlul epidemiei de difterie a fost
unul dintre cele mai spectaculoase succese ale intervenţiei de sănătate publică în secolul 20.
230
Cititorul care doreşte să aprofundeze unele dintre aspectele menţionate în acest capitol poate
să acceseze informaţiile oferite de site-urile de mai jos sau şi alte site-uri.
1. The open window of susceptibility to infection after acute exercise in healthy young male
elite athletes; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kakanis%20MW%22
2. New strategies of mammary cancer vaccination: based on the administration of tumor cells
genetically modified to express major histocompatibility complex (MHC) class II gene products;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21050309
3. Receptor tyrosine kinase signaling favors a protumsrcenic state in breast cancer cells by
inhibiting the adaptive immune response; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20924104
4. Replacement of dietary fish oil by vegetable oils affects humoral immunity and expression of
pro-inflammatory cytokines genes in gilthead sea bream Sparus aurata;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20817101
5. Model systems to the rescue: The relationship between aging and innate immunity;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21057627
6. Innate Immune Response to Mycobacterium tuberculosis Beijing and Other Genotypes;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21049036
7. Skin Commensals Amplify the Innate Immune Response to Pathogens by Activation of Distinct
Signaling Pathways; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21048787
8. An Effective HIV Vaccine: A Combination of Humoral and Cellular Immunity?
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20636279
231
4. Următoarele afirmații despre imunitatea dobândită sunt adevărate, cu excepția:
A. apare în urma infecțiilor
B. cea activă se dezvoltă rapid
C. vaccinurile au o contribuție importantă în dezvoltarea imunității dobândite
D.cea pasivă se dezvoltă rapid
232
Reacţia imună este un răspuns normal fiziologic faţă de microorganisme sau celule
tumorale.
Totuşi, RI poate îmbrăca şi aspecte patologice, de tipul (HS) sau al
. Primele
făcute de Charles Richetobservaţii
în urmă cuprivitoare
un secol,laobservaţii
reacţiile de hipersensibilitate
care auI din
vor acoperi tipul fost
clasificarea Gell şi Coombs de mai tȃrziu. Pornind de la diferite tipuri de reacţii
observate, Gell şi Combs (1968) au propus o clasificare folosind termenul de
hipersensibilitate de tip I-IV. În 1974, Roitt adaugă hipersensibilitatea de tip V,
stimulantă (pornind de la anticorpii stimulanţi ai funcţiei tiroidei, prezenţi în
hipertiroidia primitivă, boala Basedow).
În mod clasic, HS reprezintă o a organismului, pe baza unui
, indusă de la anumite structuri antigenice
(sau haptene). Cuvȃntul alergen a fost pentru prima oară utilizat de Riquet;
desemnează un antigen care dă naştere unei reacţii de hipersensibilitate.
HS este specifică şi include
· un ,
· o perioadă de latenţă şi
· un nou contact, , cu acelaşi antigen care a fost implicat în
contactul sensibilizant.
HS se poate clasifica în funcţie de tipul de răspuns imun în:
· HS mediată (rol primordial LB şi anticorpii)
-HS de tip I (anafilactică, atopică), aşa cum se înregistrează în cazul şocului
anafilactic, edemului Quincke, conjunctivitelor sau rinitelor alergice, astmului alergic,
urticariei, eczemei atopice etc;
-HS de tip II (citotoxică), aşa cum se întâmplă în liza celulară prin anticorpi,
complement dependentă sau în citotoxicitatea anticorp dependentă, complement
independentă (mecanisme ce pot fi implicate de ex. în patogenia reumatismului
articular acut, în anemii hemolitice inclusiv după infecţii cu Mycoplasma pneumoniae,
reacţii posttransfuzionale, sindromul Goodpasture etc);
-HS de tip III (prin complexe antigen-anticorp), aşa cum se înregistrează în reacţia
Arthus, boala serului, boala plămânului de fermier, glomerulonefrita extramembranară,
lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixtă, glomerulonefrita şi periarterita
poststreptococică etc.
· HS de tip IV mediată (rol primordial LT şi citokinele),
spre exemplu în
-HS tuberculinică sau
-HS în testările intradermice care utilizează lepromină, candidină, histoplasmină,
tricofitină etc şi
-HS în multe dintre infecţiile virale.
233
Reacţia imună anafilactică se poate instala rapid (în mai puţin de 15 -30 minute) după un nou
contact cu un antigen la care organismul este sensibilizat. În această reacţie intervin celulele
(mastocite, bazofile) acoperite de „reagine” (în principal IgE), care eliberează mediatori chimici
(histamina fiind cel mai important şi cel mai cunoscut dintre aceştia).
Anafilaxia este un fenomen general, obţinut ca răspuns la antigene variate: toxine, proteine,
medicamente, alloantigene de transplant. Codeina, morfina, vancomicina şi substanţele de
contrast folosite
anafilactic, în imagistică
însă fără potIgE.
participarea determina , cu aceleaşi manifestări ca în şocul
Anticorpii anafilactici (reaginele) sunt anticorpi care se fixează prin fragmentul lor Fc pe
receptorii specifici exprimaţi la suprafaţa bazofilelor şi mastocitelor.
Controlul producerii de IgE este realizat de LT. LTh2 stimulează producerea IgE (sunt implicate
IL-4, IL-5, IL-10). LTh1 inhibă producerea IgE (fiind implicate IFNγ și IL-12).
Th2 (Figura nr. 1) are o acţiune autocrină, secretă IL-4 cu acțiune atât asupra LB cât şi asupra
celulei secretoare.
Sinteza de IgG4 și sinteza de IgE se află sub controlul aceloraşi citokine şi se realizează de
aceeaşi populaţie celulară. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulină sunt situate foarte
apropiat una de cealaltă, pe cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4 devine
independentă de cea de IgE nu este clar elucidat, dar se pare că un rol l-ar putea juca Il-10.
Efectele diferite induse de cele 2 tipuri de imunoglobuline se datorează structurii diferit e. IgE
prezintă faţă de IgG4 un domeniu constant suplimentar, o zonă balama diferită şi zone de
recunoaştere pentru ambele tipuri de receptori: FcεRI (afinitate înaltă) şi FcεRII (afinitate joasă).
IgE au uneste
acestora timpfoarte
de viaţă mai scurt
scăzută (<2 individului
în serul zile) comparativ cu 21-23 zile pentru IgG, iar concentraţia
normal.
Ataşarea IgE de mastocite şi bazofile (ca dimeri cuplaţi cu alergenul) duce la creşterea duratei
de viaţă a IgE de la mai puțin de 2 zile la 10 zile.
IgE nu trec de bariera feto-placentară datorită faptului că placenta nu conține FcεR. Ȋn sângele
fetal se pot găsi IgE în cantităţi sub 1UI/ml prin ataşare de FcγRI de pe macrofagele fetale. FcγRI
pot semnaliza pentru degranulare şi după cuplarea cu alte molecule (ex. lectine, Ac anti lanțt α
FcγRI).
şi se caracterizează prin prezenţa unor granule metacromatice, roşii după
coloraţia cu albastru alcyan, datorită histaminei şi heparinei.
Mediatorii mastocitari sunt reprezentaţi de histamină, leucotriene, prostaglandine, factorul
activator plachetar (PAF), adenozină, factori chemotactici pentru eozinofile (ECF) şi neutrofile
(NCF) şi o serie de citokine proinflamatorii (IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, GM-CSF, TNF-a, TGF-β1,
IFN-g). La suprafaţa bazofilelor şi mastocitelor sunt exprimaţi diverşi receptori, dintre care cei
mai importanţi sunt FceRI, FceRII (CD23) şi C3aR şi C5aR (CD88).
Legarea reaginelor de receptorii FceRI, FceRII iniţializează semnalizarea spre interiorul celulei,
ducând
Activareala bazofilelor
activarea celulară.
şi mastocitelor se realizează prin mecanisme mediate imun şi necesită
prezenţa unui mesager secund intracelular (Ca2+ sau AMPc). Procesul de activare constă dintr-o
serie de reacţii biochimice în trepte, cu participarea fosfolipidelor membranare, activarea PKC,
fosforilarea tirozinei, toate ducând la creşterea influxului de Ca 2+ extracelular alături de
mobilizarea rezervelor de Ca 2+ intracelular. Rolul Ca2+ este de a iniţia eliberarea mediatorilor
preformaţi şi sinteza denovo a mediatorilor lipidici.
Exemplificăm efectele acestor mediatori prin histamină care produce:
· prin acţiune directă pe receptorii H1 ai musculaturii netede traheo-
bronşice,
234
· arterio-capilară prin contracţia fibrelor musculare netede din peretele
venulelor postcapilare,
· ,
· şi
· la nivel cutanat.
Mastocitele eliberează histamină şi LTD4, care vor determina edem, hipersecreţie de mucus şi
bronhoconstricţie, cu scăderea FEV1, însă eliberează şi IL-5, TNFα, care vor atrage eozinofile,
limfocite, neutrofile şi macrofage.
Aceste celule inflamatorii vor determina modificări cronice la nivelul plămȃnului: hiperplazie a
celulelor secretoare
musculară de mucus,
netedă. Aceste depunere
modificări de colagenolahiperreactivitate
vor determina nivelul membranei bazaledar
bronşică, şi hiperplazie
de data
aceasta, nespecifică (hiperreactivitate bronşică la aer rece, efort). Activitatea inflamatorie care
are loc la nivelul bronhiilor se corelează cu valoarea NO expirat (inducere iNOS la nivelul
macrofagelor), cu un număr crescut de eozinofile şi cu valori mari ale ECP ( eozinophilcationic
protein) în sputa indusă. Aceste teste nu au valoare diagnostică, însa pot fi utilizate orientativ
pentru aprecierea severităţii astmului.
Faptul că mastocitele intervin în ambele faze, imediată şi tardivă, o demonstrează efectul
benefic pe care îl are cromoglicatul (stabilizator de membrană, se opune degranulării) în
tratamentul astmului bronșic. Corticosteroizii acţionează numai pe răspunsul tardiv. Ei nu pot
face discriminarea între implicarea mastocitelor şi LT în inflamaţia cronică datorită faptului că
inhibă ambele celule.
Dintre manifestările clinice sistemice care pot apărea în cazul unei stări de HS de tip I, sunt de
reţinut:
- şocul anafilactic, care la om se manifestă prin colaps cardio-vascular şi bronhospasm; în lipsa
tratamentului
sunt poate
înţepăturile evolua către deces.
de himenoptere (albine,Principalele antigeneunor
viespii), injectarea caremedicamente
pot declanşa şocul anafilactic
(penicilina,
miorelaxante, ACTH etc), latexul (la infirmiere, chirurgi) şi
- edemul Quincke care cuprinde faţa, gura şi uneori faringele şi laringele, ducând la asfixie şi
deces.
Dintre manifestările clinice localizate ar fi de amintit:
- manifestările localizate la nivelul mucoasei oculare sau respiratorii, având drept principali
agenţi declanşatori polenul, acarienii, praful de casă, sporii de ciuperci (conjunctivite alergice,
rinite alergice inclusiv febra de fân, traheita spasmodică şi astmul alergic);
- manifestările cutanate (urticarie, dermatite sau eczema atopică) şi
- manifestările digestive (diaree, vomismente în caz de alergie la laptele de vacă, ouă, peşte,
fructe, ţelină etc).
O tânără de 19 ani ajunge la camera de urgenţă din cauza unui atac acut de dispnee, respiraţii
şuierătoare (wheezing), înroşire (erupţie eritematoasă) generalizată la nivelul tegumentelor şi
vărsături. Era cunoscută ca suferindă de astm bronşic, ţinut sub control cu tratament
235
medicamentos. Din antecedentele din copilărie, avea notat în carnetul de sănătate o reacţie
„alergică” (dermatită atopică şi urticarie) după ingerarea de unt de arahide.
După spusele colegilor care au însoţit-o la spital, înainte de a-i apărea simptomele, a mâncat o
ciocolată de la un tonomat din cămin. Pe ambalaj nu apăreau notate alunele ca ingredient.
Totuşi ...
La un pacient astmatic, un atac acut, sever, de bronhospasm, în absenţa unor semne recente de
astm, trebuie să ridice întotdeauna suspiciunea anafilaxiei. Anafilaxia indusă de produse
alimentare poate fi confundată de ex. cu un atac astmatic sever. Cu alte cuvinte, anamneza şi
examenul clinic pot contribui la orientarea diagnosticului.
În primul rând şi cel mai important este ca reacţia de hipersensibilitate (HS) de tip I să fie
prevenită şi măsurile includ educarea pacienţilor şi a familiilor acestora cu privire la modul în
care să evite ingestia accidentală de alune, cum să recunoască primele semne şi simptome ale
unei reacţii „alergice” şi cum să reacţioneze în primele stadii ale unei reacţii anafilactice.
236
bifazice apar în primele 4 ore de la reacţia anafilactică iniţială, pacienţii trebuie ţinuţi sub
observaţie cel puţin 4 ore înainte de a fi externaţi din camera de urgenţă.
Pentru a bloca interacţiunea Th2 - IL-4 se pot folosi Ac anti IL-4 sau receptori solubili pentru IL-4.
Utilizarea receptorilor solubili IL-4 s-a încercat terapeutic, cu rezultate bune invitro
(administrare inhalatorie), dar nu și invivo (probabil datorită contracarării acțiunii acestora prin
intervenția altor citokine implicate în sinteza de IgE).
Sinteza de IgG4 și sinteza de IgE se află sub controlul aceloraşi citokine şi se realizează de
aceeaşi populaţie celulară. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulină sunt situate foarte
apropiat una de cealaltă, pe cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4 devine
independentă de cea de IgE nu este clar elucidat, dar se pare că un rol l-ar putea juca Il-10.
237
Testele cutanate, prick-test, reprezintă metoda cel mai des utilizată în diagnosticul HS de tip
I.
Se introduc cȃte 0,1μl din fiecare preparat antigenic de testat intradermic (de obicei se
testează 25 de astfel de preparate), un martor pozitiv (histamina), şi unul negativ (soluție salină
fiziologică). Modificările cutanate apar în 5-15 min şi durează 30 minute sau mai mult. Vor fi 2
tipuri de răspuns:
papulă, cu aspect eritematos şi dimensiuni mai mari şi care are ca mecanism reflexul de axon.
Altă tehnică ar include dozarea IgE, însă testul este mai puţin sensibil decȃt testele cutanate.
Testele ”patch” reprezintă aplicarea cutanată a 10μg alergen şi realizarea unei biopsii din
zona respectivă după 24 sau 48 ore. Există 3 moduri de aplicare a antigenului în cazul patch-
test: injecţii intradermice locale, plasture sau godeu. Ultima metodă are avantajul că se pot lua
probe repetate fără traumatizarea suplimentară a pielii la fiecare prelevare.
238
chiar pe cel de celulă efectoare, al LT in hipersensibilitatea tip I. Se pare că rolul LT ca efector în
HSI nu se limitează doar la nivel cutanat, dar şi la nivelul mucoasei nazale şi conjunctivei în rinita
alergică şi a epiteliului bronşic în astm.
Un alt test care se poate folosi este testul de provocare prin nebulizarea antigenului, cu
răspuns rapid în 20 minute constȃnd în bronhospasm şi cu un raspuns tardiv în 4 -8 ore,
constȃnd în eliberare de mediatori denovo şi infiltrat celular. Răspunsul tardiv pozitiv se poate
pune în evidenţă prin LBA (lavaj bronho-alveolar), cȃnd se identifică nu celulele, ci produşi ai
acestora (histamina, prostaglandine, leucotriene, MBP, ECP) sau prin biposie, cȃnd se pot
identifica toate modificările patologice care pot să apară în astm (celule inflamatorii, depunere
de colagen,
Pentru subţierea hiperreactivităţii
demonstrarea peretelui bronşiolelor), reunite
bronşice sub denumirea
nespecifice de de
se fac teste remodelare
provocarebronşică.
cu
histamină, metacolină sau aer rece. Teoriile spun că evaporarea crescută de apă, care va răci
epitelilul, ori stimulează direct terminaţiile nervoase, ori stimulează eliberarea de mediatori din
celulele locale (histamină din mastocite).
Pe frotiul de sânge periferic se remarcă eozinofilie, iar în secreţiile nazale ale unui astmatic,
titrurile de ECP şi CXCL8 (IL-8) vor fi crecute. pH-ul vaporilor de apă în criză va fi acid. Examenul
CT al sinusurilor nazale poate arăta opacifierea acestora, situaţie întȃlnită la o treime din
astmatici.
Ca și în cazul oricărei alte patologii nu se poate rămȃne doar la stadiul de observare, nici la
cel de diagnostic, ci trebuie să se meargă la următorul nivel, identificarea unui tratament.
239
Alegeți răspunsul corect.
Întrebarea 1
1). Anafilaxia apare după un contact nou cu un antigen la care organismul nu era sensibilizat.
2). Ȋn HS de tip I intervin mastocite, bazofile cuplate cu Ac anafilactici care se mai numesc şi
reagine.
3). mediatorul mastocitar principal este histamina, care este un mediator sintetizat de novo.
Dintre cele 3 afirmaţii de mai sus, care este adevărată/care sunt adevărate?
A) 2
B) toate
C) nici una
D) (1) si (3)
Ȋntrebarea 2
Alegeți afirmațiile care sunt amândouă corecte și se află în relație de cauză-efect.
a). Activarea bazofilelor şi mastocitelor se realizează prin mecanisme mediate imun pentru că
necesită prezenţa unui mesager secund intracelular (Ca 2+ sau AMPc).
b). Histamina determină bronhoconstricţie la nivelul plămȃnului pentru că acţionează pe
receptorii H1 ai musculaturii netede traheo-bronşice
c). Şocul anafilactic la om se manifestă prin colaps cardio-vascular şi bronhospasm pentru că în
lipsa tratamentului poate evolua către deces
d). Polenul, acarienii, praful de casă, sporii de ciuperci nu pot determina leziuni la nivelul
mucoasei oculare sau respiratorii deoarece ei nu pot declanșa un raspuns imun.
Intrebarea 3
Care dintre următoarele nu reprezintă un test diagnostic al hipersenibilității tip I
a). prick-test
b). patch
c). dozarea IgE
test
d). dozarea IgG
Intrebarea 4
Nu se folosește ca tratament al hipersensibilității tip I
a). hiposensiblizarea prin injectarea alergenului în cantităţi mici pentru o perioadă de cȃteva luni
b). un fragment antigenic conţinȃnd numai primii 20 aminoacizi din structura primară a
alergenului caruia i s-a crescut şi capacitatea de legare de IgE
c). introducerea genomului alergenului bacterian cu ajutorul unui vector în celulele gazdei, cu
modificarea răspunsului imun al acesteia
d). anticorpii monoclonali anti-IgE umanizaţi
Intrebarea 5
Pentru a găsi afirmaţia corectă ajutaţi-vă de povestirea adevărată
a).La un pacient astmatic, un atac acut, sever, de bronhospasm, în absenţa unor semne recente
de astm,
b). nuimportant
Cel mai ar trebui să ridice
este niciodată
ca reacţia suspiciunea anafilaxiei.
de hipersensibilitate (HS) de tip I să fie prevenită
c). Ȋn cazul HS tip I se evită adrenalina, antagoniştii receptorilor histaminici H1 şi H2, oxigenul,
albuterolul şi corticosteroizii
d). Pentru că aproximativ 90% din răspunsurile bifazice apar în primele 4 ore de la reacţia
anafilactică iniţială, pacienţii pot fi externaţi din camera de urgenţă înainte de atingerea a 4 ore
de la prezentare.
240
Reacţia imună citotoxică reprezintă unul dintre mecanismele importante de apărare a
organismului gazdă faţă de microorganisme. Rolul acestei reacţii este multiplu: distrugerea
bacteriilor extracelulare şi intracelulare, eliminarea celulelor infectate cu virusuri dar şi
distrugerea unor paraziţi sau fungi. Pentru îndeplinirea acestor funcţii sunt utilizate
mecanismele „imunităţii naturale” (implicând PMN, macrofage, celule NK). Imunitatea specifică
completează imunitatea naturală, adăugând aderenţa celulelor fagocitare şi a celulelor NK la
antigene prin intermediul anticorpilor şi complementului. Un rol aparte în imunitatea specifică îl
deţin limfocitele Tc cu efect litic faţă de celulele infectate viral.
HS dedeosebire
Spre tip citotoxic
de apare după cuplarea
hipersensibilitatea deanticorpilor cu antigene
tip I, Ac implicaţi în acestfixate perăspuns
tip de membrana
imuncelulară.
sunt IgG
sau IgM. Ei sunt ataşaţi celulelor gazdei sau se găsesc în matricea extracelulară (în HS III, Ac sunt
în ser, cu formarea de complexe circulante care se vor depune nespecific în ţesuturi). (Figura nr.
10)
Se cunoaște faptul că un neutrofil recunoaşte și fagocitează fagocita bacteria opsonizată cu Ac,
formează fagolizozomi urmând distrugerea produsului fagocitat.Receptorii pentru complement
sunt necesari pentru că bacteria poate fi opsonizată şi de fragmente ale sistemului compl ement.
A fost demonstrat experimental (pe șoareci) că rolul esenţial nu revine C3R, ci FcR. Ȋn loturile cu
deficit de sinteză a lanţului γ al FcR, HS de tip II nu apare, în timp ce la şoarecii cu deficit al
componentelor sistemului complement, nu s-a constatat nici o diferenţă faţă de lotul de
control. , în locul endocitozei bacteriei, are loc o exocitoză a enzimelor
lizozomale asupra celulei/matricei tapetate cu Ac.
După formarea complexului antigen-anticorp este activat sistemul complement, se generează
complexul de atac al membranei cu lezarea membranei celulare. Odată cu liza celulei gazdă are
loc eliberarea de tromboxan, precursor al prostaglandinelor şi leucotrienelor.
Alături de FcR
prezenţei neutrofile participăşi
pe membrana lor.macrofagele,
Macrofagele,trombocitele,
eozinofilele şicelulele K, eozinofilele
neutrofilele datorită
au un răspuns mai
puternic datorită prezenţei şi a C3R pe membrana celulară. Amplitudinea fenomenelor la nivel
celular depind de cantitatea de Ac dar şi de rezistenţa celulelor ţintă la liză. De exemplu, în cazul
eritrocitelor este suficient un singur MAC, în timp ce pentru celulele nucleate există o capacitate
mai mare de a se reechilibra ionic precum şi mecanisme de apărare anti-complement.
Liza mediată de este implicată în anemiile hemolitice,
ABO sau Rh etc. Leziunile membranare sunt accentuate de atragerea
fagocitelor şi eliberarea locală a enzimelor litice.
Organismul uman posedă în mod normal în sȃnge anticorpi față de Ag sistemului ABO pe care
nu le deține. În aceste condiții, Ac nu se vor întȃlni niciodată cu fără o intervenţie din afară. Ȋn
cazul unei transfuzii cu sȃnge incompatibil simptomele vor fi reprezentate de febră,
hipotensiune, vomismente, dureri la nivelul toracelui (anterior și posterior), datorită hemolizei
intravasculare.
Este de menționat că o femeie însărcinată poate păstra sarcina în cazul unui făt cu o altă grupă
de sȃngepentru că Ac formaţi împotriva Ag eritrocitare sunt de tip IgM (pentameri) care nu vor
trece bariera
Sistemul fetoplacentară.
Rh, însă, poate provoca sindromul hemolitic al nou-născutului. Mama, sensibilizată
împotriva Ag Rh fetale, produce Ac anti Rh fetal de tip IgG, care vor trece bariera feto-
placentară. Manifestările sindromului hemolitic al nou-născutului constau în
hepatosplenomegalie, icter şi peteșii apărute de exemplu la nivel facial. Primul copil Rh
incompatibil cu mama sa, nu va suferi, însă, următorii, da. Situaţia caracteristică este: mama,
Rh- iar fătul, Rh+. Ac anti Rh+ rămân ”in amonte” de placentă. Pornind de la aceste constatări s-
a imaginat un tratament care şi-a dovedit eficienţa. Se administrează mamei imediat post-
partum Ac anti RhD, care vor distruge hematiile Rh+ materne.
241
Alte sisteme sangvine implicate în reacţiile posttransfuzionale, în afară de sistemele ABO şi Rh,
sunt MN, Duffy şi Kell. Formarea de IgG vor induce o reacţie hemolitică mai puţin accentuată.
Eritrocitele transfuzate vor fi preluate de fagocitele de la nivelul ficatului şi splinei, şi nu vor da o
hemoliză intravasculară sistemică. Ȋnsă poate apărea şi în acest caz necroza acută tubulară
datorită eliberării masive a componentelor eritocitare.
Pot apărea reacţii postransfuzionale îndreptate şi împotriva altor componente celulare
sangvine, însă consecinţele nu sunt la fel de pregnante ca în cazul eritrocitelor.
Reacţiile de respingere de grefă se manifestă la nivelul ţesuturilor vascularizate direct (un
exemplu de țesut care nu suferă reacţii de respingere este corneea). Cele mai severe
manifestări se datorează tot sistemului ABO, cu activarea complementului, liza eritrocitelor,
recrutare de neutrofile
incompatibilităţii MHC. şi trombocite. Ȋnsă frecvente sunt şi manifestările datorate
Alte exemple:
- anemia hemolitică după ataşarea de proteinele de suprafaţă a hematiilor a unor medicamente
(penicilină, fenacetină, chinidină etc) şi iniţierea producerii şi cuplării unor anticorpi de tip IgG.
HS de tip II la medicamente se poate produce în 3 modalități diferite:
· prin ataşarea medicamentului la membranna celulară cu producerea ulterioară de Ac
(cazul penicilinei, quininei, sulfonamidelor),
· prin formarea de complexe imune circulante medicament-anticorp care se ataşează pe
membrana celulară şi
· prin inducerea producerii de autoanticorpi (alfa metildopa). (Figura nr. 11)
- apariţia unui sindrom asemănător lupusului eritematos după administrarea de hidralazină care
stimulează producerea
- anemia hemolitică deinfecţii
după autoanticorpi anti-ADN;
cu Mycoplasmapneumoniae , datorită stimulării producerii de
anticorpi care se fixează pe hematii;
- cardita reumatismală din reumatismul articular acut (anticorpii faţă de streptococul beta -
hemolitic de grup A reacţionând încrucişat cu ţesutul cardiac);
- sindromul Goodpasture (după apariţia de Ac care se fixează pe membrana glomerulară renală
sau la nivel pulmonar, se activează , rezultând leziuni grave ale membranelor celulare).
Studiul mecanismului de producere a HS de tip II a stat la baza imaginării unor tratamente ce
folosesc Ac citotoxici: Trastuzumab ( antihumanepidermalgrowthfactorreceptor 2) în terapia
cancerului de sȃn; Infliximab (Ac anti-TNF) în boala Crohn; Rituximab (Ac anti-CD20) în
limfoamele non-Hodgkin, trombocitopenie autoimună, artrită reumatoidă şi lupus eritematos
sistemic; Alemtuzumab (Ac anti CD25) în leucemii şi pentru inducerea imunosupresiei la
pacienţii ce suferă un transplant de celule stem.
În urmă cu 30-40 de ani, reumatismul articular acut (RAA) (febra reumatică) reprezenta un
subiect foarte frecvent dezbătut în publicaţiile ştiinţifice, mai mult chiar decât infarctul
miocardic acut, de ex. Atunci existau atât de mulţi copii cu această boală, încât spitale întregi
erau dedicate tratamentului RAA.
În prezent, majoritatea medicilor din ţările dezvoltate nu au mai văzut cazuri de RAA (profilaxia
primară şi secundară a atacului reumatismal realizându-se în mod corespunzător); experienţa în
ţările occidentale este astăzi limitată la constatarea prezenţei leziunile de valvă mitrală la
pacienţi care au fost afectaţi de RAA în tinereţe.
242
În ţările dezvoltate, populaţia cumulată este mai mică de 20% din populaţia globului; pentru
restul populaţiei (peste 80%), RAA şi cardita reumatismală continuă să reprezinte o problemă
importantă. Se estimează că la nivel mondial există 15,6 milioane de persoane cu RAA, în fiecare
an apar peste 450.000 de cazuri noi, iar circa 230.000 decese sunt provocate fie de RAA fie de
diferitele complicaţii ale RAA. Este posibil ca numărul real de cazuri să fie mai mare.
O consecinţă negativă a scăderii interesului faţă de RAA în ţările dezvoltate este reducerea
cercetării în acest domeniu şi singurele progrese din ultima jumătate de secol au fost realizate în
domeniul tratamentului medical şi chirurgical al RAA.
Principala modalitate de control al RAA rămâne tratamentul corect al faringitelor cu streptococ
β-hemolitic de grup A şi administrarea de injecţii cu penicilină retard (varianta „depozit” cu
intervalul
unei cel mai
perioade lung
lungi de între
timp,2laadministrări
persoanele poate fi administrată
cu o istorie la 3-4asăptămâni),
de RAA pentru de-a lungul
preveni episoadele
recurente (profilaxie secundară). Ambele strategii au fost publicate încă din anii 50, în SUA. În
prezent se încearcă şi obţinerea unui vaccin, pentru profilaxie primară (se estimează că în 10-20
ani va putea fi obţinut un vaccin sigur şi eficient).
În lipsa unor cercetări realizate în ţările dezvoltate, se încearcă obţinerea unor date în statele în
care RAA are o frecvenţă crescută. Spre exemplu, studii realizate în Mozambic, Cambodgia,
Franţa şi Australia, au demonstrat utilitatea ecocardiografiei în detectarea pacienţilor cu boală
cardiacă reumatică (copii cu vârstă şcolară), detectându-se astfel cu 90% mai multe cazuri decât
prin metoda clasică, de diagnostic clinic. S-a descoperit că 2-3% dintre copii cu vârstă şcolară din
Cambodgia şi Mozambic sufereau de boală cardiacă reumatică, majoritatea nefiind diagnosticaţi
în cursul acestui studiu. Aceste date confirmă faptul că RAA şi cardita reumatismală au o
suficient de mare importanţă pentru publicului internaţional şi a comunităţilor
de cercetare.
Ȋntrebarea 1
Printre rolurile hipersensibilităţii de tip II se numără:
a). distrugerea bacteriilor extracelulare şi intracelulare
b). eliminarea celulelor infectate cu virusuri
c). distrugerea unor paraziţi sau fungi
d). toate cele de mai sus
Ȋntrebarea 2
Care dintre următoarele afirmaţii este incorectă?
a). Ȋn HS de tip II limfocitele Tc cu efect litic faţă de celulele infectate viral.
b). Ȋn HS de tip II sunt utilizate atȃt mecanismele „imunităţii naturale” (implicând PMN,
macrofage, celule NK) cȃt și ale imunităţii specifice.
c). Imunitatea specifică presupune, printre altele, formarea de Ac care vor forma ulterior
complexe imune circulante.
d). Complexele imune circulante sunt rapid epurate din organism, ele neavȃnd posibilitatea de a
se depune la nivelul ţesuturilor.
243
HS de tip III se poate datora:
- unei infecţii persistente (ex. lepră, malarie, hepatită virală, endocardită stafilococică);
- unei boli autoimune (ex. artrită reumatoidă, lupus eritematos sistemic, polimiozită);
- inhalării de material antigenic (ex. actinomicete în cazul plămȃnului de fermier, antigene aviare
în cazul plămȃnul crescătorilor de păsări).
Complexele imune activează o serie de căi ale răspunsului imun. Aminele vasoactive eliberate în
cadrul activării acestor căi determină retracţia celulelor endoteliale, ceea ce are ca efect
creşterea permeabilităţii vasculare, depunerea complexelor imune, dar şi expunerea
colagenului, care va stimula agregarea trombocitelor şi formarea de microtrombi.
Se intră într-un cerc vicios deoarece complexele imune depuse pe membrana bazală continuă să
genereze C3a şi C5a (anafilatoxine). Astfel, complementul, iniţial cu rol protectiv, determină
ulterior creşterea suplimentară a permeabilităţii capilare. Polimorfonuclearele sunt atrase şi îşi
exocitează conţinutul în loc să endociteze complexele imune (acestea nu pot fi desprinse de pe
membrana bazală vasculară). Enzimele inhibitoare serice împiedică enzimele lizozomale să
acţioneze la nivel sistemic, însă nu şi local, de aceea se vor genera leziuni tisulare locale.
Eritrocitele primatelor conţin receptori pentru C3b, importanţi pentru preluarea complexelor
imune şi transportul lor către splina şi ficat, unde vor fi fagocitate. Ȋn HS de tip III, sistemul este
suprasaturat, ceea ce îi scade eficienţa. Complementul menţine complexele Ag-Ac solubile pe
calea clasică şi resolubilizează complexele Ag-Ac agregate pe calea alternă, de aici putȃndu-se
deduce rolul depleţiei de componente ale complementului sau a unor boli ereditare (deficit C2)
în patologia HS de tip III. Este importantă şi dimensiunea complexelor imune. Cele mari sunt
repede preluate de ficat şi eliminate, în timp ce complexele mici rămȃn în circulaţie o perioadă
mai lungă de timp. Un defect genetic ce determină sinteza de Ac cu afinitate joasă, va favoriza
producerea de complexe Ag-Ac mici şi deci, leziunile caracteristice HS de tip III.
Depunerea complexelor imune
Administrarea de metilsergida sau clorfenilamina (antagonişti ai aminelor vasoactive) reduce
considerabil depunerea complexelor imune prin scăderea permeabilităţii vasculare.
Depunerea complexelor mai este dependentă de regimul presional crescut şi de prezenţa
turbulenţelor. Ȋn capilarele glomerulare presiunea sȃngelui este de 4 ori mai mare decȃt în
restul capilarelor. Turbulenţe se întȃlnesc în zonele de bifurcaţie a arterelor şi în zonele de filtru
vascular (plexurile coroide şi corpii ciliari). Preferinţa pentru un ţesut sau altul poate fi
dependent de sarcina electrică a complexului imun, de gradul de glicozilare a Ac.
244
· afluxul de trombocite, cu generarea fenomenelor de tromboză.
Fenomenul Arthus a fost observat la iepure, cobai, şoarece etc, dar şi la om. Experimentul a fost
efectuat pe iepure prin injectarea de antigen netoxic (ex. albumină) de la altă specie, asociat cu
un adjuvant imun. După unele rapeluri, necesare uneori pentru obţinerea de anticorpi circulanţi
IgG precipitanţi, reacţia Arthus poate fi obţinută prin injectarea subcutanată a antigenului.
Manifestările apar după 2 ore, atingând maximum la 6 ore şi dispar după 24 -48 ore. Constau în
edem, eritem indurat, peteşii şi uneori purpură necrotică sau chiar necroză. Leziunile de la locul
injectării antigenului duc la fixarea de igG şi C3b cu sediul perivascular sau în peretele vascular.
injectarea
sub termenulde ser de calserică
de boală hiperimunizat. În 1911,
(febră, artralgii, von Pirquet
vasculită descrie
cutanată), complicaţiile
survenită la uniiacestei
bolnaviterapii
după
8-12 zile de la prima injecţie.
Injectarea unică, pe cale intravenoasă, a unei substanţe netoxice, ca serumalbumina bovină
(BSA), în cantitate mare, la animalul neimunizat (iepure), este urmată de apariţia bolii serice
acute (experimentală) cu 3 faze: 1. faza anterioară imunizării (durează 5-8 zile. BSA marcată
radioactiv, scade, iniţial brutal prin difuziune în spaţiile extravasculare, apoi după 24 de ore,
lent, corespunzător propriului catabolism); 2. faza complexelor imune (corespunde prezenţei
concomitente de BSA şi a anticorpilor anti-BSA); este boala serică cu glomerulonefrită. În jurul
zilei a 5-a, concentraţia sangvină de BSA scade rapid. Anticorpii anti-BSA liberi nu sunt decelabili
decât după dispariţia BSA liberă. Detectarea complexelor imune corespunde acestei perioade,
ca şi scăderea complementului seric. Manifestările patologice nu sunt datorate anticorpilor anti-
BSA liberi şi nici complexelor imune circulante. Ca şi în reacţia Arthus, leziunile sunt datorate
acţiunii complementului, care este urmată de un aflux de neutrofile. La animalul fără
complement apare o simplă albuminurie fără glomerulonefrită); 3. faza de restitutioad
integrum (nu mai există antigen liber sau conjugat decelabil; anticorpii anti -BSA sunt crescuţi;
245
asociată cu necroză fibrinoidă şi infiltrat inflamator leucocitar în peretele arteriolelor şi arterelor
interlobulare. Au fost observate proliferări celulare. În ambele cazuri a apărut insuficienţa renală
acută (IRA) severă (în cazul celui de al doilea, evoluţia a fost nefastă, spre deces).
Un copil de sex masculin, 11 ani, a fost internat în spitalul din oraşul de reşedinţă.
Motivele internării au fost reprezentate de inapetenţă, edem facial, diaree, vomă şi hematurie
macroscopică, constatate în ultimele 2 zile. La internare s-a constatat că pacientul era febril
(38°C) şi prezenta hipertensiune arterială (TA = 220/120 mmHg).
După o săptămână, în timpul internării, a apărut oligurie şi a fost trimis la un spital de un nivel
superior. A evoluat spre anurie şi a necesitat dializă peritoneală.
După 4TA
vomă; săptămâni
a putut fide la internare,
controlată anuria a continuat să persiste, asociindu -se cu episoade de
medicamentos.
A fost transferat la spital de nivel superior.
Examenul clinic la internare a arătat o stare generală relativ bună, edem prezent în pătrimea
distală la nivelul membrelor inferioare, greutate = 78,4 kg, înălţime = 157 cm, TA = 100/70
mmHg, 26 respiraţii/minut, 76 bătăi cardiace/minut. A fost menţinut în dializă peritoneală
continuă.
Rezultatele analizelor de laborator la această internare au fost următoarele: hematocrit 28%,
hemoglobină 9,2 g / dl, proteine totale 8,2 g%, albumină 2,9 g%, Na = 138 mEq/l, K = 4,3 mEq/l,
Ca = 8,4 mg%, P = 8,6 mg%, Mg = 1,5 mg%, uree = 172 mg%, creatinină = 18,3 mg%; factor
antinuclear negativ.
Ecografia renală a fost în limite normale pentru vârsta lui.
Datorită prezenţei vărsăturilor, s-a indicat efectuarea endoscopiei digestive (în a doua zi de la
ultima internare), evidenţiindu-se hernie hiatală şi duodenită (la examenul microbiologic nu s-a
identificat H.pylori). A primit tratament cu domperidonă şi omeprazol, în urma căruia greaţa şi
vărsăturile au dispărut.
În a 5-a zi de difuză
proliferativă la internare s-a efectuat
endocapilar o biopsie
exsudativă, renală,
cu 17% iar diagnosticul
proliferări celulare. aLafost: glomerulonefrită
examenul în
imunofluorescenţă s-au observat depozite granulare difuze de C3 în structura capilarelor şi
arteriolelor. Prin examenul cu ajutorul microscopului electronic s-au observat depozite
electronodense mezangiale, subendoteliale şi subepiteliale.
În ziua a 14-a de la internare s-a iniţiat tratament („puls-terapie” / doze mari administrate
pentru perioade scurte) cu metilprednisolon 1g i.v. şi prednison, pe cale orală, 40 mg/zi. După a
3-a zi de corticoterapie s-a continuat cu prednison 40 mg/zi.
În a 20-a zi de internare, datorită unei HTA acută, pacientul a primit propanolol şi minoxidil.
Abia din a 26-a zi de internare, pacientul a prezentat diureză de 10 ml/zi, iar după încă trei zile
diureza a ajuns la 120 ml/zi (cu hematurie macroscopică).
Rezultatul analizelor de laborator în a 4-a săptămână de la ultima internare au fost: uree = 80
mg%, creatinină = 3,5 mg% (o valoare încă foarte mare, dar de circa 5 ori mai mică decât în
momentul internării), clearance-ul creatininei = 13ml /min /1,73 m 2 (suprafaţa corporală),
, (Normal = 0,5 - 1,5 mg%). În a 29-a zi de la internare diureza a ajuns
la de 900 ml iar TA era fost ţinută sub control.
În aceste
După încăcondiţii, pacientuldiureza
două săptămâni a fost externat, şi s-alarecomandat
s-a menţinut săml/zi,
de 900-1000 revinăvaloarea
la control, săptămânal.
pentru uree a
fost de 50 mg% iar pentru creatinină de 2,1 mg%; nu a mai fost necesară dializa, dar s-a
menţinut tratamentul antihipertensiv.
O pacientă de sex feminin, în vârstă de 66 ani, a fost internată în spitalul Facultăţii de Medicină
din localitatea de reşedinţă.
Motivele internării au fost reprezentate de: anorexie, diureză scăzută şi hematurie
macroscopică. La internare s-a văzut că pacienta este apatică şi prezintă tuse cu expectoraţie
spumoasă.
246
Prin anamneză s-a aflat că în urmă cu circa o lună, pacienta a făcut o infecţie orofaringiană,
pentru care a primit tetraciclină.
Examenul clinic la internare a relevat o stare generală bună, absenţa temperaturii, greutate = 63
kg, înălţime = 147 cm, TA = 140/80 mmHg, 80 bătăi cardiace / minut, 20 respiraţii / minut,
jugulare turgescente, raluri ronflante la nivelul bazelor pulmonare, ficat palpabil la 5cm sub
rebordul costal.
Au fost înregistrate următoarele valori pentru analizele de laborator efectuate: hematocrit
40,2%, hemoglobină 13,5 g/dl, număr leucocite = 15.600/mm 3. Examenul de urină a arătat o
densitate de 1025, pH = 5, proteinurie = 4+, fără glicozurie, hematurie = 3+, hemoglobinurie =
3+, leucocite, hematii şi cilindri numeroşi în sedimentul urinar iar urocultura a fost negativă.
După 12 ore de
următoarele la internare,
rezultate: proteinuria
proteine totale = a6,4
crescut. Iar celelalte
g%, albumină = 3,6analize de laborator
g%, globuline au avut
= 2,8 g%, glicemie
= 156 mg%, Na = 136 mEq/l, K = 4 mEq/l, Ca = 10 mg%, P = 8,2 mg%, acid uric = 10,6 mg%, uree
= 174 mg%, creatinină = 1,84 mg%, , (Normal = 0,5 -
1,5 mg%), (Normal = 400-500 µg/ml), . Factorul anti-nuclear a
fost absent.
Examenul ecografic renal a fost în limite normale.
Funcţia renală s-a deteriorat progresiv, şi în aceste condiţii, la 20 de zile de la internare, ureea a
ajuns la valoarea de 223 mg%, creatinina la valoarea de 8,3 mg%, clearance-ul creatininei la 5,34
ml/min, iar proteinuria la 3,9 g/24 h.
S-a efectuat o biopsie renală care a evidenţiat o glomerulonefrită proliferativă difuză
endocapilar exsudativă, cu necroză tubulară acută (25% proliferări celulare). La
imunofluorescenţă s-au observat depozite granulare difuze de C3 în capilare şi mezangiul
arteriolelor. Prin ME s-au observat depozite voluminoase mezangiale şi subepiteliale.
În acest context s-a pus diagnosticul de glomerulonefrită acută post-infecţioasă.
Pacienta a primit un tratament în urma căruia funcţia renală s-a ameliorat progresiv, iar la 6 zile
ureea a ajuns
ml/min, momentla valoarea
în care adefost
122externată
mg%, creatinina = 2,85 mg% şi clearance-ul creatininei = 14
(la cerere).
După aproximativ două săptămâni, pacienta a revenit, iar la acel moment valoarea diurezei era
scăzută, prezenta proteinurie = 9,2 g/24 h, uree = 180 mg%, creatinină = 3,17 mg, clearance-ul
creatininei = 9 ml/min; din punct de vedere clinic pacienta era dispneică şi prezenta
fatigabilitate intensă.
A doua biopsie a demonstrat înrăutăţirea tabloului anterior, cu 80% proliferări celulare şi 42%
scleroză glomerulară şi necroză fibrinoidă pe arterele mici, cu depozite de C 1q, C3, IgG şi fibrină.
Pacienta a evoluat foarte rapid către IRA. După 3 săptămâni s-a început dializa. După 9
săptămâni, a prezentat erizipel la membrul inferior drept şi şoc septic, urmat de deces.
Ȋntrebarea 1
Este corectă afirmaţia:
a). Pentru HS de tip III apare conceptul de Ac „in situ”
b). Complexul imun se formează în ţesuturi sau este fixat secundar
c). Reacţia Arthus a fost descrisă după injectarea subcutanată de ser de iepure la un cal
hiperimunizat.
247
d). Boala serică se caracterizează prin febră, artralgii, vasculită cutanată survenită imediat după
injectarea de ser de cal hiperimunizat
Ȋntrebarea 2
Care dintre următoarele nu este fază a bolii serice acute?
a). faza leziunilor vasculare
b). faza anterioară imunizării
c). faza de restitutioadintegrum
d). faza complexelor imune
Ȋntrebarea 3 afirmaţie „leziunile sunt datorate acţiunii complementului, care este urmată de un
Următoarea
aflux de neutrofile” este valabilă:
a). pentru reacţia Arthus
b). pentru boala serului
c). atȃt pentru reacţia Arthus cȃt şi pentru boala serului
d). pentru nici una dintre ele.
Ȋntrebarea 4
Printre principalele afecţiuni umane datorate HS de tip III nu se numără:
a). boala plămânului de fermier
b). lupusul eritematos diseminat
c). cardita reumatismală
d). glomerulonefritele şi periarteritele poststreptococice.
Ȋntrebarea 5
Depunerea
a). complexelor
permeabilitatea imune este dependentă de:
presională
b). regimul presional crescut
c). prezenţa turbulenţelor
d). nici una dintre mențiunile de mai sus
e). primele 3 afirmații sunt corecte.
Hipersensibilitatea de tip IV reprezintă o reacţie (mai) întârziată, care apare la 48 -72 de ore
după contactul
este un cu antigenul
tip exagerat şi seimun
de răspuns datorează
celular.limfocitelor Th1 specifice antigenului. HS de tip IV
HS de tip IV poate fi considerată ca un martor al mecanismelor protective față de germenii
intracelulari dar şi de alte substanţe chimice care se leagă puternic de membrana celulară.
Totuşi, corelaţia protecţie-hipersensibiltate nu e perfectă, în sensul că se poate ca un pacient cu
HS de tip IV la un anumit germen să dezvolte infecţii progresive cu acel patogen (ex. situați a din
infecțiile cu M.leprae).
Au fost descrise patru tipuri diferite de hipersensibilitate (de tip IV), dintre care ultimele trei
sunt importante în patologia umană.
248
(nu are echivalent la om);
După o injecţie
legarea hapteneiulterioară intradermică
de un carrier, sauantigenic
complexul după aplicarea antigenului
este fagocitat de ope tegument,
celulă urmează
Langerhans care
se va activa, matura şi îşi va începe migrarea spre zona paracorticală a nodulilor limfactici sub
acţiunea IL-1 şi TNF secretaţi de keratinocitele agresate.
Corespunde unei infiltrări dermice şi epidermice, edemului epidermic şi eritemului apărut după
48-72 ore, care va persista câteva zile. Absenţa reacţiei se datorează unui deficit imun celular.
Sensibilizarea prealabilă cu DNCB (ex. la fotografii) poate declanşa un şoc anafilactic la IgE.
Primele modificări apar începând cu a 6-a până la a 8-a oră după contactul cu alergenul; LT
activate şi cele cu memorie vor ajunge în circulatie şi ulterior în zona inflamată, alături de
monocite, unde vor îndepărta complexul haptenă-carrier. Ele înconjoară vasele sanguine,
glandele sudoripare, glandele sebacee, foliculii piloşi şi infiltrează epidermul. Infiltratul celular se
accentuează progresiv şi ajunge maxim spre a 72-a oră.
Infiltratul conţine celule T CD4+ (în majoritate), T CD8+, celule Langerhans, macrofage şi
bazofile.
Aceleaşi keratinocite, dar şi macrofagele, vor produce ulterior PGE, cu rol inhibitor al reacţiei
inflamatorii.
LTs intervinde
producerii deIL-1.
asemenea în terminarea
Ultravioletele reacţiei
inhibă direct şi de HS (laLangerhans.
celulele fel ca şi ultravioletele), prin scăderea
Ȋn concluzie, fenomenele apar în următoarea succesiune: celulele Langherhans activează LT
CD4+ cu memorie; acestea produc diferite citokine: IL-2, IL-3, IFN-g şi GM-CSF. Celelalte celule
sunt recrutate şi activează o reacţie inflamatorie în care predomină celulele mononucleare.
(Figura nr. 12)
Persoanele infectate cu unul din germenii (M.tuberculosis, M.leprae, Leishmaniatropica etc.) /
sau care vin în contact cu substanţele chimice (beriliu, zirconiu etc.) care pot provoca
hipersensibilitatea de tip tuberculinic au LT deja activate.
În laborator, pentru sensibilizare se injectează la un animal Ag împreună cu adjuvantul complet
Freund (pregătirea animalului prin imunodepresie cu ciclofosfamidă permite şi utilizarea
adjuvantului Freund incomplet). Această fază de sensibilizare începe cu 2-3 săptămâni înainte
de testarea HS.
După injectarea antigenului la animalul sensibilizat, LT specific sensibilizate migrează în jurul
vaselor sanguine (la 12 ore) iar activarea lor duce la secreţia de interleukine care recrutează alte
celule nesensibilizate. Infiltratul desparte fibrele de colagen din derm şi atinge un maxim la 48 -
72 oreulterior
2/1)], după injecţie.
încep săCelulele observateiniţial
se acumuleze macrofagelesunt(atingând
LT [predomină T CD4+
un maxim spre(raport
finalulCD4/CD8
celei de a-
treia zi de la inoculare).
Fenomenele sunt maxime la nivelul dermului dar pot atinge şi epidermul; keratinocitele exprimă
la suprafaţa lor molecule HLA DR (la 48-96 de ore după apariţia infiltratului limfocitar, fapt care
va amplifica răspunsul imun al gazdei), circulaţia aferentă şi eferentă a celulelor
imunocompetente seamănă cu cea observată în hipersensibilitatea de contact; se poate
observa o infiltrare uşoară cu bazofile; în timp se poate dezvolta o reacţie granulomatoasă.
La om se practică (PPD, derivat proteic purificat, un amestec
relativ bine standardizat de antigene proteice mycobacteriene). Citirea rezultatului se face după
249
72 ore, asigurând o bună iluminare a zonei examinate (de preferat lumina naturală). Se
identifică existenţa unei eventuale arii intens eritemato-violacee, circumscriind urma înţepăturii
dermice. Apoi se apreciază tactil (prin repetate mişcări într-un sens şi altul deasupra zonei de
reacţie) cu pulpa inelarului, limitele unei zone de induraţie (percepută ca fiind reliefată) şi care
corespunde histopatologic infiltraţiei dermice (edem, limfocite, macrofage, PMN), reprezentând
răspunsul imun faţă de antigenul injectat. Se măsoară şi se înregistrează „diametrul maxim” al
zonei de infiltraţie (a se vedea şi anexa nr. 3). Leziunile dezvoltate la injectarea intradermică de
tuberculină se rezolvă în mod normal în 5-7 zile; persistenţa acestora face ca leziunea să se
transforme dintr-una tuberculinică într-una granulomatoasă.
Este o formă
antigenul mai gravă
persistă de hipersensibilitate
şi nu poate (întârziată) de printr
fi eliminat. Se caracterizează tip IV care sur vine atunci
-o acumulare când
şi o proliferare de
macrofage, care stau la srcinea granulomului care apare la 21- 28 zile după sensibilizare şi
poate să persiste mai multe săptămâni. Hipersensibilitatea granulomatoasă poate succeda
diferite hipersensibilităţi întârziate precedente, în general după o perioadă de 3 - 4 săptămâni.
Elementul distinctiv al hipersensibilităţii granulomatoase este formarea de celule epiteloide,
celulele derivate din macrofage, de dimensiuni mari pe seama dezvoltarii reticulului
endoplasmatic, cu rolul lor de a întreţine inflamaţia prin secreţia continuă de TNF. Persoanele
cu deficit de IFN nu dezvoltă granuloame, însă nici nu se apără eficient împotriva tuberculozei ,
leprei, leishmaniozei, schistosomiazei etc. Prin fuziunea celulelor epiteloide rezultă celule
gigante. Mai sunt denumite şi celule Langhans. Atenţie, sunt diferite de celulele
Langerhans! Aceste celule gigante au mai mulţi nuclei, însă periferici, reticulul endoplasmic este
puţin dezvoltat, iar mitocondriile şi lizozomii sunt în degradare. Se pare ca aceste celule
Langhans ar reprezenta etapa finală din diferenţierea macrofagelor.
Reacţiile de hipersensibilitate de tip IV observate în patologia umană pot fi observate în trei
grupe principale de afecţiuni:
1. Eczema
piele de contact
de animal, care poate
produselor apărea
cu săruri datorită
de crom, bijuteriilor
cremelor care conţin
„solare”, nichel,chimici
compuşilor produselor din
de cauciuc,
produselor farmaceutice (penicilină, streptomicină, neomicină) etc;
2. Maladii infecţioase în care agenţii patogeni se dezvoltă intracelular (tuberculoză, lepră,
leishmanioză, listerioză, micoze profunde etc);
Ȋn cazul M.tuberculosis, leziunea granulomatoasă conţine pe lȃngă macrofage, celule epiteloide,
celule gigante şi LT dispuse centrifug, şi o zonă de necroză centrală, un fel de puroi numit
cazeum. Ȋn jurul întregului ansamblu se află o zonă de fibroză şi o cantitate crescută de colagen.
Ȋn cazul M. leprae, reacţia granulomatoasă se numeşte reacţiaMitsuda.
Apariţia de leziuni la injectarea de antigene splenice de la un alt pacient cu sarcoidoză unei alte
persoane cu sarcoidoză, constituie pozitivarea testului Kweim.
3. Alte maladii (sarcoidoză ciroză biliară primitivă, hepatitele cronice virale B şi C, SIDA, infecţia
HIV, poliartrita reumatoidă, reumatismul articular acut, b. Crohn etc).
Tuberculoza sistemului nervos central se poate prezenta ca meningită tuberculoasă, sub formă
de tuberculoame sau, rareori, sub formă de abcese. Examenul clinic este de obicei nespecific, în
faza acută putând sugera o tumoră malignă (25-85% dintre pacienţi sunt asimptomatici).
Localizările extracerebrale trebuie investigate sistematic.
250
Cazul prezentat este cel al unui pacient de sex masculin, în vârstă de 53 de ani, internat pentru
slăbiciune musculară la nivelul membrelor inferioare, cu deficit proprioceptiv. Investigaţiile de
laborator au fost în limite normale, iar testul HIV a fost negativ. Examenul tomografic (CT)
cranian a revelat o leziune masivă în lobul parietofrontal drept, cu zone omogene perilezionale
relativ sugestive pentru un proces malign (cancer) cu localizare cerebrală; examenul RMN a
confirmat existenţa şi dimensiunile leziunii.
Datorită simptomatologiei şi valorilor crescute ale reactanţilor de fază acută, s-a început terapia
cu corticosteroizi, pacientul prezentând o remisie a simptomelor. S-a efectuat biopsie din zona
afectată, histologic descoperindu-se leziuni foliculare cu celule epitelioide dar fără necroză. S-au
realizat frotiuri colorate Gram, Ziehl-Neelsen şi PAS; nu au fost evidenţiate microorganisme iar
decizia aa se
Pentru fostelucida
de a nu se trimite
motivul produsele
apariţiei acesteirecoltate spre
leziuni, au laboratorul
fost realizate şideo bacteriologie.
serie de investigaţii
extracerebrale (CT toraco-abdominal, lavaj bronhoalveolar şi bronhoscopie) fără a se obţine
date suplimentare pentru un diagnostic pozitiv.
În aceste condiţii, medicul curant a pus diagnosticul de sarcoidoză localizată la nivelul SNC iar
pacientul a fost externat, continuând la domiciliu tratamentul cu corticosteroizi, conform
scrisorii medicale eliberată în spital.
După 2 luni bărbatul a fost reinternat cu deficienţe motorii şi febră (38,2ºC). S-a indicat din nou
examen CT; rezultatul nu a permis explicarea simptomatologiei. Recoltându-se produse din mai
multe zone, examenul bacteriologic, complet, a permis punerea diagnosticului de tuberculoz ă
diseminată.
S-a continuat tratamentul cortizonic, dar s-a început tratamentul anti-tuberculos cu o asociere
de 4 medicamente (izoniazidă, rifampicină, pirazinamidă şi etambutol).
După 4 luni simptomele au reapărut şi s-a luat decizia intervenţiei chirurgicale, pentru excizia
formaţiunii. Analiza anatomo-patologică a pus în evidenţă structura tipică pentru granulomul
tuberculos (ceea ce prin biopsia „oarbă” efectuată cu câteva luni înainte, nu s-a reuşit).
Tratamentul
pentru a continuat,
o durată de 6 luni.dar a fost adăugată
Pacientul amikacina,
nu a prezentat reacţiipenta-terapia
adverse. Dupăanti-TB
un an,realizându-se
au fost scoase
din asocierea medicamentoasă 3 medicamente iar pacientul a primit pentru încă 6 luni (durata
totală a tratamentului anti-TB a fost de 18 luni) numai izoniazidă şi rifampicină.
Discuţii
Tuberculoza cerebrală are o rată de mortalitate care variază între 5 şi 60%. Tratamentul de
elecţie este cel medicamentos, cu o durată de circa 18 luni, până la dispariţia leziunilor sau până
la calcificarea acestora. O creştere paradoxală în dimensiuni a leziunii, sub tratament, poate
duce la recomandarea intervenţiei chirurgicale de excizie a tuberculomului, aşa cum s -a
întâmplat şi în această situaţie.
251
Ȋntrebarea 2
Alegeti dintre următoarele afirmaţii adevărate pe cea care nu se potriveşte în context (ca sens
de desfăşurare a reacţiilor imune):
a). Ultravioletele inhibă direct celulele Langerhans, care au un rol important în sensibilizare
b). Persoanele cu deficit de IFN nu dezvoltă granuloame
c). Absenţa reacţiei epidermice la contactul tegumentului cu DCNB se datorează unui deficit
imun celular
d). Keratinocitele exprimă la suprafaţa lor molecule HLA DR la 48-96 de ore după apariţia
infiltratului limfocitar, fapt care va amplifica răspunsul imun al gazdei
Ȋntrebarea
Alegeţi 3 care se potriveşte pentru spaţiile libere din următoarea afirmaţie:
varianta
”Intradermoreacţia la .................... presupune apariţia unei eventuale arii intens...................,
circumscriind urma înţepăturii dermice, ...................... si reliefate, care corespunde
histopatologic infiltraţiei dermice (edem, limfocite, macrofage, PMN), reprezentând răspunsul
imun faţă de antigenul injectat”
a). tuberculină; eritemato-violacee, indurate
b). bacil Koch; eritemato-violacee; indurate
c). tuberculină; cianotice; retractile
d). bacil Koch; cianotice; indurate
a). 5-7
b). zileore
48-72
c). 72 ore
Care este asocierea corectă?
a). 1-a; 2-b; 3-c
b). 1-c; 2-b; 3-a
c). 1-a; 2-c; 3-b
d). 1-b; 2-a; 3-c
Ȋntrebarea 5
Care dintre următoarele tipuri de HS de tip IV nu are echivalent la om?
a). Hipersensibilitatea tuberculinică
b).Hipersensibilitatea de tip Jones-Mote;
c). Hipersensibilitatea de contact
d). Hipersensibilitatea granulomatoasă
252
Boala Graves, o afecţiune a glandei tiroide (guşă exoftalmică, tegument cu aspect de „coajă de
portocală”, hipertiroidism) a fost considerată o boală autoimună, în care organismul produce
autoanticorpi anti-receptor pentru hormonul tireotrop (TSH) şi autoanticorpi anti-tiroxină şi
anti-tireoglobulină (mecanismul nu a fost elucidat complet).
Celulele foliculare tiroidiene (prezintă pe suprafaţă receptori pentru TSH), sunt stimulate atât
fiziologic de către hormonul hipozar, cât şi patologic, de către autoanticorpii (de tip IgG) care
„imită” structura şi funcţiile TSH. Această dublă stimulare conduce la o hipersecreţie de
hormoni tiroidieni (T3 şi T4), putând provoca tireotoxicoză. Simptomele din hipertiroidism pot fi,
parţial, explicate de către aceste mecanisme. De exemplu, exoftalmia poate fi explicată prin
faptul că atât glanda tiroidă şi muşchii externi ai globului ocular prezintă un Ag comun care este
recunoscut
oculari. de către
Aspectul auto-Ac;
de „coajă derezultă un proces
portocală” al pieliiinflamator retroocular
se datorează infiltrăriişide
protruzia globilor
Ac subcutanat,
determinând un proces inflamator la acest nivel.
Miastenia gravis este o boală neuromusculară caracterizată clinic prin hipotonie musculară
intermitentă (accentuată în efort, ameliorată în repaus) şi oboseală musculară. Mecanismul de
producere este autoimun, prin blocarea receptorilor de tip N (nicotinic) ai acetilcolinei de către
auto-Ac circulanţi, care ajung la nivelul joncţiunii musculare post-sinaptice
Cititorul care doreşte să aprofundeze unele dintre aspectele menţionate în acest capitol poate
să acceseze informaţiile oferite de site-urile de mai jos sau şi alte site-uri.
http://www.pnas.org/content/107/50/21553.long
Un nou ajutor în managementul terapeutic al pacienţilor cu anemie Fanconi
http://www.biomedcentral.com/1471-2148/10/264
Sistemul nostru imun şi infecțiile parazitare
http://www.biomedcentral.com/1471-2431/10/61
Fumatul pasiv al copiilor
http://www.biomedcentral.com/1471-2431/10/61
Un exemplu de influență a mediului asupra fenotipului
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1806-
37132010000300003&lng=en&nrm=iso&tlng=en
Pot doze repetate de vaccin BCG să protejeze împotriva astmului?
http://www.jci.org/articles/view/43964
Colagenul endogen-terapeutic?
http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0011983
Bordetellaperttusis pentru inducerea bolilor autoimune în cercetarea fundamentală.
253
Reacţia antigen-anticorp este o reacţie între un antigen ( ) şi un anticorp ( ) şi constă în
legarea grupării determinante de pe suprafaţa antigenului ( - o „proeminenţă”) cu situsul
de combinare de pe suprafaţa anticorpului ( - o „adâncitură”). (Figura nr. 1)
Reacţia Ag-Ac are 2 proprietăţi principale, specificitatea şi reversibilitatea.
se referă la faptul că un antigen nu este recunoscut decât de anticorpii care au
fost produşi în urma inoculării respectivului antigen, iar anticorpii nu recunosc decât antigenul
faţă de care au apărut. Trebuie menţionat că specificitatea nu este absolută, întrucât un Ag cu
reactivitate încrucişată, poate reacţiona cu un Ac format faţă de un alt antigen (reacţia
încrucişată se explică prin aceea că anumite Ag posedă anumite grupări determinante comune).
complexului Ag-Ac se datorează faptului că legăturile necovalente sunt
reversibile la cald sau pH acid (<3).
Legarea antigenului cu anticorpul este determinată de complementaritatea reciprocă dintre
conturul suprafeţei epitopului şi paratopului, care apropie la câţiva Angstromi grupările chimice
care le alcătuiesc, permiţând stabilirea unor forţe intermoleculare între epitop şi paratop
(hidrofobe între grupările nepolare, de atracţie electrostatică între grupările ionizate de semn
contrar).
Iniţial are loc cuplarea între Ag şi Ac rezultând complexe Ag-Ac mici, solubile, care se pot
desface relativ uşor. În continuare, datorită existenţei mai multor situsuri de lega re, complexele
Ag-Ac mici se reunesc formând structuri de dimensiuni mai mari, adevărate reţele Ag-Ac, care
pot fi evidenţiate fie direct, fie după utilizarea unor artificii tehnice (19.4., 19.5).
Reacţia dintre antigen (Ag) şi anticorp (Ac) necesită interacţiunea determinantului antigenic
(epitop) cu situsul de combinare al anticorpului (paratop).
Factorii care condiţionează interacţiunea Ag-Ac sunt:
- complementaritatea structurală dintre epitop şi paratop (reacţia este );
complementaritatea presupune adaptarea conformaţională a celor două grupări, de tipul „cheie
în broască” (vezi şi 17. 1.); Fiecare anticorp posedă, în porţiunea Fab, o regiune hipervariabilă
care constă în 3 bucle de legătură între pliurile β adiacente ale domeniilor variabile de la nivelul
lanţului greu (VH) şi celui uşor asociat (VL). Aceste fragmente mai poartă denumirea de
(complementarity-determiningregions) sau fragmente ce determină complementaritatea în
reacţia cu antigenul. Însă într-o reacţie Ag-Ac, nu doar aminoacizii din CDR interacţionează cu
epitopul, ci şi alte porţiuni din regiunea variabilă, uneori existând posibilitatea ca o porţiune CDR
să nici nu fie implicată în reacţie.
- complementaritatea electrochimică a grupărilor care intră în reacţie este o consecinţă a
complementarităţii structurale; pentru stabilizarea legăturii intră în acţiune forţe
intermoleculare, care sunt legături necovalente, forţe nespecifice cu valoare mică, spre exemplu
legături de hidrogen / energie de legare 3-7 kcal / mol;
forţe electrostatice (coulombiene sau ionice) / energie de legare 5 kcal / mol;
legături van der Waals / energia de legare 1-2 kcal / mol
legături hidrofobe.
Complementaritatea structurală sau forţele intermoleculare nu sunt suficiente, fiecare în parte,
pentru a forma legături stabile; este necesară îndeplinirea ambelor condiţii. Cu cât energia de
legare a reactanţilor este mai mare, cu atât complexele Ag-Ac sunt mai stabile.
254
Fiecare determinant antigenic poate avea o structură liniară – lucru posibil pentru orice tip de
moleculă: proteină, carbohidrat, lipid, acid nucleic – iar în cazul proteinelor, în plus faţă de
secvenţa liniară, un epitop poate fi determinat de conformaţia proteinei – structura terţiară.
Astfel se definesc două tipuri de epitopi: şi .
Pe o proteină se pot găsi ambele tipuri de epitopi, crescând astfel şansele ca aceasta să
interacţioneze cu paratopul specific.
Pe de altă parte, secvenţele de aminoacizi cunoscute de anticorpi pot fi ”ascunse” în cadrul
proteinei, reacţia Ag-Ac neputând avea loc.
Aranjamentul spaţial al epitopilor pe o proteină poate influenţa modul de legare a Ac. Astfel că
atunci când determinanţii antigenici se situează la o distanţă netă unul faţă de celălalt, anticorpii
se potrestricţii
apar lega fărădesănatură
se suprapună. Când epitopii
sterică, ajungând să se sunt foarte apropiaţi, între anticorpii specifici
suprapună.
Legarea unui anticorp de epitop poate conduce, în cazuri mai rare, la modificarea
conformaţională a unui alt epitop, cu consecinţe pozitive sau negative asupra reacţiei Ag-Ac.
Acest efect se numeşte efect alosteric, iar mecanismul este asemănător celui asociat enzimelor
alosterice la care centrul activ se poate modifica după ce enzima a interacţionat cu un cofactor
activator sau inhibitor.
Interacţiunea dintre epitop şi paratop este definită de 2 parametri (afinitatea şi aviditatea
anticorpilor). (Figura nr. 2)
· Afinitatea măsoară forţa de legare dintre epitop şi paratop. Afinitatea este rezultanta
forţelor de atracţie şi de respingere care mediază interacţiunea celor doi reactanţi. O
interacţiune cu afinitate înaltă presupune structuri complementare perfecte, în timp ce
complementaritatea imperfectă a grupărilor reactante determină o afinitate scăzută, deoarece
forţele de atracţie sunt active numai pe distanţe foarte mici şi sunt diminuate de forţele de
respingere. Afinitatea anticorpilor se poate măsura prin dializă la echilibru. Afinitatea reprezintă
caracteristica unei singure perechi Ag-Ac şi este definită printr-o constantă, (Kd), care relevă cât
este crescută.
este de uşor săÎndesparţi un complex
serul uman, Ag-Ac
anticorpii în componentele
au diferite sale.
afnităţi faţă Când Kd este
de antigene, scăzut,
lucru afinitatea
determinat în
principal de secvenţele din CDR.
· Aviditatea este un parametru al interacţiunii Ag-Ac care rezultă din multivalenţa Ag. Cele
mai multe Ag posedă mai mult decât un epitop. De exemplu, bacteriile, polizaharidele etc, au pe
suprafaţă un număr mare de epitopi repetitivi (antigene multivalente). Ag proteice au epitopi
multipli, dar diferiţi. Antigenele multivalente leagă un număr echivalent de molecule de
anticorpi. Energia totală de legare a epitopilor multipli ai unui Ag, cu paratopii specifici este mult
superioară în comparaţie cu energia separată a fiecărei interacţiuni dintre epitop şi paratop.
Aviditatea caracterizează energia medie de legare a unui Ag multivalent cu Ac specifici şi
măsoară forţa rezultantă a afinităţii dintre epitopii multipli ai unui Ag şi paratopii
complementari. Complexele Ag-Ac formate de antigenele multivalente sunt stabile, disocierea
lor fiind dificilă, deoarece este necesară ruperea tuturor legăturilor existente. O moleculă
pentamerică de IgM care are afinitate scăzută faţă de un antigen multivalent, poate să se lege
ferm de Ag, reacţia având aviditate crescută datorită însumării interacţiunilor de joasă afinitate
dintre fiecare epitop şi paratop.
·Spre exemplu,
Anticorpiiluând în considerare
din clasa ceeaînceRIP
IgM, care apar se au
întâmplă în mare
afinitate cursulşiRIP şi RIS: mică pentru Ag (se
aviditate
cuplează uşor cu epitopul, dar legătura durează puţin);
Anticorpii din clasa IgG, care apar în RIS au afinitate mică, dar aviditate mare pentru Ag (şi
legăturile sunt mult mai stabile).
255
În anumite cazuri pot avea loc reacţii încrucişate; un Ag reacţionează cu un Ac care a fost
sintetizat faţă de un alt Ag (aceste reacţii pot apărea de ex. datorită faptului că anumite Ag
posedă anumite grupări determinante comune). Spre exemplu, serul imun anti-polizaharid
capsular de Streptococcuspneumoniae aglutinează eritrocitele umane de grup A (cu
specificitate antigenică conferită de N-acetil-galactozamină), iar serul imun anti-Escherichiacoli
aglutinează eritrocitele umane de grup B (cu specificitate antigenică conferită de galactoză).
Persoanele ”alergice” la diferite mâncăruri sau substanţe, pot dezvolta foarte uşor alte stări de
hipersensibilitate la structuri asemănătoare.. De exemplu un individ ”alergic” la alune, poate să
dezvolte ”alergie” şi faţă de soia, mazăre sau alte seminţe.
În funcţie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul urmărit există mai
multe tipuri de reacţii Ag-Ac, după cum urmează:
· reacţii de precipitare
o pot avea loc în gel (imunodifuzia radială simplă Mancini, dubla difuzie Ouchterlony etc) sau
o pot avea loc în mediu lichid (reacţia Ramon, Ascoli etc.)
· reacţii de aglutinare
256
o se pot folosi în diagnosticul bacteriologic (ex. reacţia Huddleson) sau
o se pot folosi în diagnosticul serologic (ex. reacţia Wright)
· reacţia de fixare a complementului (RFC)
o în diagnosticul serologic al sifilisului (RBV – Reacţia Bordet-Wasserman), leptospirozei etc.
o în diagnosticul serologic al infecţiilor virale etc.
· reacţii de seroneutralizare
o reacţia ASLO (în diagnosticul serologic al infecţiilor streptococice)
o testul plăcilor semineutralizate
o diferite intradermoreacţii cu mecanism imun umoral etc.
· reacţii în care componentele sunt marcate
o izotopic
o enzimatic(radioimmunoassay , RIA)
(enyzme-linkedimmunoassay , ELISA)
o fluorescent (fluorescentimmunoassay, FIA)
o chemiluminiscent (chemiluminiscentassay, CLA).
Dintre patologiile infecţioase în ansamblu, infecţiile aparatului locomotor sunt printre cele mai
mortale şi mai greu de îngrijit. Un răspuns terapeutic satisfăcător depinde de abordarea
multidisciplinară a afecţiunii: chirurgia trebuie coroborată cu diagnosticul microbiologic corect
executat. În general există tendinţa de a se instaura un tratament antibiotic empiric fără un
diagnostic
tot empiric,deculaborator prealabil,
un spectru iarAdministrarea
mai larg. dacă tratamentul nu se arată
antibioticului eficient,antibiogramei
conform se va abordaar
unfialtul,
soluţia cea mai buna şi cea mai ieftină, dar frecvent nu se recurge la ea.
reumatismul articular
dovedeşte aşadar acut,ASLO
că titrul cardita
nu reumatismală
este o metodăsau glomerulonefrita
specifică poststreptococică.
pentru detectarea Se
infecţiei exclusiv
cu S.pyogenes.
Streptolizina O este secretata de streptococii din grupurile A, C şi G şi de Streptococcus
canis. Măsurarea în dinamică a titrului ASLO este o metodă simplă şi eficientă pentru a
diagnostica infecţiile cu aceste tipuri de streptococi. Toţi dintre ei sunt implicaţi în infecţii
musculoscheletale şi toţi au rămas sensibili la penicilină. Aşadar la un pacient cu semne de
osteomielită sau fasciită la care nu se pot lua probe din produsul patologic, este recomandat să
se utlizeze măsurarea titrului ASLO şi dacă acesta este foarte mare, balanţa se înclină către o
257
infecţie streptococică, uşor de tratat cu penicilină. Această abordare ar fi ideală pentru a reduce
administrarea abuzivă de antibiotice cu spectru larg, fiind nevoie doar de un test de laborator
simplu şi sensibil.
1. Sudha Pottumarthy, Virginia C. Wells, Arthur J. Morris; A Comparison of Seven Tests for
Serological Diagnosis of Tuberculosis; J Clin Microbiol. 2000 June; 38(6): 2227 –2231
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC86769/)
2. Lennox K. Archibald; Rapid Diagnostic Testing of Infectious Diseases
(http://www.medscape.com/viewarticle/748139)
3. Mohammad Reza Hasanjani Roushan, Mohammad Jafar Soleimani Amiri, Abolghasem Laly,
Amrollah Mostafazadeh ,A. Bijani; Follow-up standard agglutination and 2-mercaptoethanol
tests in 175 clinically cured cases of human brucellosis; International Journal of Infectious
DiseasesVolume 14, Issue 3 , Pages e250-e253, March 2010
(http://www.ijidonline.com/article/S1201-9712%2809%2900211-2/fulltext )
4. A. Gupta, N.T. My Thanh, S.J. Olsen, S. Sivapalasingam, T.T. My Trinh, N.T. Phuong Lan, R.M.
Hoekstra, W. Bibb, N.T. Minh, T.P. Danh, P.D. Cam, E.D. Mintz; Evaluation of community-based
serologic screening for identification of chronic Salmonella Typhi carriers in Vietnam;
International Journal of Infectious Diseases Volume 10, Issue 4 , Pages 309-314, July 2006
(http://www.ijidonline.com/article/S1201-9712%2805%2900176-1/fulltext )
258
3. Care este afirmaţia falsă?
A. între epitop şi paratop nu se stabilesc legături covalente, ci forţe int ermoleculare
B. un determinant antigenic liniar nu este recunoscut de anticorpul specific
C. o reacţie antigen-anticorp este reversibilă deoarece între cei doi reactanţi nu se stabilesc
legăuturi greu de scindat
D. un anticorp specific unui antigen poate să lege un alt antigen înrudit datorită fenomenului de
„reacţie încrucişată”
E. epitopii conformaţionali sunt determinaţi de structura terţiară a proteinelor
A. sunt
B. sunt sinonime
caracteristice doar moleculelor IgG
C. sunt parametri ai interacţiunii antigen-anticorp şi au semnificaţie diferită
D. nu se pot defini în cazul unei reacţii încrucişate
E. aviditatea măsoară forţa de legare dintre epitop şi paratop
1. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman, Shiv Pillai, 2007, Cellular and Molecular Immunology, 3 rd
edition, 6, 143-161
2. Jawetz, Melnick, Adelberg, 2007, Medical Microbiology, 24 th edition, II-8, 128-137
3. Kayser, Bienz, Eckert, Zinkernagel, 2005, Medical Microbiology, 121-132
4. Lee Goldman, Dennis Ausiello, 2008, Cecil Medicine, 3 rd edition, Section VII, 249-270
5. Strohl, Rouse, Fisher, 2001, Lippincott's Illustrated Reviews: Microbiology, 79-101, 437-455
6. Ilker Uçkay, Tristan Ferry, Richard Stern, Juan Ambrosioni, Axel Gamulin, Diego Andrey,
Marina Djordjevic, Louis Bernard, Pierre Hoffmeyer, Daniel Lew; Use of serum antistreptolysin O
titers in the microbial diagnosis of orthopedic infections; International Journal of Infectious
Diseases, Volume 13, Issue 4 , Pages 421-424, July 2009
7. http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/ab-ag-rx.htm - Immunoglobulins-Antigen-Antibody
Reactions, Dr Gene Mayer
259
Reacţia de precipitare între Ag şi Ac poate avea loc în mediu lichid sau solid şi constă în unirea
Ag solubile cu Ac specifici, rezultând complexe antigen-anticorp, care nu devin insolubile şi
stabile decât în cazul formării unei reţele tridimensionale între antigen şi anticorp, conform
teoriei reţelei care presupune: un antigen cel puţin trivalent pentru amplasarea anticorpilor,
anticorp bivalent şi condiţii fizice favorabile precipitării (ex. Ac puţin glicozilaţi / de tip IgG cu 3%
glucide superiori celor IgM cu 10% glucide).
Reacţia de precipitare este sensibilă şi specifică în evidenţierea prezenţei Ag (pentru realizarea
reţelei Ag-Ac este necesar ca în reacţie să intre o anumită „cantitate” de Ag şi Ac, care să se
găsească într-un anumit raport / proporţie, iar Ag care participă la formarea agregatelor sunt
într-o cantitate proporţional mai mică, în raport cu Ac). În cadrul cursului se discută diferitele
situaţii legate de prezonă (exces de Ac), exces relativ de Ac, zona de echivalenţă (Ag şi Ac se
găsesc „în totalitate” în precipitat), exces relativ de Ag şi respectiv postzonă (exces de Ag).
Pentru anumite sisteme Ag-Ac va fi definită şi noţiunea de proporţie optimă.
Au la bază unirea Ag cu Ac în mediul lichid, formându-se complexe Ag-Ac, care vor precipita
atunci când Ag şi Ac se găsesc în anumite proporţii.
20. 2. 1. 1. Reacţii de precipitare în amestec
260
Reacţia de precipitare între Ag şi Ac se poate cuantifica şi este foarte utilă pentru a demonstra
prezenţa şi respectiv absenţa precipitatului în funcţie de concentraţiile relative de Ag şi Ac. Spre
exemplu, pentru metoda se pun în contact, în amestec în
tuburi, cantităţi egale din componenta care trebuie titrată (toxina difterică, Ag) cu cantităţi
variabile de Ac la care titrul este cunoscut. Cantitatea maximă de precipitat se găseşte în tubul
unde există raportul de echivalenţă. Pentru sistemul toxină difterică - anticorpi anti-toxină
difterică (ca şi în cazul sistemului toxină tetanică - anticorpi anti-toxină tetanică), raportul de
echivalenţă se „suprapune” peste proporţia optimă, astfel încât se poate observa relativ uşor
tubul în care apare cantitatea cea mai importantă de precipitat. Cunoscând titrul anticorpilor, se
află imediat titrul toxinei (1 Lf = 1 limesfloculans = cantitatea de toxină care se combină cu o
unitateînde
apare antitoxină
tubul în care =titrul
1 UAanticorpilor
= 1 unitateeste
antitoxică). Dacă
de 10 UA, spre
titrul exemplu
toxinei esteprecipitarea
de 10 Lf. maximă
În mod asemănător, prin metoda se poate
cunoscând titrul toxinei.
20. 2. 1. 2. Reacţii de precipitare în inel
Reacţia de precipitare în inel, constă în punerea în contact a Ag şi Ac astfel încât să nu se
amestece; reacţia care apare la interfaţa dintre Ag şi Ac se concretizează printr-un inel de
precipitare albicios. Se utilizează pentru identificarea srcinii petelor de sânge (reacţia Uhlenhut,
în medicina legală) şi pentru identificarea provenienţei unor preparate pe bază de carne (în
industria alimentară).
Demonstrativ, în cursul lucrărilor practice, reacţia de precipitare în inel (reacţia Ascoli) se poate
utiliza pentru identificarea prezenţei antigenului cărbunos (Ag obţinut de la Bacillusanthracis).
Istoric, soluţia de antigen se prepara pornind de la organe (de ex. splină) recoltate de la un
animal care a decedat şi pentru care se suspecta că decesul a fost produs de o infecţie
generalizată cu Bacillusanthracis. Fragmentul de organ se mojarează în soluţie de clorură de
sodiu sterilă, adăugându-se ulterior câteva picături de acid acetic, apoi se menţinea la
temperatura
filtrarea de fierbere
şi rezulta soluţia timp de 5-10Din
antigenică. minute.
punct După decantarea
de vedere şi alcalinizarea
tehnic vom cu NaOH,
utiliza 3 tuburi, urma
1 pentru
reacţie şi 2 tuburi martor. În primul tub martor vom pipeta 0,5 ml ser anticărbunos şi 0,5 ml
soluţie salină fiziologică iar în al doilea tub martor vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal şi 0,5 ml
soluţie de antigen. În ceea ce priveşte tubul de reacţie trebuie să pipetăm întâi 0,5 ml din serul
anticărbunos, urmând ca soluţia de antigen (în cantitate de 0,5 ml) să fie pipetată foarte lent,
eventual prin „scurgere picătură cu picătură” pe peretele interior al tubului, în aşa fel încât cele
2 soluţii să nu se amestece. În cazul reacţiei pozitive (prezenţa Ag cărbunos în soluţia
antigenică), după circa 5 minute, la interfaţa dintre cei 2 reactivi apare un „inel” de precipitare.
Reacţia de precipitare în tub capilar a fost utilizată pentru evidenţierea prezenţei
proteinei C reactive (CRP).
Dozajul nefelometric: în prezenţa unei cantităţi constante de Ag sau Ac, se formează
complexe Ag-Ac care modifică intensitatea şi dispersia luminii direct proporţional cu
concentraţia de Ag sau Ac (principiul de măsurare este proporţionalitatea dintre cantitatea de
complex antigen-anticorp formată şi lumina „împrăştiată”). Cu ajutorul unui nefelometru, care
utilizează fascicule luminoase monocromatice intense şi a unei măsurări a precipitatului în
mediu lichidsau
antigenului prina difracţie de raze
anticorpilor, luminoase,
folosind o curbăeste posibilă dozarea
de etalonare. uşoară, se
Nefelometria reproductibilă a şi
utilizează curent
determină cantitativ proteine specifice din ser şi urină (IgG, IgA, IgM, CRP, haptoglobină,
orosomucoid, fibrinogen, C3, C4, prealbumină, alfa1-antitripsină etc).
Utilizarea gelozei, în care pot să migreze cei doi reactivi (se va utiliza o anumită concentraţie de
agar în soluţie de tampon veronal, în aşa fel încât porii gelului să permită migrarea), va du ce la
vizualizarea reacţiei Ag-Ac printr-un arc / linie de precipitare.
20. 2. 2. 1. Imunodifuzia radială simplă (IDRS Mancini)
261
Imunodifuzia radială simplă (Mancini) se bazează pe difuzia spontană şi radială a Ag din proba
de cercetat, într-un gel care conţine o cantitate constantă de anticorpi, determinând apariţia
unui cerc de precipitare al cărui diametru este direct proporţional cu concentraţia de antigen
din probă. Pentru a obţine un cerc de precipitare de mărime convenabilă, concentraţia Ac
înglobaţi în gel trebuie să fie aleasă în funcţie de titrul acestora şi de concentraţia Ag care
urmează a fi testat. Metoda permite determinareacantitativă a imunoglobulinelor (IgG, IgM,
IgA), fracţiunii C3 a complementului, alfa1-antitripsinei, siderofilinei etc.
Sunt necesare plăcuţe (de ex. cu diametrul de 5 cm) în care se toarnă un gel care include Ac faţă
de structura a cărei concentraţie dorim să o determinăm. Există un cod al culorilor şi spre
exemplu, plăcuţele care vor fi utilizate pentru determinarea concentraţiei de IgG au culoare
roşie,perforate
sunt pentru IgA culoarea
mici godeurieste albastră,
(3 mm pentruSunt
diametru). siderofilină
necesareculoarea
seruri deeste portocalie
cercetat şi un etc. În gel
ser de
referinţă în care se cunoaşte concentraţia diferitelor componente (spre ex. câte 100 UI / ml
pentru fiecare dintre cele 3 imunoglobuline). Înainte de pipetarea serurilor în godeuri se
realizează diluarea acestora, diluţia fiind ¼ pentru IgG, IgA şi siderofilină şi respectiv ½ pentru
IgM, complement C3 şi alfa1-antitripsină. Diluţia serului de referinţă se face în funcţie de
proteina care urmează a fi determinată. Cantitatea de ser introdusă în fiecare godeu este de 5
ml (un godeu pentru serul de referinţă şi restul pentru serurile de cercetat).
După 10 minute de menţinere a plăcuţei pe masa de lucru aceasta se incubează la 37°C, cu
stratul de gel poziţionat în sus, timp de 48 ore pentru IgA şi IgM şi respectiv 24 de ore pentru
celelalte componente. Citirea se realizează cu ajutorul unei rigle gradate, din plastic, o riglă
specială pentru această analiză (demonstrat în cursul lucrărilor practice). Se va măsura iniţial
diametrul cercului de precipitare din jurul godeului în care se află serul de referinţă iar rezultatul
obţinut trebuie să corespundă aşteptărilor (de ex. 6 mm pentru IgG care a fost diluat ¼ şi astfel
are concentraţia de 25 UI / ml). În cazul că rezultatul este cel aşteptat, se poate face direct
citirea diametrelor cercurilor de precipitare pentru serurile de cercetat; în caz contrar este
necesară pentru
obţinută o „corecţie” (dacă
serurile spre exemplu
de cercetat diametrul
se scad 0,5 mm).este 6,5citirea
După mm îndiametrelor,
loc de 6 mm,sedin valoarea
compară
rezultatele cu cele puse la dispoziţie în tabele iar cifra obţinută se înmulţeşte cu diluţia probei
(spre ex. dacă obţinem o valoare de 50 UI / ml pentru IgG, vom înmulţi cu 4 pentru a obţine
rezultatul real).
20. 2. 2. 2. Imunodifuzia dublă radială (Ouchterlony)
Imunodifuzia dublă se bazează pe difuzia Ag şi Ac (unul spre celălalt) într -un gel. Deoarece
mărimea moleculelor de Ag şi Ac este mai mică decât diametrul porilor gelului, iar distanţa
parcursă de reactant într-un anumit timp este direct proporţională cu gradientul concentraţiei
sale şi invers proporţională cu greutatea sa moleculară, migrarea reactanţilor unul spre celălalt
determină formarea unor linii de precipitare la locul de întâlnire Ag-Ac. În gelul transparent vor
apărea linii opace, numărul lor corespunzând numărului sistemelor Ag-Ac studiate.
Metoda certifică prezenţa sau absenţa proteinei cercetate. Se pot evidenţia alfa-fetoproteina,
proteina C reactivă, beta-2 microglobulina, proteine Bence-Jones tip kappa şi lambda, produşi
de degradare ai fibrinogenului (PDF) etc. În micologie, prin imunodifuzie se poate identifica
prezenţa exoantigenelor fungice ( Histoplasmacapsulatum,Blastomycesdermatidis,
262
anti-CRP în godeul central şi ser de referinţă cu CRP în godeurile 1 şi 4. În celelalte godeuri
pipetăm serurile de cercetat. Incubăm la 37°C, timp de 24 de ore, în cameră umedă (într -o cutie
Petri putem pune o bucată de vată îmbibată în soluţie salină fiziologică, alături de lama
respectivă). Liniile de precipitare pot deveni vizibile după 2 -4 ore dar sunt mult mai clare după
24 de ore.
Pentru citire pot fi necesare o lupă şi o sursă de lumină. Între godeul central şi godeurile 1 şi 4
(martori pozitivi) vor apărea linii (arcuri) de precipitare. În cazul în care de ex. în godeul 2 există
CRP, va apărea un arc de precipitare şi între godeul central şi godeul nr. 2. Este certificată
prezenţa CRP în cazul în care cele 2 linii de precipitare (dintre godeul central şi godeurile 1 şi 2)
sunt una în continuarea celeilalte (imagine de „genunchi îndoit”).
20. 2. 2. metodă
Această 3. Dublapermite
difuzie Elek
depistarea capacităţii toxigene a unei tulpini de Corynebacterium
diphteriae. În cazul în care tulpina este toxigenă, toxina va difuza în mediu iar după unirea cu Ac
anti-toxină, complexele Ag-Ac vor da naştere unor linii de precipitare.
Într-o cutie Petri turnăm mediul Elek şi după ce mediul s-a întărit, decupăm un şanţ pe unul din
diametre. În şanţul respectiv pipetăm 0,5 ml ser antidifteric, ser care conţine Ac anti -toxină
difterică în concentraţie de 1.000 UI / ml. Ac anti-toxină difterică vor difuza în mediu. După circa
2 ore însămânţăm perpendicular pe şanţul cu Ac anti-toxină, de fiecare parte a şanţului, o
tulpină de Corynebacterium diphteriae toxigenă (martor pozitiv), o tulpină de Corynebacterium
diphteriae ne-toxigenă (martor negativ) şi tulpini de cercetat, câte un striu (de fiecare parte a
şanţului) pentru fiecare tulpină. Incubăm la 37°C pentru 48 ore, dar urmărim zilnic apariţia
culturii şi precipitatului (liniilor de precipitare). De-a lungul liniilor de însămânţare apare cultură
bacteriană. Din cultura de Corynebacterium diphteriae toxigen, toxina (Ag) difuzează în mediu.
Unirea dintre Ag şi Ac duce la formarea unor complexe Ag-Ac care precipită, iar în mediu vor
apărea linii de precipitare în unghiurile dintre cultură şi şanţul cu Ac anti -toxină. În cazul în care
apar linii de precipitare în unghiul dintre una dintre tulpinile de cercetat şi şanţul cu Ac anti -
toxină, respectiva
tulpinile tulpină
de cercetat este toxigenă. Reacţia va fi negativă pentru martorul negativ şi pe ntru
ne-toxigene.
importante
20. de Ag K, prezenţa acestuia poate fi evidenţiată de ex. prin imunoelectroforeză.
2. 3. 3. Contraimunoelectroforeza
Contraimunoelectroforeza reprezintă o dublă difuzie în care deplasarea unul faţă de celălalt a
Ag şi Ac este accelerată de un câmp electric. Pe o lamă de microscop se toarnă un gel de agar
1% şi se perforează 3 grupe de perechi de godeuri, faţă în faţă. Metoda poate fi utilizată pentru
acele structuri antigenice care în câmp electric migrează către anod. Luând în discuţie spre
exemplu doar una dintre cele 3 grupe de perechi de godeuri, în godeurile care vor fi poziţionate
spre catod (polul negativ) pipetăm Ag iar în godeurile care vor fi poziţionate spre anod (polul
pozitiv) pipetăm Ac cunoscuţi, specifici Ag pe care dorim să-l identificăm. Reacţia este mai
rapidă şi mai sensibilă decât dubla difuzie deoarece migrarea celor doi reactanţi unul către
263
celălalt este amplificată de câmpul electric. Reacţia (apariţia unei linii de precipitare între
godeuri, în cazul în care în godeul catodic se găseşte Ag presupus) poate fi citită după numai 30 -
90 minute în loc de 24 de ore aşa cum se întâmplă în dubla difuzie Ouchterlony. Metoda a fost
utilizată din punct de vedere istoric pentru identificarea prezenţei Ag HBs. Se poate utiliza
pentru identificarea antigenelor capsulare î n lichidul cefalorahidian la pacienţi cu meningită
acută (Haemophilusinfluenzae,Neisseriameningitidis,Streptococcuspneumoniae ).
20. 2. 3. 4. Electroimunodifuzia
Electroimunodifuzia are la bază electroforeza probelor care conţin proteina-antigen, într-un
strat de gel, care conţine o cantitate constantă de anticorpi monospecifici (anti-proteină
antigen), rezultând zone de precipitare în formă de rachetă sau conuri, a căror arie este direct
proporţională cu concentraţia antigenului. Metoda are o sensibilitate mai mare decât IDRS.
Există mai multe variante tehnice de aglutinare. Dintre acestea vom prezenta în continuare, pe
scurt, aglutinarea directă, aglutinarea indirectă, inhibarea aglutinării, aglutinarea în coloană şi
aglutinarea mediată de Ac anti-imunoglobuline. Ulterior vom discuta reacţiile de aglutinare
utilizate în bacteriologie şi micologie.
20. 4. 1. Aglutinarea directă
Aglutinarea directă reprezintă aglutinarea Ag naturale ale unor particule (bacterii, celule) de
către Ac specifici. Se poate utiliza în diagnosticul bacteriologic, de ex. pentru identificarea
enterobacteriilor (Shigella, Salmonella, E.coli etc) sau a altor germeni Gram-negativi (Vibrio
cholerae) etc., pe baza structurii antigenice, în diagnosticul serologic al unor boli infecţioase
(febră tifoidă, bruceloză etc), pentru determinarea grupelor sanguine (ABO) etc.
20. 4. 2. Aglutinarea indirectă sau pasivă
Este o reacţie în care particule artificiale (globule roşii formolate, particule de latex, cristale de
colesterol, colodiu etc) sau naturale sunt „încărcate” in vitro cu Ag sau Ac şi sunt aglutinate de
către Ac sau Ag corespondente din proba de cercetat. Se utilizează în principal pentru decelarea
factorului reumatoid, determinarea CRP, determinarea grupului streptococic etc.
20. 4. 3. Inhibarea aglutinării
Reacţia constă în inhibarea aglutinării particulelor „încărcate” cu Ag, după ce în prealabil Ac
reacţionează cu Ag corespondent. Se utilizează de ex. pentru decelarea mioglobinei sau în
diagnosticul imunologic al sarcinii.
20. 4. 4. Aglutinarea în coloană
Metoda permite o mai bună vizualizare a reacţiei. Dispozitivul utilizat are 2 compartimente,
partea în care se introduc reactivii (situată superior) şi o coloană situată inferior, plină cu
microparticule de sticlă. După introducerea hematiilor şi a serului de cercetat şi „incubarea”
264
acestora, dispozitivul este centrifugat. În cazul unei reacţii pozitive complexul Ag-Ac se va putea
vizualiza la nivelul coloanei, în timp ce în cazul unei reacţii negative, hematiile se depun în
porţiunea inferioară a coloanei.
20. 4. 5. Aglutinarea mediată de Ac anti-imunoglobuline
Anticorpii anti-Ig se vor cupla cu particule „încărcate” cu Ac şi vor duce la apariţia unor
aglutinate (prin apariţia complexului imun). Se utilizează spre exemplu în decelarea factorului
reumatoid (tehnica Waaler-Rose).
Vom prezenta atât exemple de utilizare a reacţiei de aglutinare în diagnosticul direct cât şi în
diagnosticul indirect (serologic). Reamintim faptul că în cadrul diagnosticului de laborator
serologic se va determina prezenţa (sau se va dovedi absenţa) Ac necunoscuţi, în serul
pacientului respectiv, utilizând Ag cunoscute. În diagnosticul serologic, de regulă, trebuie să
putem răspunde la esenţiale: există anticorpi în serul pacientului investigat?
care este titrul anticorpilor? cum evoluează în dinamică (în timp) acest titru? În acest scop vom
realiza minim două determinări diferite la un interval de 7-10 zile (pentru majoritatea infecţiilor
care pot fi diagnosticate astfel). În acest capitol vom discuta atât exemple de reacţii serologice
calitative cât şi exemple de reacţii serologice cantitative.
265
toate direcţiile, pentru a favoriza contactul dintre cei 2 reactanţi şi unirea complexelor Ag-Ac
mici, solubile, pentru a forma reţele de complexe Ag-Ac. În cazul reacţiei pozitive
(corespondenţă între Ac cunoscuţi şi Ag pe care dorim să îl identificăm) picătura „se limpezeşte”
şi apar grunji de aglutinare. Este indicat să citim reacţia pe fond negru. De cele mai multe ori
citirea se face cu ochiul liber însă în cazul unor aglutinate de dimensiuni foarte mici poate fi
necesar să folosim o lupă, un microscop sau un aglutinoscop. Pentru identificarea diferitelor
microorganisme există scheme care orientează etapele de urmat (tabelele şi schemele
respective se livrează de către producători împreună cu serurile cu Ac specifici). Lamele pe care
se fac reacţiile de aglutinare, după terminarea reacţiilor se introduc în amestecul dezinfectant.
În cadrul lucrărilor practice vor fi discutate aglutinările pentru identificarea E.coli, Salmonella
spp. până la nivel de specie (conform clasificării Kauffmann-White) şi respectiv a grupurilor de
Shigellaspp . Tot prin aglutinare directă se mai pot identifica tulpini de Vibriocholerae ,
Haemophilusinfluenzae tip b, tulpini de Brucellaspp., tulpini de E.coli entero-patogen, iar în
cazul leptospirelor şi unor rickettsii apariţia aglutinării trebuie verificată cu ajutorul
microscopului.
Reacţii de aglutinare indirectă se pot utiliza pentru detectarea în p.p. a streptococilor de gru p A
sau B, pneumococilor, meningococilor, E.coli tip capsular K1, H.influenzae tip capsular b,
pentru detectarea unor enterotoxine (stafilococice, clostridiene etc), pentru detectarea unor
fungi (Cryptococcusneoformans, Candidaalbicans , Aspergillusspp.) sau a unor virusuri. Tot prin
tehnica de aglutinare indirectă se pot identifica exotoxine în filtratul de cultură, streptococii de
grup A-D, E.coli O:157, Legionellapneumophila , Listeriamonocytogenes etc.
20. 5. 1. 2. Aglutinarea în tuburi
Tehnica de aglutinare în tuburi se poate folosi pentru confirmarea unui rezultat pozitiv la
aglutinarea pe lamă sau atunci când rezultatul unei aglutinări pe lamă nu este suficient de clar.
Vom avea la dispoziţie cultura pură de identificat care se va prepara diferenţiat în funcţie de
tipul de Ag pe care dorim să-l identificăm. Spre exemplu, dacă încercăm să identificăm Ag de tip
O iar bacteria
cultura ar putea1-2
se va menţine să prezinte şi Agpentru
ore la 100°C H sau Ag K (care arAgputea
inactivarea inhibadupă
de înveliş, aglutinarea
care secu
vaAg O) la
trece
realizarea aglutinării în tuburi (o procedură asemănătoare poate fi necesară şi în cazul tehnicii
de aglutinare pe lamă). Vom utiliza un şir de eprubete în care vom introduce Ac cunoscuţi, care
se vor dilua succesiv, binar, cu soluţie salină fiziologică. În tuburile respective vom adăuga o
cantitate echivalentă de suspensie Ag (spre ex., la 0,5 ml Ac vom adăuga 0,5 ml suspensie Ag).
Incubarea se va face diferenţiat, în funcţie de tipul de Ag pe care dorim să-l identificăm (ex. 20
ore la 52°C pentru identificarea Ag O).
Reacţia este pozitivă în cazul apariţiei aglutinatelor (grunjoase - în cazul prezenţei Ag O,
floconoase - în cazul prezenţei Ag H etc). Reacţia de aglutinare în tuburi permite şi verificarea
titrului la care are loc formarea complexelor Ag-Ac.
În diagnosticul
serul serologic,
de cercetat în mod obişnuit,
dar şi stabilirea reacţiile
titrului. Totuşi utilizate
există permit
şi câteva detectarea
exemple prezenţei
de reacţii Ac în
de aglutinare
calitative.
20. 5. 2. 1. Aglutinarea pe lamă
Reacţiile de aglutinare pe lamă Huddleson (în diagnosticul brucelozei) şi respectiv Kudicks -
Steuer (în diagnosticul tifosului exantematic) au intrat în istoria medicinii. Prima dintre reacţii o
utilizăm demonstrativ în cadrul lucrărilor practice, apariţia aglutinatelor fiind clară iar tehnica de
lucru foarte simplă. Sunt necesare următoarele materiale: lame de microscop curate, Ag
brucelos inactivat (colorat în violet), ser de cercetat. Pe o lamă de microscop depunem o
picătură din soluţia de Ag brucelos şi în imediata vecinătate a acesteia, o picătură de ser de
266
cercetat. Cu colţul unei alte lame amestecăm şi omogenizăm cei 2 reactanţi. Prin mişcări de
înclinare a lamei în toate direcţiile facilităm formarea complexelor Ag-Ac, în cazul în care în serul
de pacient sunt prezenţi Ac anti-Brucellaspp. Reacţia este pozitivă în cazul în care se remarcă
prezenţa aglutinatelor. Chiar şi în perioada în care această se utiliza în diagnostic, o reacţie
pozitivă pe lamă trebuia să fie confirmată prin aglutinare în tuburi.
Tehnica de aglutinare indirectă poate fi utilizată în diagnosticul serologic al infecţiilor produse
de Helicobacterpylori, Treponemapallidum (hemaglutinare pasivă) etc.
20. 5. 2. 2. Aglutinarea în tuburi
Tehnica de aglutinare în tuburi se poate folosi în diagnosticul serologic al brucelozei (reacţia
Wright), diagnosticul serologic al infecţiilor produse de Cryptococcusneoformans, diagnosticul
serologic
tifoide al febrei
a intrat tifoidemedicinii.
în istoria etc. Denumirea de reacţie Widal pentru diagnosticul serologic al febrei
Luând în discuţie diagnosticul serologic al febrelor enterice, inclusiv febra tifoidă, sunt necesare
următoarele: seruri recoltate (în dinamică) de la pacienţii la care se suspicionează acest
diagnostic, tampon fosfat salin, baie de apă cu temperatură reglabilă, Ag cunoscute (Ag O şi Ag
H). Se va lucra cu 2 rânduri de eprubete, un rând pentru detectarea prezenţei şi titrului Ac anti-
O, al doilea pentru detectarea prezenţei şi titrului Ac anti-H (pentru persoanele în convalescenţă
sau în cazul suspicionării stării de purtător vom încerca să identificăm în serul de cercetat Ac şi
titrul Ac anti-Vi, de ex. prin hemaglutinare pasivă).
Serul de cercetat, pentru fiecare rând de tuburi, va fi diluat cu tampon fosfat salin, în diluţii
binare. Dacă amestecul de ser de cercetat şi diluant va fi în cantitate de 0,5 ml, vom adăuga o
cantitate similară de Ag, câte 0,5 ml Ag O în primul rând de tuburi şi respectiv câte 0,5 ml Ag H
în al doilea rând de tuburi. Vom proceda în aşa fel încât să obţinem în primul tub o diluţie de
1/20, în al doilea tub 1/40 etc. Un tub va conţine doar un amestec de tampon fosfat salin şi
soluţie Ag (tub martor). După ce omogenizăm conţinutul tuburilor, vom incuba tuburile cu Ag O
timp de 20 ore la 52°C iar tuburile cu Ag H vor fi incubate timp de 2 ore la 52°C urmat de 10
minutese
Citirea la va
temperatura
realiza dupăcamerei.
incubare, comparând rezultatul din fiecare tub cu martorul pentru Ag.
Pentru evidenţierea reacţiei vom agita uşor tuburile. Aglutinarea H diferă de aglutinarea O.
Aglutinatul O este mai dens, mai grunjos, în timp ce aglutinatul H este mai floconos şi uşor de
disociat prin agitare. Ultimul tub care mai prezintă aglutinare vizibilă permite stabilirea titrului
reacţiei. În capitolul 38 vom relua acest tip de diagnostic şi vom discuta modalităţile de
interpretare.
267
Face parte dintre reacţiile al căror rezultat nu poate fi vizualizat fără un artificiu tehnic, în acest
caz utilizarea unui sistem hemolitic indicator. Motivul pentru care este necesar acest sistem
indicator se datorează faptului că Ag este fie sub formă macromoleculară fie este reprezentat
de corpi microbieni de dimensiuni foarte mici, iar complexul Ag-Ac format nu devine vizibil cu
ochiul liber. RFC a fost imaginată încă din anul 1901 de către Jules Bordet şi s-a perfecţionat
destul de mult de-a lungul timpului. Această reacţie este utilizată în peste 100 de sisteme Ag -Ac,
prin tehnici clasice sau tehnici care au suferit modificări, inclusiv introducerea micrometodelor
RFC.
Se utilizează de ex. Ag cunoscute, puse în contact cu serul testat (în care căutăm Ac) care este
decomplementat (prin încălzire la 56°C timp de 30 minute) şi cu o cantitate de de cobai
(alexină); dacă în serul cercetat există Ac, ei se vor cupla cu Ag formându-se complexe Ag-Ac, pe
care se ataşează , care se va consuma şi nu va mai acţiona în timpul doi (nu va mai produce
hemoliza). Într-un al doilea timp este adăugat un sistem hemolitic (substrat indicator) compus
din globule roşii de oaie (acoperite cu anticorpi IgG de iepure). Dacă globulele roşii nu sunt
hemolizate, înseamnă că a fost utilizat în cursul primului timp şi reacţia este pozitivă (Ac
prezenţi în serul de cercetat); dacă globulele roşii sunt hemolizate, înseamnă că nu s -a utilizat
care a rămas disponibil pentru a se ataşa de sistemul hemolitic, reacţia este negativă (nu sunt
prezenţi Ac în serul de cercetat).
Reacţia de fixare a complementului se poate folosi atât pentru identificarea Ag cât şi în
diagnosticul serologic. Pentru că nu urmează să discutăm pe larg prima variantă, vom enumera
doar câteva dintre exemple, RFC permiţând identificarea unor Ag rickettsiene, chlamydiene,
virale etc. În diagnosticul serologic, cea mai cunoscută metodă rămâne încă RFC Bordet -
Wasserman, utilizată încă în diagnosticul serologic al sifilisului.
Subliniem faptul că RFC este o metodă laborioasă, în care nu se admit erori tehnice, dar fiind
executată corect este foarte exactă, are o mare sensibilitate şi specificitate. Este de asemenea
una dintre metodele cu un mare grad de reproductibilitate.
Principiul RFC:
RFC se bazează pe proprietatea sistemului de a se fixa pe complexul imun Ag-Ac.
În prima fază a reacţiei se introduce serul de cercetat iar dacă acest ser conţine Ac specifici faţă
de Ag cunoscut se va forma un complex Ag-Ac, urmat de fixarea , care se va activa pe calea
clasică şi nu va mai fi „disponibil” pentru a se fixa pe sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac-
antihematie). În cazul în care serul de cercetat nu conţine Ac specifici faţă de Ag cunoscut, nu va
avea loc formarea unui complex Ag-Ac în prima etapă a RFC.
După introducerea în reacţie a sistemului hemolitic indicator, hematiile şi Ac -antihematie se vor
cupla, vor forma un complex imun iar „liber” se va fixa pe acesta. După fixare va urma
activarea şi respectiv liza hematiilor, hemoliza putând fi examinată cu ochiul liber.
Materiale şi reactivi necesari:
- serul de cercetat recoltat de la pacientul suspect sau o pereche de seruri, obţinute „în
dinamică”;
- seruri de referinţă (martor pozitiv şi negativ);
- Ag cunoscut (suspensie corpusculară sau soluţie coloidală, după caz);
- sistemul obţinut din ser proaspăt sau conservat recoltat de la cobai;
- sistemul hemolitic indicator format din
o hematii de berbec, soluţie 4%, valabil timp de o săptămână la 4°C şi
o ser hemolitic anti-hematii de berbec (obţinut prin injectări repetate de hematii de oaie la
iepurele de laborator, spălate cu soluţie salină fiziologică) titrat şi conservat la 4°C;
- baie de apă cu temperatură reglabilă;
268
- plăci cu godeuri, tuburi de hemoliză, pipete diferite etc.
Tehnica de lucru:
Aşa cum am menţionat, tehnica de lucru este laborioasă şi nu va fi prezentată în totalitate, în
cele ce urmează.
Serul de cercetat se va menţine 30 minute la 56°C, în baia de apă, pentru inactivarea propriu.
Aşa cum am menţionat anterior, principial, RFC are loc în 2 etape (Figura nr. 1):
o în prima etapă se pun în reacţie , serul de cercetat şi Ag cunoscut; există 2 posibilităţi: în
serul de cercetat , rezultând un complex Ag-Ac pe care se va fixa ; în serul
de cercetat , nu se formează complex Ag-Ac, rămâne liber;
o în a doua etapă se introduce în reacţie sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac anti-
hematie); există
hemolitic, lizează2hematiile
posibilităţi: a. nu este
şi observăm liber, hemolizei.
apariţia nu are loc hemoliza, b. se fixează pe sistemul
Toţi reactivii utilizaţi trebuie standardizaţi, respectiv se vor realiza:
o omogenizarea suspensiei de hematii cu eventuală etalonare prin spectrofotometrie;
o titrarea serului hemolitic;
o titrarea în prezenţa Ag;
o titrarea „bidimensională” a Ag şi a serului de referinţă.
În RFC „finală” se va proceda astfel:
o se diluează conform indicaţiilor din protocolul de lucru reactivii utilizaţi (serul hemolitic,
serurile de cercetat, Ag, serurile de referinţă, );
o se repartizează în godeurile corespunzătoare serurile de cercetat, Ag şi ;
o pe o placă separată se prepară martorii (martor pentru sistemul hemolitic, martor pentru ,
martor pentru Ag, 2 martori pentru serul de referinţă, martor sigur negativ);
o plăcile se introduc până a doua zi la 4°C;
o a doua zi, plăcile se menţin la 37°C timp de 30 minute;
o se adaugă în toate godeurile sistem hemolitic;
o se
o plăcile
pun se menţin
plăcile la 37°C
la 4°C, pânătimp de 30 minute;hematiilor.
la sedimentarea
Există anumite diferenţe între tehnicile cantitative şi cele calitative, dar principiile sunt aceleaşi.
Interpretare:
Iniţial se verifică rezultatele apărute pentru martori (fie că este vorba de o metodă cantitativă
sau calitativă); spre ex. în cazul metodei calitative, în tubul martor pentru serul de cercetat
trebuie să fie hemoliză, la fel ca şi în tuburile martor pentru Ag, şi ser sigur negativ. În tuburile
martor sigur pozitiv şi martor pentru sistemul hemolitic, nu trebuie să fie hemoliză.
În tuburile cu serul de cercetat, dacă apare hemoliza, înseamnă că iar testul este
(lichidul dinatunci
Testul este tub vacând
aveaînun aspectcu
tuburile roşu,
ser limpede).
de cercetat nu apare hemoliză, hematiile se
depun formând un „buton” în partea inferioară a tubului (în serul de cercetat ). Pentru
a stabili diagnosticul final, este necesar ca RBW să fie confirmată prin reacţii specifice (vezi
capitolul dedicat genului Treponema).
Control de calitate:
Cu privire la controlul de calitate am menţionat utilizarea martorilor, pentru fiecare reacţie.
În RFC utilizată în diagnosticul serologic, Ag cunoscut va fi ales în funcţie de suspiciunea de
diagnostic. RFC cantitativă se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infecţiilor produse de
269
Mycoplasmapneumoniae, Chlamydiaspp ., Rickettsiaspp., Treponemapallidum, Leptospiraspp.,
Borreliaspp., Brucellaspp., diferite virusuri etc.
În scopul creşterii sensibilităţii şi specificităţii se aleg proprietăţile Ag cunoscut, o anumită
temperatură „de incubare” (de ex. 4°C în loc de 37°C în RFC Kolmer) etc. Ac fixatori de apar
precoce în cursul bolii astfel încât identificarea prezenţei lor poate semnifica o infecţie acută sau
recentă.
Prezentăm câteva dintre posibilele direcții de cercetare pe care cititorul le poate evalua
deschizând următoarele link-uri:
http://highered.mcgraw-
hill.com/sites/0072552980/student_view0/chapter16/animation_quiz_1.html
http://www.cehs.siu.edu/fix/medmicro/cfix.htm
http://aje.oxfordjournals.org/content/94/4/351.short
http://pediatrics.aappublications.org/cgi/content/abstract/4/4/443
http://www.jci.org/articles/view/107949
270
La fel ca şi în cazul RFC, în reacţia de seroneutralizare (RSN) este necesar un artificiu tehnic
pentru a permite vizualizarea rezultatelor. În cazul RSN, Ag are o anumită proprietate biologică
(toxică, enzimatică) care poate fi blocată ( ) prin cuplarea cu Ac specific.
Neutralizarea efectului biologic respectiv se poate realiza doar în cazul în care determinantul
pentru toxicitate sau pentru activitatea enzimatică respectivă este acelaşi cu determinantul
antigenic (epitop).
Reacţiile de seroneutralizare ar putea fi utilizate în mai multe împrejurări, spre exemplu în:
· diagnosticul microbiologic direct
o identificarea Clostridiumperfringens prin metoda plăcilor semineutralizate (vezi anexa nr. 2 şi
capitolul 51);
o testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacteriumdiphteriae (test de seroprotecţie, vezi
anexa nr. 2);
o toxinotipia în cazul suspicionării unei toxi-infecţii alimentare cu Clostridiumbotulinum (vezi
anexa nr. 2 şi capitolul 50);
· diagnosticul serologic
o reacţia ASLO (vezi şi capitolul 28);
· prevenirea unor boli infecţioase prevenibile prin vaccinare şi evaluarea eficacităţii
vaccinale
o vaccinarea cu anatoxine (DTP, DT, dT, ATPA, ADPA; vezi şi anexa nr. 4);
o titrarea prezenţei Ac anti-toxine (difterică, tetanică etc);
o testarea prin IDR (intra-dermo-reacţie) a susceptibilităţii faţă de o anumită boală infecţioasă
care are la bază drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine. Intradermoreacţiile Schick
sau Dick, pentru a dovedi susceptibilitatea persoanei testate faţă de o infecţie difterică sau
scarlatinoasă au intrat în istoria medicinii.
· tratamentul / profilaxia unor boli infecţioase prin utilizarea de imunoglobuline specifice
omologe sau utilizarea unor seruri hiperimune heterologe.
Această reacţie poate fi utilizată în diagnosticul retrospectiv al unei infecţii streptococice sau
pentru confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice (împreună cu criteriile minore şi
majore de diagnostic). Reacţia ASLO determină titrul Ac anti streptolizină O (SLO).
Principiu:
Titrarea Ac anti-SLO se bazează pe faptul că SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure
sau de berbec. În cazul în care în serul de cercetat există Ac anti-SLO, acţiunea hemolitică a SLO
este neutralizată. Combinând diluţii din serul de cercetat cu o cantitate constantă de SLO vom
putea determina titrul ASLO.
Materiale şi reactivi
- ser de cercetat (saunecesari:
seruri „pereche”, recoltate la interval de 2 săptămâni);
- SLO liofilizată (standardizată de către producător);
- sânge defibrinat de iepure / berbec;
- soluţie salină izotonă, soluţie de rivanol 0,3%;
- eprubete, pipete gradate foarte curate;
- baie de apă, centrifugă etc
Tehnica de lucru:
Trebuie urmate toate indicaţiile din protocolul de lucru, respectiv
271
- se omogenizează suspensia de hematii;
- se îndepărtează inhitorii SLO din serul de cercetat (utilizăm soluţie de rivanol şi suspensie de
cărbune activ, realizăm o diluţie de 1/10 a serului care se va menţine 30 minute la 56°C);
- se realizează diluţiile de ser şi se repartizează în tuburile de reacţie (ser în diluţii succesive)
împreună cu SLO (în cantitate constantă, câte 0,5 ml / tub); combinarea serului de cercetat cu
SLO reprezintă prima etapă a reacţiei;
- se agită tuburile pentru omogenizare şi se menţin timp de 15 minute la 37°C;
- urmează a doua etapă a reacţiei ASLO, respectiv adăugarea suspensie de hematii (5%), câte
0,5 ml în fiecare tub;
- se agită pentru omogenizare şi se incubează timp de 45 minute la 37°C;
- se (temperatura
4°C centrifugheazăfrigiderului).
tuburile timp de 1 minut (1.500 rotaţii / minut) şi se menţin până a doua zi la
Interpretare:
Pornind de la o diluţie iniţială a serului de 1/10, după adăugarea tuturor reactivilor titrul
(numărul de unităţi ASLO) va fi 12, 50 în tubul următor, 100, 125, 166, 250, 333 etc în tuburile
următoare. Titrul reacţiei ASLO este dat de cea mai mare diluţie de ser la care lipseşte complet
hemoliza. Pentru zona noastră geografică se acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250)
unităţi ASLO. Există teste serologice şi pentru evidenţierea prezenţei şi titrului anticorpilor faţă
de alte structuri antigenice (de exemplu streptodornază, hialuronidază, streptokinază).
Control de calitate:
Ultimele 2 tuburi sunt reprezentate de tubul martor pentru hematii, în car e se verifică
rezistenţa hematiilor şi respectiv tubul martor pentru SLO în care se pun SLO şi suspensia de
hematii.
Există şi posibilitatea de a realiza o micrometodă ASLO, reacţia efectuându-se în plăci de
material plastic cu godeuri.
272
intrat IDR Dick, care permite testarea susceptibilităţii faţă de scarlatină (toxina este elaborată de
către streptococul de grup A lizogenizat) şi respectiv IDR Schick, care permite testarea
susceptibilităţii faţă de difterie (toxina este elaborată de către bacilul difteric lizogenizat).
o Ambele IDR se realizează similar din punct de vedere tehnic;
o Spre ex. în cazul IDR Schick se injectează în treimea medie a antebraţului, strict intradermic o
cantitate de 0,1 ml toxină difterică diluată corespunzător. În cazul în care în sângele persoanei
testate se găseşte o cantitate de Ac anti-toxină mai mare de 0,03 UAI / ml, toxina inoculată va fi
neutralizată şi nu va apărea nici o modificare la locul inoculării (lipsa eritemului semnifică faptul
că persoana testată nu este susceptibilă să facă difterie, în cazul în care se infectează cu un bacil
difteric toxigen). În cazul în care persoana respectivă nu prezintă Ac anti-toxină difterică, Ag
inoculat
22. va conduce
2. 3. Terapia la apariţiaspecifică
sau profilaxia unui eritem la locul de inoculare.
(imunoterapie pasivă)
• Administrarea de imunoglobuline specifice omologe, obţinute de la persoane imunizate
(natural sau artificial) faţă de o anumită maladie infecţioasă, de ex. în imunoterapia infecţiei cu
Clostridium tetani (tetanos) se pot administra intramuscular 3-6.000 UAI.
• Administrarea de seruri imune heterologe, obţinute prin hiperimunizarea cailor, în
tratamentul tetanosului, difteriei, botulismului etc.
Terapia bolilor în care mecanismul patogenic implică exotoxine trebuie instituită cât mai rapid,
deoarece exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci când se găsesc în circulaţie. Pe de altă
parte, administrarea de ser heterolog trebuie realizată numai în caz de necesitate (datorită stării
de hipersensibilitate care ar putea fi indusă şi care ar duce la reacţii adverse).
Reamintim că, în funcţie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul
urmărit există mai multe tipuri de reacţii Ag-Ac, şi anume:
· reacţii de precipitare
· reacţii de aglutinare
· reacţia de fixare a complementului (RFC)
· reacţii de seroneutralizare.
Dacă în cazul primelor 2 tipuri de reacţii vizualizarea se poate face direct (cu ochiul liber, cu
ajutorul unei lupe etc) în cazul RFC şi RSN este necesară utilizarea unor „sisteme indicator”. În
continuare vom discuta despre reacţiile Ag-Ac în care pentru interpretare este necesară
marcarea reactanţilor, ceea ce se poate face:
- izotopic (radio immunoassay, RIA);
- enzimatic (enzyme-linked immunoassay, ELISA);
- fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA);
- chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA) etc.
În prezent aceste metode sunt extrem de folosite având avantajul unei mari sensibilităţi, sunt
automatizate şi adaptabile la testări utile în toate disciplinele bio-medicale.
273
Inflamaţia este un proces fiziopatologic complex ce include: fenomene alterative,
fenomene de tip reactiv, vasculo-exudative şi proliferative (este vorba despre o reacţie tisulară
nespecifică, cu caracter de apărare locală) şi fenomene reparatorii. Inflamaţia are drept
principal scop limitarea acţiunii şi eventual neutralizarea „agentului agresor” (indiferent de
natura acestuia). Cu alte cuvinte, discutăm despre fenomenul inflamator şi în cadrul unor
„agresiuni” microbiene (bacteriene, fungice, parazitare, virale, prionice), dar inflamaţia
reprezintă un concept mult mai complex (apare în mult mai multe circumstanţe, decât în cele
infecţioase). (Figura nr. 1)
Inflamaţia poate interesa ţesuturi, organe, sisteme sau chiar întregul organism şi are drept
semne / simptome clasice, următoarele: tumor(umflare, edem), rubor(eritem, înroşire locală),
calor(temperatură crescută în zona în care evoluează fenomenul inflamator), dolor(durere),
însoţite sau nu de „ functiolaesa” (tulburări funcţionale mai ample sau mai puţin ample,
mergând până la impotenţă funcţională, de ex. imposibilitatea deplasării membrului inferior
datorită unei inflamaţii la articulaţia genunchiului, în cadrul unei infecţii diseminate cu Neisseria
gonorrhoeae).
Există o mare diversitate de „agenţi determinanţi” ai unui proces inflamator, printre
aceştia putând fi enumeraţi:
- diferiţii agenţi fizici (radiaţii, frig, căldură, curent electric, traumatisme etc.);
- microorganismele (prioni, virusuri, bacterii, fungi, paraziţi);
- agenţii chimici exogeni, unii încă necunoscuţi până în acest moment, dar exemplificarea
încearcă să dea în primul rând sensul diversităţii şi să explice faptul că fenomenul inflamator
poate fi determinat de foarte multe substanţe dintre care vor fi enumerate doar câteva,
exogene (ex. ulei de croton, terebentină, caolin, dextran etc) şi / sau endogene (uree, acizi biliari
etc.), care produc leziuni la nivelul sediului eliminării lor din organism pe alte căi decât cele
fiziologice (de exemplu în situaţia apariţiei unui reflux bilio -gastric).
Indiferent de „agentul determinant”, în urma acţiunii acestuia va putea apărea o afectare a
vaselor mici, a ţesutului colagen (noţiune foarte importantă pe care o vom reîntâlni în cadrul
discutării diferitelor maladii, cu sau fără o determinare precizată), a proteinelor interstiţiale etc.,
rezultând astfel eliberarea şi de cele mai multe ori activarea unor mediatori şi a unor enzime.
Acestea din urmă pot fi considerate mecanismelele de declanşare sau „trigger” pentru procesul
inflamator.
În rezumat, inflamaţia reprezintă reactivitatea diferitelor structuri ale organismului, structuri
care aparţin diferitelor reţele informaţionale (de exemplu reţeaua imună ce include organe ale
sistemului imun, celule ale sistemului imun, substanţe sintetizate şi eliberate în cursul reacţiilor
imune, inter-relaţii mediate celular sau umoral etc) ce declanşează diferite tipuri de răspunsuri
care urmăresc, cel puţin în stadiile iniţiale, să realizeze o reechilibrare şi „aducere la normal”, la
situaţia anterioară intrării în contact cu „agentul agresor”. Dintre variantele de posibile reacţii
putem să amintim:
Rezultatul acestei reactivităţi este reprezentat de ex. de apariţia exsudatului inflamator (care
poate fi examinat prin metode de laborator).
274
Aşa cum am menţionat mai sus, toate aceste fenomene sunt declanşate pentru neutralizarea
activităţii „agentului determinant” (al inflamaţiei). Fenomenele vasculo-exsudative, la fel ca şi
exsudatul inflamator, încearcă să limiteze efectele produse de agentul pro -inflamator şi să
împiedice extinderea procesului inflamator spre zonele învecinate sau la nivelul întregului
organism. În cazul în care aceste activităţi au succes, alte fenomene vor conduce la asanarea
focarului inflamator. Aceste fenomene, în ansamblu, pot determina:
- vindecarea anatomică în totalitate ( restitutioadintegrum),
- vindecarea însoţită de cicatrizare sau
- cronicizarea inflamaţiei.
Aşa cum am aminitit, procesul inflamator este un proces fiziopatologic. Cel mai frecvent există
tendinţa
care către vindecarea
sistemele ţesuturilor
de control sunt lezate. Inflamaţia
dezorganizate sau atuncidevine un fenomen
când procesul patologic
inflamator se în cazul în
cronicizează.
Modificările fiziopatologice apar independent de cauza inflamaţiei sau, cu alte cuvinte,
indiferent de „agentul determinant”. Chiar dacă acesta este reprezentat de un traumatism prin
compresiune, o înţepătură sau o tăietură (de ex. cu un instrument chirurgical), o arsură
(indiferent de procentul de tegument afectat), de bacterii, virusuri, paraziţi, sau este vorba de o
necroză (mortificare) tisulară care apare în cursul dezvoltării unui neoplasm (cancer) sau în
urma apariţiei metastazelor tumorii primare, în cursul procesului inflamator va rezulta sinteza şi
eliberarea reactanţilor de fază acută (RFA).
Diferitele particularităţi structurale ale organismului gazdă sau ale unui anumit ţesut ar putea
explica (parţial) diversitatea fenomenelor inflamatorii identificate ca fiind produse de către
acelaşi agent etiologic. Spre exemplu, Salmonellaenteritidisserotipul typhimuriumproduce
inflamaţii proliferative la nivelul sistemului limfatic şi respectiv inflamaţii exsudative în
parenchimul pulmonar. Mycobacteriumtuberculosis, agentul etiologic al tuberculozei, produce
inflamaţii alterative (la nivel pulmonar), inflamaţii exsudative (la nivel pleural) sau inflamaţii
prezenţei
realizăm unacestor celule (de ex.primul
şi în într-orând
inflamaţie
căutămdesănatură infecţioasă apărută la nivel faringian,
identifică , astfel
având o informaţie care susţine ipoteza unei infecţii bacteriene) poate fi foarte utilă. PMN şi
macrofagele sunt atrase de moleculele chemotactice şi migrează direcţionat de aceste molecule
prin procesul de diapedeză, iar la locul inflamaţiei fagocitează, endocitează, secretă enzime
lizozomale şi generează anioni superoxid. Pe de altă parte, leucocitele PMN şi macrofagele
prezintă receptori specifici de suprafaţă pentru componenta C5a a sistemului complement,
pentru CCF (crystal-inducedchemotacticfactor) şi LTB4 (leucotriena B4), precum şi pentru
peptidele din factorii chemotactici. Aceste peptide servesc cuplării PMN-factor chemotactic şi
astfel fagocitele se îndreaptă spre locul unde acesta a fost produs. Ajungând la nivelul respectiv,
275
PMN sau macrofagele îşi pierd configuraţia rotundă, devin oarecum triunghiulare, cu baza spre
factorul chemotactic. Pentru ca modificarea de formă să fie posibilă, are loc o rearanjare a
elementelor din citoschelet, microtubulii generează o polarizare „faţă-spate”, filamentele de
actină se acumulează în faţa şi în spatele celulei. Se asigură astfel forţele necesare deplasării
(motilitatea celulară depinde de polimerizarea monomerilor de actină în filamente de actină).
(Figura nr. 2)
Fagocitarea „agentului determinant” al procesului inflamator (de ex. o structură bacteriană)
este favorizată de opsonizare. Materialul fagocitat este inactivat la nivelul fagolizozomilor
(atunci când acest lucru este posibil) şi / sau transformat în superantigen cu rol în declanşarea
unor cascade de reacţii imune. Până în acest moment, sistemul complement a reprezentat
elementulînesenţial,
rezultate cascadafie că a fost activatparticipă
complementului pe cale directă sau pesecreţiei
la stimularea cale alternă. Fragmentele
macrofagice (mediatori ai
răspunsului inflamator acut).
Activitatea leucocitelor PMN este facilitată şi de prezenţa unei întregi game de proteine active
de tipul moleculelor de adeziune celulară (selectine, integrine, ICAM-1 (intercellularadhesion
molecule), ELAM-1 (endothelialcellleucocyteadhesionmolecule ), GMP-140, adezine, LECAM-1
(leucocyteendothelialcelladhesionmolecule ), ISCOM (immunostimulatingcomplex), PAF, MAC
(membraneatackcomplex), MACIF (MACinhibitoryfactor), precum şi o serie de proteine
sintetizate şi eliberate de ficat drept reactanţi de fază acută (RFA). Dintre RFA am putea
menţiona: (PCR este secretată în mod predominant de ficat şi ţesuturile
adipoase ca răspuns la stresul inflamator şi este reglat, în mare parte, de interleukina -6.
Valoarea semnificativă pentru prezenţa inflamaţiei este de 1mg/dl sau mai mult. Fiind de
încredere şi uşor de dozat, este foarte utilizată în practica medicală ca metodă de screening şi
monitorizare a inflamaţiei, însă nu trebuie să uităm ca PCR poate fi crescută şi în sarcină sau în
arsuri etc). (1)
Alți RFA sunt:a2-macroglobulina, a1-antitripsina, a1-antichimotripsina, ,
haptoglobina,
caractere hemopexina,
speciale RFA care ceruloplasmina, componenta
se testează mai frecvent C3 şi amiloidul
în practică, P seric. Am subliniat cu
în ţara noastră.
Aceste proteine de fază acută mediază procesul inflamator, în cursul căruia se şi consumă.
Majoritatea sunt glicoproteine sintetizate de ficat (mici cantităţi sunt sintetizate şi de către
macrofage). Rolul RFA nu este pe deplin elucidat. Se cunoaşte, totuşi, că o serie de RFA sunt
implicaţi atât în procesele de necrobioză cât şi în cele de remaniere tisulară.
Informaţii cu privire la existenţa unui proces inflamator putem obţine şi verificând valoarea
.
„anse
singurădecelulă,
tip feed-back”
în timp ceendocrine
o singură şi autocrine,
citokină poatecare sporesc
acţiona sinteza
asupra maide citokine
multor de către
celule. o nr.
(Figura
6)
Spre exemplu, IFN-g(sintetizat şi eliberat de limfocitul T) are cel puţin trei acţiuni importante şi
anume: deviază sinteza la nivelul măduvei osoase hematopoietice spre linia monocito-
macrofagică, activează exprimarea Ag HLA de clasa a II-a la nivelul membranei macrofagelor şi
creşte puterea de fagocitoză a sistemului MM în vederea fagocitării atât a actualelor antigene,
cât şi a viitoarelor complexe imune ce se vor constitui în cursul procesului inflamator.
Aproape simultan, celulele endoteliale reacţionează eliberând diferiţi produşi de secreţie,
precum endotelinele (ET) şi EDRF (endothelium-derivedrelaxingfactor ). „Jocul” dintre cele două
276
proteine vasoactive condiţionează pentru un timp aportul local de oxigen şi nivelul acidozei.
Iniţial se eliberează local factorii vasodilatatori (EDRF) şi NO, care au drept scop creşterea
fluxului sanguin local, cu creşterea atracţiei de celule ale răspunsului imun la locul impactului cu
”agentul determinant” al procesului inflamator. EDRF este rapid inactivată de hemoglobină şi de
substanţe antioxidante (care apar în urma stimulării activităţii PMN dar şi datorită prezenţei
eritrocitelor).
Pe măsură ce debitul sanguin local creşte (determinat de sistemul kinină / bradikină), creşte şi
sinteza de EDRF (EDRF are însă o „viaţă” de numai 6-10 secunde). Vasodilataţia locală se
dezvoltă până în momentul în care celulele endoteliale, fiind comprimate de edemul
perilezional, încep să sintetizeze şi să elibereze local endoteline (ET), în special ET1. Această
endotelină
foarte (caretocmai
intensă, are depentru
asemenea o „viaţă”
scăderea foartesanguin
debitului scurtă)şiinduce vasoconstricţie
limitarea amplitudinii brutală şi
răspunsului
inflamator local (endotelina este considerată cel mai puternic vasoconstrictor din organism).
Rezultatul etapei de declanşare este reprezentat de , manifestat prin
vasodilataţiecapilară(eritem, înroşire), exsudareaproteinelorplasmatice (edem) şi acumulare
deleucocitePMN.
, care la rândul ei se subîmparte în trei subetape:
A) Subetapamoleculară, în care se activează:
- cascada complementului;
- sistemul de coagulare-fibrinoliză;
- diferitele căi de metabolizare ale acidului arahidonic (care provine din peretele bacterian în
urma scindării date de fosfolipază), respectiv: calea ciclooxigenazei prin care rezultă
prostaciclină (PGI) care determină vasodilataţie, inhibă agregarea trombocitelor şi aderarea
PMN, prostaglandină (ex. PGE2) şi tromboxan (TxA2) care determină agregare plachetară, are
efect vasoconstrictor şi de creştere a permeabilităţii capilare); calea lipooxigenazei, care duce
la apariţia leucotrienelor, de exemplu LTD4, LTG4(care determină bronhoconstricţie,
vasoconstricţie
(Figura sistemică,
nr. 7, Căile vasodilataţie
ciclooxigenazei la nivelul microcirculaţiei) şi calea epooxigenazei;
si liopooxigenazei)
- sistemul kinină-bradikinină;
- familia citokinelor;
- superfamilia interferonilor;
- sistemul extracelular „gunoier” al actinei. Actina este o proteină care se găseşte în cantităţi
mari şi este responsabilă pentru motilitatea celulară, schimbarea formei şi mărimii celulelor
(care depinde de proprietatea monomerilor de a polimeriza). După apoptoză, actina eliberată
are tendinţa de a polimeriza, ducând la apariţia de filamente de actină în vase, cu un rezultat
catastrofal (de exemplu în şocul septic, necroza hepatică etc). Există însă şi un mecanism
homeostatic ce are la bază două proteine plasmatice, gelsolina şi proteina Gc (care sunt
depăşite însă din punct de vedere funcţional în distrugerile masive).
B) Subetapavasculară, în care au loc modificări ale calibrului vaselor mici, ale vitezei de
circulaţie a sângelui, ale permeabilităţii vaselor mici din aria tisulară lezată. Iniţial se produce
vasoconstricţie, în decurs de secunde / minute (are loc un aflux masiv de celule sanguine
proinflamatorii - neutrofile, monocite, eozinofile - sub acţiunea unor mediatori solubili eliberaţi
dinvasculare
a) zona tisulară afectată,
(dilataţie care produc două
arteriolocapilară categorii
cu creşterea de efecte:de capilare active, hiperemie,
numărului
stimularea expresiei pe celulele endoteliale din zonă a unor receptori de adeziune intercelulară
astfel încât celulele sangiune recrutate vor adera la endoteliul vascular prin cuplaj receptorial şi
în final o fază de stază vasculară pasivă, cu hipoxie şi creşterea permeabilităţii vaselor mici) şi
b) chemotactice (celulele proinflamatorii sunt atrase către ţesutul lezionat şi activate
metabolic)..
C) Subetapaexsudativă, în care se formează exsudatul inflamator (plasma exsudată, bogată în
proteine şi LDH) la care se adaugă elementele figurate extravazate, elementele celulare
mobilizate local şi produşi rezultaţi din diferite modificări locale. Prin constituenţii săi celulari şi
277
moleculari, exsudatul asanează focarul inflamator şi tinde să blocheze procesul infecţios la
poarta de intrare, constituind bariera fibrino-imuno-leucocitară.
Consecinţele activării mecanismelor implicate în procesul inflamator
În funcţie de cascadele activate poate rezulta un anumit tip de inflamaţie. Putem lua în discuţie
diferitele forme clinice evolutive (acută, subacută, cronică) precum şi formele anatomoclinice.
Evoluţia spre cronicizare se datorează agenţilor inflamatori care au proprietatea de a
stimula în special sistemul efector timodependent, autoantigenelor sau persistenţei stimulului
inflamator.
Inflamaţia cronică este din ce în ce mai mult privită nu numai ca o consecinţă a unui risc
infecţios continuu, dar şi ca o parte integrantă a multor boli neinfecţioase, cum ar fi disfuncţiile
autoimune,
Astfel, diabetul
nu este sau bolile
surprinzător cardiovasculare
că unele etc.
sisteme hormonale, cum ar fi sistemul renină-angiotensină
(SRA), care a fost descris prima dată în contextul bolilor cardiovasculare, s-a dovedit a fi factorul
major de reglare a răspunsului inflamator. (4) (Figura nr. 8)
Evoluţia spre vindecare presupune:
- asanarea focarului inflamator (începe concomitent cu constituirea barierei fibrino-leucocitare
şi cu îndepărtarea resturilor celulare şi a eventualelor microorganisme care sunt „agenţi
determinanţi”); devine maximă după acumularea de leucocite PMN şi macrofage.
- vindecarea propriu-zisă începe relativ rapid în cursul procesului inflamator; vindecarea începe
aproape concomitent cu fenomenele distructive, pe care tinde să le înlocuiască pentru a
conduce la una dintre variantele evolutive menţionate anterior.
Varianta cea mai favorabilă este reprezentată de vindecarea completă, anatomică (numită şi
„restitutioadintegrum”). Cealaltă posibilitate este reprezentată de evoluţia spre apariţia unei
cicatrici (cicatrizarea). Cicatrizarea apare în cazul unor inflamaţii însoţite de fenomene lezionale
întinse, pierderi de ţesut şi eventual de infecţii şi cronicizarea infecţiei.
Aspecte anatomo-clinice:
apărute după
Brucella infecţii cu
sau datorate Mycobacteriumtuberculosis,Treponemapallidum,
prezenţei diferite specii de
unui corp străin). (Video nr. 1, Inflamaţia acută
http://www.youtube.com/watch?v=yQwxHmn6tvw); (Video nr. 2, Răspunsul inflamator
http://www.youtube.com/watch?v=aIzE-XsBrcg-)
278
(pyrexia) este un semn şi simptom medical caracterizat de creşterea temperaturii
corpului o anumită valoare (ex. peste 37,8°C; însă este important de cunoscut valoarea
temperaturii bazale, pentru fiecare subiect) datorită stabilirii unui alt punct de echilibru la
nivelul centrului reglator din hipotalamus. Se acompaniază de creşterea tonusului muscular,
tremurat (frison) şi paradoxal, de senzaţia de frig. Senzaţia de cald apare odată ce noua
temperatură de echilibru este atinsă. Etimologia termenului este dublă: din grecescul pyretos
(foc)şi din latinesculfevris(febră).
Febra este o dovadăa funcţionării sistemului imun, deoarece prin această modificare de
temperatură, organismul încearcă “să distrugă” bacteriile şi virusurile. Dar infecţiile nu sunt
singurul mecanism declanșator al febrei.
De obicei
care nu este nevoie
temperatura de tratament
crește foate mult sauantipiretic. Acesta pacientului.
pentru confortul se administrează doar în cazurile în
Hipertermia, spre deosebire de febră, nu presupune un nou punct de echilibru, ci depăşirea
capacităţii de termoreglare (ex. o zi în soare înnăbuşitor fără consum adecvat de lichide) sau
supraîncălzirea (ex. după un efort fizic foarte intens).
Temperatura se măsoară clasic la nivel anal, la nivel axilar, în cavitatea bucală, sau la nivel
auricular. Vorbim despre febră dacă temperatura intrarectală depăşeşte 37,5 -38,3°C și/sau cea
din cavitatea bucalădepășește 37,7 °C (”în mare” vorbim de subfebră între 37-38°C şi de
febrăpeste 38°C).
Persoanele maiîn vȃrsta au o abilitate scăzută de a genera caldură, astfel că și o temperatură nu
foarte crescută poate fi expresia unei afecțiuni grave.
Cauze posibile de febră ar fi: hemoragia intracraniană, administrarea anumitor medicamente,
boli ale țesutului colagen, distrucţii tisulare de diverse cauze (traumatisme, intervenţii
chirurgicale, iradieri, arsuri, infarcte), neoplazii, hemopatii maligne,reacţii ”alergice”, conflicte
de ordin psihologic, probleme neurologice, endocrine, metabolice sau pot fi de cauză iatrogenă
(de cauză medicală).
Pirogenii endogeni sunt citokinele. Il-1; Il-6; TNF-αsunt pirogeni majori. Alţi pirogeni: Il-8,
macrophage
Febra inflammatory
evoluează în 3 stadii: protein-α, IFN α, βsi γ.
a) : stadiul de creştere a temperaturii, de la cȃteva minute la cȃteva ore, zile
sau săptămȃni.
b) stadiul de temperatura maximă reprezintă perioada de apogeu a
temperaturii.
c) stadiul de scădere a temperaturii, de declin sau defervescenţă se
caracterizează prin creşterea termolizei.
Iată tipurile de febră, fiecare patologie caracterizȃndu-se prin una din urmatoarele:
. Orice stare febrilă care persistă mai mult de trei săptămȃni reprezintă o febră
279
prelungită.
este o febră ridicată în care diferenţa dintre temperatura matinală şi cea
vesperală timp de mai multe zile nu depăşeşte 1 grad C. Ea este întȃlnită în pneumonia francă
lobară, febra tifoidă (în perioada de stare a bolii), tifosul exantematic, osteomielită etc.
este febra ce se caracterizează prin aceea că diferenţa dintre temperatura
matinală şi cea vesperală depăşeşte 1 grad C. Ea apare în septicemii, supuraţii pulmonare,
tuberculoza pulmonara gravă, în perioada a doua a febrei tifoide.
se caracterizează printr-o alternanţă în timp de 24 de ore a temperaturii
normale cu febră mult ridicată. Cȃnd oscilaţiile devin foarte mari (ex. 3-5 grade C pe parcursul a
24 de ore) febra foarte ridicată oscilȃnd cu temperatura normală sau chiar subnormală vorbim
de . Ea apare în
evoluează cusupuraţiile pulmonare,
febră ridicată infecţii
şi continuă timp urinare şi unele
de 5-8 zile septicemii
alternȃnd etc.
cu perioade
afebrile. Ea apare în limfogranulomatoza malignă, tuberculoza pulmonară, infecţii urinare sau
biliare, leptospiroze etc.
este o variantă de febră recurentă caracterizată prin faptul că ascensiunile
termice survin la intervale foarte variate şi îmbracă caracter de puseuri (o întȃlnim în colangite,
pielite, carcinom şi unele forme de tuberculoză etc.).
este caracterizată prin ascensiuni termice ce se repetă periodic. Ridicarea
temperaturii este progresivă, iar defervescenţa este lentă pȃnă la afebrilitate sau subfebrilitate
urmată de cicluri repetate.
este febra în care temperatura matinală este mai ridicată decȃt cea vesperală.
Apare în tuberculoza pulmonară gravă, supuraţii profunde şi inflamaţii cavitare etc.
se referă la febra care nu poate fi încadrată în nici unul din tipurile descrise şi
care nu poate fi descrisă așa cum s-a menționat mai sus. (3)
este luată în considerație atunci când, după 1 săptămână de
încercări în a pune diagnosticul și a stabili etiologia febrei (clinic, paraclinic, alte metode de
VSH reprezintă rata la care sedimentează hematiile dintr-o probă de sȃnge cu anticoagulant,
într-o oră. Ȋn mod normal hematiile dintr-o probă de sȃnge sedimentează lent datorită
încărcăturii de suprafaţă negative a acestora, care face ca celulele adiacente să se respingă cȃnd
distanţa intercelulară scade sub un nivel minim. Ȋn anumite afecţiuni care determină creşterea
proteinelor de fază acută (alfa-globuline, fibrinogen) sau creșterea valorii imunoglobulinelor,
proteinele plasmatice se ataşează pe suprafaţa hematiilor şi reduc potenţialul de suprafaţă
determinȃnd agregarea hematiilor şi creşterea sedimentării acestora.
Care sunt recomandările efectuării acestui test?
VSH poate fi folosit ca test screening în suspiciunea unor reacţii inflamatorii, infecţii, boli
autoimune, discrazii plasmocitare, dar şi pentru monitorizarea evoluţiei şi tratamentului în
anumite boli (ex. arterită temporală, polimialgie reumatică, artrita reumatoidă, reumatism
articular acut, lupus eritematos sistemic, boală Hodgkin, tuberculoză, endocardită bacteriană).
De reţinut şi
Sȃngele se recoltează ajeun (pe nemȃncate) sau postprandial (după masă) pe anticoagulant
(vacutainer cu dop negru cu citrat de sodiu 3,8 % tamponat). După prinderea venei se desface
garoul pentru a nu liza hematiile. Să nu uităm că o masă lipidică poate determina alterări
280
plasmatice şi modifică şi VSH-ul. Se va recolta cȃt permite vacuumul; raportul
sȃnge/anticoagulant trebuie să fie 4/1.
Pentru citire se folosesc 2 metode:
1. metoda Westergren: se aşează tubul în poziţie verticală într-un suport gradat milimetric şi se
citeste nivelul de sedimentare a hematiilor în mm după 1 oră; în unele teste este citit rezultatul
şi după un interval de 2 ore, dar aceasta nu furnizează informaţii suplimentare. (Figura nr. 3)
2. Metoda automată (cititor automat de VSH)
Probaestestabilătimpde2 orela temperatura camerei (18-26o C): testul ar trebui efectuat la
cel mult 2 ore după recoltare. Dacă este ratată citirea la 1 oră, sȃngele nu poate fi remixat şi
refolosit pentru VSH. Testul trebuie efectuat la temperatura camerei.
o
La 2-8 C îşi menţine
temperatura camereistabilitatea 12 ore; dacă
înaintea efectuării sȃngele a fost refrigerat, trebuie reechilibrat la
testului.
a. În menstruație: VSH creşte în timpul ciclului menstrual, atingȃnd nivelul maxim în faza
premenstruală şi scăzȃnd în timpul menstruaţiei.
b. În sarcină: VSH-ul creşte continuu începȃnd cu a 4-a săptămȃnă de sarcină pȃnă în a 3-a
săptămȃnă postpartum şi atinge un nivel maxim de pȃnă la 45 mm/h în prima săptămȃnă
postpartum.
c. la nou-născuţi: VSH-ul este scăzut datorită hematocritului crescut şi nivelului scăzut de
fibrinogen.
d. la femei vȃrstnice (70-89 ani) aparent sănătoase VSH poate atinge valori de pȃnă la 60 mm/h.
a. Refrigerarea sângelui;
b. Anemia: datorita numărului scăzut de eritrocite; în anemia feriprivă creşterea VSH nu
corespunde numărului de eritrocite deoarece microcitoza concomitentă încetineşte
sedimentarea
c. Macrocitoza.;hematiilor;
d. Medicamentele: contraceptive orale, dextrani (datorită absorbţiei pe suprafaţa eritrocitelor),
anticonvulsivante, carbamazepină, cefalotină, ciclosporină A, dexametazonă, etretinat,
fluvastatin, hidralazină, indometacin, isotretinoin, sulfametoxazol, ofloxacină, lomefloxacină,
metisergid, misoprostol, procainamidă, propafenonă, quinină, zolpidem etc.
a. Temperaturi >20-24o C;
b. Hiperglicemia;
c. Hiperlipoproteinemia (în special chilomicronii);
d. Hipofibrinogenemia;
e. Policitemia;
f. Leucocitoza;
g. Prezenţa de eritrocite anormale: microcite, drepanocite, echinocite, poichilocite, stomatocite,
acantocite, sferocite (prin scăderea suprafeţei necesare pentru agregarea hematiilor);
h. Caşexia;
i.hidroxiclorochină,
Medicamentele: metotrexat,
aspirină, aur,antiinflamatorii
corticotropină,nesteroidiene,
ciclofosfamidă,penicilamină,
glucocorticoizi,
sulfasalazină,
tamoxifen, trimetoprim etc.
Concomitent, macrofagele dezvoltă o serie de activităţi şi anume: pregătesc superantigenul,
eliberează în circulaţie monokine şi îşi expun (la suprafaţa membranei) Ag HLA de clasa a II-a
(vezi și capitolul 11). (Figurile nr. 4 și 5)
281
Infecţia reprezintă un tip particular de relaţie între microorganismele condiţionat patogene şi
patogene pe de o parte şi organismul gazdă pe de altă parte. Pentru ca să se declanşeze un
proces infecţios şi să apară infecţia, microorganismele trebuie să pătrundă în organismul gazdă,
să depăşească barierele şi mecanismele de apărare, să-l colonizeze, să se multiplice şi eventual
să intre într-un lanţ de transmitere prin intermediul căruia poate contamina o nouă gazdă.
Procesul infecţios defineşte ansamblul relaţiilor stabilite între microorganism şi gazdă, apărute
după infecţie.
Starea de boală (manifestă clinic sau fără ca modificările apărute să fie exteriorizate şi
constatabile de către medicul clinician) se datoreşte interacţiunii dintre microorganism
(bacterie, parazit, virus, fung, prion) - gazdă şi este urmată de apariţia unor simptome (de ex.
temperatură peste 39ºC, cefalee, eliminarea unor scaune diareice etc.) şi de reacţii funcţionale
din partea gazdei (de ex. stare generală modificată, senzaţie de febră, frisoane, creşterea
numărului de respiraţii pe minut, creşterea numărului de bătăi cardiace pe minut etc). Infecţia
nu este urmată obligatoriu de starea de boală, putând fi inaparentă, subclinică sau latentă.
Poate apărea şi starea de purtător şi / sau eliminator de germeni.
Datorită infecţiei pot apărea, sau nu, manifestări foarte variate în funcţie de:
- agentul infecţios (factori de patogenitate, gradul de virulenţă);
- organismul gazdă (rezistenţa specifică şi nespecifică);
- mediul extern (factori geografici, climatici, sociali, economici etc).
Manifestări subclinice
a) Infecţia inaparentă nu se asociază cu semne sau simptome şi ar putea fi decelată numai prin
examene de laborator. Spre deosebire de infecţia latentă, infecţia inaparentă este limitată în
timp şi poate contribui la crearea unei stări de imunitate (ex. infecţia cu Neisseriameningitidis ,
infecţii cu Haemophilusinfluenzae etc).
b) Boala subclinică se deosebeşte de infecţia inaparentă prin apariţia unor tulburări funcţionale
(febră, transpiraţii, dureri etc) şi chiar a unor leziuni organice (de multe ori fără o
simptomatologie distinctă / specifică, dar există şi situaţii în care nu este decelat nici un
simptom, de exemplu în formele subclinice de hepatită virală acută).
c) Infecţia latentă este asimptomatică, agenţii patogeni putând persista timp îndelungat în
ţesuturile gazdei. După un timp variabil, infecţia latentă poate deveni evidentă clinic, de obicei
în urma acţiunii unor factori favorizanţi externi sau interni, proprii organismului (de exemplu
infecţia cu Mycobacteriumtuberculosis care este un microorganism condiţionat patogen,
infectează circa o treime din populaţia globului dar produce tuberculoză la circa 8 milioane de
persoane, pe an).
d) Starea de purtător de germeni se referă la bolnavul cu o stare infecţioasă, la persoana aflată
în convalescenţă, înainte de „eradicarea” infecţiei suferite dar şi la persoanele aparent
sănătoase care adăpostesc germeni patogeni (de exemplu Salmonellatyphi la nivelul veziculei
biliare,
purtătormicroorganismul putându-se
reprezintă atingerea „cantona”
unui echilibru la acest
relativ între nivel după verigi,
cele două o febrădetifoidă). Starea
multe ori fiindde
însoţită de eliminarea în mediu a germenilor care au produs infecţia şi se află în diferite focare
latente (precum în exemplul de mai sus, situaţie în care starea de purtător se elimină doar prin
extirparea veziculei biliare). De exemplu, în ţara noastră apar din când în când izbucniri
epidemice („outbreak”) de febră tifoidă, după inundaţii, dacă în zona respectivă există un
purtător de S.typhi, iar condiţiile igienico-sanitare pentru prevenirea transmiterii pe calea fecal-
orală nu sunt respectate. În cursul stării de purtător există teste biologice şi imunologice care
pot certifica prezenţa microorganismelor (direct, de ex. după cultivare sau amplificare genică şi
282
/ sau indirect).
Manifestări clinice
a) Infecţia locală, în care agenţii patogeni rămân cantonaţi la poarta de intrare şi în vecinătatea
acesteia, unde se multiplică (de exemplu în furunculul stafilococic, infecţia amigdaliană produsă
de streptococul piogen).
b) Infecţia de focar este o formă particulară a infecţiei locale. Evoluează cronic, cu manifestări
locale minime (acestea putând chiar lipsi), adesea însă cu tulburări la distanţă (subfebrilitate,
mialgii, artralgii etc.) a căror apariţie încă nu a fost complet explicată.
c) Infecţia regională cuprinde un teritoriu mai extins, de obicei aferent porţii de intrare, prin
afectarea vaselor limfatice şi a ganglionilor limfatici regionali (de exemplu, infecţia tuberculoasă,
cu Boala
d) producerea de manifestări
infecţioasă anatomo-clinice
cu manifestări şi paraclinice
clinice la nivelul întreguluirelativ caracteristice).
organism (sistemice), în care
germenii patogeni diseminează pe cale circulatorie (bacteriemie) în diferite ţesuturi şi organe, la
distanţă de poarta de intrare sau de focarul infecţios primar. Se descriu două forme:
- boala infecţioasă ciclică, cu evoluţie regulată, în mai multe etape care se succed într -un timp
limitat, de exemplu febra tifoidă produsă de S.typhi.
- septicemia (conform nomenclaturii mai vechi) are evoluţie clinică neregulată, de obicei foarte
gravă, fiind definită prin existenţa unei porţi de intrare, a unui focar septic (detectat sau
suspectat), bacteriemiei şi a unor „metastaze” septice care pot deveni focare secundare; din
focarele secundare au loc descărcări secundate de germeni în circulaţie.
Drept definim prezenţa pasageră de germeni viabili în sânge. Bacteriemia nu duce,
de regulă, la apariţia de metastaze septice şi nici la apariţia unui tablou clinic manifest.
Bacteriemii pot apare de ex. după extracţii dentare sau intervenţii chirurgicale pe focare septice,
ca şi în multe dintre bolile infecţioase (exemplu în pneumonia cu pneumococ, meningita cu
meningococ etc; se explică astfel utilitatea recoltării de sânge pentru hemocultură, cu toate că
produsul patologic „principal” este reprezentat de spută în primul caz şi lichid cefalorahidian în
al doilea
În caz).de faţă, s-a decis utilizarea noţiunii de
momentul entitate care reuneşte existenţa unui
proces infecţios şi respectiv existenţa răspunsului inflamator sistemic. Starea de sepsis include
prin definiţie două sau mai multe din următoarele elemente:
283
ţesuturile gazdei, de exemplu în bruceloză.
Poarta de intrare
Pentru a produce infecţia (după parcurgerea etapelor menţionate anterior privind „definiţia”
infecţiei) şi a invada organismul gazdă după multiplicare sau prin intermediul unor produse
toxice specifice (ex. exotoxine), fiecare microorganism patogen utilizează una sau mai multe căi
de pătrundere. Spre exemplu, vibrionul holeric ( Vibriocholerae) pătrunde pe cale digestivă (ex.
consum de apă contaminată), se multiplică şi produce manifestările caracteristice la nivel
intestinal (rolul esenţial revenind toxinei holerice) etc.
Difuzarea în organism a microorganismului patogen de la poarta de intrare se realizează în
diferite moduri şi pe mai multe căi:
- extindere
grup A; locală în suprafaţă, ex. în cazul erizipelului produs de streptococul beta -hemolitic de
- extindere în profunzime, ex. în miozita produsă de Clostridiumspp. (C.septicum,sporogenes,
histolyticum etc.);
- extindere regională;
- diseminare sanguină, de exemplu în febra tifoidă (produsă de Salmonellatyphi);
- diseminare pe cale nervoasă, de exemplu în infecţia cu virusul rabic.
Perioadele bolii infecţioase:
- Incubaţia reprezintă intervalul de timp din momentul infectării până la apariţia primelor semne
şi simptome ale bolii; durata incubaţiei variază în limite relativ stabile (ex. 1 -5 zile în dizenterie,
circa 14 zile în febra tifoidă);
- Invazia este de obicei concomitentă cu debutul bolii, care poate fi brusc (în plină stare de
sănătate) sau lent progresiv; în momentul invaziei este posibil să „surprindem” prezenţa
bacteriemiei (recoltăm sânge pentru hemocultură);
- Perioada de stare se caracterizează prin manifestările esenţiale şi deseori caracteristice ale
bolii;
- Încheierea
1. evoluţiei
convalescenţă, bolii,
în care careclinică
boala se poate face prin:
a încetat şi organismul îşi recapătă treptat capacitatea de
apărare şi revine la starea anterioară bolii infecţioase respective;
2. vindecare, urmată de stabilirea unui grad de imunitate; în unele cazuri imunitatea este de
durată, chiar şi pentru tot restul vieţii; instalarea răspunsului imun, precum şi statusul imun în
relaţie cu un anumit microorganism / produs al acestuia, pot fi dovedite prin teste de laborator
(reacţii antigen-anticorp); pentru unele entităţi este stabilit nivelul de protecţie (de ex. prezenţa
anticorpilor în valoare de 0.01 UAI/mLasigură protecţie faţă de apariţia tetanosului);
3. cronicizare (uneori prin atingerea unui echilibru microorganism şi gazdă; în alte situaţii
cronicizarea poate crea probleme importante) sau
4. exitus, fie datorită agresivităţii (virulenţei) particulare a tulpinii bacteriene implicate, fie
datorită incapacităţii organismului de a reacţiona în mod eficient.
284
medicament antiinflamator (diclofenac), pe cale orală (2 × 50 mg / zi, timp de 5 zile) şi să revină,
la nevoie, pentru reevaluare. La circa 48 de ore de la debutul durerii în articulaţia mâinii drepte,
pacienta a decis să revină la camera de gardă pentru că prezenta lipsa poftei de mâncare,
ameţeli şi senzaţie de febră. Termometrizarea a arătat că pacienta are, într -adevăr, febră
(38,3°C).
Discuţia cu pacienta şi examenul clinic au permis înregistrarea următoarelor date: pacienta nu a
avut greţuri, vărsături, tulburări de tranzit intestinal şi nici semne care să poată fi încadrate într -
un sindrom meningean; erau prezente edem (umflătură) de culoare uşor eritematoasă
(roşiatică) al articulaţiei mâinii drepte, căldură la nivelul acestei articulaţii (în comparaţie cu
articulaţia simetrică), dificultate în utilizarea mâinii; la nivel palmar, bilateral, a fost pusă în
evidenţă
De aceastăo erupţie cu maiclinician
dată, medicul multe elemente
a luat în de culoare violacee,
considerare dureroase
mai multe variantespontan şi la palpare.
de diagnostic. Totuşi,
o parte dintre supoziţii au putut fi eliminate relativ uşor (reumatism articular acut, lupus
eritematos diseminat) în timp ce datele obţinute în cadrul unei anamneze mai riguros realizate
(dar şi în contextul în care pacienta, îngrijorată de condiţia fizică personală, a fost de acord să
ofere date suplimentare) au permis restrângerea ipotezelor la o reacţie în cadrul unei infecţii
care a fost transmisă pe cale sexuală.
Examenul ginecologic a evidenţiat congestie şi eritem la nivelul colului uterin şi leucoree
(secreţie abundentă la nivel vaginal, cu aspect purulent).
S-a recoltat secreţia vaginală dar s-a realizat şi o recoltare cu un tampon fin, de la nivelul
endocolului (tamponul a fost introdus în endocol pe o distanţă de circa 1,5-2 cm).
S-a administrat „tratamentul minut” recomandat în unele dintre infecţiile cu transmitere
sexuală, respectiv ceftriaxonă (o doză, 250 mg, injectabil, intramuscular).
Examenul microscopic a relevat numeroase leucocite PMN în secreţia genitală şi un număr mai
mic de PMN pe frotiul din produsul recoltat de la nivelul endocolului.
Pacientei i s-a recomandat o internare de scurtă durată, ceea ce a acceptat.
După 36 vaginală
secreţia ore, medicul de gardă
a realizat din alaboratorul
frotiuri, de microbiologie
executat textul clinică,
oxidazei şi testul examinând
superoxol şi a cultura
începutdin
testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice.
Diagnosticul microbiologic a fost infecţie cu Neisseriagonorrhoeae , iar diagnosticul final a fost
cel de artrită gonococică.
Rezultatul testării sensibilităţii la antibiotice (antibiograma difuzimetrică standardizată) a
demonstrat o tulpină cu sensibilitate la majoritate antibioticelor şi chimioterapicelor testate,
inclusiv la penicilină. Pentru mai multă siguranţă, deşi în literatură a fost descris faptul că
„tratamentul minut” este eficient, s-a prescris penicilină G, 1 doză la 12 ore, timp de 10 zile. În a
treia zi de la internare, starea generală a pacientei era bună, durerea articulară diminuase
semnificativ, edemul şi erupţia erau abia perceptibile, curba febrilă a înregistrat valori normale
iar pofta de mâncare a revenit.
Comentarii cu privire la caz
Există statistici în literatura de specialitate internaţională care consideră că artrita gonococică
reprezintă una dintre cele mai frecvente cauze de artrită inflamatorie localizată la o singură
articulaţie, la tineri. Nu există date statistice relevante la nivel naţional. În aceste condiţii,
trebuie să
Control luăm
and în seamă pe
Prevention); datele puse
site-ul la se
CDC dispoziţie
discută cu
că generozitate de CDC
3% dintre cazurile de(Center
infecţiefor Diseases
gonococică
sunt însoţite de diseminarea N.gonorrhoeae, mai frecvent la femei decât la bărbaţi. Infecţia
gonococică se poate însoţi de diseminare, indiferent de calea de pătrundere. Ca şi în cazul
meningitei produsă de meningococ, un factor de risc este reprezentat de deficienţe ale
sistemului complement. Sindromul infecţiei gonococice diseminate include în mod clasic:
dermatită, sinovită, artrită migratorie („prinzând” eventual mai multe articulaţii).
În funcţie de localizare, diagnosticul microbiologic se poate pozitiva după cultivarea unor
produse recoltate de la nivel genital, de la nivel articular sau poate fi vorba de sânge.
285
O problemă care poate apărea este legată de tulpinile de gonococ rezistente la antibiotice şi
chimioterapice, ceea ce nu a fost constatat în această situaţie.
Este demonstrat
inflamatorie şi nustatistic faptulPrin
infecţioasă. că aproape toate keratoconjunctivitele
urmare, tratamentul la adulţireprezintă
local cu corticosteroizi sunt de srcine
alegerea adecvată. În comunitatea medicală există tendinţa de a limita prescrierea antibioticelor
topice, în speranţa încetinirii apariţiei fenomenului de rezistenţă la medicamentele
antimicrobiene. În prezent, cea mai frecventă indicaţie pentru prescrierea unui antibiotic într -o
afecţiune oculară acută este reprezentată de către secreţia mucopurulentă la acest nivel, cu
recomandarea recoltării secreţiei respective şi realizarea diagnosticului microbiologic direct,
înainte de administrarea oricărui alt medicament.
Trebuie menţionat faptul că marea majoritate a presupuselor ulceraţii corneene nu sunt altceva
decât infiltrate leucocitare sterile, care în nici un caz nu justifică administrarea de medicamente
antimicrobiene. Este uimitor însă faptul că „tratamentul” cel mai frecvent al acestora se face cu
antibiotice locale!
Este luată în discuţie situaţia unei paciente cu endocardită infecţioasă în antecedente, la care, în
urma unei intervenţii stomatologice (moment în care a primit profilaxie cu antibiotice) a apărut
o osteită
fi luate înladiscuţie,
nivel mandibular.
pornind deAceastă descriere
la sepsisul are relevanţă
cu germeni pentruşimai
Gram-negativi multe aspecte
continuând care pot
cu utilizarea
corectă a antibioticelor şi chimioterapicelor, inclusiv situaţia în care gestul chirurgical reprezintă
alegerea optimă. De asemenea, este exemplificată o urmare a fenomenului inflamator.
O pacientă în vârstă de 59 de ani s-a aflat în supravegherea unei clinici cu specific de boli
infecţioase datorită unei afecţiuni valvulare pe care s-a grefat în urmă cu câţiva ani un proces
infecţios. Într-o perioadă de câţiva ani, pacienta a necesitat mai multe controale sau intervenţii
stomatologice şi în câteva dintre aceste cazuri a primit antibiotice, datorită faptului că
intervenţiile au fost „sângerânde”. Cu toate acestea, în urma uneia dintre aceste intervenţii
(timp în care a primit o cefalosporină cu spectru lărgit), la câteva zile de la intervenţie pacienta a
început să prezinte febră (38,8ºC), transpiraţii, oboseală şi dureri la nivelul toracelui. Numai
după încă o săptămână a decis să se adreseze spitalului (necăjită datorită prea multelor
spitalizări din ultimii ani), iar la camera de gardă i s -a propus internarea, ceea ce pacienta a
acceptat.
Atitudinea a fost corectă şi susţinută de datele anamnestice, pentru că în urmă cu circa 3 ani
pacienta mai fusese internată în spitalul de profil, iar diagnosticul la acea dată a fost cel de
sepsis cu Enterobacterspp
antibiotice, ., ca s-a
dar tulpina izolată urmare a unei
dovedit a fi extracţii
rezistentădentare (şimedicamentele
la toate de acea dată pacienta a primit
beta-lactamice
care au fost testate prin antibiogramă difuzimetrică standardizată, inclusiv la medicamentele
administrate profilactic).
La internare, tensiunea arterială era în limite normale, dar auscultator medicul de gardă a
detectat suflu sistolic atât în focarul mitral cât şi în focarul tricuspidian, iar după câteva ore de la
internare, la contravizită, au putut să fie auscultate frecături pericardice. Datele de laborator
obţinute în regim de urgenţă au relevat leucocitoză (15.850/μl) cu neutrofilie (10.900 PMN/μl),
valori crescute ale reactanţilor de fază acută (proteină C reactivă 6mg/l, VSH 112 mm/oră,
fibrinogen 526 mg/dl) şi anemie (nr. hematii 3,1×10 6/μl). A fost recoltat sânge pentru trei
286
hemoculturi incubate atât în aerobioză cât şi în anaerobioză. Prima hemocultură a fost recoltată
imediat după internare. În două dintre cele trei hemoculturi a fost izolat Enterobacterspp.,
tulpină care s-a dovedit sensibilă la ampicilină, gentamicină, amikacină, ciprofloxacină,
carbenicilină şi asocierea piperacilină-tazobactam. S-a decis instituirea unui tratament cu
ampicilină plus gentamicină, pentru o durată de 3 săptămâni. Nu a fost utilizată ampicilina în
monoterapie, fiind cunoscut faptul că într-o astfel de eventualitate ar fi fost posibilă dezvoltarea
rezistenţei nu numai faţă de acest antibiotic dar şi faţă de alte antibiotice (ex. piperacilină).
Temperatura a rămas ridicată, iar pacienta a menţionat că simptomele nu se ameliorează, în
cursul primelor două săptămâni de terapie. Reactanţii de fază acută au diminuat ca valoare,
menţinându-se însă peste valorile normale. Examenul clinic realizat (repetat) de către medicul
stomatolog
de al sub
favorabilă, unităţii nu a revelat
tratament. o afecţiune
Totuşi, care să pară
după ce mandibula a fi în
a fost legătură cu
examinată evoluţia cu
radiologic, insuficient
foarte
multă atenţie, a fost remarcată o situaţie patologică şi s-a presupus existenţa unui granulom
care nu era cunoscut anterior.
Luând în calcul aceste noi informaţii şi solicitând un examen de specialitate la o clinică
universitară cu profil stomatologic, s-a decis extracţia dintelui situat în vecinătatea granulomului
respectiv, chiuretarea zonei şi asanarea presupusului focar de infecţie. Intervenţia
stomatologică a avut rezultate foarte bune, după 14 ore de la aceasta constatându-se
diminuarea temperaturii. În următoarele 2-3 zile simptomele s-au ameliorat semnificativ. S-a
decis continuarea tratamentului antibiotic în aşa fel încât durata totală să fie de 4 săptămâni.
După a treia săptămână de tratament probele biologice au revenit la valori normale, starea
generală a fost considerată ca fiind bună iar după patru săptămâni de tratament pacienta a fost
externată, vindecată.
Când pielea este rănită, un Ag necunoscut îşi găseşte expresia în keratinocitele deteriorate.
Celulele gamma-delta
pe plan local, de factoriT epiteliali
învecinate desecreştere
grupează şi contribuie
şi citokine la vindecarea
inflamatoare. rănii prin
Ȋn absenţa producerea,
celulelor
gamma-delta T ale pielii, vindecarea rănilor este împiedicată (5). În mod tradiţional,
keratinocitele au fost considerate drept constituenţi inerţi ai epidermului cu mai multe straturi.
Conceptul actual s-a modificat în mod fundamental.
Keratinocitul este recunoscut azi ca un ”jucător activ” în reînnoirea epidermului şi având funcţii
cheie în apărarea imună a pielii. În condiţii homeostatice, se presupune că celulele generatoare
de keratinocite se divizează în mod simetric sau asimetric, ceea ce înseamnă că ele continuă să
prolifereze sau continuă să se diferenţieze în formă definitivă constituind epiderma de
suprafaţă. Procesul fin de reînnoire a epidermului se bazează pe o reţea extraordinară de
cascade semnalizatoare care sunt guvernate de interacţiunile receptorului keratinocitului cu
mediul înconjurător prin circuitele paracrine si autocrine. Opuse acestui proces homeostatic
coordonat sunt semnalele de rănire şi inflamare. Ele modifică soarta keratinocitului şi răspunsul
său la mediul înconjurător prin alterarea moleculelor de adeziune şi receptorii de suprafaţă, prin
completarea declanşării unui răspuns inflamator imediat al keratinocitului, prin secreţia de
citokine, chemokine şi peptide antimicrobiene. Dacă nu sunt controlate, modificările
fundamentale impuse
leziuni severe ale pielii de răniredisfuncţii
inclusiv şi inflamare asupra programului
inflamatorii cronice (6). homeostatic,
De asemeneapot conduce
Factorul de la
creştere a hepatocitului (HGFA) este cunoscut a avea importanţă majoră în morfogeneza
ţesuturilor, în regenerare şi în progresul tumorilor, prin receptorii săi, MET. În vivo, HGFA
activează, de asemenea, proteina stimulatoare de macrofage, care prin receptorii săi RON, are
roluri în recrutarea macrofagelor, declanşarea procesului infecţios, supravieţuirea celulelor şi
vindecarea rănilor. Prin urmare, activitatea pericelulară a HGFA poate constitui un factor
important de reglare a activităţilor citokinelor multifunctionale în vivo. (7)
287
Șocul septic determină imunosupresie. De aici usurința unor suprainfecții cu germeni
condiționat patogeni sau cu tulpini multirezistente, precum: Stenotrophomonasspp.,
Acinetobacterspp., Candidaspp., Pseudomonasspp., Enterococcusspp, citomegalovirusuri etc.
Mecanismele prin care conduc la imunosupresie sunt variate: induc depleția celulelor sistemului
imun prin apoptoza acestora, suprimă exprimarea MHC II, induc supraexpresia citokinelor
antiiinflamatorii și a moleculelor co-stimulatoare negative, cresc numărul de LTs. Privind din
acest unghi, prevenția imunosupresiei induse de sepis devine o prioritate în tratamentul acestei
entitati. Vom parcurge acum câteva terapii propuse de oamenii de știință.
PD-1 (programed death 1) este o proteină de srcine macrofagică, co -stimulatoare negativă, a
cărei sintezăde
capacitatea creste în infecția
apărare HIV, concomitent
a organismului cu a ligandului
prin inducerea său,
apoptozei, PDL-1.
prin PD-1sintezei
creșterea scade de IL -10
(antiinflamatoare), prin impiedicarea proliferării LT, pe care le face neresponsive. S-a încercat
blocarea PD-1 cu rezultate promițătoare în cazul infecțiilor fungice și a sepsisului bacterian (în
experimentele pe șoareci).
Și-au dovedit eficiența și imunostimulatoarele, precum: IFN (interferon), GM-CSF (granulocyte–
macrophage colony-stimulating factor)și G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor). Au fost
rezerve în legătura cu posibilitatea inducerii unei boli autoimune sau a hiperinflamației. Acest
lucru se pare că nu se produce pentru că rezervele organismului sunt mult prea scăzute.
Il-7 și Il-15 sunt citokine antiiapoptotice și imunostimulatoare care și-au demonstrat eficiența pe
animale de laborator. Il-7 restaurează funcția limfocitelor și îmbunătățește migrarea limfocitară
prin creșterea activității integrinelor. Folosirea IL-7 ca medicament este deja în fază de ”trialuri
clinice” pentru cancer și infecție cu VHC și HIV.
S-ar putea folosi flow-citometria pentru cuantificarea moleculelor co-stimulatoare sau proba de
stimulare totală a secreției citokinice (rapid whole-blood stimulation assays of cytokine
secretion). (8)
Să luăm un caz ... alegem... boala Alzheimer. Bine, bine....dar ”Alzheimer-ul acesta” nu e o boală
neurologică? Da, foarte bine. Ȋnsă, ca și în situația multor altor boli, astăzi i se recunoaşte şi o
componentă inflamatorie.
Iată cȃteva argumente pentru a susţine componenta de inflamaţie cronică a bolii degenerative
Alzheimer:
Unii se bazează pe dovezi terapeutice, respectiv pe faptul că AINS ameliorează evoluţia (în
special AINS de tipul ibuprofen, indometacin, sulindac)
Alţii se bazează pe markeri biologici, arătând că PCR este crescută, cu valori în cele 3 quartile
superioare ale valorilor, cu 25 ani înaintea diagnosticului bolii.
288
Sunt luate în discuție și teste genetice, spre exemplu mutaţia genei M694 pentru gena Pyrin,
care reprezintă un factor de risc pentru boala Alzheimer pentru populaţia reprezentativă >65
ani din Italia. Şi se pare că este factor de risc şi pentru alte boli, cum ar fi infarctul miocardic.
Iată şi cȃteva exemple concrete ale farmacogeneticii/farmacogenomicii în cadrul bolii
Alzheimer, luate ca exemplu (nu poate fi o abordare exhaustivă).
Asocierea dintre genotipul ApoE şi boala Alzheimer reprezintă una din întrebările ştiintifice
ridicate de dezvoltarea farmacogenomicii. Dar genotipul nu este numai „profil de risc”, ci şi
indiciu terapeutic. Tacrina (inhibitor de acetilcolinesteraza) se pare că încetineşte progresia bolii
pentru cei care nu sunt homozigoţi pentru ApoE4. Pe de altă parte, există şi studii cu rezultate
negative privind valoarea predictivă a genotipului ApoE. Un al doilea exemplu relevan t este cel
al promotorului
aveau efect numaisintezei
pentru5-LO. Ȋn urmă cu
unii pacienţi, câţiva ani în
variabilitate s-astrȃnsă
observat că inhibitorii
legatură căii lipooxigenazei
cu polimorfismul 5 -LO.
S-a tras concluzia că putem stabili un tratament diferenţial, în funcţie de genotipul pacientului,
concluzie extrapolată de la astm la boala Alzheimer.
Un alt exemplu se referă la polimorfismul TLR4, receptor ce se pare că este implicat in
fiziopatologia bolii Alzheimer şi care ar putea fi folosit pentru înţelegerea rolului profilaxiei cu
antibiotice în acest caz. (9)
Alegeți A dacă 1, 2, 3 sunt adevărate; B dacă 1, 3 sunt adevărate; C dacă 2, 4 sunt adevărate; D
dacă 4 este adevărat, E dacă toate sunt adevărate (
)
Ȋntrebarea 1:
Următoarele evenimente au loc în cazul declanşării unui răspuns inflamator:
1).Modificări la nivelul microcirculaţiei, cu creşterea calibrului vascular.
2).Creşterea permeabilităţii vaselor mici şi scăderea vitezei de circulaţie (stază).
3).Modificări ale hemostazei şi respectiv marginaţia, diapedeza, migrarea leucocitelor.
4).Creşterea vitezei de circulaţie şi scăderea riscului trombotic.
Ȋntrebarea 2:
Sunt false următoarele afirmaţii:
1).Febra este o dovadă a alterării sistemului imun.
2).Diferitele particularităţi structurale ale organismului gazdă sau ale unui anumit ţesut ar putea
explica (parţial) diversitatea fenomenelor inflamatorii identificate ca fiind produse de către
acelaşi agent etiologic.
3).Rezultatul detectabil prin metode de laborator al etapei de vindecare este eliberarea unor
factori chemotactici, a unor proteaze şi kinaze.
4).Modificările fiziopatologice apar independent de cauza inflamaţiei sau, cu alte cuvinte,
indiferent de „agentul determinant”.
289
proces inflamator în derulare în organism.
C).Ȋn mare, vorbim de febră între 37-38°C şi de subfebră peste 38°C.
D).Cel mai fidel loc de preluare a temperaturii corporale este axila.
E).Infecţiile generalizate superficiale nu pot genera febră.
Ȋntrebarea 4:
A).Fibrinogenul va fi mereu normal într-o inflamaţie de orice etiologie.
B).PCR este secretată de către adipocite și ficat în mod fiziologic, însă valori mai mari de 1mg/dL
indică existenţa unui proces inflamator.
C).VSH-ul este un test diagnostic pentru infecţie localizată sau generalizată.
D).VSH-ul reprezintă rata la care sedimentează hematiile dintr-o probă de sȃnge coagulat, într-o
oră.
E).Ceruloplasmina şi amiloidul P seric nu sunt RFA (reactanţi de faza acută).
Ȋntrebarea 5:
A).Coccii piogeni, precum Streptococcuspneumoniae, Staphylococcusaureus, Neisseria
meningitidis nu pot provoca inflamaţii exsudative purulente.
B).Inflamaţiile fibroase, care reprezintă acumularea de fibrinogen, cu apariţia fibrinei şi
formarea de depozite care se organizează şi duc la apariţia „aderenţelor”, nu apar în pneumonia
cu Streptococcuspneumoniae, în dizenteria bacteriană, în miocardita difterică.
C).Vindecarea propriu-zisă începe tardiv în cursul procesului inflamator.
D).Inflamaţii proliferative, având ca formă particulară granulomul, de aspect nodular, apar în
infecţia cu Mycobacteriumtuberculosis,Treponemapallidum,infecția cu diferite specii de
Brucellasau datorate prezenţei unui corp străin.
E).Ȋn miocardita difterică sau în miozita produsă de Clostridiumspp predomină procesele
distrofice şi necrobiotice, care corespund inflamației seroase.
290
: Toleranţa imună reprezintă lipsa răspunsului imunologic indusă de prezentarea unui
antigen la celulele imunologic competente.
Toleranţa imunologică reprezintă un proces complex, încă incomplet studiat, ce este intricat cu
procesul de maturare a celulelor imunităţii adaptative.
Pentru a menţine homeostazia imunologică, indivizii trebuie să fie aresponsivi faţă de antigenele
proprii (numite self). Limfocitele activate de auto-antigene se distrug (inducţia apoptozei-
proces cunoscut şi sub numele de "moarte celulară programată"), sunt inactivate (inducţia
anergiei) sau îşi schimbă specificitatea (Figura 1.)
291
Schemă generală reprezentând posibilile mecanisme de inactivare a limfocitelor
autoreactive, la nivelul organelor limfocitare centrale cât şi în periferie. Celulele sistemului
limfocitar provin dintr-o populaţie suşă (stem), comună limfocitelor T şi B, ce îşi are sediul în
292
măduva hematogenă. Limfocitele T migrează în timus pentru a continua dezvoltarea. Ambele
seturi limfocitare sunt expuse la antigene self, pentru care unele din aceste celule prezintă
receptori. Acestea au potenţial auto-reactiv, astfel încât, fără mecanisme de reglare, ar putea
duce la apariţia unor boli autoimune. Mecanismele implicate în reglarea răspunsului limfocitar
sunt: apoptoza, anergia, editarea de receptori, generarea de limfocite reglatorii şi supresia de
către acestea a răspunsului imunitar.
Toţi indivizii moştenesc, în mare, aceleaşi gene care codifică receptorii antigenici. Rearanjarea
acestor gene duce la generarea unui imens repertoriu imunologic ce permite organismului să
răspundă faţă de o paletă foarte largă de antigene. Pentru a ajunge la acest nivel de
variabilitate,
pentru rearanjarea
receptorii genelor
antigenici suferăcodante
procesulare
deloc la întâmplare.
rearanjare, ( genomul
nu întreg Doar genele codante
limfocitar.)
Calităţile antigenice care dictează statul tolerogen sau imunogen sunt rezumate în Tabelul 1:
293
rezultă din recunoaşterea antigenelor de către subseturi limfocitare specifice. Aceste
limfocite, prezente şi la indivizii sănătoşi, recunosc antigene proprii de pe APC, dar reacţionează
într-o manieră care induce toleranţa şi nu un răspuns imun.
294
Pe parcursul maturării în timus, limfocitele T trebuie să posede două caracteristici esenţiale,
care stau la baza funcţionării sistemului imun. Astfel, reamintim conceptul de dublăselecţie
necesar pentru maturarea LT şi migrarea lor din timus:
- selecţie pozitivă – trebuie să recunoască receptorul MHC II, prezentat pe timocite
- selecţie negativă – nu trebuie să recunoască antigene expuse î n timus
În timpul dezvoltării, toate limfocitele ce se dezvoltă în organele limfoide centrale trec printr-o
fază în care sunt expuse doar la auto-antigene. Astfel că, în timus, limfocitele T care recunosc cu
afinitate crescută un astfel de auto-antigen sunt distruse.
Pentru a asigura o selecţie cât mai bună a limfocitelor, este necesar ca în această etapă
limfocitele să întâlnească cât mai multe antigene self. Pentru a facilita acest deziderat,
timocitele exprimă antigene "periferice" după inducţia factorului de transcripţie –
uto mmune gulator. Trebuie reţinut că (aproape) toate celulele din organism conţin
molecule identice de ADN. Astfel, sub acţiunea promoterilor corecţi, celulele pot exprima orice
antigen prezent în organism.
Toleranţa LT Periferică reprezintă procesul prin care limfocitele mature, în organe limfoide
periferice devin incapabile să răspundă la auto-antigene.
Importanţa clară este reprezentată de toleranţa faţă de antigenele specifice ţesuturilor
periferice ce nu sunt abundent exprimate în timus. Consolidează toleranţa indusă central.
Am menţionat în alte capitole ale acestei cărţi, rolul critic al pentru
declanşarea răspunsului imun. (vezi capitolul 13. Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri
secunzi.)
Expunerea LT CD4+ la antigene, în absenţa costimulării APC, poate induce . Astfel este
posibil ca antigene periferice prezentate subseturilor LT autoreactive, în lipsa reacţiei imunităţii
native (inflamaţiei) să inducă toleranţa.
Experimentele
transmis de TCRaunuarătat ca în lipsapentru
este suficient co-stimulării
a inducederăspunsul
către cuplul
imunmolecular
şi induceB7-CD28,
toleranţasemnalul
prin
anergie sau apoptoză (Figura 2).
295
Figura 2. Răspunsul în urma interacţiunii celulelor sistemului imun aflate în diferite stadii de
activare. În lipsa unor semnale de activare date de inflamaţie, macrofagele şi limf ocitele imature
imunologic vor conduce la toleranţă.Celulele APC mature sunt caracterizate de prezenţa pe
membrana lor a ligandului costimulator numit B7. Celulele LT mature prezintă pe membrană
receptorul CD28, iar din interaţiunea lor, se transmit semnale stimulatoare, rezultând în
activarea şi proliferarea LT. În absenţa uneia dintre cele două molecule, se induce anergia. LT
imature prezintă, în loc de CD28, o moleculă inhibitoare, numită CTLA4. Funcţia moleculei
CTLA4 este de fosfatază, cu rolul fiziologic de a contra-regla răspunsul imun.
296
moleculelor stimulatoare B7.
Este posibil ca celulele dendritice rezidente în organe limfoide sau organe periferice să se afle
într-un stadiu imatur, exprimând puţine molecule B7. În lipsa semnalului costimulator, LT devin
anergice.
- unele
Deşi experimente
acest subset estedemonstrează inhibarea
cel mai bine studiat, APC
s-au prin contact
descris direct
mai multe a LTR reglatoare.
fenotipuri
Se caută defecte de dezvoltare a LTR in boli autoimune precum DZ1 (Diabet Zaharat tip I) şi SM
(Scleroză Multiplă).
-CaleaMitocondrială(Bim)
Limfocitele T care recunosc antigene fără costimulare sau în absenţa inflamaţiei activează un
răspuns pro-apoptotic, prin proteina Bim (membră a familiei Bcl-2).
Molecule aflatefiind
diverse roluri, in membrana mitocondrială,
pro- si anti-apoptotice, câtreglează stabilitatea
şi molecule acesteia.
senzor pentru Aceststresori.
diverşi e molecule au
Citocromul C este sechestrat în mod normal în interiorul mitocondriei, iar eliberarea sa în
citoplasmă este mediată de canale sensibile la moleculele pro-apoptotice de tip Bax/Bak.
Citocromul C joacă un rol important, ca marker al destabilizării membranei mitocondriale şi
activator al caspazelor. Molecule precum Bcl şi Bcl-XL au rolul de a stabiliza canalele
mitocondriale, având astfel rol anti-apoptotic.
-CaleaReceptorilorMorţii(Fas -FasL)
Stimularea repetată a LT conduce la co-expresia unor receptori care, activaţi, induc apoptoza.
În LT CD4+, receptorul implicat în inducerea apoptozei este numit Fas (CD95). Acesta este
membru a familiei TNF şi conţine, în porţiunea intracelulară domenii specializate care traduc
semnale pro-apoptotice. De menţionat că FasL este o moleculă cvasi-ubicuitar exprimată,
contribuind la menţinerea toleranţei – interacţiunea LT CD8+ cu MHC I de pe ţesuturi, în lipsa
citokinelor de la LT CD4+ duce la dominanţa relativă a semnalelor transmise de Fas.
Trimerizarea Fas duce la inducerea programului pro-apoptotic prin activarea unor serin-
proteaze
ADN. numite . Acestea induc degradarea proteinelor intracelulare şi fragmentarea
Deşi caspazele pot induce apoptoza separat, cele doua mecanisme se autopotenţează. Caspaza
8 activează molecula Bid care activează şi calea mitocondrială de apoptoză. (Figura 3)
297
Figura 3. Schema reprezintă cascadele intracitoplasmatice care conduc la activarea programului
apoptotic şi punctul de intersecţie reprezetat de Caspaza 8 şi Bid.
298
Figura 4. Schemă a mecanismelor implicate în toleranţa limfocitelor B, centrală şi periferică.
Scopul unui răspuns imun bine-reglementat este să apere gazda de patogeni, fără a cauza
distrugeri ţesuturilor organismului.
299
dendritice placentare să transforme LT CD4+ în fenotip CD25+ foxP3+, capabile de secreţia IL-10
[3].
Până acum am discutat despre mecanismele prin care sistemul imun devine neresponsiv faţă de
auto-antigenele expuse de ţesuturile proprii. Menţinerea relativ constantă a numărului de
limfocite în faţa numeroaselor stimulări antigenice întâmpinate de individ este o componentă
vitală pentru menţinerea homeostaziei. (Figura 5)
300
moleculă competiţionză direct cu CD28 pentru a se lega de B7 de pe APC (blocarea semnalului
costimulator). Un alt mecanism de acţiune îl reprezintă recrutarea de fosfataze, care
defosforilează regiunile ITAM ale CD3 şi ζ, blocând semnalul TCR. Alte molecule de inhibare a
răspunsului imun au fost descrise, dintre cele mai studiate fiind PD -1. (Figura 6)
Figura 6. Inhibiţia semnalelor B7 şi TCR prin exprimarea în număr mare a CTLA4 la câteva zile de
la activarea limfocitară.
Anticorpii IgG inhibă activarea limfocitelor B prin formarea de complexe antigen-anticorp (CAA)
cu antigene polivalente. CAA se cuplează, prin porţiunea Fc a anticorpilor cu receptorul specific
de pe limfocite B, FcγRIIB (sau CD32). Aceşti receptori conţin secvenţe care, odată fosforilate,
recrutează fasfataze (SHIP). Prin legarea simultană
301
Una din consecinţele inflamaţiei este fibroza tisulară. În lipsa unei controlări judicioase a
semnalelor ce întreţin inflamaţia şi răspunsul imun, organismul ar suferi leziuni induse de aceste
mecanisme de apărare. Ca urmare a citokinelor secretate în focarul inflamator, fibroblastele
devin active metabolic, ducând la producţia şi secreţia de colagen. În cazul inflamaţiei
moderate, ca cea întâlnită într-o stimulare normale a sistemului imun de către un agent
patogen comun, fibroza este minimă iar citoarhitechtura şi fiziologia tisulară rămâne fără
consecinţe – un astfel de grad de fibroză este fiziologică; în cazul inflamaţiei severe sau cronice,
fibroza este importantă şi duce la disfuncţii organice profunde. Unul din mecanismele care
rămân încă mult investigate sunt translaţia epitelio-mezenchimală prin care, tot sub influenţa
produşilor inflamatorii, celulele epiteliale trec în fibroblaşti sau miofibroblaşti care sunt
responsabileînde
importante fibroză parenchimatoase
organele [4]. Este lesne de înţeles că aceste
ca plămânul, modificări
rinichiul sunt
şi ficatul încu atât
care mai înalt -
epiteliile
specializate au rol foarte important. Pierderea masei epiteliale induce disfuncţii seve re ale
funcţiei acestor organe.
302
în bolile infecţioase (numite de către unii autori şi boli transmisibile; transmisibilesuntînsăşi
maladiilegenetice,fărăafiînacelaşitimpşiinfecţioase ) diagnosticul are o importanţă
considerabilă ( , influenţând în mod direct prognosticul).
De stabilirea corectă şi precoce a diagnosticului pot depinde
În fiecare capitol vom exemplifica modul în care se poate face diagnosticul de laborator,
folosind o schemă generală de diagnostic (prezentată în capitolul 27) pentru infecţiile produse
de principalele microorganisme studiate.
Considerăm că utilizarea în mod repetat a unei scheme clare permite o mai bună fixare a
cunoştinţelor precum şi atingerea obiectivului stabilit: reţinerea unor principii utile, indiferent
de specialitatea care a fost / va fi aleasă ulterior.
Microbiologia este, după părerea noastră, o ştiinţă cu foarte mare aplicabilitate practică.
Elementele de bază ale microbiologiei sunt necesare şi utile pentru toţi cei implicaţi în sistemul
sanitar; cunoaşterea acestor elemente de bază ar putea preveni o serie de anomalii şi erori care
uneori sunt dezastruoase (aşa cum s-a întâmplat spre exemplu într-o maternitate în care o serie
de nou-născuţi au decedat datorită unor infecţii de spital/nosocomiale).
Dacă în urmă cu circa 40 de ani, la nivel internaţional a început să se considere (în mod absolut
eronat) că problemele legate de bolile infecţioase sunt din ce în ce mai puţin importante (eroare
care şi la nivel naţional şi internaţional), în
ultimii 13-14 ani (în special începând cu anul 1998) s-a dovedit, concret, că bolilor infecțioase
trebuie să li se re-acorde importanţa cuvenită.
303
,a
cărei traducere în limba română poate fi examinată la http://eur-
lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CONSLEG:1998D2119:20071228:RO:PDF
Pornind de la această DECIZIE au fost elaborate numeroase acte normative în domeniu iar
fondurile alocate au sporit substanţial, încercând să se „vindece” situaţia la care se ajunsese
datorită erorilor făcute anterior.
Astfel,
fost activitatea
în acea desfăşurată
perioadă, din acestînpunct
domeniul reformelor
de vedere, destulpentru sănătatea
de aproape publică care
de reforma în România a
a avut loc
în restul UE.
Diferitele proiecte şi programe iniţiate în special în perioada 1997-2000 (iniţial în colaborare cu
CDC, Atlanta, GA şi OMS, Copenhaga sau OMS, Geneva) și-au găsit concretizarea în aplicarea
unor măsuri cu mare importanţă la nivel naţional:
Totuşi, dorim să
supraveghere subliniem
a bolilor faptul căa prima
infecţioase încercare (reuşită)
fost înregistrată pentru
în perioada reforma sistemului de
1990-1991.
, echipă care , a fost din păcate
distrusă în anul 1992, arătând încă o dată influenţa negativă a politicului în sănătate.
Din anul 1999 România face parte (ca membru fondator) din Reţeaua de supraveghere a bolilor
transmisibile în Balcani. În anul 2000, a fost organizată una dintre cele mai importante întâlniri
cu scopul armonizării supravegherii bolilor infecţioase în Europa (Consensus Meeting on
Surveillance of Infectious Diseases, Grottaferrata, Italia, 7 aprile 2000). Prezentarea pe care unul
dintre coordonatorii prezentului volum a făcut-o cu acest prilej, discuţiile care au urmat în
„ateliere de lucru”, întâlnirile cu factori de decizie ai Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii, iniţiativa
organizării unei reţele de supraveghere a bolilor infecțioase/transmisibile în ţările din Europa
Centrală şi de Est (întâlnire plenară pe care am organizat-o în decembrie 2000, la Bucureşti,
prima şi singura de acest nivel în perioada 1990-2007, neegalată până în prezent) au dus la
construirea unui proiect de reformă în domeniul supravegherii bolilor transmisibile cu sprijin
european (Phare) pe care l-am gândit în perioada mai-octombrie 2000, l-am scris în perioada
octombrie-noiembrie
Europeană şi Programe 2000 (ajutat pentru
de Sănătate finalizareSănătăţii)
din Ministerul de colegiişide la Direcţia
care de Integrare
a fost aprobat la „data
istorică” de 14 noiembrie 2000.
Finanţarea a fost de circa 5 milioane EUR (circa 4 milioane EUR fonduri nerambursabile, Phare).
Implementarea fondurilor pe care le-am câştigat în anul 2000 a avut loc în perioada 2003-2004,
după opinia noastră mai târziu decât a fost cazul şi cu o performanţă mai scăzută în comparaţie
cu cea care ar fi fost atinsă de echipa condusă (în perioada 1999-2000) de unul dintre
coordonatorii prezentului manual, în acelaşi timp autorul proiectului.
304
Chiar dacă reprezintă măsuri pentru prevenirea unor maladii virale (şi nu bacteriene sau
fungice), vom mai aminti, dintre măsurile luate în ultimii ani, îmbunătăţirea programului de
vaccinare împotriva infecţiilor cu virusul hepatitei B, în anul 1999. Vaccinarea nou-născuţilor
avea deja o „vechime” de 4 ani, dar în 1999, prin politica dusă în domeniul sănătăţii publice, a
fost inclusă şi vaccinarea copiilor din clasa a III-a, vaccinarea tuturor elevilor din anul I de la
şcolile sanitare postliceale şi respectiv a studenţilor din anul I din facultăţile de medicină şi
stomatologie. Ulterior, cohortele de copii vaccinaţi „apropiindu-se”, a început vaccinarea
tinerilor aflaţi în clasa a XII-a şi astfel, nu numai viitorii medici sau asistenţi medicali au
beneficiat şi beneficiază de această metodă profilactică. Politica de vaccinare a permis ca î n
numai câţiva ani, un mare număr de generaţii de copii şi tineri să fie vaccinate faţă de o infecţie
Fiecare dintre aspectele menţionate are o strânsă legătură atât cu microbiologia, cât şi cu
sănătatea publică şi merită a fi cunoscute atât de către medicii cât şi de viitorii medici care
activează în sistemul sanitar românesc sau la nivel european.
Așa cum am menționat anterior, în privința terminologiei, în vorbirea curentă se discută despre
boli transmisibile (traducere a termenului anglo-saxon „communicablediseases ”), însă mai
corect este să le denumim boli infecțioase.
Cu toate că în primii ani de studiu este abordată în mod special partea microbiologică
(bacteriologică, virusologică, parazitologică, micologică) a diagnosticului, este strict necesar să
menţionăm că .
Orice investigaţie de laborator este precedată de studierea elementelor clinice, ulterior discuţiei
cu pacientul sau aparţinătorii acestuia (anamneză). Fără un examen clinic aprofundat şi fără
evaluarea zilnică a evoluţiei din punct de vedere clinic şi paraclinic a bolii, nici laboratorul de
305
microbiologie modern nu poate fi utilizat la nivelul posibilităţilor actuale. Dorim să subliniem
faptul că în scopul diagnosticării bolilor infecţioase au fost puse la punct numeroase tehnici de
laborator, metode paraclinice, precise şi obiective, dar utilitatea lor este maximă atunci când
rezultatele sunt interpretate în contextul clinic şi epidemiologic.
său direcţionează
necesar demersuluiinvestigaţiile paraclinice
diagnostic poate de laborator,
fi realizat imagistice
prin coroborarea ş.a. astfel
datelor încât
extrase tabloul
prin toate unitar
cele
trei metode.
respectiv (evoluţia
electrolitică) putând
cât şi din fi severă
punct în lipsa
de vedere instituirii rapide
al diseminării a măsurilor
infecţiei (1) (de ex.de
în re -echilibrare
cazul hidro-
în care această
situaţie ar apărea în Delta Dunării, în condiţii igienico -sanitare precare).
2. obţinute în vederea diagnosticului ; diagnosticul de boală
infecţioasă trebuie să rezulte din totalitatea datelor clinice şi a celor de laborator considerate şi
interpretate unitar. Nu pot fi absolutizate nici posibilităţile clinice şi nici cele ale laboratorului.
Metodele de laborator, luate separat, nu permit punerea diagnosticului, dar executarea corectă
a manoperelor de laborator reprezintă o condiţie sinequanon pentru un diagnostic corect şi
util.
Este deosebit de important ca, în momentul în care luăm în calcul un diagnostic din sfera bolilor
infecţioase, să nu excludem şi alte etiologii posibile. De exemplu, o pacientă în vârstă de 51 de
ani se prezintă pentru apariţia recentă a unor leziuni eritematoase (Figura nr. 1).
Date din anameză (tratament cu etoricoxib) corelate cu lipsa decelării altor leziuni similare la
examenul clinic obiectiv, au condus către diagnosticul de eritem fix – reacţie adversă rară la
administrarea de etoricoxib (2). Acest caz ilustrează ponderea datelor anamnestice în
formularea unei ipoteze diagnostice.
3.
deEste indispensabil să se stabilească în toate
pentru maladiile
tulpina infecţioase,
izolată, având în însoţit
vedere
utilitatea şi importanţa tratamentului antimicrobian, precum şi actualitatea problematicii
referitoare la rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice (3). Anamneza trebuie realizată cu
rigurozitate; aprecierea statusului imunologic poate avea o contribuţie esenţială; efectuarea
unui examen clinic minuţios constituie o altă condiţie a unui diagnostic complet. Pentru medic
(dar şi pentru pacient) contează toate datele obţinute prin examenul obiectiv; nici un element
nu trebuie neglijat:
- faciesul bolnavului (facies = aspect caracteristic, corelat cu boala de care suferă o anumită
persoană), postura şi unele aspecte particulare;
306
- febra/curba termică (cu toate caracteristicile ei); trebuie folosită termometrizarea şi nu
„senzaţia de febră” (vezi și subcapitolul 24.1.);
- modificările apărute la nivelul mucoaselor şi la nivel tegumentar;
- semnele de insuficienţă respiratorie acută;
- semnele care relevă un dezechilibru hidro-electrolitic şi acido-bazic;
- modificările neurologice şi psihice etc.
În interpretarea curbei termice, este important să evaluăm urmatoarele aspecte:
magnitudinea febrei,
frecvenţa şi durata episoadelor febrile,
recurenţa acestor
relaţia dintre puls şiepisoade (cu/fără
temperatură periodicitate),
şi patternul de remisie a episoadelor febrile (4) etc.
Administrarea de antibiotice şi/sau antipiretice poate altera aspectul curbei termice (5), dar cu
toate acestea, în cazurile tipice, este important de decelat prezenţa unor pattern -uri febrile aşa-
zise „clasice”. De exemplu, febra terţiară se suprapune peste ciclul de reproducere asexuată al
Plasmodiumfalciparum, P.vivax, P.ovale pe când febra cuaternară este înalt sugestivă pentru
P.malariae(6). Totodată, febra continuă poate fi întâlnită în patologiile de etiologie rickettsiană
iar un pattern bifazic poate semnala febra Dengue (5).
4. care pot fi oferite de către laborator constituie un alt aspect foarte
important. Este necesar ca fiecare medic clinician să ştie ce analize să solicite, ce produse se
recoltează de la bolnav, când şi cum să le recolteze, cum să le expedieze / pregătească pentru
expediere către laborator. Sunt de menţionat şi reţinut următoarele reguli:
- produsele se recoltează înainte de administrarea tratamentului antimicrobian;
- se trimite laboratorului o cantitate suficientă de produs pentru examinat;
- produsul trimis trebuie să fie reprezentativ pentru boala respectivă (de exemplu, spută şi nu
salivă în infecţiile
- produsul trebuierespiratorii
recoltat în inferioare);
perioada în care probabilitatea decelării agentului etiopatogen
este maximă (de exemplu, recoltarea pentru hemoculturi se face, pe cât posibil, în timpul unui
episod febril);
- produsul examinat nu trebuie contaminat cu alţi germeni în cursul recoltării sau al
transportului (recoltare şi transport în condiţii aseptice) (7);
- expedierea către laborator se face în condiţiile de conservare cerute pentru fiecare produs în
parte (trebuie să existe recomandări specifice, în detaliu, la îndemâna medicilor);
- se solicită examinarea imediată a produselor transmise către laborator;
- se urmăreşte, în timp, apariţia rezultatelor şi „se ţine legătura” cu colegii din laborator.
Însă, pentru ca datele de laborator să fie corecte este strict necesară respectarea unei anumite
conduite în laborator, utilizarea judicioasă a diferitelor aparate şi echipamente de laborator şi
implementarea controlului de calitate (intern şi extern) (a se vedea anexa nr. 5).
5. Trebuie să existe o strânsă şi continuă între clinician şi specialistul de laborator.
Este necesară o informare (care să includă aspecte rezultate în urma anamnezei şi elemente
clinice) a medicului de laborator făcută de către clinician (direct sau cel puţin prin telefon)
pentru orientarea
identificare cercetărilor
a agentului în laborator
etiologic. În acelaşi şi pentru
timp, alegereainformează
laboratorul celor mai bune metode
clinicianul pede
parcurs în
legătură cu datele preliminare obţinute.
307
cefalorahidian poate aduce date preţioase pentru elucidarea etiologiei unei pleurezii şi resp ectiv
a unei meningite.
: prin biopsii (recoltate prin tehnică chirurgicală) sau prin puncţii-biopsii
ale diferitelor organe (ficat, rinichi, plămân, ganglioni limfatici, fragmente vasculare, mucoasă
digestivă sau respiratorie) se pun în evidenţă modificări structurale caracteristice, determinate
de acţiunea agentului patogen.
: în diagnosticul bolilor infecţioase sunt utile informaţiile
obţinute prin analiza valorii hemogramei, leucogramei (cu modificări destul de caracteristice în
anumite situaţii), vitezei de sedimentare a hematiilor, testelor de disproteinemie, testelor
enzimatice, proteinei C reactive (beta-globulină care nu se găseşte în serul normal, apărând
numai în afecţiuni
(reactanţi inflamatorii,
de fază acută) etc. neoplasme şi în procese necrotice), altor teste de inflamaţie
: examenul radiologic poate furniza date de valoare pentru bolile
infecţioase cu participare pulmonară (pneumonii virale, febră Q, pneumonie pneumococică
etc). Se mai pot folosi rectosigmoidoscopia, electroencefalografia, electrocardiografia, diferite
determinări biochimice, examene oftalmologice, scintigrafia, ecografia, tomografia
computerizată, rezonanţa magnetică nucleară.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca
pacientului să i se fi administrat antibiotice sau chimioterapice, cât mai rapid şi corect din punct
de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie, prelevând
un anumit produs patologic în funcţie de manifestarea clinică în cazul respectiv, de exemplu
urină în cazul unei infecţii urinare, materii fecale în cazul dizenteriei, spută în cazul tuberculozei
sau aspergilozei, scuame în cazul unei micoze cutanate superficiale etc) (vezi anexa nr. 6).
308
biopsie etc). în cazul suspicionării unei infecţii mycobacteriene este necesară realizarea unui al
treilea frotiu, care se va colora Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examinează la microscopul optic,
iniţial cu obiectivul 40× pentru o analiză mai generală, pentru stabilirea câmpului microscopic
sau a zonei „de interes”, apoi cu obiectivul de imersie. Se notează prezenţa diferitelor celule
(eventual modificate faţă de normal, „burate” de microorganisme), prezenţa celulelor
inflamatorii (dovada reactivităţii organismului, ex. leucocite, surprinzând eventual fenomenul de
fagocitoză), precum şi eventuala prezenţă a microorganismelor (bacterii, levuri,
pseudofilamente, micelii), care va fi interpretată cu precauţie, în contextul dat. Chiar dacă
examenul microscopic este de cele mai multe ori un examen orientativ, trebuie realizat de
fiecare dată, cu rigurozitate, în anumite situaţii putând fi foarte important şi foarte util.
Atunci
se când produsul
realizează recoltat
frotiuri fixate este reprezentat
şi colorate. de sânge,
Spre exemplu, urinămateriilor
în cazul sau materii fecale,
fecale, de face
se va regulă
o nu
coprocitogramă, un preparat proaspăt (nativ) între lamă şi lamelă, căutându-se în special
prezenţa leucocitelor (dar şi a unor structuri care pot da anumite informaţii cu privire la
funcţionalitatea tractului digestiv). În cazul suspicionării unei infecţii urinare, se va realiza un
sediment urinar (după centrifugarea urinei), care se va examina între lamă şi lamelă în vederea
aprecierii numărului de leucocite pe câmp microscopic, în cazul în care acestea există, în
vederea aprecierii prezenţei unor cilindri leucocitari precum şi a altor celule normale sau
patologice, a prezenţei unor elemente fungice etc., date care pot fi deosebit de utile în vederea
unui diagnostic corect şi util pentru pacient.
În cazul suspicionării unei infecţii micotice sunt utile atât preparatele proaspete (ex. preparatul
montat în soluţie de KOH-glicerol 10-20%), frotiurile cu coloraţii „negative” (tuş de India,
nigrozină), precum şi frotiurile colorate May-Grünwald-Giemsa sau Gram.
izolăm; spre
condiţiilor ex. în cazul
anaerobe în care infecţia
de cultivare este produsă
este imposibilă de microorganisme
izolarea strictPentru
agentului etiologic). anaerobe,
fungiîn lipsa
trebuie utilizate mediile potrivite şi o temperatură mai mică decât cea utilizată în cazul
bacteriilor. Cultivarea se va realiza în aşa fel încât să se poată obţine colonii izolate (tehnica
„însămânţării în poligon”) şi respectiv o cultură pură, care se va identifica.
309
anticorpi cunoscuţi pentru a identifica antigenele microbiene necunoscute. Spre exemplu, prin
reacţii de aglutinare directă, pe lamă, se pot identifica antigenele şi respectiv speciile şi tulpinile
din genul Shigella, Salmonella, Vibrio etc). Reacţii de aglutinare indirectă se pot utiliza pentru
detectarea în p.p. a streptococilor de grup A sau B etc., pentru detectarea unor enterotoxine,
pentru detectarea unor fungi ( Cryptococcusneoformans, Candidaalbicans , Aspergillusspp .) etc.
e) Caractere de patogenitate: putem examina capacitatea unui microorganism de a elabora
anumite substanţe cu rol în patogenitate (ex. coagulaza produsă de Staphylococcusaureus) sau
infecţia experimentală a unui animal de laborator (ex. izolarea pneumococilor de la un pacient
cu pneumonie după inocularea sputei la şoarecele alb; în cazul în care în spută există
pneumococi, animalul va muri în 24-48 de ore, iar din sângele lui se va izola o „cultură pură” de
Streptococcuspneumoniae).
f) Sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific (lizotipie);
g) Alte caractere (identificate de ex. prin metode ale biologiei moleculare sau alte metode
moderne) (vezi anexa nr. 7).
27. 2. 2. 2. În pacientului
reactivitatea cadrul diagnosticului
faţă de unde laborator
anumit imunobiologic
antigen se va studia, de exemplu,
inoculat. Intradermoreacţia la tuberculină
(PPD, preparat proteic purificat) (9) sau la candidină (10) reprezintă exemple clasice, în acest
sens. Tehnica intradermoreacţiei este folosită în mai multe scopuri şi trebuie să avem în vedere
că în funcţie de scopul urmărit şi respectiv în funcţie de antigenul inoculat (şi de mecanismul
implicat), modul de citire al rezultatelor va fi diferit (vezi anexa nr. 3).
Considerăm că pentru orice medic, indiferent de specialitate, multe dintre principiile
microbiologiei sunt foarte utile, merită să fie înţelese şi aplicate corespunzător.
Pentru cei care se dedică microbiologiei sau bolilor infecţioase, aceste noţiuni reprezintă o bază
310
obligatorie, care poate fi completată utilizând pe de o parte diferitele tratate medicale în
domeniu dar şi experienţa personală dezvoltată atât din punct de vedere teoretic cât şi practic.
Precocitatea diagnosticului este unul dintre factorii de care depinde prognosticul unei boli.
Astfel, un domeniu prioritar pentru cercetarea medicală este reprezentat de punerea la punct a
unor noi teste diagnostice, care să poată fi utilizate cât mai precoce după momentul pătrunderii
agentului patogen la nivelul organismului uman.De exemplu, un deziderat ar fi realizarea unui
test urinar pentru identificarea antigenelor specifice bolii Lyme (cauzate de Borrelia
burgdorferi). Până de curând, acest lucru nu a fost posibil din cauza concentraţiilor mici ale
antigenelor la nivel urinar, sub limita de detecţie a testelor clasice. Recent, Douglas şi
colaboratorii au demarat un studiu asupra rolului unui nou biomaterial (microparticule de tip
hidrogel: N-izopropilacrilamida-acid acrilic) în capturarea şi implicit concentrarea biomarkerului
urinar pentru Borreliaburgdorferi . Rezultatele preliminare au arătat că aceste microparticule au
capacitatea de a concentra de 100 de ori biomarkerul de la nivel urinar, crescând sensibilitatea
testelor antigenice urinare (13).
Problema luată în discuţie este a unei colege mai tinere, studentă într -un „an mare” la medicină,
dar de fapt, ca şi următoarea, poate fi considerată o problemă care poate fi a unui sistem şi nu a
unui „caz particular”.
În urmă cu mai mult de un an, colega noastră primeşte diagnosticul de litiază renală şi
recomandarea de eliminare a calculilor prin litotripsie [manevră care constă în mărunţirea
calculilor urinari, fragmentele fiind apoi eliminate în mod natural prin urină; acce sul la calculi se
face pe cale endoscopică şi sub control endoscopic; pulverizarea calculilor poate să fie realizată
cu ajutorul unei pense (litotripsie mecanică), cu ajutorul ultrasunetelor (litotripsie ultrasonică),
prin unde de şoc repetate (litotripsie electrohidraulică) sau cu ajutorul unei fibre laser
(litrotripsie cu laser)]. Manevra este executată, cu succes (conform protocolului operator).
După 5 luni, în anul următor, semnele clinice şi analizele de laborator (în special urocultura
311
însoţită de testarea sensibilităţii la antibiotice) permit punerea diagnosticului de infecţie urinară
(ITU) cu Escherichiacoli. Viitorul medic primeşte norfloxacină, timp de 10 zile. Pentru că la 3
săptămâni de la primul diagnostic simptomatologia persistă, primeşte un nou tratament, de
această dată cu amoxicilină + acid clavulanic. La încheierea celui de al doilea tratament,
simptomatologia persistă şi colega ni se adresează solicitând un sfat, menţionând şi că medicul
urolog i-a recomandat să înceapă un tratament cu cefuroximă (cefalosporină de generaţia a II-a)
şi Uro-vaxom, timp de 20 de zile, apoi să refacă analizele. Tulpina de E.coli identificată la ultimul
examen bacteriologic prezenta sensibilitate la: acid nalidixic, ceftazidim, cefuroxim,
cotrimoxazol, fosfomicină, gentamicină, rezistenţă la: amoxicilină şi la amoxicilină + acid
clavulanic şi era „intermediară” la norfloxacin (cu alte cuvinte, putem remarca „evoluţia sub
tratament”înatrepte”).
„câştigată tulpinii, iniţial sensibilă la norfloxacin şi amoxicilină + acid clavulanic, rezistenţă
La recomandarea noastră, colega se prezintă din nou la un control ecografic, conform căruia se
pun în evidenţă „elemente litiazice”. Este cunoscut faptul că litiaza renală reprezintă unul dintre
factorii de risc pentru apariţia şi persistenţa ITU.
Opinia noastră a fost ca, în acest caz, analizele de laborator să se realizeze în INCDMI
„Cantacuzino” şi pentru că era încă vacanţă iar reşedinţa nu era în capitală, colega noastră a
respectat recomandarea în a doua jumătate a lunii septembrie. Din discuţiile pe cale
„electronică” am aflat că medicul urolog a afirmat „că este vorba de o boală de tub renal” şi că
în aceste condiţii trebuie să evite ITU, care pot fi factor de agravare. Colega noastră era deja
îngrijorată datorită rezistenţei la tratament a infecţiei cu E.coli.
După administrarea de Uro-vaxom, urocultura realizată la Bucureşti în luna septembrie a fost
„sterilă”, situaţie conformă cu statusul clinic (lipsa semnelor sau simptomelor).
Totuşi, după circa 2-3 săptămâni, semnele şi simptomele revin şi colega ni se adresează din nou,
pentru un sfat, menţionând şi rezultatele obţinute la testarea sensibilităţii la antibiotice pentru
tulpina de E.coli (menţionate mai sus) şi cerând să îi recomandăm unul dintre antibioticele din
listă cum
Aşa pentru
niciadiagnosticul
începe un nou tratament. tratamentului la telefon nu reprezintă un bun exemplu
şi prescrierea
în medicină, nici utilizarea „căii electronice” nu poate să substituie examenul clinic şi analizele
de laborator. Având în minte aceste recomandări pe care le-am învăţat, la rândul nostru, în
vremea studenţiei sau în timpul rezidenţiatului, singurul sfat pe care l-am putut exprima a fost:
refacerea analizei de laborator, tot la INCDMI „Cantacuzino”.
Sfatul a fost urmat iar diagnosticul a fost ITU cu Klebsiellapneumoniae , ceea ce a contrariat-o pe
colega noastră (totuşi, rezultatul nu a fost surprinzător).
Pentru că toată această discuţie se purta, din nou, pe „cale electronică” (colega noastră se
întorsese în localitatea de reşedinţă) şi pentru că nu ştiam unde fusese realizat ultimul examen
de laborator, în primul rând am solicitat această informaţie. Aflând atât laboratorul cât şi
medicul care a pus diagnosticul, aceasta a reprezentat pentru noi o certitudine că ultimul
diagnostic este şi el corect şi, în context, existau două posibilităţi „de primă intenţie”:
Un alt coleg mai tânăr, de această dată în primii ani de studiu, a relatat după momentul în care
312
am discutat şi rezolvat o situaţie particulară, medicală, că în vremea copilăriei a primit de foarte
multe ori antibiotice, de regulă în cadrul unei „auto-medicaţii” stabilită în familie.
Cele mai frecvente „probleme”, ca şi la mulţi alţi copii (dacă nu chiar la toţi) erau legate de nas -
gât-urechi (ORL), iar medicamentele antimicrobiene primite s-au „repetat” anual şi de mai
multe ori pe an până spre vârsta de 13-14 ani.
Se pare că un moment important a fost legat de o infecţie de acelaşi tip, cu manifestări ceva mai
serioase, care au determinat familia să se prezinte împreună cu tânărul nostru la medicul de
familie; acesta, analizând „auto-medicaţia” propusă a concluzionat că respectivul medicament
în cantitatea propusă reprezenta un risc pentru pacient şi în acest context, pacientul a înţeles că
nu trebuie să mai accepte medicaţia „ca atare” (chiar dacă era minor, la acea dată). Totuşi,
colegul
Însă, nostru
toate a concluzionat:
aceste probleme s-au„oricum
arătataafost suficient
fi minore, dede
faţă mult timp
ceea ce asăurmat.
iau pastile aiurea”.
Într-o toamnă, la început de liceu, într-o vineri (majoritatea problemelor importante/grave se
pot petrece vinerea, în week-end, noaptea, „la sfârşit de program” etc), tânărul coleg a revenit
acasă cu dureri foarte mari în zona articulaţiei coxo-femurale, după o lovitură aparent minoră,
în cursul unui meci de fotbal. Una dintre erori a fost, probabil, faptul că prima reacţie acasă a
fost o „baie fierbinte” (dar realmente fierbinte).
După 36-48 de ore durerile s-au intensificat foarte mult şi copilul (avea totuşi numai 15 ani) nu
s-a mai putut deplasa fără ajutorul unuia dintre părinţi sau a unui cadru metalic.
Au început peripluri prin unităţi sanitare, iniţial la un spital cu profil de „urgenţe copii”, ulterior
la un spital de urgenţă „pentru adulţi”, la o secţie de ortopedie (imaginile radiologice nu sugerau
nimic, se pare). La cel de al doilea spital s-au administrat medicamente calmante, s-au efectuat
noi radiografii plus recomandarea de a reveni luni, pentru noi analize.
În timpul weekend-ului durerile s-au intensificat şi a fost înregistrată febra (peste 38,5ºC);
copilul nu mai putea pune „pe pământ” membrul inferior drept.
La recomandarea unor cunoştinţe, familia s-a îndreptat iniţial către cel de al treilea spital (cu
profil „depentru
necesar copii”).
a îlLaconsulta
acest spital, în tot
pe copil cursul
care dimineţii respective,
menţionează, nimeni
din amintiri: nu anugăsit
„nimeni s -a timpul
uitat la
mine, eu mă ţineam de pereţi şi mama alerga...”, motiv pentru care au plecat de la al treilea
spital şi s-au îndreptat spre cel de al doilea, cel cu profil „de adulţi”. Analizele efectuate au fost
remarcabile prin intensitatea inflamaţiei (tradusă prin valorile înalte ale reactanţilor de fază
acută) şi sugerarea unei infecţii. Medicul a luat legătura cu un coleg de la un al patrulea spital
(cu profil „de copii”), suspicionând, se pare, un proces tumoral localizat osteo-articular.
Din amintirile de copil am putea remarca «între timp trecuseră cam 5 zile, poate chiar o
săptămână, urlam de durere când încercam să merg, abia mai puteam să mă dau jos din pat şi
daca eram ajutat urlam de durere pentru că nu mai suportam să fiu atins; devenise un chin să
merg la baie pentru că oricum dura mult şi acolo nu prea mai puteam să stau ... mi s-au făcut
analize, radiografii; analizele indicau o „infecţie care creştea" în comparaţie cu analizele trecute
... radiografiile nu spuneau nimic».
Medicii, după un timp, au indicat tratament cu oxacilină, 12g/zi, iar între diagnosticele
diferenţiale luate în discuţie s-au aflat: cancer osos (cel mai frecvent discutat), tuberculoză
osoasă, reumatism şi ... în cel mai bun caz, o infecţie (copilul, actualul nostru coleg, îşi aminteşte
că după
acest mult
lucru detimp a aflat de
la început; şi îşilamai
părinţi că a existat
aminteşte şi aspecte,
şi alte suspiciunea de cancer,
pe care dar părinţii
nu le putem discutaau în
ştiut
materialul de faţă).
După circa 1 săptămână de la internare, pacientul se deplasa cu mare greutate, circa 15 metri în
30 de minute, ca să ajungă la baie („noroc cu nişte băieţi care stăteau cu mine în salon şi mă
ajutau”). A primit în continuare oxacilină 12 g/zi, a fost examinat repetat, radiologic (se pare că
s-au executat 20-25 de radiografii de bazin de la început şi până în timpul acestei internări),
semnele de laborator (reactanţii de fază acută) au început să stagneze sau să evolueze pozitiv;
durerile au continuat, la fel şi impotenţa funcţională.
La sfaturile unor prieteni, părinţii au decis să transfere pacientul în al cincilea spital, cu profil „de
313
adulţi”, transfer care nu a fost realizat cu foarte multă uşurinţă, dar se pare că acest ultim
transfer a fost salutar. Actualul nostru coleg poartă şi astăzi un deosebit respect celor care s-au
ocupat de el în clinica de ortopedie a spitalului, atât şefului de clinică dar şi un ui coleg, care la
acea vreme era mai tânăr şi pe care avem plăcerea să îl cunoaştem şi noi. Datorită suspiciunii de
cancer osos, au urmat alte analize, o tomografie computerizată şi o scintigrafie osoasă (din
fericire infirmând respectiva suspiciune); tratamentul anti-infecţios a fost continuat iniţial cu
oxacilină 2g/zi în asociere cu gentamicină 2mg/kg/corp (de 2 ori pe zi) timp de 2 săptămâni,
urmat de tratament cu oxacilină 2g/zi.
Tânărul nostru coleg îşi mai aminteşte că, înainte de transferul la al ci ncilea spital tratamentul a
fost administrat intra-venos „când am plecat de la ... deja arătam ca un drogat; aveam pe mâini
foartecămulte
dată vene
a existat sparte, cheaguri
suspiciunea pe branule
de cancer ...” iarcirca
osos a slăbit în momentul în care a auzit pentru prima
4 kg în 2 zile.
În final, pacientul a fost externat, vindecat, după o lungă perioadă de suferinţă.
Din discuţia cu tânărul nostru coleg şi din amintirile acestuia, nu am remarcat vreo încercare de
diagnostic microbiologic, vreo recoltare de produs patologic care să fie transmis spre analiză
(înainte de administrarea antibioticelor sau chimioterapicelor), vreo recoltare de sânge pentru
hemoculturi.
Nu putem menţiona toate impresiile pe care copilul, pacientul, tânărul coleg le -a acumulat pe
parcursul acestei experienţe de viaţă. Totuşi, amintim o dorinţă exprimată de acesta „de fiecare
dată când trebuie să merg la spital, mă rog să dau de un OM”.
Foarte mult timp, la cursuri în timpul studenţiei sau în timpul rezidenţiatului am fost învăţaţi că
IDR cu PPD (vezi şi anexa nr. 3) „nu are nici o valoare, în România, pentru că toţi copiii sunt
vaccinaţi la naştere, pentru că tuberculoza este endemică etc.; în aceste condiţii toţi cetăţenii
români au IDR pozitiv şi o nouă testare nu va aduce nicio informaţie utilă.” Am suspicionat de
mult timppatru
În ultimii că această „teoremă”
ani, prin colaborarenu cu
areoacoperire reală. entuziaşti (sigur, studiile trebuie
serie de studenţi
continuate şi este necesară realizarea unor observaţii pe un lot semnificativ statistic), am
început infirmarea acestor supoziţii, transmise, din păcate, multor generaţii de studenţi,
rezidenţi etc. Din cei peste 60 de studenţi care au dorit să participe la studiu, în 40,9% dintre
cazuri valoarea citirii la 48 şi 72 de ore a fost 0 (zero) milimetri în timp ce în 19,7% valoarea
induraţiei a fost de peste 10 şi până la 22 milimetri. Într -un caz, consultul cu medicul de
specialitate pneumo-ftiziolog a dus la recomandarea administrării de hidrazidă a acidului
izonicotinic, pentru prevenirea unei tuberculoze manifeste, ceea ce probabil a fost salutar
pentru respectivul, mai tânăr, coleg.
La următoarele întrebări se pot alege unul sau mai multe răspunsuri corecte (după caz):
1.
A. Care dintreeste
anamneza următoarele afirmaţii sunt
cea mai importantă corecte: a demersului diagnostic
componentă
B. anamneza, examenul clinic obiectiv şi investigaţiile paraclinice compun “trepiedul diagnostic”
C. anamneza poate orienta examenul clinic obiectiv
D. examenul clinic obiectiv poate suplini anamneza în cazul pacienţilor conştienţi şi cooperanţi
E. testele paraclinice se rezumă la tehnici de investigaţie imagistică
314
la demersul terapeutic
B. antibiograma nu mai este de actualitate în demersul diagnostic şi terapeutic în bolile
infecţioase, cazurile de rezistenţă la antibiotice şi chimoterapice fiind din ce în ce mai rare
C.recoltarea produselor patologice trebuie efectuată înainte de administrarea tratamentului
antimicrobian
D. saliva poate înlocui cu succes sputa ca şi produs patologic recoltat în infecţiile respiratorii
inferioare
E.în cadrul examenelor de laborator, diagnosticul microbiologic are doar semnificaţie istorică
A.periodicitatea
B.relaţia episoadelor
dintre puls febrile
şi temperatură
C.administrarea de antibiotice şi/sau antipiretice
D.pattern-ul de remisie a episoadelor febrile
E.frecvenţa şi durata episoadelor febrile
adevărate,
A. CU EXCEPŢIA:
se vor realiza minim două frotiuri din produsul patologic, care se vor colora cu albastru de
metilen (AM) / Giemsa şi respectiv Gram
B. în cazul suspicionării unei infecţii urinare, sedimentul urinar se va examina între lamă şi
lamelă
C. prezenţa celulelor inflamatorii este un element frecvent decelat şi ca atare poate fi trecut cu
vederea
D. în cazul suspicionării unei infecţii mycobacteriene este necesară realizarea unui frotiu colorat
Ziehl-Neelsen
E.atunci când produsul recoltat este reprezentat de sânge, urină sau materii fecale, de regulă nu
se realizează frotiuri fixate şi colorate
315
Lumea microbiană este alcătuită dintr-un mare număr de ordine, familii, genuri, specii,
subspecii, tipuri, subtipuri şi tulpini microbiene a căror p rezentare face subiectul unor
importante tratate în domeniu. În lucrarea de faţă vor fi incluse informaţiile considerate
esenţiale şi care sunt organizate utilizând un stil, pe care îl considerăm folositor.
Microbiologia medicală reprezintă o specialitate care poate asigura (în condiţiile în care
între clinică şi laborator funcţionează) date foarte precise, oferind suportul stabilirii
unor atitudini, uneori decisive pentru evoluţia ulterioară a pacientului.
În acest sens se pot da numeroase exemple, dar ne vom opri asupra a trei dintre acestea.
În cazul în care un pacient se prezintă la medic şi afirmă că are o infecţie urinară, medicul va
putea, prin efectuarea în mod corect a anamnezei (ex. discuţia cu pacientul respectiv) şi a
examenului clinic, să realizeze un prim pas către diagnostic şi stabilirea tratamenului. Însă
certitudinea diagnosticului şi stabilirea tratamentului corect vor rezulta numai prin examenul de
laborator.
Într-o suspiciune de infecţie urinară, urocultura cantitativă trebuie precedată de examenul
microscopic al sedimentului urinar care necesită o dotare minimă (eprubete, centrifugă fără
pretenţii, lame, lamele, microscop optic nesofisticat şi mai ales, dorinţamediculuideafacecât
maimultşicâtmaibinepentrupacienţiisăi). Urina recoltată corect (adică aşa cum se cunoaşte
încă din facultate) trebuie examinată macroscopic, centrifugată iar sedimentul urinar trebuie
examinat microscopic. În circa 20 de minute (sau mai puţin) se va putea observa eventuala
prezenţă a leucocitelor în sediment, amănunt care va permite (în contextul clinic respectiv)
aprecierea corespunzătoare a situaţiei şi adoptarea atitudinii celei mai potrivite. Utilizarea
corectă a datelor de laborator va permite nu numai o diminuare a risipei de medii de cultură şi
reactivi (nu în ultimul rând a timpului celui / celor care procesează probele) ci şi o posibilă
direcţionare spre un alt diagnostic decât cel al unei eventuale infecţii urinare, interpretată în
mod mecanic sau la indicaţia / solicitarea pacientului. Un studiu pe care nu l-am publicat a
arătat că într-unul dintre spitalele din Bucureşti, din peste 10.000 de uroculturi efectuate, s-au
pozitivat mai puţin de 20%; examinarea sedimentului urinar ar fi putut contribu i la selectarea
situaţiilor în care urocultura „merita” să fie făcută.
În cazul prezenţei unor dureri de cap intense (cefalee), a apariţiei fotofobiei, vărsăturilor fără
efort, poziţiei caracteristice (antalgice) se ridică ipoteza unei meningite a cărei etiologii nu se
poate preciza fără diagnosticul de laborator. Acest diagnostic va permite diferenţierea unor
meningite în funcţie de cauză [există meningite neinfecţioase şi meningite infecţioase (virale,
bacteriene, parazitare sau fungice), iar examenul biochimic la LCR împreună cu diagnosticul de
laborator microbiologic vor putea arăta care este etiologia]. Acest lucru este de maximă
importanţă atât pentru evoluţia ulterioară, cât şi pentru prognosticul pacientului implicat
deoarece este bine cunoscut faptul că în cazul meningitei există şi posibilitatea unei evoluţii
nefavorabile, cu persistenţa unor sechele sau chiar apariţia decesului. În cazul unei meningite
(inclusiv a unei meningite meningococice), recoltarea şi transportul lichidului cefalo-rahidian
316
este esenţială. Este de preferat ca medicul să ştie care sunt manevrele necesare pentru a
procesa produsul patologic "la patul bolnavului". Realizarea şi examinarea corectă a frotiurilor
va permite nu numai ca în maxim 20 minute să se pună diagnosticul de meningită
meningococică (prezenţa leucocitelor şi a cocilor Gram-negativi intra şi extra-leucocitari) dar şi
să se instituie tratamentul (de ex. cu penicilină).
minuţiozitate
examenele asupra examinării
paraclinice semnelor
se realizează şi simptomelor
de obicei în relaţie cu aparatul respirator.
radiografia cardio-toraco-pulmonară. Alte Dintre
examene de laborator (aşa cum am menţionat în capitolul precedent) sunt necesare şi trebuie
efectuate. Din punct de vedere microbiologic, recoltarea corectă şi transportul sputei reprezintă
elementul esenţial. În laborator sputa va fi prelucrată, vom realiza cel puţin trei frotiuri pe care
le fixăm şi colorăm cu AM / Giemsa, Gram şi Ziehl-Neelsen. Din momentul recoltării produsului
patologic şi până la obţinerea primelor informaţii prin examinarea frotiurilor, pot trece nu mai
mult de 20- 30 minute. În cazul în care nu parcurgem aceste etape şi de ex. administrăm direct
tetraciclină, evoluţia pacientului ar putea fi nefavorabilă, chiar şi către deces, iar frotiurile
realizate şi examinate post-mortem (pe produse recoltate anatomo-patologic) ar putea
demonstra prezenţa de hife şi levuri, semnificând o infecţie fungică. Continuând cu etapa de
identificare am putea stabili, de ex., că a fost vorba de o pneumonie provocată de Candida
albicans . Decesul a fost precipitat de utilizarea iraţională a tetraciclinei, medicament care
distrugând flora de asociaţie a permis multiplicarea „în voie” a fungului respectiv. Dacă am fi
examinat sputa recoltată de la bolnav am fi putut detecta prezenţa elementelor fungice şi am fi
ales medicaţia corespunzătoare.
Bacteriile studiate pot fi grupate după mai multe criterii, dar o variantă utilă este cea în care
avem în vedere structura peretelui bacterian şi respectiv afinitatea acestuia faţă de diferiţi
coloranţi.
Un prim grup important este cel care include Gram-pozitivi
(stafilococi, streptococi, pneumococi etc) şi respectiv Gram-negativi (meningococi, gonococi
etc).
Între bacteriile Gram-negative care au dimensiuni pe baza cărora nu pot fi încadrate drept coci
sau bacili se află parvobacteriile, Gram-negativi (H.influenzae,B.pertussis,Brucella
spp. etc).
Gram-pozitivi care vor fi incluşi în prezentările din acest manual se pot grupa în bacili
nesporulaţi (Corynebacteriumdiphteriae,Listeriaspp.) şi respectiv bacili Gram-pozitivi sporulaţi
(Bacillusanthracis,Clostridiumspp .). Totuşi, nu trebuie să uităm că există şi alţi bacili Gram-
pozitivi.
Bacilii Gram-negativi studiaţi fie aparţin familiei foarte numeroase a enterobacteriilor ( E.coli,
Salmonellaspp.,Shigellaspp.,Klebsiellapneumoniae,Proteusspp.,Yersiniaspp . etc),fie sunt
incluşi în genuri
Pseudomonas . separate precum V.cholerae din genul Vibrio sau Ps.aeruginosa din genul
Microorganismele din genul Mycobacterium se pot colora (cu destul de mare dificultate; uneori
nu se colorează şi apar sub aspectul unor zone necolorate, „fantome” bacteriene) prin metoda
Gram, dar în mod caracteristic se colorează prin metoda Ziehl -Neelsen. O adaptare a tehnicii
Ziehl-Neelsen este medoda de colorare Kinyoun. Specia principală studiată este M.tuberculosis.
Există şi alte specii de mycobacterii dar şi bacterii aparţinând altor specii şi genuri, care se pot
colora prin aceste tehnici.
O serie de (Treponemapallidum,Leptospiraspp.,Borreliaspp .) nu se colorează
prin metoda Gram datorită structurii particulare a peretelui. Pot fi studiate microscopic fie în
317
preparate proaspete (utilizând tehnici microscopice speciale) fie utilizând coloraţii particulare
(ex. impregnarea argentică).
Până în urmă cu o perioadă de timp microorganismele aparţinând genurilor Rickettsia,
Chlamydia şi Mycoplasma erau incluse în categoria virusurilor. Totuşi, proprietăţile lor
fundamentale fac să le studiem astăzi între bacterii.
În obiectul de studiu sunt încadraţi şi fungii (ciupercile) care au o serie de caracteristici aparte.
Noţiunile legate de micologie sunt reluate în cadrul dermatologiei iar diagnosticul micologic este
prezentat mai pe larg în diferite tratate de specialitate.
În ceea ceizolarea
necesară priveştemicroorganismului
tratamentul, este util să reţinem
implicat, că pentru
identificarea majoritatea
acestuia situaţiilor
şi testarea este la
sensibilităţii
antibiotice şi chimioterapice (de ex. utilizând cel puţin antibiograma difuzimetrică).
318
Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili, nesporulaţi, catalază-
pozitivi.
Genul Staphylococcus cuprinde mai multe grupe de microorganisme de interes medical (unele
dintre aceste grupuri incluzând mai multe specii).
S.aureus este şi specia recunoscută cel mai de mult (Rosenbach, 1884), în timp ce una dintre
speciile recunoscute mai recent, S.succinus, se estimează că ar avea o „existenţă” de mai multe
milioane de ani. Numărul speciilor din acest gen a ajuns la 35, însă numărul este şi mai mare
dacă luăm în consideraţie şi subspeciile (de ex. S.aureus subspecia aureus şi S.aureus subspecia
anaerobius ).
Cele mai cunoscute specii sunt reprezentate de:
-S.aureus;
-S.epidermidis(produce un pigment alb);
-S.saprophyticus(produce un pigment citrin).
S.aureusreprezintă specia cel mai frecvent implicată în clinică, în timp ce celelalte două specii
sunt de obicei nepatogene. În funcţie de capacitatea de a elabora coagulază, toţi stafilococii
coagulazo-pozitivi sunt grupaţi ca S.aureus.
S.aureusse poate multiplica la nivelul tegumentelor şi mucoaselor (în special în zonele piloase
şi la nivelul vestibulului nazal).
Există o serie de factori care determină şi/sau influenţează starea de purtător pentru S.aureus.
O parte dintre aceşti factori sunt legaţi de apărarea la nivel de gazdă, o parte sunt corelaţi cu
anumite proprietăţi ale bacteriei. Dintre acestea, menţionăm formarea de biofilm (caracteristică
tulpinilor care se pretează portajului nazal, dar nu şi celor care nu determină stare de portaj) (1),
care pare să faciliteze nu numai creşterea supravieţuirii bacteriilor în contextul tratamentului
antibiotic, dar şi evitarea mecanismelor de apărare specifice gazdei, care pot fi de tip peptide
antimicrobiene precum: lizozimul, lactoferina, SLPI (secretory leukoprotease inhibitor),
catelicidine, alfa şi beta defensine (2), inclusiv beta defensina umană 3 (HBD -3), cea mai
eficientă dintre beta defensine în ceea priveşte rolul în infecţiile cu S.aureus(3).
Deoarece unele studii arată că circa 20% dintre persoanele sănătoase sunt purtătoare în mod
permanent de S.aureus iar în circa alte 50-60% dintre cazuri este discutată situaţia portajului
temporar, s-a intuit că există un anumit grad de influenţă genetică privind starea de purtător de
S.aureus. Într-un studiu transversal recent la care au participat în mod voluntar colegii tineri
aflaţi în finalul anului 2 de facultate (date nepublicate, 2007), 35,5% dintre studenţi au fost
purtători de Staphylococcusaureus, nazal şi/sau faringian. Un studiu similar, transversal,
efectuat în 2010 în Brazilia, pe un lot comparabil de voluntari (incluzând studenţi aflaţi în finalul
319
anilor 1 şi 2 de facultate în domeniile: farmacie, medicină dentară şi medicină generală), a
decelat un procent de portaj nazal de 40,8% (102/250), un CMI (50) la meticilină de 0,5 µg/mL şi
un CMI (90) de 1 µg/mL. Datele obţinute de noi în România sunt comparabile cu cele obţinute în
Brazilia, cu atât mai mult cu cât există similitudini şi la nivelul loturilor de voluntari incluse în
studiu.
Stafilococii coaguloază-negativi (SCN) formează microcolonii la nivelul foliculilor piloşi (4) şi la
nivelul glandelor sebacee. Habitatul principal pentru S.epidermidis este reprezentat de
vestibulul nazal.
Deoarece au un tropism special pentru derm, stafilococii pot fi implicaţi în infecţii la nivelul
tegumentelor
localizate şi anexelor
la nivelul pielii
oricărui (infecţii
alt ţesut sauînsoţite
organ. de puroi), dar pot fi implicaţi şi în infecţii
Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi, cu diametrul de 0,6-1,5 mm. Pe frotiul realizat din cultura pe
medii solide se poate remarca o dispoziţie în grămezi neregulate. În frotiurile realizate din
culturi pe medii lichide sau din produse patogene, se pot dispune în lanţuri scurte, perechi sau
coci izolaţi. În culturile cu o vechime mai mare de 2 zile, stafilococii pot apărea ca şi Gram-
variabil sau chiar şi Gram-negativi „la limită”.
Se dezvoltă în general pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore, la 35-37°C. Coloniile au aspect
de tip S, au diametrul cuprins între 1-3 mm şi sunt pigmentate în funcţie de specia izolată.
Pigmentarea devine mai pronunţată după menţinerea plăcii cu mediul de cultură încă 24 -48 ore
la temperatura camerei.
Pe mediul geloză-sânge, în jurul coloniilor poate apărea o zonă de hemoliză clară (β-hemoliză),
dar S.aureus poate produce mai multe tipuri de hemolizine.
Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolerând o concentraţie de 7-10% NaCl
(exemplu mediul Chapman).
Stafilococii sunt relativ rezistenţi faţă de agenţii din mediul extern. În culturi (bulion, geloză),
rezistă la temperatura frigiderului câteva luni; în puroi uscat pot supravieţui 2 -3 luni.
320
Sunt relativ rezistenţi la anumite antiseptice şi dezinfectante (de exemplu, rezistă peste 30
minute la alcool 70°şi peste 10 minute în fenol 2%). Sunt distruşi în 60 minute la o temperatură
de 60°C.
321
fibrină. Procesul diferă de coagularea normală prin faptul că nu sunt necesari o serie de factori
(ex. Ca2+) iar cheagul care se formează este mai friabil şi nu se retractă. Studii recente
demonstrează că TFPI (inhibitorul căii factorului tisular), prin secvenţa sa C -terminală, joacă un
rol antimicrobian împotriva S.aureus şi împotriva altor bacterii Gram-pozitive (Bacillussubtilis ),
Gram-negative (Escherichiacoli şi Pseudomonasaeruginosa) şi chiar împotriva fungilor Candida
albicans şi Candidaparapsilosis (6).
c). Stafilococii pot produce o serie de hidrolaze cu structuri antigenice diferite, precum:
- stafilokinaza, care determină liza cheagului (prin convertirea plasminogenului în plasmină) sub
controlul unui material genetic fagic;
- nucleaza (termonucleaza), cu activitate endo- şi exonucleazică asupra ADN şi ARN, generând
3'-nucleotide;
- diferite lipaze evidenţiabile prin opacifierea agarului cu gălbenuş de ou sau prin scindarea
substanţei numită Tween; contribuie la supravieţuirea stafilococului la nivel dermic;
- hialuronidaza;
- ureaza;
- diferite proteaze (serin protează, cistein protează, metaloprotează).
d). În momentul se faţă se cunosc patru hemolizine produse de stafilococi. O tulpină anume
poate produce mai multe hemolizine. Unele dintre hemolizine distrug şi alte celule, ducând la o
necroză locală şi pot avea efecte letale asupra animalelor de experienţă. Principalele caractere
ale hemolizinelor sunt următoarele:
e). Stafilococii pot produce o serie de exotoxine piretogene, un grup de toxine cu mai multe
activităţi patogene, spre exemplu cu efecte imunosupresoare, cu un efect mitogen mai
pronunţat la nivelul limfocitelor T supresoare (au capacitatea de a activa policlonal toate celule
322
T); cresc toxicitatea endotoxinelor germenilor Gram-negativi (blochează funcţia de clearance a
sistemului reticuloendotelial); produc eritrodermie prin mecanisme de hipersensibilitate de tip
întârziat. Efectul piretogen se realizează cel puţin în parte prin stimularea producerii de IL-1. Din
acest grup fac parte exotoxinele piretogene A şi B, enterotoxinele stafilococice (cu cinci tipuri
serologice) şi respectiv TSST-1, cauza sindromului de şoc toxic stafilococic. Circa 50% din
tulpinile de S.aureus izolate produc una sau mai multe enterotoxine. Aproximativ 15% produc
TSST-1. Mai rare sunt tulpinile care produc exotoxine piretogene A şi B.
f). Leucocidina este produsă de majoritatea tulpinilor de S.aureus şi acţionează numai asupra
polinuclearelor şi macrofagelor de om şi iepure. Are două componente, F şi S. Componenta S se
fixează pe gangliozidul GM 1 (receptor pentru toxina holerică) şi activează o fosfolipază
endogenă,
apoi legată
un canal ionicdepentru
membrană. Produşii acesteia
K +şi conducând astfel la se fixează apoi pe componenta F, inducând
citoliză.
g). Exfoliatina (toxina epidermolitică) produce o varietate de leziuni dermatologice. Este o
proteină termolabilă şi acid-labilă, cu greutatea moleculară de 24.000 Da, produsă de circa 5%
din tulpinile de S.aureus. S-au descris două variante antigenice, ETB (codificată de un plasmid) şi
respectiv ETA (codificată cromozomial). Multe tulpini produc ambele exfoliatine. Toxina
acţionează prin clivarea stratului granular al epidermului, probabil prin scindarea desmosomilor
care unesc celulele acestui strat.
Bacteriocine
S.epidermidisproduce epidermina (stafilococina 1580) şi Pep5, care sunt lantibiotice. S.
gallinarum produce galidermina. Aceste lantibiotice au efecte în special asupra bacteriilor
Gram-pozitive, chiar şi asupra unor tulpini de stafilococi din altă specie decât cea producătoare.
Imunitatea postinfecţioasă este specifică faţă de produşii extracelulari (toxine, enzime) şi faţă de
antigenele legate de corpii bacterieni. Titrul anticorpilor antistafilococici este scăzut (creşte,
eventual, în cursul unor infecţii generalizate, dar nu influenţează evoluţia spre vindecare) şi nu
are utilitate practică în diagnostic. Există un însemnat potenţial de producere a unui vaccin
stafilococic care să poată fi acceptat în Uniunea Europeană (deocamdată nici un astfel de
produs nu are licenţă la nivelul UE).
S.aureusare posibilitea de a îşi modifica fenotipul, prezentându-se sub forma de SCV (small
colony variants), pentru a scăpa sistemului imun şi pentru a genera o infecţie cronică. Un studiu
pe modele celulare a arătat că printre tehnicile de persistenţă se află modificarea expresiei
factorilor de virulenţă, auxotrofismul (inabilitatea unui microorganism de a sintetiza un compus
organic necesar procesului de creştere) dar şi această diversitate fenotipică, care s-a dovedit a fi
un proces extrem de dinamic, fenotipurile SCV transformându-se rapid înapoi în fenotipurile
sălbatice complet virulente în momentul părăsirii localizării intracelulare (7).
Atât S.aureus cât şi o parte dintre SCN sunt incluşi în categoria microorganismelor condiţionat
patogene.
323
S.aureusapare mai frecvent implicat în producerea unor infecţii, de obicei la nivelul
tegumentelor şi mucoaselor, însoţite de formarea de puroi, dar cu potenţial de generalizare.
Tulpinile de S.aureus au capacitatea de a adera la mucoase, epitelii, endotelii, în special datorită
prezenţei acidului lipoteichoic, proteinei A şi altor adezine. După aderare şi multiplicare, în
cursul infecţiilor pot fi produse o serie de substanţe cu rol în patogenitate (enzimele şi toxinele
elaborate au fost prezentate la punctul 29. 2. 6).
De menţionat şi faptul că stafilococii reprezintă unele dintre primele microorganisme pentru
care s-a descris fenomenul apariţiei rezistenţei la antibiotice. Rezistenţa la penicilină (mediată
de o β-lactamază) a fost evidenţiată încă din anul 1947. Ulterior, pe măsura utilizării în infecţiile
stafilococice a unor diferite antibiotice (inclusiv a „penicilinelor penicinilazo-rezistente“), s-au
În mod clasic era considerat că o tulpină de S.aureus intră în categoria VISA în cazul în care CMI
este ≥ 6 μg/ml (determinare prin „E test”) şi în categoria VRSA în cazul în care CMI este ≥ 32
μg/ml. Conform EUCAST (2010), o tulpină de stafilococ este rezistentă la vancomicină în cazul în
care CMI este > 2 μg/ml.
Opţiunile de tratament în infecţiile cu VRSA sunt limitate. O clasă de antimicrobiene care poate
fi utilizată în tratamentul VRSA este reprezentată de streptogramine (quinupristin/dalfopristin,
pristinamicina, virginiamicina, NXL 103, etamycin).
Cu toate acestea, a fost identificată rezistenţă şi la streptogramine (9), existând totuşi
posibilitatea tratării S.aureus rezistent la streptogramina B cu lincosamide, prevalenţa acestui
fenotip fiind însă redusă, de 60,3%, spre deosebire de prevalenţa de 92,8% a tulpinilor
rezistente constitutiv la macrolide, lincosamide şi streptogramina B (10).
Stafilococii pot deveni patogeni şi se pot manifesta ca atare fie prin multiplicare şi invazivitate,
fie prin multiplicare şi toxinogeneză (fiind posibilă şi îmbinarea acestor mecanisme).
324
producere a furunculelor; coagulaza contribuie la localizarea şi persistenţa infecţiei;
hialuronidaza contribuie la invazivitate etc. Ar fi de menţionat că tulpinile izolate de la nivelul
unor furuncule sunt mai bogate în lipază şi mai sărace în hialuronidază faţă de cele izolate din
impetigo bulos. Tulpinile capsulate sunt mai virulente (împiedică fagocitoza); frecvenţa lor pare
a fi mai mare „in vivo”, deci rolul capsulei pare a fi mai important decât se credea anterior.
Datorită faptului că nici unul din caracterele enumerate nu pare a fi decisiv în virulenţa
stafilococilor, tulpinile de S.aureus nu pot fi clasificate net în patogene şi nepatogene, aşa cum
se poate face de ex. în cazul tulpinilor de Corynebacteriumdiphteriae, tox sau tox .
S.aureuseste implicat ca agent etiologic într-o mare varietate de infecţii supurative (cu puroi),
începând cu
furuncule, infecţiile
abcese superficiale
profunde, aleale
infecţii tegumentelor şi mucoaselor
diferitelor organe şi continuând
interne cu cu panariţii,
sau fără generalizarea
infecţiei. Pe de altă parte, ar fi de menţionat toxinozele (datorate în special toxinelor elaborate)
şi anume toxiinfecţiile alimentare, necroliza toxică a epidermului, sindromul de şoc toxic etc.
Toxiinfecţiile alimentare sunt provocate de exotoxinele preformate, existente în alimente în
care s-au multiplicat stafilococi enterotoxigeni. Simptomele principale sunt reprezentate de
greţuri, crampe abdominale, vărsături, diaree care apar la 1-4 (1-6) ore după ingestia
alimentelor contaminate. Se vindecă în general în circa 24 de ore. Alimentele sunt contaminate
în general de către cei care le manipulează (de exemplu bucătarul prezintă un panariţiu).
Alimentele mai frecvent incriminate sunt cremele, brânza, îngheţata, carnea şi produsele din
carne (acestea pot constitui adevărate medii de cultură pentru bacterii). Enterotoxinele
stafilococice sunt termostabile (rezistă 30 minute la 100°C), ceea ce impune păstrarea
alimentelor la frigider, atât înainte cât şi după preparare.
Dermatitele exfoliative includ dermatita exfoliativă generalizată (boala Ritter) care poate apărea
la nou născut; epidermonecroza toxică (întâlnită la copii şi eventual la adulţi); impetigo bulos şi
„scarlatina stafilococică” (spre deosebire de cea streptococică, nu afectează limba şi palatul).
325
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de stafilococi este doar bacteriologic (direct) şi
respectă etapele clasice ale acestui tip de diagnostic, începând cu recoltarea şi transportul
produsului patologic, de obicei reprezentat de puroi (fie dintr-o leziune deschisă, superficială,
fie din leziuni închise, profunde). Cultivarea în vederea obţinerii de colonii izolate se continuă cu
identificarea în care pe lângă caracterele morfologice, de cultură şi biochimice se face testul
coagulazei pe lamă şi/sau în tub. Antibiograma completează în mod diagnosticul de
laborator al unei infecţii stafilococice.
Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse de stafilococi vom alege drept
reprezentative şi ne vom referi numai la
Staphylococcusaureus .
326
Caractere morfotinctoriale: sunt coci Gram-pozitivi, cu diametrul de circa 0,6-1,5 mm,
dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi sau în grămezi neregulate.
Caractere de cultură: produc colonii de tip S, pigmentate auriu; pe mediile cu sânge pot
produce hemoliză.
Caractere biochimice: stafilococii au un metabolism glucidic atât respirator cât şi
fermentativ. Fermentează glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharozaetc. cu producere
de acid. Capacitatea de acidifiere a mediului conţinând manită este utilizată ca test de
diferenţiere între S.aureus( ) şi SCN (manită-negativ). S.aureuseste
catalază-pozitiv (vezi anexa nr. 2) (la fel ca și ceilalți stafilococi). De importanță egală
taxonomică și recomandat drept al doilea test de confirmare a apartenenței la specia S.
aureuseste testul dezoxiribonucleazei termostabile. Se poate face şi testul fosfatazei
(poate fi pozitiv și la unele specii coagulază-negative). Există sisteme multitest care se
pot procura comercial (API, Micro Scan, Minitek, Vitek etc).
Caractere antigenice: Pentru diferențierea S.aureus de SCN se pot utiliza teste
comerciale care includ fibrinogen şi IgG care cuplează coagulaza legată şi proteina A
(tehnici de aglutinare indirectă). Se pot utiliza şi truse cu anticorpi monoclonali faţă de
endo-β-N-acetil-glucozaminidazei stafilococice.
Caractere de patogenitate:
o Trebuie efectuat (vezi anexa nr. 2); factorul care produce
coagularea pe lamă poate fi prezent la circa 10% dintre tulpinile de S.
intermedius. În cazul în care în testul coagulazei pe lamă se foloseşte plasmă
umană, rezultatul poate fi pozitiv pentru S.lugdunensis şi S.schleiferi (subspecia
schleiferi).
o Pentru identificarea exotoxinelor se poate utiliza o tehnică de tip ELISA sau
aglutinarea pasivă inversată (vezi şi capitolele 20 şi 23).
Sensibilitatea la bacteriofagi: Susceptibilitatea la acţiunea litică a bacteriofagilor a fost
sistematizată
centrelor pentru tulpinile
de referinţă. deset
Există un de bazăîntr-un
S.aureus sistem carecare
de bacteriofagi, se poate
permitutiliza la nivelul
încadrarea S.
aureusîn unul din grupele I, II, III sau V. Lizotipia este actualmente evaluată comparativ
cu capacitatea „discriminatorie” a testelor care au ca mecanism biologia moleculară (ex.
ribotiparea).
Alte caractere / teste utilizate în identificare: Se pot utiliza (în centre de referinţă) teste
care se bazează pe proprietăţi fenotipice moleculare (studiul acizilor graşi celulari, al
unor enzime sau al unor polipeptide totale) sau genotipice (fragmente de restricţie ale
materialului genetic, hibridarea moleculară, ribotiparea etc.). S-au dezvoltat tehnici
rapide utilizând truse de identificare şi instrumenteautomatizate pentru evidenţierea
unor elemente ale peretelui celular (proteina A, coagulaza legată), a enzimelor
elaborate în aliment sau lichidul de hemocultură (testul pentru termonuclează) şi a
toxinelor (enterotoxine, TSST1, exfoliatine). Există metode care utilizează markeri
moleculari pentru evidenţierea prezenţei MRSA (stafilococ rezistent la meticilină, de ex.
amplificarea genică, PCR pentru gena mecA, dar şi pentru genele femA,femB) şi/sau
pentru diferenţierea intraspecifică la S.aureusşi SCN.
327
Multe persoane sunt purtătoare de stafilococi la nivel tegumentar, nazal sau faringian. Chiar
dacă stafilococii ar fi eliminaţi complet de la nivelul vestibulului nazal, recolonizarea s-ar
produce foarte rapid (4).
Totuşi, în anumite situaţii (ex. pacienţi supuşi dializei peritoneale sau hemodializei, pacienţi
infectaţi cu HIV sau la personalul medical care lucrează de ex. în secţii de arşi) încercarea de
eliminare a stării de purtător are justificare. Se poate utiliza tratamentul local cu mupirocină.
Este încă în studiu utilizarea lizostafinei în acest scop (lizostafina este o enzimă litică produsă de
o tulpină de S.simulans; atacă puntea pentaglicinică de la nivelul lanţurilor de peptidoglican ai S.
aureus; au fost făcute experimente pe animale de laborator obţinându-se rezultate
promiţătoare) (11).
Stafilococii sunt ubicuitari. Sursa de infecţie cea mai comună este reprezentată de leziunile
stafilococice de la nivelul tegumentului. De menţionat posibilitatea răspândirii infecţiei cu
stafilococi rezistenţi la antibiotice (de spital), atunci când persoanele purtătoare sunt
reprezentate chiar de personalul medical şi auxiliar.
Referitor la (SSTS), în SUA s-au raportat 157 de cazuri în 1997,
138 de cazuri în 1998 şi 113 cazuri în 1999, cu o incidenţă anuală de 0,05 0/0000. În anul 2005 au
fost raportate numai 90 de cazuri (incidenţa fiind 0,04 0/0000). Tot în anul 2005 s-au raportat 2
cazuri de infecţie cu S.aureus cu sensibilitate intermediară la vancomicină (VISA) şi 3 cazuri de
infecţie cu S.aureusrezistent la vancomicină (VRSA).
În România nu sunt disponibile (la nivel naţional) date privind SSTS sau rezistenţa la vancomicină
a tulpinilor de S.aureus. Din datele laboratorului de referință pentru stafilococ din INCDMI
”Cantacuzino”, inclusiv cele provenite din supravegherea microorganismelor izolate din infectii
invazive pe baza protocoalelor EARSS (2002-2009), respectiv EARS.Net (din 2010), în România
328
nu au fost semnalate tulpini de S.aureus rezistente la vancomicină.
Laboratorul de referință pentru stafilococ din INCDMI ”Cantacuzino” poate detecta prin metode
moleculare prezenţa genelor pentru enterotoxine, leucocidina Panton Valentine, TSST1, în
culturi de S.aureus.
Prevenirea transmiterii infecţiei are la bază metodele de igienă, asepsie şi antisepsie. În spital,
secţiile cu risc sunt cele de neonatologie, terapie intensivă, sălile operatorii şi saloanele unde se
află pacienţi cu cancer aflaţi sub chimioterapie / sau cu alte cauze de imunodepresie. În aceste
situaţii, personalul medical trebuie investigat prin metode de laborator şi este de preferat ca
persoanele purtătoare de stafilococi coagulază-pozitivi să nu aibă acces în aceste incinte şi să nu
aibă contact direct cu pacienţii în cauză. Ca alternativă trebuie să se pună accentul pe proceduri
adecvate, care să evite contaminarea pacienților.
Utilizarea substanţelor antiseptice şi încercarea de eradicare cu a jutorul antibioticelor a
portajului nazal (ex. lizostafină, mupirocină) ar putea fi utile. (11)
Utilizarea vaccinului stafilococic poate să amelioreze starea clinică în anumite situaţii, de ex. la
pacienţi care necesită hemodializă, prezenţa de catetere etc. Din păcate la nivel internaţional
(EU) nu există un vaccin stafilococic care să fi primit autorizaţie de utilizare. În ţara noastră
vaccinul stafilococic produs de INCDMI ”Cantacuzino” a avut autorizație de utilizare până în anul
2010.
Un antibiotic cunoscut din clasa streptograminelor B, etamycin, şi-a demonstrat recent eficienţa
asupra MRSA (atât tulpinile comunitare cât şi cele spitaliceşti) pe modele murine cu infecţie
sistemică letală MRSA (13). Etamycin a fost izolat de la actinomicete marine descoperite recent
(CNS-575), ceea ce a atras atenţia asupra mediului marin – privit ca potenţială sursă pentru
329
identificarea altor antibiotice eficiente asupra tulpinilor rezistente ale diverselor specii
bacteriene. Etamycin a demonstrat de asemenea o eficienţă experimentală asupra mai multor
patogeni Gram-pozitivi sau Gram-negativi, fiind ne-citotoxic la concentraţii de 20 de ori mai
mari decât CMI-ul (care a fost de 1-2 mg/L pentru MRSA comunitar sau spitalicesc).
„ ” ... Acesta este numele dat de „U.S. Department of Health” S.aureus meticilino
rezistent (MRSA). Această „denumire” a fost preluată de reprezentanţii mass-media şi în
momentul de faţă acest nume a devenit de notorietate în Statele Unite şi nu numai.
Având în vedere faptul că numai pe o perioadă de un an s-au raportat în SUA circa 20.000 de
pacienţi care au fost internaţi cu acest diagnostic, „definiţia” şi numele par a fi potrivite şi este
strict necesar ca sistemul de raportare să se ocupe cu atenţie de această situaţie. Din păcate, şi
în acest caz, trebuie să ne bazăm în special pe datele din literatura de specialitate
internaţională, datele publicate în România fiind fie puţine, fie irelevante.
Din evenimentele care au avut loc recent (octombrie 2007) în legătură cu acest subiect,
amintim decizia luată de Guvernatorul Statului Virginia, care a promulgat în regim de urgenţă o
lege, prin care toate unităţile sanitare erau obligate să raporteze cazurile suspecte şi confirmate
de infecţie cu Staphylococcusaureus meticilino rezistent (MRSA), contribuind la stabilirea unui
sistem activ de raportare, pentru a se putea astfel demonstra care este evoluţia infecţiilor cu
MRSA în contextul unei campanii speciale de control a acestor infecţii.
Toate aceste reacţii, inclusiv măsura fără precedent de închidere a peste 20 de unităţi de
învăţământ pentru „dezinfecţie şi sterilizare” au fost instituite în contextul în care un tânăr de
17 ani a decedat prin sepsis stafilococic. Decesul lui O.R. a condus la o campanie în care au
participat în colaborare unităţile de învăţământ, elevii din aceste unităţi, sistemul medical
(inclusiv centrul de prevenire şi control al bolilor, mass-media, reprezentanţii autorităţilor locale
şi o serie de politicieni).
După cum am discutat în prezentul capitol, dar şi în alte capitole ale acestui manual, stafilococii
sunt prezenţi în mod normal pe tegumente şi mucoase. Totuşi, stafilococii pot fi implicaţi şi în
patologie. Pot fi vizate persoane imuno-competente, copii, adolescenţi, tineri.
De suficient de multe ori, cei care consideră că nu sunt vulnerabili sau cred că au un risc foarte
scăzut de îmbolnăvire, de ex. sportivii (mai ales cei care practică sporturile mai dure, însoţite de
contact direct şi care se consideră „indestructibili”) pot fi printre cei mai expuşi la infecţie şi
chiar la o evoluţie gravă a acesteia. La universitatea din Virginia, întreg lotul de lupte greco -
330
romane s-a infectat venind în contact cu o saltea de luptă contaminată de un coleg care s-a rănit
în timpul antrenamentului.
De multe ori, simpla respectare a unor reguli de igienă generală şi personală pot contribui
semnificativ la prevenirea apariţiei infecţiilor stafilococice. Pentru restul cazurilor studiul
individual, cercetarea bazelor de date şi experienţa câştigată cu fiecare caz consultat, investigat,
analizat şi discutat ne ajută să ajungem la cea mai bună ipoteză diagnostică, la cel mai bun
diagnostic diferenţial, la cel mai potrivit tratament în vederea celui mai bun prognostic pentru
pacientul sau pacienţii pe care îi vom examina de-a lungul întregii cariere medicale sau medico-
chirurgicale.
5. needed?
JHospInfect., 76(3):211-4.
Merino, N.; Toledo-Arana, A.; Vergara-Irigaray, M.; Valle, J.; Solano, C.; Calvo, E.; Lopez,
J. A.; Foster, T. J.; Penades, J. R.; Lasa, I., 2009, Protein A-mediated multicellular
behavior in Staphylococcus aureus. JBacteriol, 191, (3), 832-43.
6. Papareddy P, Kalle M, Kasetty G, Mörgelin M, Rydengård V, Albiger B, et al, 2010, C-
terminal peptides of tissue factor pathway inhibitor are novel host defense molecules, J
BiolChem., 285(36):28387-98.
7. Tuchscherr L, Medina E, Hussain M, Völker W, Heitmann V, Niemann S, et al., 2011,
Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape
host immune response and establish a chronic infection, EMBOMolMed., doi:
10.1002/emmm.201000115. [Epub ahead of print]
8. Schechter-Perkins EM, Mitchell PM, Murray KA, Rubin-Smith JE, Weir S, Gupta K., 2011,
Prevalence and Predictors of Nasal and Extranasal Staphylococcal Colonization in
Patients Presenting to the Emergency Department, AnnEmergMed., [Epub ahead of
print]
9. Ho PL, Lai EL, Chan MY, Chow KH., 2011, Distinctive patterns of macrolide-lincosamide-
streptogramin resistance
aureus populations phenotypes
in Hong and determinants amongst
Kong. IntJAntimicrobAgents Staphylococcus
, 37(2):181-2.
10. Saderi H, Emadi B, Owlia P., 2011, Phenotypic and genotypic study of macrolide,
lincosamide and streptogramin B (MLSB) resistance in clinical isolates of Staphylococcus
aureus in Tehran, Iran. MedSciMonit., 17(2):BR48-53.
11. Maria do Carmo de Freire Bastos, Bruna Gonçalves Coutinho, Marcus Lívio Varella
Coelho, 2010, Lysostaphin: A Staphylococcal Bacteriolysin with Potential Clinical
Applications, Pharmaceuticals 2010, 3(4), 1139-1161; doi:10.3390/ph3041139
331
Streptococii sunt coci sferici Gram-pozitivi care formează perechi sau lanţuri în cursul diviziunii
celulare. Sunt larg răspândiţi în natură. Unii fac parte din flora umană normală; alţii sunt asociaţi
cu afecţiuni umane importante datorate parţial infecţiei streptococice şi parţial răspunsului
imun al gazdei.
Nu există încă un sistem perfect pentru clasificarea tuturor speciilor de streptococi. Totuşi,
pentru a contura o imagine legată de numărul acestora, NCBI a creat un browser taxonomic
unde putem găsi speciile cunoscute până în acest moment. (1)
Dintre numeroasele specii, unele au importanţă medicală (în patologia umană) şi dintre ac estea
amintim Streptococcuspyogenes (grup A), S.agalactiae (grup B), S.viridans (care aparţine florei
normale), S.pneumoniae (pneumococul) etc.
Streptococii sunt imobili, nesporulaţi şi pot avea sau nu capsulă.
În anul 1906 a fost descris Streptococcusfaecalis iar în 1919, Streptococcusfaecium. Împreună
cu o a treia specie, S.durans (foarte asemănătoare cu S.faecium), în 1937 a fost definit grupul
enterococilor, incluşi în grupul D al genului Streptococcus. Din 1984, pe baza studiilor de
hibridizare moleculară s-a decis că aceste specii fac parte dintr-un gen separat, genul
Enterococcus (vezi 30. 9). Enterococii pot fi izolaţi din flora enterică normală. Sunt nonhemolitici
(ocazional alfa-hemolitici); dau o reacţie pozitivă la bilă-esculină. Tolerează NaCl în concentraţie
de 6,5%. Sunt rezistenţi la multe antibiotice şi chimioterapice. Tratamentul infecţiilor cu
enterococi poate reprezenta o problemă foarte serioasă.
332
S.pyogenes. Cei mai mulţi dintre streptococii care conţin antigenul de grup A
sunt streptococi piogeni. Ei sunt beta-hemolitici (produc în mod caracteristic zone largi
de hemoliză clară în jurul unor colonii de dimensiuni mici, punctiforme). S.pyogenes
este principalul microb asociat cu invazia locală sau sistemică şi cu tulburări imunologice
poststreptococice. De regulă streptococii piogeni sunt sensibili la bacitracină. Structura
de tip capsular pe care unele tulpini o prezintă este chimic similară cu ţesutul conjunctiv
al organismului gazdă (acid hialuronic), fiind ca atare neantigenică. Membrana sa
citoplasmatică are antigene similare cu miocardul, muşchii scheletici şi muşchiul neted,
fibroblaştii valvelor cardiace şi ţesutul nervos.
S.agalactiae. Face parte din flora normală a tractului genital feminin şi poate
reprezenta
produc zoneo de
importantă
hemolizăcauză de sepsis
care sunt şi meningită
doar puţin neonatală.
mai extinse Sunt beta(1-2
decât coloniile -hemolitici
mm în şi
diametru). Streptococii de grup B hidrolizează hipuratul de sodiu şi dau o reacţie
pozitivă în testul CAMP (folosind discuri impregnate cu toxină β stafilococică) (2).
Grupele C şi G. Aceşti streptococi sunt izolaţi uneori din nazofaringe şi pot
cauza sinuzită, bacteriemii sau endocardită. Deseori formează colonii asemănătoare cu
cele ale streptococilor piogeni şi sunt beta-hemolitici. Sunt identificaţi prin reacţii cu
antiser specific pentru grupele C sau G.
Sbovis. Face parte din streptococii de grup D. Aparţine florei normale.
Ocazional produce endocardită sau bacteriemie la pacienţii cu carcinom de colon. Nu
produce hemoliză şi dă o reacţie pozitivă la bilă-esculină.
S.pneumoniae.Pneumococii sunt alfa-hemolitici, creşterea lor este inhibată
de optochin iar coloniile sunt distruse de bilă şi săruri biliare (vezi capitolul 31). În
continuare reprezintă o cauză importantă de morbiditate și mortalitate (prin
pneumonie comunitară).
S.viridans. Fac parte din flora normală la nivelul tractului respirator superior.
În mod caracteristic
inhibată de optochin.sunt
Potalfa-hemolitici,
ajunge în torentuldar sanguin
pot fi nonhemolitici. Creşterea
ca urmare a unei traumelorşinu este
reprezintă o cauză importantă a endocarditei care survine la pacienţi cu valve cardiace
patologice. Unii streptococi viridans (exemplu S.mutans) sintetizează polizaharide care
contribuie la geneza cariilor dentare.
Peptostreptococii. Cresc numai în condiţii anaerobe sau microaerofile şi
produc în mod variabil hemolizine. Fac parte din flora bucală normală, flora tractului
respirator superior, intestinal şi genital feminin. Participă, adesea în asociere cu alte
specii bacteriene, în infecţiile anaerobe polimicrobiene abdominale, pelviene,
pulmonare sau cerebrale.
30. 2. 1. Habitat
Streptococii piogeni se pot găsi la nivelul tractului respirator superior uman. Condiţiile în care ar
trebui eliminaţi se stabilesc de la caz la caz. O parte dintre speciile de streptococi colonizează
exclusiv suprafaţa dentară şi devin detectabile numai după erupţia dentară. Pentru alte specii
de streptococi, datele referitoare la habitat au fost prezentate mai sus.
333
30. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Sunt coci Gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul de circa 1µm, imobili, nesporulaţi. Se
divid într-un plan perpendicular pe axa lor lungă şi sunt aranjaţi în lanţuri (de până la 50
elemente bacteriene). Lungimea lanţurilor variază şi este condiţionată de factori de mediu .
Unii streptococi elaborează o capsulă polizaharidică comparabilă cu cea pneumococică. Cele
mai multe din speciile de grup A, B şi C produc capsulă din acid hialuronic. Capsulele sunt mai
evidente în culturile tinere şi împiedică fagocitoza. Pilii streptococici sunt acoperiţi de acid
lipoteichoic şi au rol în aderenţă.
Unul dintre caracterele biochimice importante este reprezentat chiar de producerea hemolizei.
Streptococii piogeni sunt germeni pretenţioşi care necesită pentru dezvoltare adăugarea în
mediul de cultură a vitaminelor, aminoacizilor, glucozei sau cel puţin utilizarea ca mediu de
cultură a gelozei-sânge sau a bulionului nutritiv. Streptococii degradează glucoza pe calea
glicolitică. O mare parte dintre specii pot fermenta şi alte tipuri de zaharuri şi alcooli zaharaţi
utilizând o serie de enzime inductibile (sintetizate doar în prezenţa carbohidratului respectiv şi
în absenţa glucozei). În mod uzual streptococii piogeni sunt sensibili la bacitracină. Sunt catalază
negativi.
Streptococul piogen este distrus în 30 de minute la 56ºC, dar poate supravieţui în secreţii
uscate, la temperatura camerei şi întuneric timp de câteva săptămâni. Deoarece nu este sensibil
334
la acţiunea coloranţilor de tipul trifenil-metan, cristalul violet poate fi utilizat în mediile de
cultură selective.
Streptococii hemolitici pot fi divizaţi în grupe serologice (peste 18 grupe serologice notate cu
literele mari ale alfabetului, A-U), pe baza carbohidratului C, prezent în structura peretelui
multor streptococi (grupele Lancefield). Specificitatea serologică a carbohidratului specific de
grup este determinată de un zahar aminat, care pentru streptococii de grup A este ramnoză-N-
acetil-glucozamină, pentru grupul B ramnoză-glucozamină-polizaharid etc. Cele mai importante
sunt grupele A, B, C, F şi G (includ streptococi β-hemolitici).
Streptococii beta-hemolitici din grupul A prezintă la nivel parietal proteina M, cel mai important
factor de patogenitate pentru acest grup streptococic. Anticorpii faţă de proteina M conferă
imunitate specifică de tip. Deoarece există mai mult de 100 de tipuri de proteină M (dar nu
toate au şi proprietăţi de prevenire a fagocitozei), o persoană poate face infecţii repetate cu S.
pyogenes de grup A, de diferite tipuri. Proteina M a fost identificată şi la streptococi din grupul
G.
Alte structuri antigenice sunt reprezentate de către:
- proteina asociată proteinei M (MAP);
- substanţa T care permite diferenţierea anumitor tipuri de streptococi prin aglutinarea cu
antiser specific;
- peptidaza C5a (care clivează fragmentul C5a al sistemului complement);
- proteina R, care este un antigen de suprafaţă;
- proteina F, cu rol de adezină, ce interacţionează cu fibronectina;
- nucleoproteine (substanţe P) care probabil alcătuiesc cea mai mare parte din corpul
streptococic;
-1.diferite toxine şi(fibrinolizina)
streptokinaza enzime: care transformă plasminogenul în plasmină; poate fi utilă în
tratamentul administrat intravenos în embolia pulmonară, tromboza arterială şi venoasă şi în
infarctul miocardic acut; este o structură antigenică;
2. streptodornaza (dezoxiribonucleaza) depolimerizează ADN-ul; după infecţii streptococice, în
special după infecţii ale pielii, apar anticorpi anti-Dn-ază;
3. hialuronidaza scindează acidul hialuronic, o componentă importantă a substanţei
fundamentale din ţesutul conjunctiv;
4. toxina eritrogenă solubilă, distrusă prin fierbere într-o oră, stă la srcinea rash -ului (erupţiei
caracteristice) care apare în scarlatină; toxina eritrogenă este elaborată numai de streptococii
lizogenizaţi; există un singur tip de toxină eritrogenă;
5. difosfopiridin nucleotidaza este o enzimă elaborată şi eliberată în mediu de unii streptococi;
6. hemolizinele (streptolizinele); Semnificaţia biologică a streptolizinei O este încă neclară. Se
ştie că administrată intravenos duce la animalele de laborator la deces în câteva secunde prin
acţiunea sa directă la nivel cardiac. Totuși, nu este cert că streptolizina S ar fi produsă și invivo.
(2)
În momentulîndeultimii
descoperită faţă se
anistudiază modul în care
şi încă insuficient SGB activează sistemul imun
studiată, . S-apedescoperit,
o altă cale,prin
cale
studii efectuate pe şoricei, că celulele dendritice răspund la SGB prin secreţia de IL-1β şi IL-18.
IL-1β necesită pentru a se forma pro- IL-1β şi clivaj proteolitic dependent de caspaza 1. Aici
intervine inflamazomul. Acesta, la rândul lui, pentru a fi activat are nevoie de secreţia de β -
hemolizină de către SGB. S-a determinat şi faptul că atunci când inflamazomul cu toate
compomentele sale lipseşte, şoriceii sunt mai susceptibili la infecţie. (Figura nr. 2) (3)
335
30. 2. 7. Răspuns imun
Rezistenţa împotriva infecţiei streptococice are specificitate de tip. Imunitatea faţă de infecţia
cu streptococi de grup A este legată de prezenţa anticorpilor specifici anti-proteină M. Pentru că
există mai mult de 80 de tipuri de proteină M, o persoană poate face infecţii repetate cu S.
pyogenes de grup A, de tipuri diferite. Structura şi funcţia proteinei M au fost mult studiate.
Molecula are o structură de tijă încolăcită care separă domeniile funcţionale, permiţând astfel
schimbarea unui număr mare de secvenţe în timp ce funcţia este menţinută. Au fost identificate
două clase majore (I şi II) de proteină M. Anticorpii anti-proteină M pot fi identificaţi serologic.
Deoarece există un singur tip de toxină eritrogenă, în cazul infecţiei streptococice care duce la
scarlatină imunitatea după boală este durabilă, menţinându-se eventual chiar şi pentru toată
viaţa.
În cursul infecţiilor streptococice apar anticorpi anti-streptolizină O; aceştia pot fi identificaţi
prin teste serologice (ex. reacţia ASLO). Titrul anticorpilor poate fi util în diagnosticarea bolilor
streptococice şi poststreptococice.
Proteina F are rol de adezină (se leagă de fibronectina celulelor gazdei) şi are un rol în
invazivitate.
Proteina M reprezintă cel mai important factor antigenic şi de patogenitate pentru streptococul
beta-hemolitic din grupul A. Proteina M apare ca o excrescenţă la nivelul peretelui celular.
Proteina M formează structuri fibrilare care se extind cu 50-60 nm în afara celulei bacteriene,
fiind ancorate cu cealaltă extremitate în membrana citoplasmatică (există un grad de omologie
cu proteina A stafilococică). S-a dovedit experimental că atunci când proteina M este prezentă,
streptococii sunt virulenţi. În absenţa anticorpilor specifici de tip anti -proteină M, streptococii
sunt capabili să reziste fagocitării de către leucocitele polimorfonucleare. Proteina M este
implicată şi în aderarea la celulele epiteliale ale gazdei. Streptococii de grup A lipsiţi de proteina
M sunt avirulenţi.
Se pare că proteina M şi probabil şi alte antigene streptococice au un rol important în
patogeneza „febrei reumatice” (reumatismului articular acut). Domeniile antigenice conservate
din proteinele de clasă M (în special clasa I) reacţionează încrucişat cu structuri ale muşchiului
cardiac uman. Alte tipuri M au similarităţi cu miozina, keratina sau α -tropomiozina.
Unele tulpini de S.pyogenes formează o structură capsulară compusă din acid hialuronic şi
produc colonii mucoide pe geloză-sânge (materialul capsular nu este imunogenic); poate avea
rol în virulenţa anumitor tulpini.
Hialuronidaza facilitează răspândirea microorganismelor infectante.
Difosfopiridin nucleotidaza este o enzimă elaborată şi eliberată în mediu de unii streptococi;
această substanţă permite microorganismului să distrugă leucocitele.
Toţi streptococii piogeni produc C5a peptidază, o serin-protează care scindează componenta
C5a (rezultată în cascada sistemului ). C5a este unul dintre principalii factori care atrag PMN la
sediul procesului infecţios.
Toxina eritrogenă, elaborată numai de către streptococii beta-hemolitici din grupul A
lizogenizaţi, este implicată în patogenia erupţiei din scarlatina streptococică.
336
Proprietăţile biologice ale microorganismelor infectante, natura răspunsului gazdei şi poarta de
intrare a infecţiei au o mare influenţă asupra tabloului clinic. Infecţiile strept ococice ar putea fi
grupate astfel mai multe categorii.
Tabloul clinic este determinat de poarta de intrare. În fiecare caz poate apărea o extindere
rapidă şi difuză a infecţiei de-a lungul căilor limfatice, însoţită de o supuraţie minimă. Infecţia se
poate extinde la nivel circulator. În această categorie se pot include
- apare atunci când poarta de intrare este reprezentată de tegument (formă
particulară de celulită); este caracterizat prin leziuni „lucioase”, eritemtoase, indurate,
sub forma unei plăci cu margini distincte; adesea este cauzat de streptococii de grup A
şi mai rar de grupurile C sau G. (Fotografia nr. 2)
se dezvoltă în cazul unei infecţii streptococice intrauterine.
streptococic - în 1992, American College of Chest Physicians şi Society of
Critical Care Medicine (ACCP/SCCM) au elaborat câteva criterii care pot orienta medicul
spre a pune diagnosticul de sepsis, criterii care au fost revizuite în 2001. (Tabelul nr. 2)
(4)
Infecţiile osoase şi articulare;
- inocularea poate fi de la nivelul pielii sau de la nivel intestinal.
Prevalenţă este mai ridicată la persoanele ce folosesc droguri pe cale intravenoasă. Este
cunoscută și drept gangrena streptococică, streptococul primind (în mass-media)
numele de „bacteria mâncătoare de carte”. Această entitate clinică poate avea
determinare polimicrobiană, cu floră aerobă şi anaerobă, incluzând şi Clostridium
perfringens,Bacteroidesspp. Când infecţia se localizează la nivelul perineului se
numeşte gangrena Fournier. Tabloul clinic include: febră, durere foarte intensă, eritem,
tromboză la nivelul microvascularizației care conduce la necroză, gangrenă, şoc si
insuficienţă renală. În multe dintre cazuri evoluția este nefastă, spre exitus. (Fotografia
nr. 3)
Meningita etc.
streptococică care este cea mai obişnuită infecţie datorată streptococilor beta-
hemolitici. Streptococii virulenţi de grup A aderă la epiteliul faringian prin intermediul
acidului lipoteichoic. Fibronectina glicoproteică de la nivelul celulelor epiteliale serveşte
probabil ca ligand pentru acidul lipoteichoic. Extinderea la nivel amigdalian şi eventual
la nivelul altor structuri poartă numele de streptococică. Boala se manifestă cu
durere în gât, rinofaringită, amigdalită „roşie” şi purulentă (pultacee), ganglioni limfatici
cervicali măriţi şi dureroşi, febră (39-40°C). Poate avea loc (în special la copiii mici)
extinderea infecţiei către urechea mijlocie, mastoidă şi meninge. De menţionat că circa
10-20% din infecţii pot fi asimptomatice. (Figura nr. 4)
reprezintă o infecţie localizată la nivelul straturilor superficiale ale
pielii, în special la copii. La majoritatea pacienţilor nu se găseşte o leziune
337
predispozantă. Totuşi, amintim ca factori de risc generali mediul umed şi igiena
deficitară. Clinic avem de-a face cu vezicule, pustule sau bule ce se rup şi formează o
crustă gălbuie, durere uşoara sau disconfort şi prurit. (Figura nr. 5)
(aşa cum știm, poate fi şi stafilococica) este o infecţie acută a pielii
şi ţesutului subcutan. Clinic, pacientul se prezintă cu durere, eritem ce se extinde rapid,
edem, febră, limfadenopatie regională. Cel mai adesea este cauzată de S.pyogenes
(infecţie difuză, rapid progresivă datorată enzimelor secretate) dar la pacienţii diabetici
este întâlnit şi S.agalactiae. Infecţia apare mai des la nivelul membrelor inferioare, tipic
unilateral. Peteşiile sunt adesea întâlnite, se pot dezvolta vezicule şi bule ce se pot rupe.
(Figura nr. 6)
Pneumonia
unei infecţii poate fi rapid
virale (de progresivă
exemplu gripă, şipojar
severă;
etc.;deinfecţia
obicei cu
apare ca osinciţial
virusul complicaţie, în urma
respirator la
copilul mic poate fi urmată de asemenea de o pneumonie streptococică).
Endocardita infecţioasă poate fi acută sau subacută. În cazul endocarditei acute, în
cursul bacteriemiei streptococii pot coloniza valvele cardiace normale sau lezate
anterior. Distrugerea rapidă a valvelor, în lipsa tratamentului antibiotic corespunzător şi
uneori a protezării valvulare, evoluează frecvent spre un deznodământ fatal în zile sau
săptămâni. Endocardita subacută implică mai frecvent valvele anormale (malformaţii
congenitale, leziuni reumatice sau aterosclerotice).
Sindromul de şoc toxic streptococic, foarte asemănător celui produs de către S.aureus,
apărut datorită eliberării de toxine. Mortalitatea este mai ridicată ca în cazul
sindromului stafilococic.
acută şi mai rar În majoritatea
la o reacţie cutanată cumcazurilor duceS.aureus
este cazul la sindrom
. Aredeundetresă respiratorie
debut brusc, febră
39°-40,5°C, hipotensiune, eritem difuz macular, coagulopatie, leziuni hepatice.
Atunci când streptococii sunt lizogenizaţi (infectaţi cu un bacteriofag specific), produc
toxină eritrogenă. Dacă pacientul nu are imunitate antitoxică apar erupţia caracteristică
şi scarlatina. Antitoxinele faţă de toxina eritrogenă previn apariţia rash -ului (dispare la
presiune, apare mai ales pe abdomen şi torace lateral, iniţial ca papule mici apoi ca linii
ce durează 2-5 zile), dar nu interferă cu infecţia streptococică.
338
exces de complexe imune antigen-anticorp, care circulă şi se depun la nivelul membranei bazale
glomerulare. Toţi glomerulii sunt afectaţi, mari şi infiltraţi cu PMN, monocite şi eozinofile. În
nefrita acută apar hematurie microscopică şi macroscopică, proteinurie pâna la sindrom
nefrotic, edeme la nivelul feţei (ex. periorbitale), hipertensiune arterială, retenţie de uree,
oligurie şi anurie, ascită, congestie sistemică (dispnee, tuse, stază în jugulare, cardiomegalie,
galop, edeme); nivelul complementului seric este scăzut.
Reumatismul articular acut (RAA) reprezintă cea mai serioasă sechelă a infecţiei
streptococice (tegumentară dar mai ales respiratorie - la care par să fie predispuşi cei cu grupa
de sânge A II), deoarece duce la afectarea valvelor şi a muşchiului cardiac. Anumite tipuri de
streptococi
cardiac uman desau
grupcuAstructuri
conţin antigene careganglionilor
de la nivelul reacţioneazăbazali.
încrucişat cu structuri din ţesutul
RAA este precedat de o infecţie streptococică.
În patogenia RAA sunt incluse toate tipurile de hipersensibilitate, în special cele de tip II
(citotoxică) şi de tip IV (mecanism celular / întârziat), dar şi fenomene autoimune. Semnele şi
simptomele specifice din RAA includ febră, poliartrită migratorie şi semne legate de inflamaţia la
nivel cardiac (cardita reumatismală). (Tabelul nr. 3)
Nu dorim să intrăm în toate detaliile care vor fi studiate în cadrul modulului de cardiologie, dar
dorim să punctăm câteva aspecte. RAA este o boală inflamatorie acută neinfecţioasă,
nesupurativă. Apare în comunităţi aglomerate, nivel economic scăzut, igienă precară,
alimentaţie defectuoasă, tulburări de imunitate. Incidenţa maximă a fost înregistrată la grupele
de vârstă 5-15 ani. Nu există predispoziţie de sex dar leziunile cardiace sunt diferite în funcţie de
sex.
Diagnosticul de laborator este în mod uzual bacteriologic (direct) şi include în mod necesar
recoltarea şi transportul (în maxim 2 ore) produsului patologic, cu examinarea microscopică a
acestuia, cultivarea de obicei pe geloză-sânge şi identificarea pe baza caracterelor morfologice,
de cultură, biochimice şi antigenice a microorganismelor din coloniile izolate. Antibiograma nu
este, în general, necesară deoarece streptococii piogeni îşi menţin sensibilitatea la penicilină.
Deşi cultivarea rămâne metoda standard în diagnostic, datorită faptului că rezultatul este
obţinut abia după circa 18 ore, au fost puse la punct teste rapide, care pot identifica antigenele
streptococice în circa 10 minute (extracţie enzimatică urmată de latex aglutinare în prezenţa
anticorpilor specifici pentru grupul A).
Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse de streptococii piogeni alegem
În vederea confirmării unei boli poststreptococice vom discuta reacţia ASLO (vezi şi capitolul
22).
în faringita streptococică
339
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic, ,
trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca
pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor
utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie, recoltarea se face preferabil
dimineaţa înainte ca pacientul să mănânce şi fără să se fi spălat pe dinţi, fără să fi utilizat
gargarisme cu diferite soluţii, iar dacă aceste condiţii nu au fost respectate, recoltarea se va face
după minim 4 ore etc.) (vezi şi anexa nr. 6).
Produsul recoltat trebuie prelucrat cât mai repede posibil, însă în nici un caz nu trebuie să
treacă mai mult de 2-3 ore de la recoltare până la cultivare (preferabil 1-2 ore). În cazul în care
se estimează depăşirea acestui interval de timp trebuie folosit un mediu de transport, ex.
mediul
24 Stuart
de ore până(vezi şi anexa nr.p.p.
la prelucrarea 2). Chiar şi în această situaţie, nu ar trebui să treacă mai mult de
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2).
Streptococii piogeni sunt care nu se dezvoltă pe medii de cultură obişnuite.
Mediul cel mai frecvent folosit este agar-sânge, pe care cultura apare în 18-48 ore, la 35-37°C.
În cazul în care nu remarcăm apariţia de colonii caracteristice după 24 de ore, reincubăm placa
Petri pentru încă o zi.
Coloniile au aspectcu
clară de hemoliză, deun diametru
cu diametrul de mare decât diametrul coloniei). În cursul
mult mai (zonă
însămânţării, pe cel puţin una dintre laturile „poligonului” descris trebuie să realizăm şi o
înţepare a mediului în aşa fel încât inoculul să ajungă mai în profunzime. Această manevră
(există şi alte variante tehnice) este necesară pentru a permit e activitatea hemolizinei O
(hemolizina O este inactivată în prezenţa oxigenului). Speciile care produc material capsular, din
acid hialuronic, adeseori dau naştere unor colonii mucoide (de tip M). Se pot folosi pentru
cultivare şi medii selective (de ex. agar-sânge plus trimetoprim-sulfametoxazol).
340
1% sunt rezistente la bacitracină (vezi anexa nr. 2).
- Streptococii piogeni sunt rezistenţi la trimetoprim-sulfametoxazol.
Caractere antigenice:
o Se pot utiliza teste comerciale pentru detectarea rapidă a polizaharidului
specific de grup A al streptococilor piogeni în p.p., după extracţie chimică sau
enzimatică (ex. cu pronază). Tehnicile utilizate pot fi aglutinarea indirectă (latex -
aglutinare), coaglutinarea sau ELISA.
o Prin reacţii de aglutinare (latexaglutinare, coaglutinare) pe lamă, sau precipitare
se pot determina antigenele streptococice de grup (Lancefield) sau de tip.
o
S.pyogeneseste împărţit în serotipuri pe baza antigenelor proteice M (peste
100 de serotipuri) prin reacţia de precipitare în tuburi capilare şi T (peste 28
serotipuri) prin reacţia de aglutinare pe lamă. Aceste testări se fac în centre de
referinţă.
Alte teste utilizate în identificare:
o Se pot utiliza sondele nucleotidice pentru detectarea directă a streptococilor de
grup A în exsudatul faringian.
o După amplificare genică (PCR) pot fi identificate secvenţele genetice care
codifică pentru diferitele tipuri de proteină M (genele enm). Au fost descoperite
peste 120 de secvenţe genetice diferite, această metodă fiind mai
discriminativă în comparaţie cu metoda clasică, de tipizare a S.pyogenesşi tinde
să completeze şi eventual să înlocuiască această metodă.
o Relativ recent a fost propusă tehnica MLST (multilocus sequence typing),
accesibilă unorcentre de referinţă.
5. Streptococii piogeni îşi menţin sensibilitatea cunoscută la penicilină (au fost identificate în
ultima
Pentru perioadă
pacienţii tulpini „tolerante”, care
cu hipersensibilitate sunt inhibate
("alergici") dar nu distruse
la beta-lactamine de către
se poate penicilină,
alege pentru 2003).
tratament eritromicina, dar au fost identificate tulpini rezistente la acest medicament
antimicrobian şi în acest caz antibiograma devine necesară. În general antibiograma se
realizează în scop epidemiologic, pentru supraveghere şi cercetare.
Diagnosticul serologic este util pentru certificarea etiologiei bolilor poststreptococice (RAA,
GNA), identificarea unei eventuale stări de hipersensibilitate, diagnosticul retrospectiv al unei
infecţii streptococice, evaluarea evoluţiei clinice şi eficacităţii tratamentului.
Pentru stabilirea diagnosticului pozitiv al RAA sau al GNA, criteriile de diagnostic sunt mai
complexe, dar includ prin metode de laborator a
.
Diagnosticul serologic se realizează de obicei, în România, prin reacţia ASLO, care identifică
titruri ale anticorpilor anti-streptolizină O (vezi şi capitolul 22). Testarea se face în dinamică, pe
seruri recoltate la interval de 7-10 zile.
Pentru zona noastră geografică se acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250) unităţi ASLO.
341
Este strict necesară realizarea controlului intern şi extern de calitate.
Tot strict necesară este evaluarea rezultatelor în contextul clinic.
Există teste serologice pentru determinarea prezenţei şi titrului anticorpilor faţă de alte
structuri antigenice (streptodornază, hialuronidază, streptokinază). Titrul anticorpilor anti-
streptodornază este crescut la pacienţii cu infecţii tegumentare şi trebuie investigat dacă se
suspicionează prezenţa unei glomerulonefrite acute. Se pot determina şi anticorpii
anticarbohidrat (hemaglutinare pasivă) sau anti-MAP (prin latex aglutinare).
Una dintre marile probleme terapeutice decurgând din dezvoltarea rezistenţei la antibiotice o
reprezintă apariţia pneumococilor rezistenţi la penicilină şi alte medicamente antimicrobiene.
Gravitatea acestei situaţii rezultă din incidenţa crescută a pneumoniilor pneumococice (40 -
50% din etiologia pneumoniilor comunitare) şi din valorile extrem de alarmante ale incidenţei
tulpinilor de pneumococi penicilino - rezistenţi (20-40% din tulpinile izolate în Europa
Occidentală sau în America de Nord), uneori cu multirezistenţă la antibiotice.
Pneumococii se pot izola de la persoane sănătoase, făcând parte din flora normală a tractului
respirator superior (în special bucală, nazală şi faringiană). Cu toate că frecvenţa portajului
orofaringian este estimată la 30-70%, în recentul studiu la care au participat în mod voluntar
colegii tineri aflaţi în finalul anului 2 de facultate (date nepublicate, 2007), nu am identificat nici
un purtător de Streptococcuspneumoniae.
Sunt coci Gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, dispuşi în general în diplo, încapsulaţi (cu o capsulă
comună), imobili, nesporulaţi. În coloraţia cu albastru de metilen, capsula apare ca un halou în
jurul pneumococilor. Utilizând anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o identificare rapidă
inclusiv direct, pe produsul patologic (de exemplu spută), prin reacţia de umflare a capsulei.
342
Pneumococii sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, aerobi,
facultativ anaerobi. Pe geloză-sânge formează colonii de tip S sau de tip M, înconjurate de o
zonă de a-hemoliză (la fel ca Streptococcusviridans). Multiplicarea este favorizată în atmosferă
de 5% CO2 la o temperatură de 37°C. Glucoza reprezintă principala sursă de energie pentru
pneumococi. Aceştia elaborează enzime zaharolitice, proteolitice şi lipolitice.
Glucoza reprezintă principala sursă de energie pentru pneumococi. Aceştia elaborează enzime
zaharolitice, proteolitice şi lipolitice. Fermentarea inulinei reprezintă un caracter biochimic
important, util în diferenţierea pneumococilor de S.VIRIDANS(ambele tipuri de streptococi
producând pe geloză-sânge o hemoliză de tip viridans).
Produc enzime autolitice. Autoliza este indusă şi accelerată de bilă, săruri biliare, acizi biliari;
testul este util în identificarea pneumococilor (testul bilolizei, Neufeld).
Pneumococii pot supravieţui câteva luni în spută uscată, la întuneric. În mediul extern rezistenţa
lor este scăzută. În timp, microorganismele devin Gram-negative şi tind să se lizeze
spontan.Autoliza pneumococilor este intensificată de agenţii tensioactivi de suprafaţă.
Cel mai important determinant antigenic şi patogenic este capsula polizaharidică (antigenul K),
ce protejează pneumococul faţă de fagocitoză şi permite invazivitatea. Structura polizaharidului
capsular este specifică fiecărui serotip în parte. Până în prezent au fost identificate peste 90 de
serotipuri capsulare diferite, a căror structură a fost determinată pentru majoritatea
serotipurilor. Există două sisteme diferite folosite pentru clasificarea tipurilor capsulare.
Sistemul american a numerotat tipurile capsulare în ordinea descoperirii acestora. Sistemul
danez grupează mai multe tipuri antigenic înrudite. Spre exemplu, grupul 19 din clasificarea
Statens Serum Institute grupează tipurile 19A-C şi 19F, care în sistemul american de clasificare
erau numerotate cu 19, 57, 58 şi respectiv 59. Au fost produse seruri specifice anticapsulare
polivalente şi monovalente, utile în identificarea pneumococilor cu ajutorul reacţiei de umflare
a capsulei.
Este descris şi acidul lipoteichoic numit şi antigen F (Forsman); anticorpii faţă de antigenul F
reacţionează încrucişat cu polizaharidul C de la streptococii piogeni.
Fosfocolina (FC) se găseşte atât în acidul lipoteichoic, cât şi în acidul teichoic parietal. Prezenţa
reziduurilor de FC este necesară atât în diviziune, în fenomenul de autoliză, cât şi în fenomenul
genetic de transformare. FC are şi rol de adezină (se leagă de „choline-binding proteins” de pe
suprafaţa celulelor gazdei).
343
Toţi pneumococii secretă IgA1 protează (una dintre Zn-proteinazele produse de S.pneumoniae).
Imunitatea faţă de infecţia pneumococică are specificitate de tip şi depinde atât de anticorpii
care apar împotriva polizaharidului capsular, cât şi de funcţia fagocitelor. Vaccinarea induce
producerea de anticorpi faţă de polizaharidul capsular.
S.pneumoniae este un microb condiţionat patogen care, atunci când este implicat în patologia
umană, se
capsulă, manifestă
care conferă prin multiplicare
rezistenţa şi invazivitate.
la fagocitoză. Un ser Virulenţa pneumococilor
care conţine depinde de
anticorpi împotriva
polizaharidelor specifice de tip protejează împotriva infecţiei. Dacă un astfel de ser este absorbit
cu polizaharide specifice de tip îşi pierde puterea protectoare.
- IgA1 protează;
Deoarece circa 30-70% din oameni pot fi la un moment dat purtători de pneumococi, mucoasa
respiratorie normală are un grad important de rezistenţă naturală faţă de aceste
microorganisme. Printre factorii care predispun la infecţie ar fi de menţionat:
- anomalii constituţionale sau dobândite ale tractului respirator (infecţii virale, alergii locale,
obstrucţii bronşice, afectări ale tractului respirator datorate unor substanţe iritante etc.);
- intoxicaţia cu alcool sau droguri, care deprimă activitatea fagocitară şi reflexul de tuse;
344
Familia Neisseriaceae include mai multe genuri, spre exemplu Neisseria, Moraxella,
Acinetobacter, Kingella.
În genul Neisseria, speciile importante pentru patologia umană sunt N.meningitidis
(meningococul) şi N.gonorrhoeae(gonococul), dar se pot aminti şi N.lactamica, N.sicca, N.
subflava, Neisseriabacilliformis etc. Există şi o specie (N.elongata) în care tulpinile au aspect
cocobacilar şi sunt oxidază-negative (1).
Pe baza studiilor filogenetice, speciile Neisseria au fost clasificate în cinci grupe şi anu me: N.
meningitidis, N.flavescens, N.cinerea,N.pharyngisşi N.elongata(12 specii în total).
cu dextrozei,
specie lactozei, maltozei
nouă, denumită şi sucrozei. Aceste
Neisseriabacilliformis . (4) teste au dus la concluzia că se poate descrie o
Moraxellacatarrhalis a fost identificată în flora normală a tractului respirator superior, la 40-
50% din copiii de vârstă şcolară sănătoşi şi la circa 5% dintre adulţi, dar poate fi implicată şi într -
o serie de infecţii (bronşite, traheobronşite, pneumonii, sinuzite, otite, conjunctivite), în special
la gazde cu deficienţe ale capacităţii de apărare. Există studii care estimează că un procent de
circa 15% din otitele medii ar fi produse de Moraxellacatarrhalis . Speciile de Moraxella sunt de
regulă Gram-negative (totuşi, există elemente care rezistă decolorării cu alcool-acetonă). M.
catarrhalis a aparţinut iniţial genului Neisseria, ulterior genului Branhamella, astăzi făcând parte
345
din genul Moraxella. Sunt coci Gram-negativi, dispuşi în diplo, dar pot forma şi lanţuri scurte. Se
pot dezvolta atât la 35-37ºC cât şi la 28-30ºC. Pot forma colonii pe medii care conţin colistin.
Dacă în urmă cu 35 de ani prezenta sensibilitate la penicilină, actualmente se cunoaşte faptul că
produce β-lactamază (3 tipuri enzimatice diferite); prezintă, de regulă, rezistenţă la penicilină,
ampicilină, meticilină, clindamicină şi vancomicină. Este unul dintre micro-organismele care,
alături de S.pneumoniae şi tulpinile ne-tipabile de H.influenzae, este studiat în vederea
producerii unui vaccin care să prevină apariţia otitei medii.
se poate găsi la nivelul mucoaselor genitale la gazdele infectate (indiferent dacă
infecţia este sau nu simptomatică). A fost remarcată pentru prima dată de Albert Neisser
(1879): coci intra-leucocitari la examenul secreţiei purulente din uretra masculină, la pacienţi cu
gonoree. Cultivarea
gonorrhoeae a fost realizată
a fost identificată cu 3 ani
în secreţii mai târziu. Cea
conjunctivale mai recent definită
( N.gonorrhoeae subspecie
subspecia kochii).de
N.
Nivele crescute de Lactobacillus, genul dominant în microbiota vaginală, au fost evidenţiate în
strânsă legătură cu un risc scăzut de infectare în urma expunerii la N.gonorrhoeae.Lactobacillus
scade aderenţa N.gonorrhoeaecu până la 50% şi inhibă invazia celulelor epiteliale cu până la
60%. Mai mult decât atât, lactobacilii au posibilitatea să disloce gonococii aderaţi ceea ce ne
poate conduce cu la ideea că ar putea ajuta la profilaxia postexpunere. (5)
a fost izolată la persoane sănătoase de la nivel nazal sau faringian. La pacienţii cu
meningită meningococică, germenul se multiplică în lichidul cefalorahidian (LCR). A fost izolată
pentru prima dată în anul 1887 din LCR de la un pacient cu meningită acută.
În prima decadă a secolului 20 meningita meningococică netratatată avea o rată a mortalitaţii
de 75-80%. În 1913, Simon Flexner a fost primul care a gândit o formă de terapie folosind serul
antimeningococic cabalin intratecal. Mortalitatea a fost redusă la 31% pe un lot de 1.300
pacienţi. În perioada 1928-1936 169 de copii au fost trataţi în acest fel la spitalul Bellevue din
New York iar mortalitatea a scăzut la 20%. În 1930 odată cu introducerea sulfonamidelor
mortalitatea a scăzut la 5-15%. Totuşi, odata cu ”era antibioticelor” a început şi ”era rezistenţei
la antibiotice”.
Atât (6)copiii pot fi colonizaţi de mai multe specii de Neisserii, în acelaşi timp (de ex.
adulţii cât şi
Neisseriaspp. nepatogene şi N.meningitidis). Neiseriile saprofite / comensale au fost descrise
pentru prima dată în 1906, purtând iniţial alte denumiri. Ceea ce este relativ interesant, N.
flavescens (1930) şi N.lactamica (1969) au fost izolate din LCR, motiv pentru care se presupune
că pot determina meningită. Ultima specie de Neisseria a fost definită în 1993, drept N.weaweri
(numele iniţial fiind grupul CDC M-5; de srcine canină şi rar izolată din rănile pacienţilor
muşcaţi de câini).
În continuare vor fi prezentate doar două dintre speciile enumerate, respectiv N.gonorrhoeaeşi
N.meningitidis, microorganisme cu necesităţi nutritive complexe şi care se pot dezvolta doar la
35-37ºC.
Atât meningococul cât şi gonococul sunt diplococi Gram-negativi, reniformi, imobili, înconjuraţi
de o structură capsulară comună, cu o structură de polifosfat sau polizaharid-polifosfat (în cazul
meningococului), situaţie în care capsula este mai evidentă. (Figura nr. 1 și Figura nr. 2) În
funcţie de structura capsulei există mai multe serogrupuri.
346
Gonococul produce colonii de tip S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm sau colonii de tip M,
nepigmentate, transparente sau opace. Este de remarcat faptul că în aceeaşi placă pot apărea
până la cinci tipuri de colonii (T1-T5), ceea ce poate facilita identificarea. Placa este eliminată în
cazul în care nu se dezvoltă colonii după 72 de ore.
Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1 mm. Tulpinile încapsulate (A, C)
pot conduce la apariţia unor colonii de tip M.
Metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în identificare. Spre exemplu,
gonococul poate metaboliza glucoza (nu şi maltoza), în timp ce meningococul metabolizează
ambele zaharuri menţionate. (Figura nr. 4)
Produc citocrom-oxidază, ceea ce reprezintă un test cheie în identificare; se utilizează de
exemplu benzi de hârtie de filtru îmbibată cu reactiv, respectiv tetrametil-p-fenilendiamină.
Reacţia pozitivă apare în circa 10 secunde (vezi şi anexa nr. 2). (Figura nr. 5)
Neisseriile implicate în patologia umană sunt foarte sensibile la uscăciune, lumină solară şi la
variaţii de temperatură, precum şi la majoritatea antisepticelor şi dezinfectantelor. Produc
enzime autolitice.
32. 2. 6. Structură antigenică
În cazul germenilor Gram-negativi, la nivelul membranei externe se găseşte lipopolizaharidul
(endotoxina). Spre deosebire de lipopolizaharidul (LPZ) din structura enterobacteriilor, care
conţine multiple unităţi repetitive, neisseriile au lanţuri zaharidice scurte, motiv pentru care
denumirea corectă ar fi cea de lipooligozaharid (LOZ). În funcţie de structura
lipooligozaharidului există mai multe , 6 în cazul gonococului şi 12 în cazul
meningococului. Gonococii pot exprima simultan mai multe structuri antigenic diferite.
Lipopolizaharidul (lipooligozaharidul) a fost denumit şi endotoxină, deoarece este eliberat di n
perete după distrugerea germenilor. Lipooligozaharidul se fragmentează în lipidul A (responsabil
pentru toxicitate) şi respectiv în polizaharidul (oligozaharidul) O.
Neisseriagonorrhoeae
În cazul gonococului heterogenitatea antigenică este remarcabilă. Acest microorganism este
capabil să îşi modifice structurile de suprafaţă „in vitro” (probabil şi „in vivo”), evitând
mecanismele de apărare ale gazdei. Ar fi de menţionat şi următoarele structuri antigenice:
- pilii, cu rol în ataşarea de celulele gazdei, care protejează gonococul faţă de fagocitoză şi au o
structură proteică. Capătul C-terminal are o structură variabilă. Pilinele diferă de la o tulpină la
alta şi chiar în cazul aceleaşi tulpini (există sute de tipuri de piline posibile). Există şi pili cu rol în
procesul de conjugare genetică;
- mai multe tipuri de proteine, spre exemplu porinele (proteina I), care formează pori la
suprafaţa celulei bacteriene. Fiecare tulpină prezintă un tip de porină, dar porinele diferă de la o
tulpină la alta. Această structură este utilă pentru serotiparea gonococilor. Proteina II (OPA) este
identificată la tulpinile care produc colonii opace şi este utilă pentru aderarea gonococului.
- proteina care leagă fierul (iron binding protein) este similară ca greutate cu porinele; se
exprimă atunci când aportul de Fe este insuficient;
- adezina cu greutate moleculară 36 kDa;
- proteina Rmp, o proteină localizată la suprafaţa membranei externe; are secvenţe care
prezintă omologie parţială cu proteine identificate la Shigelladysenteriae sau E.coli; anticorpii
anti-Rmp pot fi puşi în evidenţă la pacienţi sau convalescenţi cu gonoree, la nivel sanguin sau în
secreţiile genitale;
- IgA1 proteaza;
- pseudo-capsula din polifosfat;
- proteine de stres asemănătoare proteinelor de şoc termic Hsp60.
347
Variaţia antigenică este importantă, cu o valoare de circa 10 -3 (pentru OPA, LOZ, piline) şi este
utilă pentru eludarea mecanismelor de apărare ale gazdei. De menţionat prezenţa anumitor
plasmide implicate în rezistenţa la antibioticele beta-lactamice.
Gonoreea apare adesea în cadrul coinfecţiei cu HIV. LOZ induce imunitatea înnăscută legându-
se de TLR4. S-au investigat efectele LOZ din 5 tulpini diferite de Neisseriagonorrhoeae asupra
infecţiei HIV şi a provirusului din macrofage. Macrofagele care conţineau LOZ au devenit
rezistente la infecţia HIV şi la provirus. (7)
Neisseriameningitidis
În cazul meningococului, pe lângă LOZ mai este important de menţionat structura capsulară,
care permite subdivizarea speciei în 13 serogrupuri. Dintre aceste grupuri serologice (notate cu
litere),
şi W-135.maiVaccinurile
importanteconţin
datorită implicării
numai o parteîndintre
patologie sunt
aceste grupele: 29E, A, B, C, H, I, K, L, X, Y, Z
antigene.
Atât pilii, cât şi tipurile de proteine menţionate mai sus sunt prezente şi în cazul meningococului
(piline de clasa I şi II, porine de clasa 1, 2 şi 3, proteina Rmp, proteina OPA de clasă 5 etc), însă
fără fenomenele de variaţie antigenică (genetică) menţionate.
În infecţiile cu gonococ apare un răspuns imun, dar datorită fenomenelor prezentate mai sus,
practic nu există imunitate postinfecţioasă; aceeaşi persoană poate face infecţii repetate.
În cazul meningococului, imunitatea este asociată cu prezenţa serică a anticorpilor anti-
capsulari, anti-lipooligozaharid şi anti-membrană externă, care apar după infecţii subclinice.
Nou-născuţii sunt în general protejaţi datorită anticorpilor de tip IgG proveniţi de la mamă.
Infecţiile meningococice reprezintă o problemă în special pentru persoanele care au un deficit al
sistemului complement (mai ales componentele C 6-C9).
LCR conţine molecule implicate în imunitatea înnăscută (ex. sistemul complement), molecule
esenţiale în controlul infecţiei şi în activarea infiltrării cu fagocite (neutrofile, monocite). Totuşi,
celulele epiteliale ale stratului ependimal care intră în structura tubului neural sau ale plexului
coroid ar putea fi foarte vulnerabile la atacul citotoxic şi citolitic al componentelor
complementului. Un studiu publicat în 2006 (8) a arătat capacitatea celulelor epiteliale
cerebrale de a exprima la nivelul membranei receptori pentru reglarea activității
complementare (CD35, CD46, CD55, CD59). Prin studii de dublă imunofluorescenţă pentru
markeri ai celulelor ependimale (GFAp, S100, ZO-I) şi ai receptorilor pentru reglarea
complementului s-a ajuns la concluzia că aceste celule au o cantitate mare de CD55 şi CD59 şi
mai mică de CD46 şi CD35. La nivel tisular s-a observat că CD55 era slab exprimat la nivelul
plexurilor coroide şi celulelor ependimale de control dar exprimarea era crescută în meningită.
Anti-CD59 era prezent la nivelul ambelor epitelii în timp ce CD59 a fost identificat doar la nivelul
plexurilor coroide inflamate. CD46 şi CD35 nu au fost identificate în ţesuturile de control. Pe de
altă parte, în meningită aceste molecule erau puternic exprimate. Acest studiu arată
posibilitatea structurilor cerebrale de a raspunde şi susţine imunitatea înnăscută mediată de
complement. (8)
Anumite defecte ale sistemului complement au fost asociate cu o creştere a incidenței
infecţiilor cu Neisseriameningitidis.S-au făcut teste în acest sens şi s-a recoltat sâange şi ser de
la pacienţi adulţi care aveau deficit complet de C2 sau C5. Pacienţii aveau de asemenea deficit
de
prinmannose-binding
numărul de CFU lectin (MBL).
(colony- Proliferarea meningococilor
formingunit)şiprinReal introduşi în sânge a fost evaluată
-timePCR.S-ainvestigatactivitatea
bactericidăsericăşiceaopsono -fagociticăagranulocitelorincluzândserinactivattermic
postvaccinarepentruaevaluainfluenţaanticorpilorantimeningococici.Proliferarea
meningococicăafostde2log 10pentruCFUşi4sau5log 10copiiADN.Proliferareaascăzut
moderatdupăcorectareadeficituluideC2,dardupăcorectareadeficituluideC5toţi
meningocociiaufostdistruși(remarcându -seșiuntitrumaredeanticorpi). Activitateaopsono-
fagociticăafoststrictdependentădeC2,aapărutînserulnormalşiacrescutînserul
348
postvaccinare.ActivitateabactericidăsericăadepinsdoardeC2,C5şititrulanticorpilor.MBLnu
ainfluenţatînniciunfelaceştiparametri.(9)
Imunitatea adaptativă este pilonul cel mai important. Ţesutul limfoid asociat nazofaringelui
(NALT) este locul principal al răspunsului imun. LTCD4+ interacţionează în cele din urmă cu LB şi
duc la secreţie de IgA şi IgG. IgA facilitează clearance-ul microciliar, aglutinarea patogenilor şi
împiedicarea adeziunii epiteliale precum şi neutralizarea toxinelor secretate. (10)
Neisseriagonorrhoeae
Infecţiile gonococice continuă să reprezinte o problemă importantă de sănătate publică inclusiv
în ţările cu o economie dezvoltată (vezi şi 30.3.6). Acest fapt se datorează şi apariţiei /
răspândirii tulpinilor de gonococ rezistente la antibiotice/chimioterapice şi existenţei unui
număr important de infecţii asimptomatice (în special la femei).
După pătrunderea în organismul receptiv, în funcţie de calea de transmitere, gonococul se
ataşează de mucoase (genito-urinară, oculară, rectală, faringiană etc.) şi produce, local, o
supuraţie acută. În timp poate apărea invazia tisulară şi în consecinţă, instalarea unor fenomene
inflamatorii cronice şi apariţia fibrozei (în special în cazurile netratate).
La bărbaţi apare, de regulă, (manifestată prin secreţie galben-verzuie,
cremoasă, însoţită de usturimi şi dureri la micţiune); în lipsa tratamentului, aceasta poate afecta
prin invazie epididimul şi prin fibroză poate determina apariţia stricturilor uretrale.
349
În cazul sexului feminin, gonoreea se localizează , dar se poate extinde la nivelul
uretrei, vaginului, glandelor Bartholin, trompelor uterine (în ultimul caz, cu posibilitatea apariţiei
unor fibroze şi obstrucţii care conduc la sterilitate). Dacă mama are gonoree şi nou-născutul se
naşte pe cale naturală, va apărea (prevenită de ex. prin instilaţii cu soluţie
de nitrat de Ag 1% în sacul conjunctival).
Rareori gonococul poate disemina pe cale sanguină (bacteriemie), cu apariţia unor leziuni
dermice, artrite, tenosinovite gonococice etc.
Neisseriameningitidis
Meningococul poate produce şi alte infecţii, dar este important de menţionat că reprezintă una
din primele trei cauze de meningită infecţioasă la adulţi (alături de Haemophilusinfluenzae şi
Streptococcuspneumoniae). Contagiozitatea este mare, dar se estimează că meningita
meningococică apare la 1/1.000 din persoanele contaminate.
În producerea meningitei sunt implicate succesiv colonizarea mucoasei respiratorii (portaj = o
relaţie de comensalitate între bacterie şi gazdă, fără ca gazda să prezinte vreun semn sau
simptom care să ne ducă cu gândul la patologie), invazia locală, bacteriemia (favorizată de
prezenţa capsulei), invazia meningeală, alterarea barierei hemato-encefalice, inflamaţia în
spaţiul subarahnoidian şi creşterea presiunii intracraniene. Apariţia vasculitei cerebrale şi
scăderea fluxului sanguin la nivel cerebral reprezintă factori de agravare. Activarea mai multor
cascade inflamatorii (în special datorită eliberării unor cantităţi importante de endotoxină) pot
conduce la instalarea unui sindrom de coagulare intravasculară diseminată şi la o evoluţie
nefastă spre deces.
Diagnosticul
meningococică,de laborator
dar trebuieeste
să bacteriologic
fie orientat de(direct)
examenul atâtclinic.
în gonoree câtmeningitei,
În cazul şi în meningita
de mare
importanţă este utilizarea unor examene paraclinice complementare.
În , recoltarea produsului patologic se realizează diferenţiat (într-o oarecare
măsură) în funcţie de vârstă, sex şi de practicile sexuale ale individului infectat. În cazul gonoreei
la femei, recoltarea se va face de la nivelului colului uterin. La bărbaţi, recoltarea se va face de la
nivelul uretrei, eventual utilizând un tampon steril uretral, introdus cu blândeţe circa 2 cm în
uretra anterioară. Transportul trebuie realizat foarte rapid (şi în condiţii care să permită
supravieţuirea microorganismului) sau pe medii speciale de transport, dar ar fi de preferat
inocularea imediată pe mediul de cultură.
Diagnosticul de laborator este .
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile
cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât
mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de
asepsie şi antisepsie etc). La bărbat se prelevează (eventual „picătura
matinală”), iar la femeie recoltarea trebuie efectuată pe masă ginecologică
şi glandelor
purulent. Bartholin
Este de preferat (vezi şi anexa nr., 2,
cultivarea peA.medii
6. 1.).deSecreţiile au de obicei
cultură potrivite şi un aspect
. În cazul în care p.p. urmează a fi transportat către laborator, transportul trebuie realizat
fără întârziere (la o temperatură apropiată de 37°C). Chiar şi în cazul utilizării mediilor de
transport (ex. mediul Amies plus ), acesta nu ar trebui să dureze mai mult de 6
ore. Gonococul ar putea fi izolat şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor conjunctivale,
faringiene, cultivarea urinei etc. În cazul în care nu există nici o secreţie, se poate utiliza urina
care trebuie centrifugată şi însămânţată pe medii de cultură.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din
produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de
350
metilen (AM) şi respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se
notează prezenţa celulelor, a (ex. leucocite) şi prezenţa
, dispuşi în diplo, reniformi, imobili, înconjuraţi de o structură capsulară comună, situaţi
intra sau extraleucocitar. Aspectul microscopic este acelaşi ca şi în urmă cu aproape 130 de ani.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2).
Gonococii sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, sunt aerobi, facultativ
anaerobi. Se pot utiliza medii selective (ex. medii în care se include vancomicină, colistin,
trimetoprim şi nistatin) sau neselective (ex. mediul GC, geloză-sânge sau geloză-chocolate cu
diferite suplimente nutritive; se recomandă utilizarea pulberii de hemoglobină şi nu a sângelui
proaspăt).
p.p. Este preferată
este reprezentat cultivarea
de secreţie de „în dublu”,rectului
la nivelul pe medii
sauselective şi neselective;
de secreţie în vor
faringiană se cazulfolosi
în care
numai medii selective. Este necesară o atmosferă de 3-10% CO2, la o temperatură de 35-37°C.
Coloniile apar în 24-48 de ore. Gonococul produce colonii de tip S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm
sau colonii de tip M, nepigmentate, transparente sau opace. Este de remarcat faptul că în
aceeaşi placă pot apărea până la cinci tipuri de colonii (T1-T5), ceea ce poate facilita
identificarea. Placa este eliminată în cazul în care nu se dezvoltă colonii, după 72 de ore.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
· Caractere morfotinctoriale: Sunt coci Gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi, imobili,
eventual înconjuraţi de o structură capsulară comună, nesporulaţi. Se poate utiliza şi „coloraţia”
fluorescentă.
· Caractere de cultură: Coloniile de gonococ sunt de tip S sau M (vezi punctul 3).
· Caractere biochimice:
Metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în ident ificare. Gonococul
metabolizează glucoza dar nu şi maltoza.
Produc citocrom-oxidază, un test cheie în identificare (vezi anexa nr. 2).
Testul catalazei (superoxol) este intens pozitiv.
Auxotipia evaluează necesităţile nutriţionale ale gonococului.
Există o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatică a Neisseriilor (ex. Quad
Ferm+, RIM, Minitek, Gonochek II etc).
Utilizând galeriaAPI NH(manuală) putem identifica specii de Neisseria, Haemophilus şi
Branhamella catarrhalis,în circa 4 ore.
· Caractere antigenice:
În funcţie de structura lipooligozaharidului există 6 serotipuri. Gonococii pot exprima simultan
mai multe structuri antigenic diferite, ceea ce creează probleme tehnice. Aceste testări se
realizează în centre de referinţă.
Prezenţa gonococului poate fi detectată direct prin coaglutinare (suspensie
de S.aureus tip Cowan I stabilizată şi sensibilizată cu Ac monoclonali antiproteină I din
membrana externă a gonococilor) sau printr-o tehnică imunoenzimatică, ELISA (cu Ac
policlonali).
Se pot utiliza Ac monoclonali cunoscuţi, pentru identificare gonococului prin tehnica
imunofluorescenţei directe.
· Caractere utilizate în tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate sau direct pentru p.p.:
Există diferite tehnici (imunologice, biochimice, de biologie moleculară) care sunt practicate
numai în centrele de referinţă.
· Metodele biologiei moleculare au atât o specificitate cât şi o sensibilitate foarte bună; se
pot utiliza fie pornind de la culturi fie de la p.p.
- Sondele nucleotidice (ADN) pot hibridiza cu ARNr extras din celulele microbiene.
PCR
351
LCR (Ligase Chain Reaction); această metodă se poate utiliza pornind de la urină sau de la secreţii
vaginale dar are un dezavantaj - costul.
5. Antibiograma (testarea sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii tratamentului)
şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice (mediul utilizat este GC
suplimentat nutritiv dar fără pulbere de hemoglobină). Au fost identificate tulpini rezistente la
penicilină (fie datorită unui plasmid care codifică o β-lactamază de tipul TEM, fie datorită unor
mutaţii cromozomiale). Este necesară testarea producerii de β-lactamază (de ex. folosind discuri
cu nitrocefin). Determinarea CMI se poate realiza prin metode clasice sau cu ajutorul testului E
(vezi capitolul 7).
În diagnosticul este urgent (risc de deces şi evoluţie cu
sechele),
de derealizarea
preferat importanţă maximă
unei fiind
cultivări „ recoltarea şi transportul
”, chiar rapid al LCR către
dacă pentru laborator. Este
concentrarea
germenilor este necesară centrifugarea LCR. Analiza citologică şi biochimică a LCR este utilă în
stabilirea etiologiei.
Diagnosticul de laborator este .
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile
cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât
mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de
asepsie şi antisepsie etc). Aşa cum am menţionat, prin puncţie (după verificarea
presiunii din artera centrală a retinei prin examinarea fundului de ochi) trebuie făcută pe cât
posibil la patul bolnavului, având la dispoziţie tot ce este necesar pentru pregătirea frotiurilor,
cultivarea pe diferite medii de cultură, repartizarea unei cantităţi de LCR pentru examenul
citologic şi biochimic (vezi şi anexa nr. 6). LCR poate fi purulent. În cazul în care p.p. urmează a fi
transportat către laborator, transportul trebuie realizat fără întârziere (la o temperatură
apropiată de 37°C). Meningococul ar putea fi izolat şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor
nazale sau faringiene etc. Prezenţa meningococului poate fi detectată direct în produsul
patologic prin
polivalente antilatex
- A, aglutinare,
C, Y, W-135coaglutinare sau contraimunoelectroforeză
şi respectiv seruri monovalente anti - B (careutilizând seruri
pot fi utile şi în
identificarea „încrucişată” a antigenului K 1 al E.coli).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din
produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de
metilen (AM) şi respectiv Gram. Dacă LCR este franc purulent, frotiurile se pot executa direct din
p.p., în caz contrar realizăm iniţial centrifugarea LCR. Frotiurile se examinează la microscopul
optic cu imersie şi se notează prezenţa (ex. leucocite) şi prezenţa
, dispuşi în diplo, reniformi, imobili, înconjuraţi de o structură capsulară comună,
situaţi intra sau extraleucocitar.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2).
Meningococii sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, sunt aerobi,
facultativ anaerobi. Se pot utiliza medii selective (ex. medii în care se include vancomicină,
colistin, trimetoprim şi nistatin) sau neselective (ex. Mueller-Hinton, geloză-sânge sau geloză-
chocolate) pe care formează colonii de tip S sau de tip M. Este necesară o atmosferă de 3 -5%
CO2,
4. la o temperatură
Identificarea de 37°C. implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
microorganismului
caractere:
· Caractere morfotinctoriale: Sunt coci Gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi, imobili,
înconjuraţi de o structură capsulară comună, nesporulaţi.
· Caractere de cultură: Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1-2
mm. Tulpinile încapsulate (ex. grupele A, C) pot conduce la apariţia unor colonii de tip M.
· Caractere biochimice:
Metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în identificare. Spre exemplu
meningococul metabolizează atât glucoza cât şi maltoza.
352
Produc citocrom-oxidază, un test cheie în identificare (vezi anexa nr. 2)
Există o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatică a Neisseriilor (ex. Quad
Ferm+, RIM, Minitek etc).
· Caractere antigenice: În funcţie de structura lipooligozaharidului există 12 serotipuri. Cel
mai important determinant antigenic este capsula polizaharidică. Structura capsulară permite
subdivizarea speciei în 13 serogrupuri. Dintre acestea mai importante sunt grupele: A, B, C, Y şi
W-135.
Prezenţa meningococului poate fi detectată direct prin latex aglutinare,
coaglutinare sau contraimunoelectroforeză utilizând seruri polivalente anti -A, C, Y, W-135 şi
respectiv seruri monovalente anti-B (se pot detecta 0,02-0,05 mg de Ag / ml). De notat
posibilitatea
Tehnici similareunei
se potreactivităţi încrucişate
utiliza pentru faţă detulpinilor
identificarea Ag grupului B, respectiv Ag
de meningococ K1 deînlacultur
izolate E.coli.
ă.
· Caractere utilizate în tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate: Există diferite tehnici
(imunologice, electroforetice, de biologie moleculară) care sunt practicate numai în centre de
referinţă. Utilizarea PCR are o sensibilitate şi specificitate de circa 91%; foarte utilă la pacienţii
pentru care s-a iniţiat deja antibioticoterapia.
5. Antibiograma (testarea sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii tratamentului)
şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. Majoritatea tulpinilor de
meningococ au rămas sensibile la penicilină. Totuşi, realizarea antibiogramei poate fi utilă,
orientând continuarea tratamentului. În cazul unor infecţii grave antibiograma trebuie să fie
însoţită de alte determinări (vezi capitolul 14).
353
33.1.Definiţie.Încadrare
Familia Enterobacteriaceae cuprinde un număr foarte important de genuri şi specii de
microorganisme semnificative din punct de vedere medical. Această familie reprezintă probabil
cea mai larg reprezentată grupare taxonomică, intens studiată, atât din punct de vedere al
microbiologiei fundamentale cât şi datorită implicaţiilor practice, clinice.
Numele acestei familii a fost propus în anul 1937, dar Serratiamarcescens a fost descrisă şi a
primit acest nume în 1823. Este adevărat că tulpinile de S.marcescens, producătoare de
pigment caracteristic de culoare roşie, sunt uşor de identificat şi în acelaşi sens se estimează că
prezenţa lor a fost luată în discuţie cu circa 3 secole înainte de Hristos. Salmonellatyphi a fost
descrisă în 1884, iar Yersiniapestis, după încă 10 ani.
Dacă în 1974, familia includea 12 genuri şi 36 de specii, iar în 1994, 30 de genuri şi 107 specii, în
momentul de faţă familia Enterobacteriaceae cuprinde peste 40 de genuri de microorganisme
semnificative din punct de vedere medical şi peste 150 de specii (în cazul în care nu luăm în
considerare clasificarea genului Salmonella în peste 2.390 de specii) (vezi şi A.6.5.1. şi capitolele
37-42).
33.2.Caracteregenerale
Enterobacteriile se pot găsi în apă, pe sol, pe plante sau pot coloniza în mod normal intestinul
omului şi animalelor. Totuşi trebuie reţinut că peste 90% din flora intestinală normală umană
este formată de germeni anaerobi.
Unele dintre genuri (Shigella, Salmonella, Yersinia) cuprind specii patogene pentru om, în timp
ce altele (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Proteusetc) cuprind specii saprofite sau
condiţionat patogene (cu excepţia anumitor tulpini, patogene) şi se găsesc în flora normală
gastrointestinală, sau de ex. în flora tractului respirator superior.
Când se utilizează termenul de „bacterii enterice”, unii autori includ şi alte genuri precum
Pseudomonas sau Vibrio, care nu fac parte din familia Enterobacteriaceae.
Sunt bacili Gram-negativi (multe dintre specii având o dimensiune de aproximativ 2- 3 / 0,6μm),
cu capete rotunjite, care , mobili cu cili peritrichi (ex.
Salmonellaspp , Proteusspp.), sau imobili (ex. Shigellaspp. , Yersiniapestis, Klebsiellaspp. ),
nesporulaţi; unele specii pot prezenta capsulă (ex. Klebsiellapneumoniae ).
Sunt germeni nepretenţioşi care se pot multiplica pe medii simple, aerobi facultativ anaerobi,
utilizează fermentativ glucoza cu sau fără producere de gaz, sunt oxidază-negativi, catalază-
pozitivi, reduc nitraţii la nitriţi, se pot cultiva pe medii obişnuite formând colo nii de tip S, R
(„vechi”) sau M (pentru speciile capsulate), pot fermenta (ex. Escherichiacoli, Klebsiellaspp. )
sau nu lactoza (ex. Salmonellaspp. , Shigellaspp. ). De altfel, caracterele biochimice sunt foarte
importante în identificarea enterobacteriilor. În Tratatul de Microbiologie şi Infecţii Microbiene
(Topley and Wilson’s, 2005), nu mai puţin de 11 pagini de tabele (1.319 -1.329) sunt dedicate
caracterelor biochimice ale enterobacteriilor (de menţionat că această prezentare reprezintă o
simplificare şi prescurtare privind acest subiect).
354
hidroximiristic cu 14 atomi de carbon), care este prezent la toate enterobacteriile şi care se
găseşte în natură numai în această structură particulară, lipidul A. De lipidul A se ataşează:
- polizaharidul format dintr-un miez (core) similar la toate bacteriile Gram-negative şi o serie de
unităţi terminale repetitive care diferă de la specie la specie (antigenul O). Antigenul O este
termostabil, rezistent la alcool. Poate fi detectat prin reacţii de aglutinare cu antiseruri specifice.
Antigenul O este asimilat cu termenul de endotoxină. Formele „R” sintetizează un LPZ care nu
conţine elementele repetitive ale polizaharidului O, caracteristice culturilor „S”.
Faţă de antigenul O apar în special anticorpi din clasa IgM. Fiecare gen cuprinde antigene O
specifice, dar un microb poate avea mai multe structuri antigenice diferite, de exemplu:
- pot exista antigene O comune la E.coli, Shigella;
-- anumite
pot existastructuri
reacţii încrucişate
antigenice între
O de E.coli, Klebsiella
la E.coli , Providencia
reacţionează , Salmonella
încrucişat ; antigenice
cu structuri
izolate de la genul Vibrio, cu structuri antigenice de grup sangvin sau alte antigene de suprafaţă
de la celulele animale.
Antigenul H este de natură proteică; denaturat de alcool (50°) şi de temperatură
(70°C). Este localizat la nivelul flagelilor (nu există la speciile imobile). Are antigenicitate mai
mare decât antigenul O (dominant); de aceea, pentru a putea apărea combinaţia cu antigenul
O, în anumite situaţii, antigenul H trebuie denaturat în prealabil. Antigenul H poate fi detectat
prin reacţii de aglutinare cu antiseruri specifice (în special cu anticorpi din clas a IgG).
Anticorpii anti-H imobilizează bacteria, atenuând virulenţa microorganismelor mobile, fiind
probabil cauza apariţiei variaţiei de fază la Salmonella . Variaţia de fază este proprietatea
bacteriei de a altera exprimarea unui anumit tip de antigen flagelar.
Antigenul K se situează extern faţă de antigenul O, la bacteriile capsulate. Este un
antigen polizaharidic, parţial stabil la temperatură. Dacă este organizată o structură capsulară,
aglutinarea cu antigenul O va fi inhibată. Au fost identificate şi structuri asemănătoare
antigenului tipic capsular; spre ex. la E.coli există antigenul K1. Antigenul K este implicat şi în
patogenitate, favorizând rezistenţa la fagocitoză a bacteriei şi contribuind la invazivitate.
La Salmonellatyphi există în mod suplimentar antigenul Vi (de virulenţă) care face
parte din antigenele „de înveliş” ale acestei bacterii, are structură polizaharidică şi este implicat
în scăderea complementului seric, leucopenie, capacitatea de multiplicare intramacrofagică.
Poate „masca” antigenul O, acoperindu-l. Antigenul Vi se poate identifica prin reacţii de
aglutinare cu antiseruri specifice.
Clasificarea antigenică a enterobacteriilor indică adesea prezenţa fiecărui antigen specific, de
exemplu E.coli O55:K5:H21 etc.
Unele enterobacterii elaborează şi exotoxine, spre exemplu toxina SHIGA PRODUSĂ
DE SHIGELLADYSENTERIAE TIPUL 1, VEROTOXINA PRODUSĂ DE E.COLI O157:H7 ETC.
Majoritatea enterobacteriilor prezintă fimbrii, de natură proteică (există 6 tipuri de
fimbrii); unele enterobacterii prezintă şi proteine filamentoase (ex. E.coli) care par să aibă rol în
patogenitate.
Adezinele
Practic toate bacteriile Gram-negative prezintă fimbrii (pili), indispensabili pentru aderarea de
mucoase, acesta fiind primul pas în vederea colonizării şi multiplicării iniţiale.
Toxinele
a). Exotoxinele: toxina Shiga ( Shigellashiga), toxina Shiga-like (la Shigella şi la unele tulpini de E.
coli), toxina LT (termic labilă) la E.coli (asemănătoare cu exotoxina vibrionului holeric) etc. Ar
mai fi de menţionat existenţa unor citotoxine produse de E.coli care sunt alfa-hemolizine
355
(exotoxine); beta-hemolizinele rămân legate de celulă şi inhibă fagocitoza şi chemotaxia
leucocitelor.
b). Endotoxinele (Antigen O) sunt incluse în peretele tuturor germenilor Gram-negativi, putând
determina în cazul unei eliberări masive (distrugerea brutală a unui număr mare de b acterii)
şocul endotoxic. Administrarea experimentală a lipopolizaharidului la animal determină febră,
leucopenie, trombocitopenie, CID (coagulare intravasculară diseminată), activarea sistemului
complement şi eliberarea de substanţe vasoactive proinflamatorii.
Achiziţia de fier
O serie de enterobacterii sintetizează o componentă care are capacitatea de a chela fierul
(siderofor), complexul format fiind apoi recaptat de către bacterie (de exemplu, aerobactina de
la E.coli).
Structurile capsulare
Antigenele de tip K aleE.coliau structură proteică şi sunt importante în colonizare; diminuă
opsonizarea şi fagocitoza. Antigenul K 1 este un polimer al acidului N-acetil-neuraminic. Este
similar cu structuri proprii gazdei şi este slab imunogen.
Klebsiella prezintă un antigen K (şi respectiv o capsulă) bine reprezentat.
Antigenul Vi de la Salmonellatyphi acoperă (maschează) antigenul O şi are importanţă în
invazivitate.
Plasmidele
Sunt importante pentru faptul că transmit atât informaţii genetice legate de rezistenţa la
antibiotice (factor R) cât şi pentru virulenţă.
33.3.Povestireadevărată
Un pacient de sex masculin, în vârstă de 33 ani, este cunoscut cu diagnosticul de leucemie acută
promielocitară de circa 1,5 ani; se internează pentru administrarea tratamentului chimioterapic
şi pentru
La circa 3 realizarea unui transplant
ore de la administrarea de celule stem.
profilactică de imunoglobuline pe cale i.v., pe un cateter fixat
anterior, pacientul devine febril (temperatură 39,5ºC).
S-a recoltat sânge pentru hemoculturi şi după aceasta s-a administrat o asociere între o
cefalosporină de generaţia a 3-a şi gentamicină. Sângele a fost însămânţat în bulion sânge, cu
trecere „oarbă” după 18 ore, pe geloză-sânge şi pe un mediu care conţinea eozină şi albastru de
metilen. După încă 24 ore, apar culturi (de tip „S/M”) pe ambele medii, se apreciază că este
vorba de colonii lactoză-pozitive, iar examenul microscopic al coloniilor izolate relevă prezenţa
unor bacili Gram-negativi.
Se realizează teste biochimice pe „medii multi test”, microorganismul fiind glucoză-pozitiv şi
lactoză-pozitiv, hidrogen sulfurat-negativ, citrat-pozitiv, imobil, indol-negativ, urează-negativ.
Analiza preliminară orientează spre o enterobacterie, dar, se face testul oxidazei care este
pozitiv. Efectuând şi alte testări, diagnosticul final a fost: infecţie cu Agrobacteriumradiobacter
la un pacient cu imunodepresie. Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice a
recomandat continuarea tratamentului cu imipenem.
Evoluţia a fost favorabilă, iar la 3 săptămâni de la episodul acut s-a putut realiza tratamentul
356
Genul Escherichia, considerat genul tip pentru familia Enterobacteriaceae, cuprinde germeni
comensali care se găsesc ubicvitar (în apă, pe sol, etc). La nivelul intestinului uman au rol în
sinteza unor vitamine (simbioză). Sunt bacili Gram-negativi mobili sau imobili, aerobi facultativ
anaerobi, lactoză pozitivi.
Specia tip, reprezentată de Escherichiacoli, şi-a căpătat numele în 1919, în memoria lui Theodor
Escherich care, studiind flora intestinala copilului, a izolat-o din materii fecale denumind-o
Bacteriumcolicommune.
Sunt bacili Gram-negativi drepţi sau uşor incurbaţi, cu capete rotunjite şi dimensiuni cuprinse
între 2-5µm / 0,5-1µm (pot avea uneori aspect filamentos, pot exista şi forme cocobacilare). În
majoritate sunt mobili, prin prezența flagelilor (în preparatele native). Unele tulpini prezintă
capsulă (antigene capsulare de tip K).
Se dezvoltă bine pe medii simple de cultură; pe geloză se pot dezvolta colonii de tip S, lactoză
pozitive, convexe, umede, cu suprafaţă lucioasă, margini netede, uşor emulsionabile în soluţie
salină fiziologică sau colonii de tip R, uscate, cu marginile crenelate, care se emulsionează greu
şi neuniform în soluţie salină fiziologică; există forme intermediare între coloniile S şi R, după
cum există şi colonii mucoide de tip M.
Germenii sunt aerobi, facultativ anaerobi, se dezvoltă în limite largi de temperatură şi pH.
Asemenea celorlalte enterobacterii, specia E.coli este catalază pozitivă, oxidază negativă şi
fermentează glucoza. Capacitatea majorităţii tulpinilor de E.coli de a fermenta lactoza este utilă
în diferenţierea de alte enterobacterii (ex. Salmonella,Shigella). Tipic, tulpinile de E.coli testate
pe medii de identificare biochimica precum TSI, MIU si/sau MILF nu produc H 2S, produc indol şi
lizindecarboxilază, dar nu urează si fenilalanindezaminază. În plus, E.coli nu poate creşte pe un
357
mediu care are ca unică sursă de carbon citratul (caracter metabolic important pentru
diferenţierea de alte enterobacterii).
Tulpinile EHEC/VTEC, de regulă, nu fermentează sorbitolul.
Germenii supravieţuiesc în mediul extern (sol, apă) luni de zile. E.colieste distrus prin expunere
la 60ºC în 30 minute. Este sensibil la acţiunea antisepticelor şi dezinfectantelor uzuale.
Apare un răspuns imun umoral care nu are semnificaţie nici în ceea ce priveşte protecţia faţă de
boală şi cel mai adesea nici în diagnostic. De reţinut însă că, un titru înalt al anticorpilor anti
O157, detectat la pacienţii cu sindrom hemolitico-uremic (SHU), poate fi util pentru diagnosticul
indirect (imunologic) al infecţiei cu E. coli O157:H7 (3).
Tulpinile de E.coli domină microflora facultativ anaerobă a colonului la individul sănătos, marea
majoritate întreţinând cu aceasta relaţii de simbioză benefice ambilor. Ele pot produce infecţii în
condiţiile în care gazda este imunodeprimată sau când depăşesc bariera intestinală şi ajung în
Există însă şi tulpini de E.coli care au o virulenţa intrinsecă, putând declanşa variate procese
358
numite . Ele generează simptomatologii similare prin mecanisme de patogenitate
comune.
În prezent sunt descrise şase patotipuri de E.coli implicate în sindromul diareic (patotipuri
intestinale) (4) şi un patotip implicat în infecţii extraintestinale (ex. infecţiile tractului urinar,
principal asocierea cu manifestări clinice severe (ex. colita hemoragică), subgrupul de tulpini de
Tulpinile patogene de E.coli produc factori de virulenţă, care afecteaza variatele procese
desfăşurate la nivelul celulelor gazdei (ex. sinteza de proteine, funcţia citoscheletului, diviziunea
celulară, secreţia de ioni, funcţia mitocondriilor, apoptoza etc.). Aceşti factori de virulenţă sunt
codificaţi de structuri genetice localizate în cromozom sau pe plasmide şi intervin în
mecanismele de patogenitate folosite de bacterie pentru a învinge sistemele de apărare ale
gazdei.
Adezinele suntfactorii
uropatogene, structuri de aderenţăCFA
de colonizare aflate
din pe f imbrii/pili
tulpinile (ex. etc.)
de ETEC, fimbriile P din
sau la tulpinile
suprafaţa de E.coli
membranei
externe (ex. adezinele afimbriale Afa din tulpinile de DAEC) bacteriene. Ele reprezintă factori de
virulenţa importanţi, care permit bacteriei să colonizeze zone din organismul uman (ex. intestin
subţire, tract urinar, vagin), in care nu rezidă în mod normal.
Toxinele sunt o altă categorie de factori de virulenţă. Endotoxinele fac parte din structura
membranei externe (lipidul A din complexul LPZ) şi sunt invariabil prezente la toate bacteriile
Gram negative, nu numai la E.coli, indiferent de potenţialul lor de patogenitate. Eliberate în
urma distrucţiei peretelui bacterian îşi manifestă efectele toxice, fiind implicate în apariţia febrei
şi şocului toxic din septicemii. Exotoxinele sunt sintetizate şi secretate în cursul metabolismului
bacterian, fiind specifice nu numai speciei, ci diverselor patotipuri de E.coli. În prezent se
cunosc structura si funcţiile a numeroase toxine responsabile de patogenitatea tulpinilor de E.
coli (ex. enterotoxina termolabilă şi termostabilă produse de tulpinile ETEC, verotoxinele 1 şi 2
sintetizate de tulpinile VTEC, enterotoxina termostabilă enteroagregativă 1 a tulpinilor EAEC,
etc.).
Multe dintre tulpinile ExPEC implicate în producerea meningitei neonatale sau a infecţiilor
urinare prezintă
principal capsulă,
al capsulei o altă
este de componentă
a inhiba acţiuneaimportantă pentruseric
complementului patogenitatea speciei.
şi fagocitoza, Rolul
conferind
astfel rezistenţă bacteriei. Antigenul polizaharidic capsular K1 este prezent în 80% din tulpinile
de E. coli izolate din cazuri de meningită neonatală (6).
359
Microorganismele din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile, nesporulate, caracterizate
printr-o intensă activitate metabolică asupra hidraţilor de carbon pe care îi hidrolizează cu
producerea de acizi şi uneori de gaz. Glucoza este degradată cu producere de gaz.
Specia tip a fost descrisă în 1885 sub numele de Bakteriumlactisaerogenes. Numele actual
datează din 1954 fiind atribuit în onoarea microbiologului german Edwin Klebs. Klebsiella
pneumoniae este cunoscută şi sub numele de Bacillus Friedländer.
Recent, câţiva membri ai genului Klebsiellaau fost reclasificaţi pentru a forma un nou gen,
Raoultella, pe baza informaţiilor din studii genetice. Membrii acestui nou gen pot fi implicaţi şi
în patologia umană, iar denumirea a fost adoptată la nivelul comunităţii ştiinţifice internaţionale
[1].
Klebsiellapneumoniae este larg răspândită în natură (sol, apă), dar şi în intestinul omului şi
animalelor; în mediul spitalicesc se selectează tulpini multirezistente ce pot coloniza tractul
urinar sau respirator la adult sau tractul intestinal la copil, mai ales după terapia prelungită cu
antibiotice cu spectru larg.
Mai multe studii au urmărit „pattern-ul” de colonizare cu cu Klebsiellapneumoniae a indivizilor,
cu scopul de a determina factorii de risc pentru infecţii. S-a demonstrat astfel că aproximativ o
treime din persoanele testate prezintă portaj de Klebsiellaîn fecale. Spitalizarea şi folosirea de
antibiotice a crescut numărul celor colonizaţi de bacterii din genul Klebsiella, cât şi numărul
acestor bacterii per gram de fecale. Personalul medical prezintă Klebsiella pe mâini după ce
îngrijesc pacienţi (într-un studiu, 17% din asistentele unei secţii de terapie intensivă; rate şi mai
mari au fost înregistrate în cursul unui focar epidemiologic activ – 30 % [2]).
Se cultivă cu uşurinţă pe medii uzuale fără cerinţe nutritive speciale. Pe medii gelozate s -au
descris mai multe tipuri de colonii cel mai frecvent fiind tipul mucos (M): colonii mari,
opalescente, uneori cenuşii, cu suprafaţa umedă care după o incubare prelungită prezintă
tendinţă la confluare şi „curgere” pe suprafaţa mediului. Pe medii lactozate sunt lactoză -
pozitive. Klebsiellapneumoniae nu se dezvoltă pe medii înalt selective şi este parţial inhibată pe
360
cele moderat selective. S-a raportat apariţia unor tulpini ce dezvolta colonii hipermucoide,
aceste tulpini având şi o virulenţă crescută [3].
Sunt puţin rezistenţi la căldură (distruşi în 5-7 minute la 100°C); pe sol, în alimente rezistă un
mare număr de zile. Dezinfectantele obişnuite îi distrug în intervale de timp cuprinse între 30 de
minute şi 2 ore.
Considerată iniţial ca fiind agent etiologic al pneumoniilor, s-a dovedit că numai 1-3 % din
pneumonii sunt produse deKlebsiellapneumoniae , dar aceste pneumonii pot fi extrem de grave
(pneumonii necrotice şi hemoragice), în special la pacienţi cu un sistem de apărare deficitar.
Klebsiellapneumoniae poate fi implicată într-o mare varietate de boli precum toxiinfecţii
alimentare de tip infecţios, infecţii ale tractului respirator superior, infecţii urinare etc. Din ce în
ce mai frecvent acest microorganism apare în infecţii nosocomiale (de spital), la fel ca şi
361
· replicare hepatică (la 36 ore),
· metastazare septică (după 48 ore).
S-a tentat identificarea unor gene care favorizează producerea abcesului hepatic [8-10].
În ultima vreme tulpini de Klebsiellaproducătoare de β-lactamaze sunt tot mai des responsabile
de infecţii nosocomiale mai ales la pacienţi iimunocompromişi. De o importanţă particulară sunt
enzimele cu activitate β-lactamazică cu spectru extins ( ExtendedSpectrumBetaLactamaze,
ESBL); tulpinile de Klebsiella producătoare de ESBL sunt recunoscute în patologia umană
datorită dificultăţii tratamentului curativ.
Tratamentul de primă linie pentru tulpinile de K.pneumoniae producătoare de ESBL a fost
reprezentat de carbapeneme. În 1996 s-a identificat pentru prima oară în SUA o tulpină
362
specificitate a acestor metode sunt foarte bune, dar trebuie să fie folosite cu prudenţă, pentru a
nu oferi rezultate fals-negative prin limitarea altor germeni posibili implicaţi în procesul
patogenic. [11]
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
· Caractere morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, cu dimensiuni mari, capsulaţi,
capsula fiind voluminoasă, dispuşi în lanţuri scurte, perechi sau izolaţi. În mediul de cultură pot
pierde capsula.
· Caractere de cultură: produc colonii de , mari (2-3 mm la 24 de ore,
peste 4 mm la 48 ore), bombate, vâscoase, cremoase, în „picătură de miere”, care dau aspectul
de „curgere” pe suprafaţa mediului de cultură, cu tendinţă la confluare. Pe mediul MacConkey
coloniile apar roşii (fermentează lactoza, cu producerea de gaz).
· Caractere biochimice:
· Klebsiella este un microorganism lactoză-pozitiv, ceea ce se poate evidenţia încă din etapa
de izolare pe mediul MacConkey (virează culoarea mediului în roşu);
· alte caractere biochimice se studiază după repicarea unor colonii pe medii multi- test (TSI,
MIU), pe mediul Simmons sau în sisteme multi-test comerciale de tip API;
· Klebsiellapneumoniae este glucoză-pozitivă (cu producere de gaz), lactoză-pozitivă, nu
produce H2S, imobilă, urează-pozitivă, indol-negativă, care se dezvoltă folosind citratul ca unică
sursă de carbon; K.oxytoca e indol-pozitivă acesta fiind un caracter ce poate fi folosit în schema
de diagnostic de laborator diferenţial.
· produce acetoină din glucoză, caracter evidenţiat prin reacţia Voges-Proskauer (adăugarea
de hidroxid de potasiu duce la virarea în roşu a unei culturi bacteriene în care se află acetoină,
în prezenţa unui indicator de pH precum alfa-naftol).
· Caractere antigenice: se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea
tulpinilor de Klebsiella, prin tehnici de aglutinare, coaglutinare, ELISA [12], Western Blot sau
latex aglutinare. Există peste 80 de tipuri de antigen K la Klebsiellapneumoniae . Aceste reacţii se
practică în laboratoare de referinţă.
· Caractere de patogenitate: se poate utiliza inocularea la şoarecele alb (vezi şi anexa nr. 2).
· Alte caractere / teste utilizate în identificare care se pot utiliza (în centre de referinţă):
· testarea sensibilităţii la bacteriofagi (unele dintre scheme au fost stabilite în Institutul
Cantacuzino);
· gruparea în funcţie de rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice;
· bacteriocinotipie;
· caractere testate prin metode ale biologiei moleculare (stabilirea spectrului plasmidic, cu
identificarea plasmidelor implicate în virulenţă etc.).
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii
tratamentului) este obligatorie şi se realizează de obicei prin met ode difuzimetrice.
Determinarea CMI şi CMB poate fi necesară (vezi capitolul 7). Klebsiellapneumoniae reprezintă
unul dintre microorganismele cu o rezistenţă remarcabilă faţă de antibiotice şi chimioterapice.
Când sunt detectate, tulpinile producătoare de β-lactamaze şi carbapenemaze necesită teste
moleculare pentru a determina cu exactitate substratul rezistenţei.
363
Genul Proteus este format din germeni pleomorfi, foarte mobili, Gram-negativi, care nu
fermentează lactoza, produc urează, sunt nesporulaţi, necapsulaţi. Există 2 specii principale,
Proteusmirabilisşi Proteus vulgaris(P.morganii a devenit Morganellamorganii, iar P.rettgeri a
devenit Providenciarettgeri); celelalte 3 specii sunt P.myxofaciens, P.penneri şi P.hauseri.
Majoritatea tulpinilor din genurile înrudite ( Proteus, Morganella, Providencia) au anumite
caractere comune (ex. mobilitatea, rezistenţa la KCN, producerea de indol).
Germenii din genul Proteus sunt răspândiţi în natură ubicvitar, se pot identifica în materiile
organice în putrefacţie, în alimente. Fac parte din flora intestinală umană.
Sunt bacili Gram-negativi cu un accentuat polimorfism (de unde şi numele, derivat din mitologia
antică), pe frotiu putându-se observa bacili, cocobacili, forme filamentoase de până la 50-80
µm. Prezintă un mare număr de cili peritrichi care le conferă mobilitatea caracteristică (dar
există şi tulpini aciliate). Sunt necapsulaţi şi nesporulaţi.
Cresc pe medii simple, inclusiv pe medii peptonate lichide, cu degajarea unui miros caracteristic
de putrefacţie. Suportă mari variaţii de temperatură şi de pH. Pe mediile diferenţiale (cu
lactoză) nu se pot obţine colonii izolate, descriindu-se fenomenul de invazie (migrare). Cultura
se întinde pe toată suprafaţa plăcii (sau tubului) în strat continuu sub forma unor valuri
succesive. Fenomenul de invazie poate fi inhibat prin incorporarea în mediu de săruri biliare,
tiosulfat de sodiu, sulfit de bismut, sulfonamide, neomicină, cărbune activat etc.
Dacă pe o placă cu mediu solid se cultivă 2 tulpini diferite, în 2 puncte opuse, acestea se vor
dezvolta invadând până la un punct în apropierea liniei de întâlnire, unde se va crea o linie de
demarcaţie între cele 2 tulpini (fenomenul liniei de demarcaţie).
Cultivarea unui produs patologic în lichidul de condens al unui tub cu geloză înclinată incubat în
poziţie verticală, va conduce (în cazul în care în produsul patologic există o tulpină de Proteus
spp.) la obţinerea în 24 ore a unei culturi pure de Proteus, datorită mobilităţii acestor
microorganisme (fenomenul de „căţărare”).
Sunt aerobi, facultiv anaerobi. Pe medii slab şi moderat selective pe care fenomenul de migrare
a fost inhibat, speciile de Proteus dezvoltă colonii de tip S, lactoză-negative (vezi 36. 4.).
Microorganismele din genul Proteus sunt glucoză-pozitive, lactoză-negative, produc H2S, sunt
urează-pozitive, indol-pozitive (exceptând P.mirabilis şi P.myxofaciens) iar pe mediul MIU se
poate constata mobilitatea.
Are o rezistenţă relativ crescută în mediu, în alimente etc şi poate rezista în soluţii antiseptice
sau în detergenţi, ceea ce poate crea probleme deosebite în mediul de spital. Rezistă mai multe
luni la temperaturi joase, inclusiv în alimentele congelate. Rezistenţa la antibiotice şi
chimioterapice este considerabilă.
364
Prezintă antigenul O (LPZ, endotoxina) specific de grup. După constatarea că serul bolnavilor de
tifos exantematic aglutinează cu o tulpină de proteus s-a demonstrat că genul include o serie de
tulpini (OX-2, OX-19, OX-K) care au înrudiri antigenice cu microorganisme aparţinând genului
Rickettsia.
Antigenul flagelar, proteic, H este comun la mai multe tipuri.
Postinfecţios apare un răspuns imun umoral care însă nu are utilitate practică.
Proteus poate deveni patogen prin multiplicare şi invazivitate, în condiţii speciale (părăsirea
habitatului natural, colonizarea unor gazde cu deficienţe ale sistemului imunitar).
La fel ca şi ceilalţi germeni Gram-negativi, eliberează de la nivel parietal, după distrugere,
endotoxina (antigenul O, LPZ).
Mobilitatea deosebită îi permite invadarea tractului urinar.
Producerea de urează alcalinizează urina şi favorizează formarea de calculi (de ex. de struvită).
Existenţa calculilor favorizează apariţia altor infecţii urinare sau cronicizarea acestora.
Rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice este remarcabilă.
De regulă microorganismele din genul Proteus sunt implicate patogenic în afecţiuni ce apar în
afara tractului digestiv. Există totuşi şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios în care aceşti
germeni au reprezentat agenţii cauzali.
În mod frecvent se discută despre infecţiile cu proteus la nivelul tractului urinar, dar sunt
posibile mai rar şi alte infecţii (genitale, pleurezii, alte localizări în cursul unei bacteriemii) de
regulă la pacienţi cu status imun deficitar sau în spital (infecţii nosocomial e).
365
Importanţa clinică a microorganismelor din genul Salmonella a fost cunoscută cu mult înainte de
studiile omologiei ADN sau de realizarea secvenţelor ARNr 16S. Pe baza unei omologii ADN-ADN
de aproximativ 90%, Salmonella şi E.coli ar fi să facă parte din acelaşi gen, dar protestul
microbiologilor şi clinicienilor obişnuiţi cu vechile denumiri a împiedicat acest lucru.
Una dintre clasificările acceptate la ora actuală grupează genul în 3 specii (Ewing):
-S.typhi patogenă numai pentru om;
-S.choleraesuis, patogenă la porc şi ocazional la om (numită ulterior S.enterica), cu 1.416
serotipuri;
-S.enteritidis, cauză de diaree la om şi la animal.
Serotipurile nu se scriu cu litere italice. De ex. S.typhimurium ar putea fi scrisă actual Salmonella
ser. Typhimurium, sau Salmonella Typhimurium sau pe scurt Typhimurium.
Sunt autori care consideră că serotipul corespunde speciei şi în acest caz, în genul Salmonella ar
putea fi luate în considerare peste 2.390 specii.
Salmonella , ca şi E.coli, a reprezentat un subiect de studiu, servind ca model pentru
metabolismul bacterian, genetica bacteriană sau studii de virulenţă. Este de asemenea un
indicator al gradului de siguranţă al conductelor de apă, dar relativ de curând a apărut „rolul” ei
în a onora o persoană publică cum ar fi S.mjordan (cu referire la baschetbalistul american).
Salmonelele sunt foarte larg răspândite în natură şi prezente la toate speciile de animale, păsări,
peşti, şerpi, insecte. Pentru S.typhi omul este unicul rezervor. Veriga alimentară este esenţială
în infectarea umană.
Sunt bacili Gram-negativi, cu dimensiuni de 2-4 mm / 0,4-0,6 mm, mobili cu cili peritrichi (cu
excepţia S.galinarumpullorum ), necapsulaţi, nesporulaţi.
Se multiplică pe medii de cultură simple şi formează colonii de tip S sau R (prin „îmbătrânire”).
Salmonella ser. Paratyphi B poate produce colonii de tip M.
Pe mediile selective cu lactoză dau naştere unor colonii lactoză-negative. Pe geloza Wilson-Blair
formează colonii caracteristice, opace, cu suprafaţa rugoasă şi margini neregulate, prezentând
un halou negru şi luciu metalic.
Se pot multiplica într-un interval larg de temperatură (7-48ºC) şi la un pH între 4 şi 8. Sunt puţin
rezistente la căldură (spre exemplu sunt distruse în 5-7 minute la 100°); pe sol (păşuni) rezistă
circa 200 de zile, în alimente rezistă 10-180 de zile (rezistă 4 ani în pulberea de ouă, a cărei
utilizare în alimentaţie este contraindicată). Dezinfectantele obişnuite le distrug în intervale de
timp cuprinse între 30 de minute şi 2 ore.
366
Modul în care o tulpină este definită din punct de vedere antigenic cuprinde 3 părţi (antigenul
O, faza 1 de la antigenul H şi faza 2 de la antigenul H).
Antigenul O este caracteristic tuturor microbilor Gram-negativi. Există peste 60 de structuri
antigenice O diferite care definesc 46 de serogrupuri O; unul sau mai mulţi factori asociaţi
determină formula antigenică a unei anumite grupe serologice care este notată cu literele mari
ale alfabetului sau doar cu cifrele respective (A…Z, O 51…O67) (1 ... 51 ... 67). A fost descris
fenomenul de variaţie genetică în legătură cu antigenul O.
Antigenele de înveliş includ de exemplu antigenul Vi la S.typhi şi Salmonella ser. Paratyphi C;
structurile antigenice Vi reprezintă substratul de fixare a bacteriofagilor, acoperă antigenul O şi
nu permit reacţia de aglutinare; se asociază virulenţei şi invazivităţii (determină leucopenie, nu
permit legarea
multiplicare componentei C3b şi în acest mod inhibă fagocitoza şi determină capacitatea de
intrafagocitară).
Antigenul H este de natură proteică, se găseşte la nivelul cililor peritrichi, este determinant de
tip, cu posibilitatea unei variaţii de fază. Majoritatea serotipurilor de Salmonella pot exprima
alternativ două tipuri de flageli cu specificităţi antigenice diferite. Din 1986 s -a văzut că unele
tulpini de Salmonella pot exprima trei sau mai multe tipuri de flageli cu antigenicitate distinctă.
Variaţia antigenică se poate realiza de ex. prin transducţie existând mai multe posibilităţi: pot
pierde antigenul H şi devin imobile; pot pierde antigenul O, coloniile S se „transformă” în colonii
R; pot pierde parţial sau total antigenul Vi (homopolimer de acid N acetil-galactosaminuronic).
Există antigene şi la nivelul fimbriilor. Apariţia anticorpilor anti fimbrii de tipul 1 la pacienţi cu
febră tifoidă sau la persoane care au fost vaccinate, poate duce la apariţia unor reacţii fals-
pozitive în cadrul analizei serice cantitative (reacţia de aglutinare în tuburi).
Schema de clasificare Ewing a fost prezentată anterior. Schema de identificare serologică
Kaufmann-White subîmparte genul Salmonella în foarte multe grupe şi „specii”, spre ex. în
grupul A, S.paratyphiA; în grupul B, S.paratyphiB, S.typhimurium; în grupul C, S.paratyphiC;
în grupul D, S.typhi, S.enteritidis etc. Conform schemei Kaufman-White există S.dublin, care în
schema Ewing poartă numele de S.enteritidis serotipul dublin . Există şi alte scheme de
clasificare.
Apare răspuns imun umoral detectabil în special după infecţiile extraintestinale. Este certă
apariţia răspunsului imun după infecţii produse de S.typhişi paratyphi(Paratyphi), cu punerea
în evidenţă a anticorpilor circulanţi anti O, anti H şi anti Vi. Anticorpii anti O şi anti Vi au rol
protector. Apariţia anticorpilor din clasa IgA secretorii pot împiedica ataşarea la nivelul
epiteliului intestinal.
Salmonellaspp ., devine patogenă prin multiplicare şi invazivitate. Primul pas, obligatoriu, este
reprezentat de colonizare, realizată cu ajutorul unor structuri de aderare, adezinele şi fimbriile,
care induc modificări la nivelul membranei celulare. Studii de fiziopatologie fundamentală au
reprezentat prima dovadă a existenţei unui receptor hormonal afectat prin ataşare şi invazie
bacteriană.
De menţionat faptul că la genul Salmonella a fost pus în evidenţă un grup de gene (genele de
invazivitate), unele din ele fiind asemănătoare cu gene identificate la genul Yersinia.
Salmonellaspp ., supravieţuieşte intrafagocitar datorită prezenţei unor structuri de suprafaţă
precum şi prin sinteza unor proteine (peste 40 de proteine diferite) care apar ca răspuns la
fagocitare. Antigenul Vi contribuie (pentru S.typhi şi Salmonella Paratyphi C la rezistenţa la
fagocitoză şi rezistenţa după fagocitoză).
Endotoxina (antigenul O, LPZ) eliberat după distrugerea germenilor, are un rol important în
patogenitate.
Tulpinile care produc toxiinfecţii alimentare secretă „enterotoxine” cu proprietăţi antigenice şi
biologice asemănătoare toxinei holerice.
367
Principial infecţiile produse de salmonele se pot împărţi în salmoneloze minore (enterocolite) şi
salmoneloze majore (febra tifoidă).
Enterocolita (gastroenterita, toxiinfecţia alimentară de tip infecţios, salmoneloza) apare după
ingestia a 105-108 salmonele. După ingestie are loc ataşarea şi adsorbţia la nivelul celulelor
epiteliale în porţiunea terminală a intestinului subţire, apoi penetrarea prin celule şi migrarea în
lamina propria, în regiunea ileocecală. La acest nivel are loc multiplicarea în foliculii limfoizi
determinând hipertrofia
determină o reacţie şi hiperplazia
inflamatorie SRE (sistemului
cu eliberare reticulo-endotelial).
de prostaglandine care duc laAcumularea de PMN
stimularea secreţiei
intestinale, urmată de diaree (nesanguinolentă), greaţă, vărsături; mai pot apărea febră, dureri
abdominale, mialgii, dureri de cap (cefalee). Persoana infectată poate fi contagioasă timp de
circa 3 luni. Simptomele sunt mai severe la copiii mai mici de 10 ani şi la bolnavii
imunocompromişi (ex. infectaţi cu HIV / SIDA).
Febra tifoidă (febra enterală) poate apărea după ingerarea a circa 10 3 salmonele. După ingestie
are loc ataşarea şi trecerea S.typhi prin şi printre celulele epiteliale de la nivelul ansei ileocecale,
urmată de multiplicarea activă în submucoasă şi de fagocitarea de către macrofage. Aici bacilii
rămân vii şi se multiplică (în macrofagele din formaţiunile limfoide intestinale), apoi t rec în
ganglionii mezenterici, apoi în canalul toracic, producând bacteriemia iniţială (care reprezintă
debutul clinic al bolii), urmată de invadarea altor organe şi formaţiuni limfatice.
Multiplicarea crescută mai ales în organele SRE (ficat, splină) este urmată de o a doua
bacteriemie masivă şi de eliminarea prin bilă şi / sau urină. La sfârşitul primei săptămâni de
boală, salmonella se elimină din foliculii intestinali şi prin bilă în materiile fecale, excreţia
prelungindu-se mult timp în convalescenţă. Pot apărea angiocolită, colecistită; bolnavul poate
368
Genul Shigella include bacili Gram-negativi, imobili, nesporulaţi, necapsulaţi, oxidază-negativi,
lactoză negativi. Shigellaspp. nu aparţine florei normale intestinale. Genul Shigella ar trebui să
facă parte, conform studiilor de biologie moleculară, dintr-un gen care să includă şi Escherichia
spp., genul Escherichia-Shigella. Cu toate acestea, este în continuare acceptată tratarea
separată a celor două genuri înrudite. Există mai multe specii. Pe baza structurii antigenice au
fost diferenţiate patru subgrupe (A-D) respectiv Shigelladysenteriae (serotipuri), S.flexneri (6
serotipuri care se pot subdiviza în sub-serotipuri), S.boydii (18 serotipuri) şi S.sonnei (1 serotip
cu 2 faze sau variante, respectiv R şi S).
Germenii se pot găsi în intestinul şi scaunul omului bolnav. În funcţie de anumite condiţii,
shigellele se pot izola din apă, alimente sau de pe obiecte. Pot fi transmise prin intermediul
muştelor.
Sunt bacili Gram-negativi, imobili, cu dimensiuni de 2-3 µm / 0,5- 0,8 µm, necapsulaţi,
nesporulaţi.
Cresc pe medii simple şi produc colonii de tip S. Pe mediile cu lactoză (ex. ADCL, AABTL)
formează colonii de tip S, lactoză-negative. Pentru izolare din materiile fecale sunt utilizate
medii diferenţiale (cu lactoză şi indicator de pH) şi / sau medii selective (mediul Shigella-
Salmonella cu săruri biliare etc).
Sunt germeni aerobi facultativ anaerobi, glucoză-pozitivi fără producere de gaz, lactoză-negativi,
nu produc H2S, urează-negativi, indol-negativi, imobili. Subgrupele A-D se pot diferenţia pe baza
fermentării manitei (subgrupul A este manită-negativ).
Shigellele sunt inactivate în 10 minute la 50-60ºC. ÎN PRAF USCAT REZISTĂ CIRCA 10 ZILE, PE
LENJERIE POT SUPRAVIEŢUI PESTE 2 SĂPTĂMÂNI. ÎN APE, LA O TEMPERATURĂ DE 7-10ºC POT
SUPRAVIEŢUI CIRCA 9 ZILE, ÎN ALIMENTE CIRCA 1-2 SĂPTĂMÂNI, IAR ÎN GHEAŢĂ PÂNĂ LA 2
LUNI.
369
Infecţia cu Shigellaspp. duce la stimularea răspunsului imun umoral, cu apariţia de anticorpi
care însă nu conferă protecţie. Apariţia de anticorpi locali de tip IgA (eventual după
administrarea de vaccinuri vii atenuate) ar putea avea o utilitate în prevenirea infecţiei.
Shigella este patogenă prin multiplicare şi invazivitate. În cazul serotipului 1 din subgrupul A ( Sh.
shiga) este implicată şi toxigeneza.
La fel ca toate microorganismele Gram-negative, shigellele elaborează lipopolizaharidul parietal,
care se eliberează ca endotoxină, după distrugerea bacteriei. Endotoxina (antigenul O) este
implicată în patogenia dizenteriei, având o acţiune iritativă la nivel intestinal.
Exotoxina shiga afectează atât intestinul (fiind implicată în mecanismul de producere al diareei),
cât şi sistemul nervos central (putând conduce la apariţia unor fenomene de meningism sau
chiar pierderea stării de conştienţă, comă). Faţă de animalele de experienţă are efect letal.
Infecţiile cu Shigellaspp. sunt de regulă limitate la nivelul tractului intestinal. Dizenteria poate
apărea după ingestia a numai 100 de bacterii, care se localizează, se multiplică şi invadează
epiteliul intestinal (pot apărea abcese la nivelul peretelui intestinului gros, la nivelul ileonului
terminal, abcese care evoluează spre ulceraţie, necroză, hemoragie).
După o perioadă de incubaţie de circa 2-5 zile, în cazul unei dizenterii tipice apar brusc febră,
diaree apoasă, dureri abdominale intense. Ulterior se elimină scaune foarte numeroase (20 -40 /
zi), nefecaloide, cu mucus, puroi şi sânge, însoţite de colici intestinale şi tenesme rectale. Starea
generală se înrăutăţeşte (mai grav în cazul unei infecţii produse de Sh.shiga) şi problema
principală este reprezentată la fel ca şi în cazul altor diarei, de pierderile hidro -electrolitice şi
instalarea unui sindrom de deshidratare acută. În lipsa tratamentului corespunzător (în special
în lipsa reechilibrării hidro-electrolitice) evoluţia poate fi fatală.
În afară de dizenterie, shigelele pot produce şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios.
370
Sunt enterobacterii de dimensiuni mici, cu aspect de bacili sau cocobacili Gram-negativi, care
prezintă coloraţie bipolară. Nu formează spori, pot prezenta structuri de tip capsular. Sunt
aerobi facultativ anaerobi, catalază-pozitivi, oxidază-negativi. Majoritatea au drept gazdă
naturală animalele şi pot produce boli (uneori foarte grave) umane.
Genul Yersinia include 11 specii dintre care 3 sunt patogene pentru om: Yersiniapestis (cauza
ciumei), Y.pseudotuberculosis şi Y.enterocolitica. Numele Yersinia a fost dat în onoarea lui
Alexander Yersin, care a izolat bacilul pestei, în Hong-Kong, în anul 1894.
Microorganismul poate fi identificat numai la animale (ex. rozătoare - şobolani) sau la omul
bolnav. Se poate transmite prin plăgi muşcate, de la o rozătoare la alta sau ocazional la om prin
intermediul purecilor. Rezultă infecţii grave, posibil mortale. În USA, ultimul caz de transmitere
interumană a fost raportat în 1924.
Y.pestis este un bacil Gram-negativ, imobil, care prezintă o coloraţie bipolară. Pe frotiuri bacilii
Aerob facultativ anaerob, se dezvoltă mai rapid pe medii ce conţin sânge sau fluide organice şi
la 30°C dar se poate multiplica şi pe medii simple. În culturi pe geloză -sânge la 37°C coloniile pot
fi foarte mici şi apar după circa 24 ore. O inoculare a unor microorganisme virulente recoltate
direct din ţesutul infectat conduce la apariţia unor colonii de tip S, sau cu aspect mucoid,
vâscoase şi colorate alb-gri. După realizarea unor pasaje în laborator, coloniile devin neregulate
şi aspre (de tip R); capsula dispare.
Sunt germeni puţin rezistenţi faţă de agenţii fizici şi chimici, dar în mediul extern pot supravieţui
până la circa 2 săptămâni în puroi sau în spută şi câteva luni în cadavre.
371
Y.pestis produce şi o bacteriocină (pesticină).
Câteva dintre antigenele Y.pestis reacţionează încrucişat cu antigene ale altor yersinii.
Yersinia pestis este un microorganism patogen în special prin multiplicare şi prin invazivitate,
rolul patogenic al diferitelor structuri sintetizate în cursul metabolismului nefiind complet
elucidat. Doza infectantă este foarte redusă, 1-10 bacili sunt suficienţi pentru producerea bolii.
Rolul esenţial pare a reveni structurilor care conferă proprietăţile de rezistenţă la fagocitoză,
spre ex. fracţiunea I, proteică, de la nivelul suprafeţei celulare, şi respectiv structurii
pseudocapsulare (virulenţa scade în lipsa pseudocapsulei).
Structurile cu rol în virulenţă (rol dovedit in vitro şi pe animalele de experienţă) sunt codificate
plasmidic sau cromozomial. S-a dovedit implicarea esenţială a unor astfel de structuri genetice,
care nu au fost identificate în cazul tulpinilor avirulente. Aceste tulpini pot fi utile în producerea
unor vaccinuri.
Dintre toxinele menţionate mai sus, una este letală pentru animalele de laborator (doză de
numai 1 mg în cazul şoarecelui). Această proteină cu GM de 74.000Da, produce blocade β-
adrenergice şi este cardiotoxică la animale. Rolul său în infecţiile umane nu a fost elucidat.
372
Genul Acinetobacter a fost descris pentru prima dată la începutul secolului XX.
În 1911, Martinus Willem Beigerinck, microbiolog olandez, descoperă o bacterie aerobă, gram
negativă, nonfermentativă, care face parte astăzi din genul Acinetobacter. În anii ’70,
Acinetobacter începe să fie recunoscut ca un microorganism implicat în infecţii „de spital”;
totuşi în acea perioadă, putea fi distrusă de către medicamentele antimicrobiene uzuale.
În 1986, Bouvet și Grimont au definit (folosind tehnicile de hibridizare moleculară) 12 grupuri în
cadrul genului Acinetobacter. Ei au propus includerea a 4 specii noi, printre care și A.baumannii,
(recunoscut astăzi şi datorită dezvoltării rezistenței la antibiotice şi chimioterapice).
Acinetobacterbaumannii și speciile numerotate 3 și 13TU formează “Complexul A.baumannii”.
Cele 3 specii au cea mai mare importanță clinică, fiind responsabile de majoritatea infecțiilor; nu
pot fi diferențiate prin teste de rutină (ale microbiologiei clasice). În anul 2004, CDC a raportat
că 80% din infecțiile cu Acinetobacter sunt produse de A.baumannii.
Alte genomospecii implicate în patologia umană sunt: A.lwoffii, A.haemolyticus și A.johnsonii.
Diferențierea speciilor se realizează prin biotipare, serotipare, bacteriocino-tipare.
Familia Pseudomonodaceae are patru genuri, dintre care numai genul Pseudomonas include
specii importante din punct de vedere medical. Genul Pseudomonas cuprinde pe baza omologiei
ARNr cinci grupuri, o parte din speciile incluse anterior în acest gen aparţinând actualmente
genului Burkholderia (B.mallei,B.pseudomallei etc). Pseudomonasmaltophilia a fost
redenumită Xanthomonasmaltophilia şi a devenit actualmente Stenotrophomonasmaltophilia.
Cea mai importantă specie a genului este Pseudomonasaeruginosa (bacilul piocianic, „bacilul
puroiului albastru”), specie implicată relativ frecvent în infecţii la persoane cu reactivitate
scăzută, precum şi în infecţii nosocomiale (infecţii „de spital”). Pseudomonasaeruginosa
reprezintă una din principalele bacterii oportuniste.
În anul 1981 se considera că există circa 800 de specii de Pseudomonas, contaminând în special
plantele.
373
Microorganism foarte răspândit în natură (agent de putrefacţie a materiei organice animale şi
vegetale), poate fi pus în evidenţă la circa 15% dintre persoanele sănătoase, la nivel intestinal,
axilar, perineal etc, preferând zonele cu un grad de umiditate. Poate contamina obiectele din
grupurile sanitare, camera de baie, chiuvetele (în special sifonul de scurgere) etc . Elaborează o
piocină (bacteriocină), cu efect inhibitor asupra unor tulpini din aceeaşi specie.
Este un bacil Gram-negativ subţire, cu dimensiuni între 1-5mm / 0,5-1mm, mobil, cu 1-3 cili
polari (există şi tulpini neciliate), nesporulat. Uneori prezintă capsulă.
Din punct de vedere nutriţional sunt germeni puţin pretenţioşi. Se pot cultiva uşor pe medii
simple în condiţii aerobe. Unele specii din genul Pseudomonas se pot multiplica la 4°C, dar cele
mai multe au temperatura optimă de multiplicare cuprinsă între 30 şi 37 °C (Pseudomonas
aeruginosa se poate multiplica şi la 42°C). Posibilitatea cultivării la 42°C permite diferenţierea de
celelalte specii.
Pe medii solide formează colonii care se pigmentează în mod specific, însoţindu-se de
pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde). De menţionat că pot apărea colonii (de tip S)
cu aspecte diferite, dând impresia prezenţei concomitente de bacterii diferite. Cultura poate
avea un miros aromat, ca al florilor de tei. Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa recoltate de la
pacienţi cu fibroză chistică formează colonii mucoide.
În bulion tulbură mediul, formând şi o peliculă la suprafaţă, sub care se evidenţiază pigmentul.
Produce diferiţi pigmenţi, dintre care mai importanţi sunt piocianina (albastru) şi pioverdina
(galben-verzui fluorescent). Este un germen catalază-pozitiv, degradează oxidativ glucoza, nu
fermentează lactoza şi este oxidază-pozitiv.
Este sensibil la căldură, fenol, alcool de 80°, dar rezistent la acţiunea compuşilor cuaternari de
amoniu.
În spital se selectează tulpini rezistente la antiseptice, dezinfectante, antibiotice, tulpini care pot
fi implicate în infecţii de spital.
Există un răspuns imun umoral, manifestat prin formarea de anticorpi (opsonine, aglutinine),
însă cu titruri nesemnificative şi fără eficacitate protectivă.
Speciile genului Pseudomonas sunt ubicuitare (întâlnite în apă, pe sol, pe plante etc, sau fac
parte din flora microbiană umană). Pseudomonas aeruginosa a fost identificat în diferite soluţii
apoase, inclusiv soluţii dezinfectante sau chiar soluţii de antibiotice, având o deosebită
capacitate de a supravieţui în medii umede. Pseudomonasaeruginosa este un microorganism
oportunist, condiţionat patogen.
Dintre factorii de virulenţă ai bacilului piocianic am putea aminti prezenţa pililor (care mediază
ataşarea bacteriană la celulele epiteliale), producerea unor proteaze (cu efecte histotoxice), a
unei lipaze, sinteza de hemolizine, exotoxine (exemplu exotoxina A, de circa 20.000 de ori mai
toxică decât endotoxina), precum şi existenţa endotoxinei (lipopolizaharidul din structura
peretelui).
Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa izolate de la pacienţi cu fibroză chistică deţin un glicocalix
foarte dezvoltat care mediază aderenţa la nivelul mucoaselor respiratorii şi împiedică
374
opsonizarea. În infecţiile cronice, la aceşti pacienţi, a fost demonstrată trecerea tulpinilor din
forme S în forme de tip M, datorită unor mutaţii care au fost identificate recent (2008).
44. 2. 1. Habitat
375
Habitatul natural al vibrionilor include sursele de apă dulce şi sărată, unde există liberi sau în
asociaţie cu diferite vietăţi acvatice. Vibriocholerae se găseşte în intestinul şi în materiile fecale
ale omului bolnav de holeră. Prezenţa vibrionului holeric în mediul extern este explicată prin
contaminarea fecală şi supravieţuirea vibrionilor, existând şi posibilitatea unui ciclu de viaţă
extraintestinal.
44. 2. 2. Caractere m
La izolarea primară, V.cholerae este un bacil Gram-negativ, curbat (forma de virgulă a devenit
mai mult o „reprezentare istorică”), lung de 2-4 mm, mobil cu ajutorul unui flagel polar.
44. 2. 3. Caractere de cultură
Sunt germeni puţin pretenţioşi şi se pot dezvolta pe medii de cultură simple, inclusiv în apa
peptonată, ceea ce este util în izolarea primară (formează un văl la suprafaţa mediului). V.
cholerae se dezvoltă bine la un pH alcalin (9-9,5), mediile cu un astfel de pH având rolul de
medii de îmbogăţire.
V.cholerae produce pe mediile de cultură solide colonii convexe, rotunde, de tip S cu un aspect
opac. Se dezvoltă foarte bine la 37°C pe multe tipuri de medii, inclusiv pe medii ce conţin săruri
minerale şi asparagină ca surse de carbon şi azot. Creşte bine pe TCBS (tiosulfat-citrat-bilă-
sucroză-agar), pe care produce colonii galbene.
44. 2. 4. Caractere biochimice
V.cholerae fermentează de obicei sucroza şi manoza. Fermentează glucoza. În funcţie de
fermentarea zaharurilor vibrionii se pot subîmpărţi în grupe. Au metabolism respirator şi
fermentativ. Sunt aerobi, facultativ anaerobi.
Testul oxidazei (pozitiv în cazul vibrionului holeric) este un test cheie în identificarea
preliminară. Majoritateavibrionilor sunt halotoleranţi şi adesea prezenţa NaCl le stimulează
creşterea prin alcalinizarea mediului.
Fiind mobil,
Vibrionul vibrionul
holeric prezintă
şi vibrionii antigenul
înrudiţi H lao nivel
produc ciliar. labilă faţă de căldură, cu masa
enterotoxină
moleculară de 84.000 Da, alcătuită din două subunităţi A şi B (activă şi de legare).
44. 2. 7. Răspuns imun
Aciditatea gastrică furnizează o oarecare protecţie în cazul ingerării unui număr mic de vibrioni.
După holeră apare imunitate faţă de reinfecţie, dar durata şi gradul acesteia nu sunt cunoscute.
La animalele de experienţă apar anticorpi specifici de tip IgA în lumenul intestinal. Anticorpii
faţă de antigenul O protejează animalele de laborator faţă de infectare. Anticorpi similari apar în
serul uman după infecţie şi se consideră că sunt asociaţi (într-o oarecare măsură) cu protecţia
376
faţă de colonizarea cu vibrioni patogeni. Prezenţa anticorpilor antitoxină nu se asociază cu
protecţia.
44. 2. 8. Caractere de patogenitate
Microbiologia medicală este interesată în cunoaşterea următorilor vibrioni patogeni sau cu
patogenitate condiţionată, potenţial periculoşi pentru sănătatea omului: Vibriocholerae O:1, cu
biotipurile cholerae şi El Tor (fiecare din aceste biotipuri putând fi clasificat în serotipurile Inaba,
Ogawa, Hikojima); Vibriocholerae grup non O:1; Vibriomimicus; Vibrioparahemolyticus ; V.
damsela; V.furnissii; Vibriovulnificus ; V.fluvialis.
Mecanismul patogen al germenilor din familia Vibrionaceae constă în aderarea la epiteliul
celular (adezine/pili), urmează colonizarea şi apoi invadarea mucoasei, care permit infiltrarea
germenilor cu producerea unor variate substanţe biologic active, incluzând enzime
extracelulare, enterotoxine, citotoxine, hemolizine, factori asociaţi cu virulenţa bacteriană.
Capacitatea chemotactică faţă de epiteliile mucoase este mai evidentă la formele monotriche,
depinzând şi de cantitatea şi calitatea mucusului.
Majoritatea germenilor ce colonizează ţesutul uman posedă pe suprafaţă componente proteice
numite ²adezine² care se leagă stereochimic de structurile moleculare complementare tisulare.
Aceşti factori de adezivitate par a fi asociaţi cu fimbriile sau pilii. Factorii de virulenţă implicaţi în
colonizare sunt sintetizaţi în paralel cu producerea enterotoxinei în cazul Vibriocholerae (toxina
holerică) şi sunt sub coordonarea aceleiaşi gene. Se presupune că pilii (proprietate importantă
asociată virulenţei germenilor din mediu) se pierd o dată cu instituirea infecţiei.
Prin observarea tulpinilor virulente la microscopul electronic s-a observat existenţa unui strat
adiţional S extern faţă de peretele celular, care oferă protecţie faţă de agenţii litici (bacteriofagi,
proteine serice).
Enterotoxina holerică este principala cauză a diareei secretorii din holeră. De exemplu, la
voluntarii care au ingerat mai puţin de 10μg de toxină purificată, în 2 zile a apărut diareea, cu un
volum de peste 20 l, cu caracter „exploziv”.
Toxina holerică (la fel ca şi enterotoxina produsă de E.coli) este compusă dintr-o subunitate A şi
5 subunităţi B, totalizând aproximativ 84.000 daltoni. Subunităţile B au o mare afinitate pentru
receptorii gangliozidici GM de pe suprafaţa celulelor ţintă. După legare, subunităţile A intră în
citoplasmă şi catalizează transferul ADP-ribozei la NAD, fiind astfel activată o proteină reglatoare
asociată membranei, numită Gs. Rezultatul este un nivel crescut al AMPc în celulele mucoase
ale intestinului subţire, urmat de hipersecreţia clorurilor şi bicarbonatului care va determina un
eflux important de apă.
Fiind germeni Gram-negativi, după distrugerea acestora din peretele celular se eliberează
endotoxina.
În condiţii naturale vibrionul holeric este patogen numai pentru oameni. S-a dovedit că pentru
realizarea infecţiei şi bolii este necesară ingerarea a 10 8–1010 microorganisme.
Holera nu este o boală invazivă. Germenii nu ajung în torentul circulator, ci rămân cantonaţi la
nivelul tractului intestinal. Vibrionii colonizează marginea în perie a celulelor epiteliale, apoi se
multiplică şi eliberează toxina holerică (iar atunci când sunt distruşi eliberează şi endotoxina).
După o perioadă de incubaţie de 1-4 zile apar brusc greaţă, vărsături, diaree abundentă (20-30
litri / zi) şi crampe abdominale. Scaunele apoase, riziforme („apă de orez”) conţin mucus, celule
epiteliale şi un mare număr de vibrioni. Există o pierdere rapidă de fluide şi electroliţi care duce
la deshidratare, colaps circulator şi anurie. Rata mortalităţii în lipsa tratamentului este 25-50%.
377
Infecţiile cu Vibriocholeraegrup non O:1sunt asociate cu cazuri de gastroenterită şi cu infecţii
extraintestinale. Sepsisul datorat grupului non O:1 a fost mai rar raportat (ex. la adulţi cu
imunitate deficitară). Totuşi, a fost raportat un caz de sepsis cu Vibriocholerae grup non O:1
plus gastroenterită la un copil de 8 ani, pacientul prezentând diaree cu sânge, febră și
deshidratare severă; vibrionii non O:1 au fost izolaţi din sânge și din materiile fecale. (1)
Microorganismele descrise în acest capitol erau anterior grupate împreună cu vibrionii şi erau
cunoscute ca patogeni ai unor variate specii animale la care produceau septicemii, avorturi sau
enterite (1963, vibrioni microaerofili). Ulterior s-a identificat specia Campylobacterjejuni ca
agent etiologic al diareei umane iar aceşti „vibrioni” au fost încadraţi, având la bază
secvenţierea ARNr 16S, precum și caracterele de cultură și biochimice diferite în genurile
Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter și Wolinella.
Genul Campylobacter conține 18 specii și subspecii, iar genul Arcobacter conține 4. Pentru o
listă cu denumirile acestor specii puteți consulta Tabelul nr. 1.
Habitatul natural al microorganismelor din genul Campylobacter cuprinde păsările, atât cele
domestice, cât și cele sălbatice, acestea reprezentând principalele surse ale infecției pentru
oameni.
Bacteriile din genul Campylobacter sunt bacili gram negativi curbați, mobili, iar majoritatea
speciilor au un singur flagel polar. După cultivarea prelungită sau după expunerea la oxigen,
microorganismele dobândesc o formă cocoidă (ceea ce ar putea preta la confuzii de
interpretare).
Sunt bacterii microaerofile, spre anaerobe. Se dezvoltă cel mai bine într-o atmosferă săracă în
oxigen (5-10%) și îmbogațită cu CO 2 (10%). În mod obișnuit, sunt utilizate medii de cultură
selective, de exemplu mediul Skirrow care conține vancomicină, polimixină B și trimetoprim cu
scopul de a inhiba creșterea altor bacterii. Temperatura optimă de dezvoltare pentru C.jejuni,
C.coli și C.lari este de 42°C (bacterii fiind cunoscute sub numele de “grupul termofil”, deși nu
sunt bacterii termofile în sensul strict al cuvântului, a se vedea ). Coloniile sunt incolore sau
gri și pot fi convexe și rotunde sau apoase cu tendință la confluare.
378
Sunt oxidază și catalază pozitive. Nu fermentează carbohidrații.
Sunt mult mai sensibile în comparație cu majoritatea bacteriilor. Sunt distruse de procedeele
obișnuite de pasteurizare ale laptelui. C.jejuni supraviețuiește în apă la 4°C timp de câteva
săptămâni, dar acest timp este mult scurtat la temperaturi de peste 15°C.
Structura antigenică a bacteriilor din genul Campylobacter este similară cu cea a tuturor
microorganismelor Gram negative. Menționăm lipopolizaharidul (de fapt un lipooligozaharid) cu
activitate de endotoxină și porinele membranei externe. De asemenea, există și antigenul
flagelar.
Anticorpii serici de tip IgG și IgM înregistrează un maxim la 2-4 săptămâni după infecție, apoi
scad rapid. Pacienții expuși frecvent la bacterii din genul Campylobacter au concentrații crescute
de IgA care sunt însoțite de imunitate. Pacienții care au infecție cu Campylobacter pot avea un
test fals pozitiv pentru anticorpi anti-Legionella.
379
Helicobacterpylori colonizează stomacul în 60-70% din dispepsiile fără ulcer şi mult mai frecvent
în ulcerul peptic. Este identificat la polul luminal al celulelor epiteliului gastric, sub stratul de
mucus sau în zonele profunde ale acestuia, fără a invada mucoasa gastrică. Ureea reprezintă un
important element nutritiv, iar amoniacul produs de urează îi asigură pH -ul optim necesar
multiplicării.
ureeureazaH2O 2CO2+2NH3'>
Prima cultură de H.pylori a fost obţinută în anul 1982 (vezi 45.13.1). Germenii izolaţi de la
pacienţii cu gastrite şi ulcer duodenal au primit iniţial numele de Campylobacterlike, apoi
Campylobacterpyloridis , Campylobacterpylori, iar din 1989 fac parte din noul gen, genul
Helicobacter cu specia tip H.pylori.
Se dezvoltă în 2-7 zile pe medii de cultură neselective (agar-chocolate, medii cu infuzie de creier
şi inimă sau agar-Brucella suplimentat cu 5-7% sânge de cal) sau pe medii selective în care se
adaugă de exemplu amfotericină B şi polymixină sau cefsulodină, în condiţii de umiditate relativ
ridicată şi un procent de 5-10% CO2.
H.pylori nu reduce nitraţii, nu desface hipuratul de sodiu; unele tulpini produc H 2S pe mediul
TSI, elaborează
multe urează şi(acatalază.
teste diagnostice se vedeaPe45.
abilitatea
3. 3). H.pylori de a produce urează se bazează mai
H.pylori este foarte susceptibil la deshidratare; rezistă relativ puţin în mediul extern. Este dotat
cu capacitatea de a supravieţui şi de a se multiplica la nivelul mucoasei gastrice.
380
este descrisă în documentul suplimentar (Anexa nr. 1) mai precis stimularea secreției de IL8 de
către acidul diaminopimelic.
Pentru a evita răspunsul imun înnăscut, este necesară “neutralizarea” receptorilor Toll-like
(prescurtați în continuare ). Aceștia recunosc PAMPs (pathogenassociatedmolecular
patterns), adică recunosc anumite molecule specifice pentru o mare varietate de agenți
patogeni care sunt diferite din punct de vedere structural de moleculele organismului gazdă.
Astfel, receptorii TLR-5 recunosc flagelina caracteristică mai multor specii bacteriene, însă nu și
pe cea conținută de H.pylori. TLR-9 recunosc ADN nemetilat al majorității bacteriilor, dar H.
pylori are un ADN puternic metilat. LPS (lipopolizaharid) a suferit modificări, astfel încât este
recunoscut doar de TLR-4 de pe macrofage, nu însă și de receptorii aflați pe celulele epiteliale
gastrice. Unul
pylori este dinacid
calea puținele mecanisme ale imunității înnăscute
diaminopimelic→NOD1→stimularea care încă este
NFkB→secreție activat de catre
IL8→neutrofile H.
( NOD
likereceptors sunt un alt tip de patternrecognitionreceptors, receptori care recunosc PAMPs).
Pentru imunitatea dobândită sunt necesare prezentarea antigenelor și proliferarea LT,
evenimente inhibate de către vacA, după am prezentat în Anexa nr. 1.
În timpul răspunsului imun dobândit, limfocitele Th0 (naive) se pot diferenția fie în Th1 (care
secretă IL2 și IFNγ), fie în Th2 (care secretă IL4, 5 și 10). Th2 stimulează LB care produc anticorpi
împotriva patogenilor extracelulari, în timp ce Th1 stimulează răspunsul imun celular,
caracteristic pentru infecțiile cu microbi intracelulari. În mod paradoxal H.pylori generează un
răspuns predominant Th1. Studiile pe șoareci au arătat ca acest raspuns predominant Th1 este
asociat cu apariția gastritei, în timp ce un răspuns Th2 este protector față de inflamația gastrică
(gastrita se pare că este cauzată de secreția de IFNγ, o citokină caracteristică răspunsului imun
tip Th1). Studiile epidemiologice la om au arătat o polarizare mai puțin pronunțată a răspunsului
imun. (Tabelul nr. 3 și Figura nr. 4)
colonizare, aderare), antigenul somatic O (endotoxina), toxina citotoxică care iniţiază inflamaţia
locală acţionând asupra celulelor din epiteliul gastric şi duodenal şi toxina care inhibă secreţia
acidului clorhidric la nivelul celulelor parietale gastrice (Anexa nr. 1)
Se pare că un rol destul de important în patogenitate îl au ureaza, ca şi prezenţa cililor.
381
glandelor gastrice și instalarea gastritei atrofice. Atrofia gastrică reprezintă unul dintre cei mai
importanți factori de risc pentru cancerul gastric, mai multe ipoteze fiind formulate pentru a
explica trecerea de la atrofie la cancer. Cea mai cunoscută dintre acestea cuprinde secvența
atrofie→metaplazie intestinală→displazie→adenocarcinom. (Figura nr. 6)
Având în vedere particularitățile acestor infecții, abordarea acestui subcapitol va fi puțin diferită
și vom începe prin discutarea unor teste care par a nu avea legătură cu materia studiată în anul
2, însă trebuie avute în vedere ca atare.
Este importantă o clasificare a metodelor de diagnostic pentru infecția cu H.pylori așa cum sunt
ele utilizate de medicul clinician, în colaborare cu medicul microbiolog și medicul care
efectuează testele paraclinice.
În diagnosticul infecțiilor produse de H.pylori, pornindu-se de la elementele clinice, se vor
realiza următoarele teste:
Cu ajutorul endoscopiei se prelevează biopsii de țesut gastric care vor fi analizate prin una din
modalitățile următoare:
: țesutul biopsiat se plasează într-o soluție de uree și un indicator de
pH. Prezența ureazei va descompune ureea și va crește pH-ul ceea ce va determina virarea
culorii indicatorului de pH.
382
: fragmentele bioptice obținute din
corpul și antrul stomacului sunt strivite pe o lamă (amprentare), fixate cu alcool metilic timp de
1 minut, uscate și apoi colorate timp de 20 de minute cu soluție Giemsa1/10 preparată
extemporaneu. Se poate utiliza și impregnarea argentică Warthin-Starry (aceasta a fost metoda
orginală de evidențiere a Helicobacter de către Warren și Marshall în 1983) Apare morfologia
caracteristică de vibrioni sau spirili. (Figura nr 8)
Cultivarea, deși reprezintă o modalitate foarte specifică și prezintă în plus avantajul de a putea
permite testarea sensibilității la antibiotice nu se realizează în mod curent din cauza unor
dificultăți tehnice și a sensibilității reduse (un număr relativ mare de infecții cu H.pylori nu au
fost validate utilizând această modalitate de diagnostic). H.pylori este un microorganism
pretențios, cu
considerăm căcreștere lentă, mai
ar fi necesare caremulte
are nevoie deîn
eforturi condiții speciale pentru a se dezvolta. Totuși,
acest sens.
Genul Corynebacterium cuprinde o serie de specii de bacili Gram-pozitivi (se pot colora
neuniform), uşor încurbaţi, măciucaţi, aşezaţi în V, L sau în „palisade”, nesporulaţi, necapsulaţi,
imobili, aerobi şi facultativ anaerobi, catalază-pozitivi. Speciile genului (62, dintre care 38 cu
relevanţă medicală) pot fi grupate în funcţie de habitat şi patogenitate.
Studii recente au delimitat în cadrul genului în care sunt
incluse speciile C.diphtheriae, C.pseudotuberculosis şi C.ulcerans (ultimele două fiind urează-
pozitive). Cultivă mai bine pe medii îmbogăţite (de ex. cu adaos de ser sau sânge). Au
capacitatea (în cazul conversiei genetice) de a elabora exotoxină. Specia cea mai importantă
este Corynebacteriumdiphtheriae (bacilul difteric). C.diphtheriae include patru biotipuri: gravis,
mitis, intermedius şi belfanti.
Difteria a fost descrisă încă din antichitate (Hipocrate). În 1821 difteria a fost diferenţiată de alte
infecţii ale tractului respirator, iar în 1883 în „falsele membrane” au fost evidenţiaţi bacili Gram -
pozitivi.
Bacteriile corineforme nu reprezintă o unitate distinctă din punct de vedere taxonomic, însă au
primit acest nume generic datorită faptului că se aseamănă din punct de vedere morfologic,
sunt bacili Gram-pozitivi, nu produc spori, au formă neregulată, unii prezintă capete umflate şi
este important să fie diferenţiate de agentul etiologic al difteriei (pot exista confuzii de
diagnostic).
46. 2. 1. Habitat
C.diphtheriae poate fi identificat în tractul respirator superior uman (la 3-5% din persoanele
sănătoase), precum şi la nivel tegumentar (de regulă în leziuni dermice).
46. 2. 2. Caractere m
383
După cultivare pe mediu Loeffler, apar ca bacili Gram-pozitivi, măciucaţi (Korynee înseamnă
măciucă, ciomag), cu tinctorialitate inegală datorită prezenţei granulelor de polifosfat
(corpusculi Babeş-Ernst) şi cu o dispoziţie care ar putea fi comparată cu literele V, L etc. sau cu
nişte „litere chinezeşti”. Se poate afirma că bacilul difteric, cu o compoziţie a peretelui celular
care cuprinde mai puţină mureină (circa 50-60%), este Gram-pozitiv la limită. Pe alte medii de
cultură morfologia este mai puţin caracteristică.
Bacilii difteroizi (de exempluC.hoffmanni, C.xerosis etc) prezintă o colorare uniformă şi sunt
dispuşi în palisade.
46. 2. 3. Caractere de cultură
Bacilul difteric este izolat în cultură pură pentru prima oară în anul 1884, când Loeffler utilizează
un mediu cu ser coagulat de bou (mediul Loeffler). Deşi este inclus într-o singură specie, bacilul
difteric prezintă variabilitate în ceea ce priveşte caracterele de cultură şi de metabolism,
deosebindu-se mai multe tipuri. Coloniile au aspect de creştere de tip R (rough). Pe mediul
Loeffler (mediu electiv) coloniile se dezvoltă în 8-12-18 ore, iar aspectul pe frotiu este cel
caracteristic.
Trei tipuri de colonii (cu grade variate de patogenitate) se evidenţiază pe mediile cu telurit (de
exemplu Gundel-Tietz): tipul gravis produce colonii nehemolitice, mari, cu suprafaţă granulară,
gri-negre, în „margaretă”, cu margini crenelate; tipul mitis produce colonii hemolitice, convexe,
cu margini circulare, de tip S; tipul intermedius produce colonii nehemolitice, mici, cu margini
circulare, cu suprafaţa granulară.
În cursul diagnosticului unei infecţii cu bacil difteric este necesară utilizarea mediului de
îmbogăţire OCST (ou-cisteină-ser-telurit), un mediu lichid.
46. 2. 4. Caractere biochimice
Deşi se poate multiplica pe medii simple, bacilul difteric are o dezvoltare mai favorabilă pe medii
îmbogăţite cu proteine animale (de exemplu ou, ser de bou).
Capacitatea de fermentare a mono şi dizaharidelor permite identificarea speciei în cadrul
genului, iar fermentarea polizaharidelor permite stabilirea tipului (gravis) în cadrul speciei.
Bacilul difteric produce cistinază (care descompune cistina, eliberând H 2S), reduce sărurile de
telur şi elaborează bacteriocine.
46. 2. 5. Rezistenţa faţă de fact
Poate rezista în fragmente din „falsele membrane”. Este distrus de căldura umedă (10 minute la
60º), alcool sau antiseptice uzuale, precum şi de antibiotice (eritromicină, penicilină etc).
46. 2. 6. Structură antigenică
Există diferenţe serologice între diferitele tulpini de Corynebacteriumdiphtheriae, dar nu s-a
putut elabora o clasificare serologică satisfăcătoare. În diagnostic nu se folosesc identificările
serologice.
Cea mai importantă structură antigenică este reprezentată de toxina difterică, un polipeptid
termolabil cu greutatea moleculară de 62.000 Da, care conţine cel puţin patru determinanţi
antigenici diferiţi.
46. 2. 7. Răspuns imun
Determină un răspuns imun umoral. Anticorpii antimicrobieni pot fi identificaţi, dar nu oferă
384
În cazul producerii toxinei, s-a dovedit faptul că prezenţa fierului este esenţială, producţia
optimă realizându-se la concentraţii care variază între 0,14-0,50 mg Fe / ml.
Toxina difterică este alcătuită din două fragmente legate prin punţi disulfidice. Fragmentul B
(greutate moleculară 38.000 Da), reprezintă fragmentul de legare pe receptorii specifici ai
celulelor susceptibile şi facilitează pătrunderea fragmentului A. Fragmentul A este activ şi inhibă
elongarea lanţurilor polipeptidice în curs de formare, catalizând inactivarea translocazei ARN t
(numit factor de elongare 2) prezentă numai în celulele eucariote. Factorul de elongare 2 este
necesar pentru translocarea polipeptidil-ARNt de pe situsul acceptor pe situsul donor al
ribozomului celulei eucariote; prin inactivarea lui nu mai are loc interacţia ARN m-ARNt şi se
stopează adăugarea a noi aminoacizi lanţului polipeptidic în curs de formare.
În mod practic,
nicotinamidă şi toxina difterică
adenozin (fragmentul
difosfat A)cuplându-se
riboză, care catalizează ocu
reacţie prindecare
factorul se eliberează
elongare 2 formează
un complex inactiv (o toxină asemănătoare ca mod de acţiune poate fi produsă de unele tulpini
de P.aeruginosa). O moleculă de toxină opreşte sinteza proteică în celulă pentru mai multe ore.
Doza letală este de 0,1 mg / kg.
Poarta de intrare a bacilului difteric poate fi reprezentată de tractul respirator (faringe, nas), de
leziuni tegumentare sau, mai rar, de mucoasa genitală. După multiplicare rezultă o inflamaţie
locală. În acelaşi timp, în cazul tulpinilor lizogene (infectate cu bacteriofagi tox ) începe sinteza
toxinei. Toxina difterică poate afecta orice tip de celulă din organism, dar are un „tropism”
special pentru celulele de la nivel cardiac (miocardită), nervos (demielinizare), renal (necroză
tubulară), suprarenalian, muscular şi hepatic. Cel mai probabil oprirea bruscă a sintezei proteice
este responsabilă
În câteva zile de lade efectele
debutul necrotice,
infecţiei neurotoxice
(şi producerii etc.
de toxină), Corynebacteriumdiphtheriae
sintetizează o „structură” compusă din fibrină la care se adaugă leucocite, eritrocite, celule
epiteliale respiratorii distruse, bacterii, structură care a fost numită „ de
culoare gri-maronie (diphtera înseamnă membrană).
Încercarea de a îndepărta „falsa membrană” (foarte aderentă) duce la sângerări la nivelul
submucoasei prin ruperi de capilare. Această structură se poate forma local (amigdalian,
faringian, nazal, genital) sau se poate extinde, acoperind faringele, obstrucţionând arborele
traheobronşic (posibil cu asfixie mecanică, situaţie numită „ crupdifteric”) etc. La adăpostul
„falsei membrane”, bacilul îşi continuă multiplicarea şi sinteza de toxină care difuzează pe cale
sanguină şi conduce la apariţia unor tulburări la distanţă (tulburări de ritm cardiac, miocardită,
dificultăţi vizuale, de vorbire, de înghiţire etc).
Cu cât diagnosticul este mai tardiv, cu atât rata mortalităţii prin difterie creşte.
Au fost înregistrate forme de difterie invazivă, cu tulpini netoxigene, la persoane care se
droghează sau la alcoolici (artrită septică, osteomielită, endocardită difterică).
Datorită faptului că în ultimii aproape 22 ani nu au mai fost înregistrate cazuri de boală în ţara
noastră,
niciodatăexistă
un cazriscul nerecunoaşterii
de difterie. acesteicazurilor
Riscul apariţiei patologiiexistă
de către medicii care
iar sistemul nu au văzut
de sănătate trebuie să fie
în permanenţă pregătit pentru a reacţiona prompt, din toate punctele de vedere (recunoaştere
clinică, stabilire diagnostic, instituire tratament, intervenţie „în focar” etc).
385
Genul Clostridium include peste 170 de specii (faţă de 83 specii listate în 1986) care se pot găsi
în intestinul animalelor şi se pot elimina în mediul exterior prin materiile fecale. O parte dintre
aceste specii sporulează. Cele mai multe dintre specii sunt anaerobe.
Fenomenul de anaerobioză a fost descoperit în anul 1861, de către Louis Pasteur, care a
identificat şi fermentaţia butirică produsă de Vibrionbutyrique (numele actual fiind Clostridium
butyricum). Până în anul 1880, aceste specii erau incluse în genul Bacillus.
Reprezintă un grup foarte heterogen, în cazul căruia secvenţierea ARN r 16S nu a condus la o
clasificare suficient de clară. Se discută despre existenţa a 19 sub -grupuri.
Sunt bacili Gram-pozitivi (uneori „la limită”), de dimensiuni mari, aşezaţi în perechi sau lanţuri,
mobili cu cili peritrichi (ex. cu excepţia C.perfringens sau a C.butyricum). Multe dintre specii
sintetizează exotoxine.
În cele ce urmează vom discuta despre speciile care produc tetanosul, botulismul şi gangrena
gazoasă.
Botulismul apare de obicei prin ingestia de alimente care conţin toxina produsă de Clostridium
botulinum, fiind o toxiinfecţie alimentară de tip toxic (toxină preformată în aliment). Toxina
botulinică este cea mai puternică otravă cunoscută; doza letală pentru om este de circa 1-2 mg.
După ingerare, toxina se resoarbe la nivel intestinal, ajunge în circulaţie, iar pe această cale la
nivelul plăcilor neuromotorii unde împiedică eliberarea de acetilcolină (determină paralizie
flască). Paralizia începe la extremitatea cefalică (ex. paralizia muşchilor globilor oculari care
apare la 18-24 ore de la ingestie şi se manifestă prin diplopie) şi evoluează descendent. Decesul
poate surveni prin asfixie (datorită paraliziei muşchilor respiratori). Botulismul infantil (posibil şi
386
la adulţi) este urmare a formării toxinei botulinice prin germinarea la nivel intestinal a sporilor
ingeraţi. Mortalitatea în botulismul neo-natal este foarte mare. Botulismul plăgilor poate apărea
la persoane care folosesc droguri injectate intravenos sau prezintă leziuni contaminate cu
pământ.
Gangrena gazoasă este produsă de două sau mai multe dintre următoarele specii: C.
perfringens, C.novyi(C.oedematiens), C.septicum, C.histolyticum, C.sporogenes etc. Sporii
clostridieni ajung la nivel tisular prin contaminarea unor leziuni (traume). În condiţii de
anaerobioză sporii germinează, formele vegetative se multiplică, fermentează zaharuri şi apare
gaz. Distensia tisulară, obstrucţia mecanică a structurilor vasculare în conjuncţie cu sinteza de
toxine favorizează diseminarea infecţiei. Enzimele (toxinele) produse contribuie şi la alterarea
gravă a stării generale. Gangrena gazoasă este caracterizată prin edeme dure, crepitante
(datorită prezenţei de gaz) şi necroză. Necroza tisulară se extinde, multiplicarea bacteriană se
amplifică, apare anemie hemolitică, toxemie şi evoluţie (în 20-80% din cazuri) către deces.
Clostridium tetani
Tetanosul a fost cunoscut încă de pe vremea lui Hipocrate, sau chiar şi înainte de menţiunile
făcute de acesta. Etiologia tetanosului a reprezentat un mister până în anul 1884 (anul
vizualizării la microscop a bacilului tetanic); în anul 1889 au fost obţinute primele culturi de C.
tetani.
Sunt germeni strict anaerobi, sporulaţi, necapsulaţi, mobili, cu cili peritrichi, care se poate
identifica pe sol (germeni telurici). Clostridiumtetani reprezintă o specie patogenă prin toxinele
(exotoxine) neurotrope elaborate.
În stare vegetativă sunt prezenţi în intestinul omului şi al animalelor. Eliminaţi în mediul extern
(pe sol), sporulează. Sporii sunt foarte rezistenţi.
Sunt bacili mari, Gram-pozitivi, cu capetele rotunjite, mobili, cu cili peritrichi. În prezenţa
oxigenului sporulează, formând un spor terminal, mai mare decât diametrul celulei bacteriene,
care conferă germenului aspectul de băţ de chibrit.
Cresc pe medii simple, în condiţii de anaerobioză, formând colonii rotunde, de tip S, înconjurate
de o zonă pufoasă.
387
49. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Formele vegetative sunt distruse de expunerea timp de 15-20 de minute la temperaturi de 55-
60°C şi de substanţe dezinfectante.
Sporii rezistă la temperatura de 100°C, dar sunt distruşi prin autoclavare la 120°C şi 1 atm, timp
de 30 de minute şi la pupinel timp de 1 oră la 180°C.
Apare un răspuns imun umoral, cu producere de anticorpi antitoxină, dar care nu sunt utili din
punct de vedere al protecţiei şi nici în scop diagnostic.
Cl.tetani este patogen prin multiplicare la poarta de intrare (nu are capacitate de invazivitate) şi
toxinogeneză (produce o toxină neurotropă).
Filtratul de cultură are două componente tetanolizina, care produce liza hematiilor unor specii
animale şi tetanospasmina, care inhibă eliberarea acetilcolinei, interferând astfel cu activitatea
sinapsei neuromusculare şi inhibă neuronii spinali postsinaptici, blocând eliberarea unor
mediatori inhibitori, determinând astfel spasme musculare generalizate, hiperreflexie şi
convulsii.
Neuronii motori spinali sunt de obicei inhibaţi de către glicină şi acidul aminobutiric. Toxina
blochează eliberarea acestor mediatori, ceea ce determină excitarea neuronilor motori spinali,
cu apariţia de spasme severe şi dureroase ale musculaturii striate (paralizie spastică). Conştienţa
este păstrată. Toxina poate ajunge la nivelul SNC şi retrograd prin propagare pe cale axonală de
la poarta de intrare sau pe cale sangvină.
Clinic, la 4-5 zile de la contaminare apar spasme ale musculaturii din zona contaminată, apoi ale
muşchilor masticatori, manifestate prin trismus (gura nu se mai poate deschide) şi facies de tip
risus sardonicus (spasme ale musculaturii faciale). Orice stimul extern precipită un atac de
tetanos. Moartea se poate produce prin asfixie; mortalitatea este de circa 50%.
388
49. 5. Tratament
Tratamentul trebuie realizat de urgenţă, prin administrarea de ser antitetanic (cu măsurile de
precauţie necesare în cazul seroterapiei) şi eliminarea focarului tetanigen, pentru a se împiedica
formarea unor noi cantităţi de toxină. La tratamentul specific se asociază administrarea
anatoxinei tetanice.
49. 6. Epidemiologie
Sursa de infecţie este reprezentată de om şi animale (prin dejectele acestora care ajung pe sol).
Transmiterea se face prin intermediul pământului contaminat cu spori. Poarta de intrare este de
obicei o plagă contaminată cu pământ ce conţine spori de bacili tetanici (plagă cu risc
tetanigen).
În anul 1998, în România au fost înregistrate 23 cazuri de tetanos ceea ce corespunde unei
incidenţe de 0,10/0000; în timp de în anii 1999-2000 au fost raportate 19, respectiv 14 cazuri de
tetanos. Numărul de cazuri raportate şi respectiv incidenţa, au avut o evoluţie fluctuantă în
perioada 2001-2006, tendinţa generală fiind de scădere (cel mai mare număr de cazuri a fost
raportat în 2001, 24 de cazuri iar cel mai mic în 2005, 8 cazuri). În anul 2006 au fost raportate
10 cazuri de tetanos, incidenţa fiind 0,05 0/0000).
În SUA au fost notificate 50 de cazuri în 1997 (incidenţă 0,02 0/0000) şi respectiv 41 cazuri în 1998
şi 40 de cazuri în 1999. În perioada 2000-2005 au fost raportate între 20 (2003) şi 37 (2001) în
fiecare an. În anul 2005 au fost raportate 27 cazuri (incidenţă 0,010/0000). Este de menţionat că
s-a înregistrat decesul în cazul a două paciente (una în vârstă de 94 ani care nu a fost niciodată
vaccinată anti-tetanic şi a doua în vârstă de 73 de ani, la care nu au putut fi găsite date cu privire
la vaccinări efectuate anterior).
49. 7. Profilaxie
Se adresează plăgilor cu risc tetanigen, plăgilor contaminate cu alte bacterii aerobe piogene
care consumă oxigen şi cele contaminate cu pământ; acestea asigură condiţii de anaerobioză, în
care sporii trec în formă vegetativă, se multiplică şi elaborează exotoxina ce ajunge la nivelul
centrilor motori bulbari.
- plăgi traumatice mari, profunde, cu margini neregulate, cu resturi de ţesuturi devitalizate care
consumă oxigenul din plagă şi care creează condiţii de anaerobioză;
389
- desfacerea marginilor plăgii şi tăierea „franjurilor”;
În plus, dacă persoana a fost corect imunizată, se face rapel cu ATPA (anatoxină tetanică
purificată şi adsorbită). Anticorpii antitoxină tetanică vor apărea în aproximativ 2 zile.
- se administrează şi ser antitetanic (în altă zonă decât cea în care s-a efectuat vaccinarea);
- ulterior se fac eventuale rapeluri cu ATPA sau dT (este indicată administrarea de anatoxină
tetanică, la fiecare 10 ani).
Cazurile de pacienţi cu tetanos sunt destul de rare, însă, oriunde în lume există posibilitatea
apariţiei unui astfel de caz (germeni telurici, eradicarea tetanosului nu este posibilă).
Examenul clinic a revelat prezenţa contracturii uşoare a muşchilor maseteri, contracţii puternice
la stimuli minori a muşchilor membrelor inferioare şi superioare iar examinarea picioarelor a
permis punerea în evidenţă a unor plăgi, unele recente, nevindecate la nivelul tălpilor. În cursul
anamnezei, medicul infecţionist a aflat că pacientul lucrează ca agricultor şi de regulă nu poartă
încălţăminte, motiv pentru care s-a rănit. Pacientul nu a putut să prezinte un carnet de
vaccinare şi nici nu a putut să menţioneze când a fost vaccinat ultima oară şi dacă a mai fost
vaccinat anti-tetanic în ultimii 5-10 ani.
390
Având în vedere datele anamnestice, datele clinice şi epidemiologice, s -a decis administrarea
unui rapel cu vaccin anti-tetanic (care s-a efectuat în muşchiul deltoid al membrului superior
drept) dar şi administrarea seroterapiei (anticorpi anti-toxină tetanică) la nivelul muşchiului
deltoid al membrului superior stâng.
Cu toate acestea, a fost necesar ca pacientul să fie internat într-o rezervă, ferit de orice stimul
(luminos, sonor etc) în măsura posibilităţilor, ştiindu-se că reacţiile şi contracturile musculare
pot fi extrem de puternice şi, pentru o perioadă de 3 săptămâni a primit tratament simptomatic
şi i-au fost supravegheate şi menţinute funcţiile vitale.
Este de subliniat faptul că vaccinarea anti-tetanică ar trebui să fie administrată din 10 în 10 ani
la orice persoană, indiferent dacă are sau nu o plagă cu risc tetanigen.
Evoluţia în cazul acestui pacient a fost favorabil, fiind externat la finele celor 3 săptămâni.
Situaţia a fost însă dramatic diferită în cazul unui alt pacient, în vârstă de 11 ani, din
aceeaşi regiune a ţării. Copilul se plimba cu bicicleta şi din neatenţie a căzut, rezultând o
fractură deschisă la nivelul membrului superior drept. Fiind transportat de către rude la un
spital cu profil ortopedie, din punct de vedere ortopedic s-au realizat toate manevrele
corespunzătoare, operaţia a permis repunerea oaselor la loc însă din nefericire nu s-a instituit
profilaxia tetanosului.
După operaţie, membrul superior a fost pus în aparat gipsat şi, probabil sub gips şi pansamentul
aplicat au fost realizate condiţii de anaerobioză. În aceste condiţii, spo rii de Clostridiumtetani
au trecut în formă vegetativă, s-au multiplicat şi au produs toxina tetanică.
La 12 zile de la operaţie copilul a devenit febril, agitat, a început să prezinte contracturi spastice,
iniţial la nivelul membrelor superioare, apoi şi la nivelul membrelor inferioare, în timp
contracturile dezvoltându-se atât pe muşchii flexori cât şi pe muşchii extensori.
Copilul a fost adus la camera de gardă a unui spital de urgenţă şi transferat imediat la un spital
de boli infecţioase unde, tot imediat au fost administrate atât serul anti-tetanic cât şi vaccinul.
Cu toate acestea, starea generală s-a degradat, contracturile au devenit brutale, copilul a ajuns
să prezinte poziţia „în cocoş de puşcă” descrisă în literatură, şi-a pierdut conştienţa şi a decedat
la 3 zile de la internarea în spital.
Cu toate că memoria imunologică ar fi trebuit să funcţioneze (cel puţin teoretic, copilul fusese
vaccinat cu DT la intrarea în şcoală; lucru menţionat în fişa personală) în acest caz evoluţia a fost
cea menţionată, spre deces.
391
În faţa unui pacient cu trismus, nu trebuie “insistat” să găsim cauza la nivelul cavităţii bucale, de
exemplu un posibil abces dentar! Mai ales dacă examinarea este chiar dificilă datorita
trismusului “eficient”, suntem tentaţi să administrăm un antibiotic şi sa reexaminăm pacientul
ulterior. Să nu uităm ca trismusul poate fi produs şi de tetanos nu numai de abcesele dentare!
Cu toate că informaţii privind o boală cu manifestări care puteau fi determinate de infecţia cu C.
botulinum au fost descrise şi înainte, despre botulism se discută în mod clar începând cu anul
1817, în Germania, după ce 71 de persoane (din 174) au decedat datorită asfixiei, după ce au
consumat cârnaţi incomplet preparaţi termic („în sânge”). În urma acestei izbucniri epidemice s -
a stabilit numele de botulinum (botulus = cârnat).
Sunt germeni strict anaerobi sporulaţi, necapsulaţi, Gram-pozitivi, mobili, cu cili peritrichi. Sporii
sunt foarte rezistenţi. Clostridium botulinum reprezintă o specie patogenă prin producerea de
toxine (exotoxine) neurotrope.
50. 2. 1. Habitat.
În stare vegetativă se poate evidenţia în intestinul omului şi al animalelor. Dacă sunt eliminaţi în
mediul extern (pe sol), sporulează. Sporii sunt rezistenţi (germeni telurici).
Sunt bacili mari, Gram-pozitivi, necapsulaţi, mobili, cu cili peritrichi. În prezenţa oxigenului
sporulează.
Cresc pe medii simple, în condiţii de anaerobioză şi formează colonii rotunde, netede, de tip S,
înconjurate de o zonă pufoasă.
392
50. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Formele vegetative sunt distruse la expunerea timp de 15-20 de minute la temperaturi de 55-
60°C precum şi de acţiunea dezinfectantelor.
Sporii rezistă la 100°C, dar sunt distruşi prin autoclavare la 120°C, timp de 30 de minute, la
presiunea de 1 atmosferă sau prin menţinerea în pupinel timp de 1 oră la 180°C.
Relativ recent, s-a demonstrat că o tulpină poate deţine concomitent gene care codifică pentru
sinteza mai multor tipuri de toxină.
Apare un răspuns imun umoral, cu producere de anticorpi antitoxină, dar care nu sunt utili din
punct de vedere al protecţiei şi nici în scop diagnostic.
Botulismul apare, mai frecvent, prin ingestia de alimente care conţin toxina, putând fi
considerat o toxiinfecţie alimentară de tip toxic (toxina este preformată în aliment). Spre
exemplu, unele conserve produse în gospodăria proprie, în finalul prelucrării pot asigura condiţii
de anaerobioză, iar sporii care au contaminat respectivul produs trec în formă vegetativă şi
produc toxină (conservele al căror capac „bombează” pot semnifica multiplicarea şi producerea
de gaz datorită unui microorganism; nu trebuie consumate).
Toxina botulinică este cea mai puternică otravă cunoscută; doza letală pentru om este de 1-2
g.
393
În prima formă de botulism, după ingerarea alimentului, toxina se resoarbe la nivel intestinal,
ajunge în circulaţie, iar pe această cale la nivelul plăcilor neuromotorii (faţă de care are
afinitate). Aici împiedică eliberarea de acetilcolină, determinând o paralizie flască. Paralizia
începe la extremitatea cefalică (de exemplu, paralizia muşchilor globilor oculari, care apare la
18-24 ore de la ingestie şi se manifestă prin diplopie-vedere dublă sau paralizie bulbară,
manifestată prin imposibilitate de înghiţire şi de vorbire) şi este descendentă, ajungând până la
paralizia musculaturii respiratorii. Moartea poate surveni prin asfixie (datorită paraliziei
muşchilor respiratori). Bolnavul rămâne conştient până aproape de exitus. Rata mortalităţii în
această formă de botulism este mare. Se estimează, în SUA, că managementul unui caz de
botulism „costă” câteva milioane de USD (spitalizare, tratament, acţiuni în justiţie, solicitare de
daune, campanii mass-media etc).
Botulismul intestinal (mai frecvent la sugari, posibil şi la adulţi), este urmarea formării toxinei
botulinice prin germinarea la nivel intestinal a sporilor ingeraţi. Manifestările clinice sunt
similare cu cele ale toxiinfecţiei alimentare cu toxina preformată (paralizie respiratorie).
Mortalitatea este foarte mare. Nu se cunoaşte motivul pentru care cel mai mare număr de
cazuri este raportat în SUA. Autorităţile americane recomandă evitarea ingestiei de miere la
sugar (copii mai mici de 1 an).
Botulismul plăgilor poate fi suspectat atunci când apar manifestări neurologice anormale şi nu
pot fi implicate alimentele drept sursă pentru toxina botulinică. Boala afectează persoanele care
folosesc droguri injectate intravenos, cele cu leziuni traumatice contaminate cu pământ sau
gravidele la care s-a efectuat o cezariană.
Se poate încerca determinarea a tipului (toxic) de Cl.botulinum implicat, prin toxinotipie. Din
aliment se extrage structura antigenică în formă solubilă. Produsul se tratează prin fierbere
(toxina botulinică este inactivată prin fierbere). Produsul în care presupunem prezenţa toxinei,
atât fiert (şi răcit) cât şi nefiert, se inoculează la şoareci după o schemă care va fi detaliată la
lucrările practice (vezi şi capitolul 22 şi anexa 2 - A.2.6.). Se investighează eventuala prezenţă a
toxinelor mai frecvent întâlnite în ţara noastră (A, B). În cazul în care în produs există toxină
botulinică, semnele clinice apar la circa 24 de ore iar şoarecii mor după circa 48 de ore de la
inocularea produsului care nu a fost supus fierberii (apariţia decesului înainte de 2 ore sau după
48 de ore de la inoculare semnifică prezenţa unei alte cauze).
Tehnicile de biologie moleculară (PCR) pentru determinarea genei care codifică pentru toxina
botulinică se pot efectua numai în cazul obţinerii culturii de Cl.botulinum, nu şi pornind de la
produsul patologic (ex. un aliment).
394
50. 5. Tratament
50. 6. Epidemiologie
Botulismul apare în întreaga lume, fiind asociat în principal cu consumul de conserve preparate
în casă (conserve de fructe, legume, peşte).
Sursa este reprezentată de alimentele care conţin toxina botulinică preformată (în majoritatea
cazurilor de botulism) sau de către solul contaminat cu spori de Cl.botulinum (ex. în botulismul
plăgilor).
Transmiterea se poate face şi prin ingestia de alimente contaminate cu spori (în botulismul
infantil şi cel al adultului) sau prin inhalarea acestora.
Cazurile de botulism, înregistrate în România în anul 1999, au fost în număr de 19, în timp ce în
anul 2000 au fost raportate 29 de cazuri, incidenţă 0,1 0/0000. În perioada 2000-2005 au fost
raportate între 14 (2002 şi 2006) şi 29 (2000) cazuri de botulism în fiecare an. Incidenţa în anul
2006 a fost de 0,06 0/0000.
În SUA, în 1997 s-au raportat 132 de cazuri de botulism (incidenţă 0,05 0/0000), 116 cazuri în 1998
şi 154 de cazuri în 1999, cu o incidenţă de 0,06 0/0000. În perioada 2000-2005 au fost înregistrate
între 118 şi 155 cazuri de botulism în fiecare an. În afară de sistemul de supraveghere „de
rutină”, autorităţile de sănătate publică americate menţin un sistem activ de supraveghere,
pentru botulism. În plus, urmăresc cazurile de botulism în funcţie de etiologie, respectiv cazurile
de toxiinfecţie alimentară (19 cazuri în 2005, cu un număr de cazuri înregistrate în perioada
1998-2005 care au variat între 16 şi 39), cazurile de botulism la nou-născut (85 cazuri în 2005,
cu un număr de cazuri înregistrate în perioada 1998-2005 care au variat între 65 şi 97) şi
botulismul rănilor sau alte condiţii în care cauza nu a fost identificată. Majoritate cazurilor de
botulism al rănilor a fost înregistrat la persoane care se droghează pe cale intra-venoasă (100%
în 2005). În anul 2005 s-au înregistrat 2 decese la cazurile de botulism - toxiinfecţie alimentară.
50. 7. Profilaxie
Departamentul de Sănătate Publică din unul dintre landurile din Germania a comunicat în
luna iunie 2003 existenţa unui focar de botulism care a inclus şapte cazuri. Toţi cei şapte
pacienţi au participat la o petrecere organizată la o fermă din landul respectiv; alţi 22 de
participanţi nu au acuzat nici o problemă de sănătate.
395
Deşi experienţa clinică era redusă în această ţară, orientarea spre diagnosticul real a fost
foarte rapidă, în baza elementelor clinice: toţi cei şapte pacienţi au prezentat uscăciune a
mucoasei bucale, trei dintre pacienţi au prezentat disfagie, în timp ce diplopia (vederea dublă) a
fost remarcată de doi dintre pacienţi. Ţinând cont şi de apariţia acestei situaţii „în focar” (date
epidemiologice), s-a emis imediat suspiciunea de botulism.
Diagnosticul a fost certificat de toxinotipie (folosind animale de experienţă) şi de punerea în
evidenţă printr-o tehnică de tip ELISA a toxinei botulinice la doi dintre pacienţi.
Evoluţia clinică la patru dintre pacienţi a fost rapid favorabilă, fără a se fi administrat ser anti-
botulinic. Aceeaşi patru pacienţi au fost externaţi după trei zile. În cazul a trei pacienţi (toţi
prezentând iniţial disfagie iar doi dintre ei prezentând şi diplopie) s-a administrat ser trivalent
(cu anticorpi anti toxină botulinică A, B şi E), iar durata spitalizării a fost de cinci zile. Evoluţia a
fost favorabilă în cazul tuturor pacienţilor, probabil datorită faptului că au consumat o cantitate
foarte mică din preparatul incriminat.
Ancheta epidemiologică a permis emiterea ipotezei privind alimentul consumat şi care ar fi
putut să conţină toxina botulinică, respectiv cârnaţi de porc preparaţi la grătar; carnea fusese
menţinută „sub vid” în pungi speciale. Nici un alt aliment consumat de cei 29 de meseni nu a
putut fi incriminat. Au mai fost raportate şi alte cazuri de botulism, în Europa de Vest.
Toxina botulinică este una dintre cele mai puternice substanţe cu caracter de otravă, cunoscute
de om. Din acest motiv, există temerea că toxina produsă de Clostridiumbotulinum (unul dintre
tipuri) ar putea să fie folosită ca armă biologică.
În scopul prevenirii unei astfel de situaţii, atât în SUA cât şi în alte state occidentale au fost
constituite grupuri de specialişti care au drept obligaţie monitorizarea oricăror posibile atacuri
teroriste biologice.
Despre un posibil „atac” cu toxină botulinică, aceştia spun că ar putea fi lansat fie prin aerosoli,
fie prin alimente iar manifestările clinice ar putea apărea la 12 -72 ore de la expunere. Răspunsul
autorităţilor va depinde punerea corectă (şi rapidă) a diagnosticului, de raportarea la timp a
cazurilor şi de realizarea unor anchete epidemiologice eficiente. Cei afectaţi trebuie să
primească ser anti-toxină botulinică, precum şi tratament complementar, inclusiv ventilaţie
asistată, la nevoie. Nu se va întârzia instituirea tratamentului, în aşteptarea unui diagnostic de
certitudine.
În ultima vreme însă, toxina botulinică şi-a găsit şi alte utilizări, mai paşnice. Dintre acestea,
amintim folosirea ei în cosmetică (unde poate determina ştergerea temporară a ridurilor),
utilizarea în neurologie (în tratamentul strabismului şi blefarospasmului asociate cu distonia
cervicală) precum şi posibila utilizare în tratamentul transpiraţiei axilare excesive
396
51. 1. Definiţie. Încadrare
Germenii fac parte din genul Clostridium, sunt bacili Gram-pozitivi, pleomorfi, mobili sau imobili
(C.perfringens), anaerobi, care formează spori. Principalele specii clostridiene implicate în
apariţia gangrenei gazoase sunt reprezentate de C.perfringens, C.novyi(C.oedematiens), C.
septicum, C.histolyticum şi C.sporogenes.
Prima dintre aceste specii a fost identificată de către Louis Pasteur, în 1877, sub numele Vibrion
septique (numele actual Clostridiumsepticum). În 1892 a fost identificat Bacillusaerogenes
capsulatum, cu numele actual Cl.perfringens, ulterior identificându-se şi alte specii ( C.novyi -
1894, C.histolyticum - 1916); în anul 1935 a fost sesizată prezenţa în flora microbiană normală
de la nivelul intestinului gros a speciei Clostridiumdifficile.
Clostridiile sunt ubicuitare în natură; sunt prezente în mod normal în tractul digestiv al omului
sau al animalelor (ca forme vegetative), fiind apoi eliminate pe sol (prin dejecte), unde în
condiţii nefavorabile, sporulează. Sporii sunt foarte rezistenţi. Sursa principală pentru
contaminare este reprezentată de sol (germeni telurici).
Sunt bacili Gram-pozitivi, pleomorfi, de dimensiuni mari 1µm / 6-10µm. C.perfringens este
încapsulat şi imobil; celelalte specii menţionate includ bacili care în forma vegetativă sunt
mobili, cu cili peritrichi. În condiţii de anaerobioză formează spori mai mari decât diametrul
bacililor, localizaţi central sau terminal.
Se pot multiplica pe medii simple, în condiţii de anaerobioză. C.perfringens creşte mai repede
(în câteva ore) la 45 C, formând colonii de tip S sau R. Pe geloză sânge produce hemoliză de tip
cald-rece (prima zonă de hemoliză apare la termostat şi este înconjurată de o a doua zonă de
hemoliză mai largă, după menţinere în gheaţă).
Celelalte clostridii formează colonii mai întinse, cu aspect de „grenadă explodată” (datorită
mobilităţii).
397
51. 2. 4. Caractere biochimice
Toţi aceşti germeni elaborează enzime cu caracter de toxine care prezintă histotropism şi pot
distruge orice tip de ţesut, cu producere de gaz. Exemple de astfel de toxine sunt: lecitinaza,
care acţionează asupra lecitinei din ţesutul nervos, diferite proteaze, hialuronidaze, colagenaze,
sialidaza etc. Singura structură care are numai un caracter enzimatic este -toxina (lecitinaza C).
Bacilii genului Clostridium au antigene parietale (somatice), antigene capsulare de tip K (la C.
perfringens), antigene flagelare de tip H (la C.novyi,C.septicum,C.histolyticum şi C.
sporogenes ) şi antigene solubile, reprezentate de exotoxine.
Spre exemplu, C.perfringens poate elabora mai multe tipuri de toxine. Dacă în trecut erau
cunoscute toxinele notate A-D, ulterior A-F, în momentul de faţă se conosc patru toxine majore
(numite α, β, ε şi θ), nouă toxine minore şi enterotoxinele implicate în toxi-infecţii alimentare.
Apare un răspuns imun umoral cu sinteză de anticorpi anti-toxici, care nu au utilitate în cursul
bolii. Sinteza de anticorpi după administrarea de anatoxine ar putea fi însă utilă.
Infecţia cu aceşti germeni determină gangrena gazoasă, caracterizată prin edeme dur e,
crepitante (cu apariţia de gaz, în urma fermentării zaharurilor), necroză şi gangrenă (necroză).
Sporii clostridieni ajung la nivel tisular prin contaminarea unor leziuni (traume). În condiţii de
anaerobioză sporii germinează, formele vegetative se multiplică, în cursul metabolismului
fermentează zaharuri şi apare gaz. Distensia tisulară, obstruarea mecanică a structurilor
398
vasculare (scade aportul sanguin) în conjuncţie cu sinteza de toxine cu efect necrotizant şi
sinteza de hialuronidază, favorizează diseminarea infecţiei. Necroza tisulară se extinde,
multiplicarea bacteriană se amplifică, apare anemie hemolitică, toxemie şi evoluţie (în 20 -80%
din cazuri) către deces. De regulă gangrena gazoasă apare printr-o infecţie concomitentă cu 2
sau mai multe dintre speciile clostridiene menţionate.
51. 4. Diagnostic
este , şi de
regulă poate fi definitivat numai în . Sunt necesare dotări speciale şi un
personal medical cu experienţă.
2. Din punct de vedere am putea menţiona mirosul putrid al p.p., prezenţa unor
fragmente de ţesut necrotic, a unor secreţii de culoare închisă, existenţa de sânge şi puroi în
plagă etc.
Examenul are rol orientativ. Pentru majoritatea laboratoarelor este unica activitate
care poate fi realizată atunci când agentul etiologic este un microorganism anaerob. În rezumat,
examenul microscopic direct trebuie să fie realizat, iar observaţiile se vor interpreta în context.
C. tetani are dimensiuni de 0,5-2 m / 2-18 mm şi poate prezenta un spor rotund localizat
terminal, C. botulinum are dimensiuni de 0,5-1,5 mm / 3-20 mm şi poate prezenta un spor oval
localizat central sau subterminal iar C.perfringens are dimensiuni de 0,5-1,5 m / 1,5-19 mm şi
poate prezenta un spor oval localizat subterminal. Examenul microscopic poate permite în
acelaşi timp un control al calităţii p.p. (evidenţiind prezenţa celulelor inflamatorii şi a celulelor
lezate) şi ar putea servi la alegerea terapiei antimicrobiene (de ex. „disocierea” între ceea ce
vedem la examenul microscopic şi lipsa apariţiei culturii, ne poate face să ne gândim la o infecţie
cu germeni anaerobi şi să alegem pentru tratamentul „de primă intenţie” medicamente cu
eficacitate asupra acestor microorganisme).
3. Pentru p.p. vom pregăti cel puţin 3 medii de cultură: bulion VF ( viande-foi) cu acid
tioglicolic şi albastru de metilen (care testează digestia cărnii de către clostridii), mediul geloză -
399
sânge suplimentat cu neomicină 100 g / ml incubat în anaerobioză şi mediul geloză-sânge
incubat în condiţii aerobe. Pentru p.p. provenite din abcese sau din plăgi care sugerează
gangrena gazoasă am putea folosi şi mediul Nagler (cu gălbenuş de ou) care permite evaluarea
producerii de lecitinază şi lipază.
Pentru a distruge formele vegetative şi a reţine sporii putem proceda aşa cum am arătat în
capitolul 10 (tehnici de izolare speciale).
Caractere morfotinctoriale:
400
Caractere de cultură:
majoritatea tulpinilor produc hemoliză dublă (zona internă, de β-hemoliză, este mai
îngustă în timp ce zona externă, de -hemoliză este mai largă); există şi tulpini care
produc zone foarte largi de hemoliză precum şi tulpini slab hemolitice;
dacă pe frotiul din cultură colorat Gram nu evidenţiem spori, pregătim 2 tuburi cu bulion
peptonă, glucoză, amidon şi extract de levură;
repicăm coloniile suspecte în cele 2 tuburi iar unul dintre tuburi în supunem unei temperaturi
de 80ºC, 10 minute;
401
dacă după o incubare de cel mult 10 zile nu apare multiplicare bacteriană în tubul supus la
temperatură crescută, nu există spori;
Caractere biochimice:
există foarte numeroase caractere biochimice care pot fi utile în diferenţierea speciilor de
clostridii (testarea este „rezervată” centrelor specializate);
în identificarea microorganismelor din acest gen utilizăm iniţial testarea producerii de lecitinază
şi lipază;
pe mediul Nagler inoculăm „în striu” tulpina (se pot testa concomitent mai multe tulpini);
în cazul în care testul este pozitiv (precipitat opac în mediul din jurul striului de cultură) poate fi
vorba de o tulpină de C.perfringens; testul este negativ pentru C.tetani sau pentru C.
botulinum ;
402
·
în cazul în care testul este pozitiv (film perlat, iridescent la nivelul striului de cultură şi în mediul
adiacent) poate fi vorba de o tulpină de C.botulinum; testul este negativ pentru C.tetani şi C.
perfringens ;
după uscarea plăcii inoculăm „în striuri” o tulpină martor pozitiv, o tulpină martor negativ şi
câteva tulpini de testat;
C.perfringens (ca şi tulpina M+) dă un rezultat pozitiv doar pe jumătatea de placă fără anti-
toxină;
403
testul inhibiţiei sialidazei se poate realiza în 2-6 ore; este pozitiv pentru C.perfringens şi negativ
pentru C.septicum;
Creşterea în lapte turnesolat sau cu bromcrezol purpur ( C.perfringens produce cheag alveolar
în laptele turnesolat);
Clostridiile sunt sensibile la vancomicină şi rezistente la colistin; alţi autori propun testarea
sensibilităţii la metronidazol;
testarea (la om) a prezenţei anti-toxinei tetanice în titruri protective prin ELISA sau
hemaglutinare (T 0,01 UAI / ml);
demonstrarea prezenţei toxinei botulinice în alimente, materii fecale, ser sau în medii de
cultură;
spre ex. prelevăm din bulionul VF pe care am identificat multiplicarea bacteriană, centrifugăm
iar supernatantul îl împărţim în 2 tuburi;
404
·
unul dintre tuburi îl supunem temperaturii de 100ºC (toxina botulinică este termosensibilă);
dacă şoarecii injectaţi cu p.p. inactivat termic mor, nu este vorba de toxina botulinică;
urmărim şoarecii timp de 2-4 zile pentru a remarca apariţia semnelor de botulism (reducerea
mobilităţii, respiraţii ample, contracţii ale muşchilor abdominali urmate de convulsii şi deces);
prezenţa toxinei botulinice poate fi confirmată prin seroneutralizare (protejăm spre ex. un
animal de laborator cu anti-toxină de tip A şi un alt animal de laborator cu anti-toxină de tip B
după care îi injectăm cu p.p. respectiv; dacă animalul seroprotejat cu anti-toxina de tip A
supravieţuieşte iar celălalt animal moare cu semne caracteristice pentru botulism, în mediul de
cultură a existat C.botulinum de tip A);
Titrarea toxinei botulinice, prin metoda DL50 (folosind injectarea p.p. în vena cozii şi curbe
standard pentru interpretare, pentru fiecare serotip);
Titrarea toxinei botulinice printr-o tehnică de tip ELISA (poate detecta până la 10 picograme);
Utilizarea tehnologiei de amplificare genică (PCR) pentru structurile care codifică sinteza
diferitelor toxine etc.
405
51. 5. Tratament
Tratamentul trebuie instituit de urgenţă şi include în primul rând toaleta chirurgicală a plăgii
(debridări extinse, eliminarea ţesuturilor devitalizate), administrarea de penicilină, administrare
de oxigen hiperbar precum şi administrarea de ser antigangrenos.
51. 6. Epidemiologie
Sursa de infecţie este reprezentată de om şi animale, care elimină germenii pe sol prin dejecte.
Transmiterea se face prin pământ contaminat cu spori; poarta de intrare în organism este de
regulă o plagă cutanată.
51. 7. Profilaxie
Pacientul de sex masculin în vârstă de 65 de ani s-a internat pentru multiple plăgi împuşcate la
nivelul toracelui şi umărului stâng, suferite în cursul unui accident de vânătoare.
La internare, pacientul se afla sub influenţa alcoolului (alcoolemia era de 2,29 o/oo), în stare de
şoc traumatic, inconştient, cu tulburări respiratorii. S-au iniţiat procedurile obişnuite de
resuscitare. Radiografia toraco-cardio-pulmonară a evidenţiat (pe lângă multiple fracturi costale
şi scapulare) un hemopneumothorax stâng cu emfizem toracic subcutanat important. S-a
practicat toracotomie lateroposterioară cu evacuarea hematomului pleural şi suturarea
ţesutului pulmonar dilacerat; s-a instalat drenaj aspirativ pleural. După intervenţia chirurgicală,
s-a instituit antibioterapia empirică cu spectru larg, administrându-se piperacilină cu
tazobactam. După trei zile de tratament, starea pacientului părea să fie stabilă. În a patra zi s -a
observat apariţia (la nivelul plăgii operatorii) a unui exsudat serosanguinolent, în jurul căreia
ţesuturile erau edemaţiate şi hiperemice. La palparea zonei s-au perceput crepitaţii
subcutanate. S-a intervenit chirurgical, s-a incizat şi s-a constatat prezenţa ţesuturilor necrozate;
s-a realizat o excizare largă a acestor ţesuturi. S-au recoltat probe intraoperator şi s-au utilizat
sisteme de transport atât în aerobioză cât şi în anaerobioză. Culturile obţinute, în anaerobioză şi
aerobioză, au fost pozitive pentru Clostridiumperfringens tip A (producător de toxine alpha,
theta şi kappa), Staphylococcusaureusşi Enterococcusspp.
S-a luat decizia instituirii terapiei cu oxigen sub presiune. În următoarele opt zile, pacientul a
fost supus unui număr de cincisprezece şedinţe de oxigenoterapie hiperbară.
406
perfuzie i.v.). S-a efectuat zilnic toaletarea plăgii, chiuretarea şi eliminarea ţesuturilor sfacelate,
a tuturor zonelor care păreau să prezinte necroză şi s-au aplicat substanţe antiseptice, local.
Pe parcursul tratamentului au fost recoltate din nou probe, care au fost transmise către
laborator, pentru diagnostic bacteriologic; nu au mai fost puse în evidenţă specii de germeni
anaerobi, însă s-a identificat contaminarea plăgii cu germeni multirezistenţi, de spital, respectiv
cu Enterococcusfaecium şi Acinetobacterbaumanii. În aceste condiţii, tratamentul
medicamentos antibacterian a fost modificat, din nou, oprindu-se administrarea de penicilină G,
instituindu-se tratament cu vancomicină şi netilmicină; administrarea de metronidazol pe cale
i.v. a continuat.
S-a continuat şi examinarea zilnică a plăgii, executând excizarea ţesuturilor necrotice şi în aceste
condiţii, datorită pierderilor suferite, pacientul a fost supus şi la două operaţii de autotransplant
tegumentar.
Discuţii:
Există date statistice în baza cărora se estimează că aproximativ 50% dintre infecţiile cu
Clostridiumspp. sunt post-traumatice, circa 35% se dezvoltă la nivelul marilor plăgi chirurgicale,
iar 15% ar putea să apară spontan (atraumatic sau metastatic). Evoluţia acestor infecţii este de
multe ori gravă, cu potenţial deces. Situaţia prezentată se referă la o infecţie severă cu
Clostridiumperfringens tip A, infecţie care a determinat mionecroză extinsă şi stare toxică faţă
de care personalul din serviciul ATI se putea aştepta la orice tip de evoluţie. De regulă, în astfel
de cazuri, simptomele gangrenei gazoase pot să apară chiar la 6-8 ore de la momentul în care
sporii bacterieni au pătruns şi în condiţii de anaerobioză au trecut în formă vegetativă şi au
început să se multiplice şi să sintetizeze o serie de factori de patogenitate (toxina α, toxina θ).
Accentuarea răspunsului inflamator poate fi extrem de rapidă; leziunea (distrugerea tisulară,
sfacelarea ţesuturilor, necrozele locale) poate avansa cu câţiva centimetri pe oră. Incidenţa
şocului septic şi a insuficienţei multi-organice în aceste cazuri este estimată la 50%, iar procentul
de mortalitate la 40% (chiar şi dacă se instituie tratamentul potrivit).
Teta-toxina (denumită hemolizină letală sau perfringolizina O) este responsabilă pentru necroza
tisulară, creşterea permeabilităţii vaselor sanguine; are şi efect cardiotoxic.
407
Cazul prezentat a avut, în final, o evoluţie favorabilă, implicând resurse extrem de importante,
umane, tehnice, materiale iar costurile au fost de asemenea foarte mari. Este un exemplu clar în
care prevenirea ar fi putut face cu mult mai mult şi mult mai la timp în comparaţie cu
tratamentul.
Pacienta în vârstă de 23 de ani se prezintă la camera de gardă pentru dureri toracice şi dispnee.
Bolnava prezenta un istoric de o săptămână de afecţiune la nivelul căilor respiratorii superioare,
iar înainte de debutul simptomelor, aparţinătorii şi-au amintit, ulterior, că suferise un
traumatism cu plagă minoră la nivelul mâinii (probabil poarta de intrare pentru infecţie).
Pacienta fusese diagnosticată în urmă cu cinci ani cu lupus eritematos sistemic (LES), pentru
care nu primea tratament; a afirmat că nu consumă alcool sau droguri.
Cu toate că examenul clinic pentru sistemul cardiovascular a fost în limite normale (cu excepţiile
menţionate mai sus), electrocardiografia a evidenţiat tulburări de ritm, ritm cardiac de 130 bătăi
/ minut şi tulburări de conducere.
În ciuda tratamentului complex aplicat, pacienta a evoluat către stop cardiac şi a decedat la 15
ore de la internare.
Discuţii
În cazul prezentat nu s-au evidenţiat leziuni „gazoase” la nivelul miocardului, iar reacţia
inflamatorie a fost predominant limfocitară, în timp ce în toate celelalte cazuri raportate reacţia
a fost cu neutrofile. În infecţiile miocardice se estimează că etiologia clostridiană este dominată
de C.perfringens urmat de C.septicum, C.fallax. Cu toate că la nivelul respectivului traumatism
de la mână nu s-a evidenţiat abces sau celulită, probabil că acesta a constituit poarta de intrare
pentru infecţie.
408
Toate cele 17 cazuri raportate până în momentul de faţă au evoluat către exitus, rapid.
Un exemplu în acest sens ne este oferit de Finlanda, una din cele mai dezvoltate ţări de pe glob,
care are şi un sistem de sănătate publică foarte bine pus la punct, incluzând un sistem de
supraveghere foarte performant.
Respectiv pacient a decedat din cauza colitei pseudomembranoase, afecţiune care poate fi
considerată „tipică” pentru acest microorganism.
Pornind de la această situaţie, s-a pus la punct un studiu retrospectiv pentru a se vedea dacă
acest caz a fost unul izolat, sau dacă face parte dintr-o posibilă izbucnire epidemică
(„outbreak”). În urma acestor investigaţii s-au descoperit 100 de cazuri de infecţie cu
Clostridiumdifficile, însă numai 2 alte persoane care prezentau aceeaşi tulpină cu cazul detectat
iniţial. Celelalte 2 persoane fuseseră ambele persoane în vârstă şi decedaseră datorită
complicaţiilor produse de infecţie.
Ceea ce i-a pus în alertă însă pe epidemiologii finlandezi, a fost faptul că toate cele 3 persoane
infectate cu această tulpină (identificată şi subtipată recent) nu avuseseră contact cu nimeni din
afara comunităţii şi nici între ele. Pornind de la această informaţie, s-a făcut presupunerea că ar
mai putea exista şi alte cazuri care ar putea să facă legătura între cele 3 victime. În aceste
condiţii, ancheta epidemiologică a continuat.
În acelaşi scop, la nivelul clinicilor medicale s-a adoptat un protocol de urgenţă, stabilindu-se
care trebuie să fie reacţia (coordonată) în cazul în care vor mai apărea astfel de cazuri.
S-a pus la punct şi un curs de instruire pentru cadrele medicale, în vederea recunoaşterii,
diagnosticării şi tratării persoanelor infectate cu acest patogen.
Este de remarcat modul profesionist, serios, eficient, în care autorităţile de sănătate publică au
reacţionat pornind de la un singur caz. A fost studiată infecţia produsă de un microorganism
cunoscut de foarte multă vreme, dar care a cărui tulpină a fost subtipată şi s-a dovedit că este
vorba de un subtip „nou”, faţă de care s-a stabilit că trebuie luate măsurile cele mai potrivite de
prevenire şi control.
Inocularea anaerobilor din genul Clostridium în zone anatomice inextensibile, de exemplu între
aponevrozele musculare, prin leziuni de contiguitate, poate duce la apariţia unui aşa zis
409
“sindrom de compartiment”. Anaerobii se multiplică la acel nivel în condiţii optime, cu creşterea
presiunii care limitează mult aportul sanguin (care ar fi trebuit să favorizeze prezenţa celulelor
necesare fagocitării, sau a antibioticului). Pacientul prezintă o tumefacţie nu foarte
impresionantă la nivelul unei zone musculare, dar cu semne clinice de suferinţă severă
sistemică. Puncţia la nivelul leziunii musculare, va evidenţia un aspect de culturăpură,fără
elementeinflamatorii(lipsa PMN, macrofage ...), doar cu germeni uneori polimorfi, pe care dacă
nu îi cultivăm pe medii în anaerobioză, vom avea surpriza că ... nu cresc. În faţa unui asemenea
frotiu, apelăm rapid la un chirurg care să intervină şi să debrideze larg, deoarece mai poate salva
membrul respectiv de acţiunea destructivă a anaerobilor!
Cu ajutorul unei clasificări bazate pe caractere morfologice (bacili, imobili) şi tinctoriale (bacili
acid-alcoolo rezistenţi, BAAR), cele două specii se diferenţiau cu oarecare dificultate de speciile
aparţinând altor genuri precum: Nocardia, Rhodococcus sau Corynebacterium.Din acest motiv
putem afirma că elementele minimale necesare stabilirii apartenenţei la genul Mycobacterium
ar putea fi reprezentate de: 1. rezistenţa la decolorarea cu acid-alcool; 2. prezenţa unor acizi
mycolici care conţin 60-90 atomi de carbon şi care pot fi clivaţi prin piroliză în acizi graşi cu 22 şi
respectiv 26 atomi de carbon; 3. un conţinut procentual de G+C de 61-71%.
410
grupul al IV-lea fac parte mycobacteriile cu ritm de multiplicare rapid (ex. M.fortuitum, M.
chelonae).
În momentul de faţă în genul mycobacterium sunt clasificate peste de specii diferite, multe
dintre acestea fiind larg răspândite în natură.
0 BAAR negativ 0
1-2/30câmpuri ± 1-2/300câmpuri
411
>90/1câmp 4+ (++++) >9/1câmp
Fiecare treaptă a gradaţiei cantitative se referă la aceeaşi suprafaţă de frotiu examinată (câmpul
vizual examinat prin metoda fluorescentă este de circa 10× mai mare decât în cazul coloraţiei
Ziehl-Neelsen). Notaţia semicantitativă este obligatorie deoarece exprimă unitar densitatea
BAAR pe frotiu indiferent de metoda folosită, permiţând comparaţii între laboratoare diferite,
între bolnavi diferiţi şi pentru acelaşi bolnav în momente evolutive diferite. Dacă rezultatul final
este „nedeterminat“ trebuie să facem încă un frotiu din acelaşi produs patologic şi să indicăm
recoltarea unui nou produs patologic.
În momentul actual, la nivel mondial există o mare varietate de medii de cultură, unele dintre
acestea fiind produse în mod special pentru mycobacteriologie, mycobacteriile dezvoltându-se
în general pe medii complexe. Singura specie cu semnificaţie clinică necultivabilă este M.leprae.
Principial, mediile de cultură utilizate în diagnosticarea unei infecţii mycobacteriene se împart în
3 grupe principale: medii de cultură lichide (bulion 7H9 etc), medii de cultură pe bază de ou (ex .
mediul Löwenstein) şi medii de cultură bazate pe compoziţia în agar. Pentru izolarea primară a
mycobacteriilor se pot folosi medii foarte variate, din fiecare grup menţionat. Mediile pe bază
de ouă au ca ingrediente: ouă sau gălbenuş de ouă, făină de cartof, săruri, asparagină şi glicerol.
Mediul este solidificat prin coagulare. Aceste substanţe reprezintă elementele de bază ale
mediului clasic Löwenstein-Jensen. Dezvoltarea M.bovis,M.africanum precum şi a tulpinilor de
M.tuberculosis rezistente la HIN este favorizată de suplimentarea cu 0,4% piruvat de sodiu a
mediului Löwenstein-Jensen.
Atunci când încercăm să realizăm izolarea primară, este necesar ca mediile de cultură să se
incubeze într-o atmosferă de 8-10% CO2. Culturile se incubează de rutină la o temperatură de
35-37°C.
Mediile de cultură solide se vor examina zilnic în prima săptămână după inoculare iar apoi
săptămânal până la împlinirea a 6-8-12 săptămâni, deoarece mycobacteriile tuberculoase au o
rată de diviziune de minim 12 ore (30 minute la E.coli).
În cazul că mycobacteria izolată este non-cromogenă (nu produce pigmenţi) se vor examina
caracterele de cultură (colonii de tip R-rugoase pentru M.tuberculosis sau M.bovis, sau S-
netede pentru M.bovis) şi se va trece la identificarea speciei pe baza a câteva teste fenotipice
clasice şi anume: testul producerii de niacină, testul reducerii nitraţilor, testul catalazei la 22°C şi
412
la 68°C, hidroliza tween 80, susceptibilitatea la hidrazida acidului 2-tiofen-carboxilic (TCH) şi
susceptibilitatea la acidul p-amino salicilic (PAS).
Primele 3 teste dau rezultate pozitive pentru M.tuberculosis (în timp ce pentru M.bovis numai
al 3-lea test este pozitiv). Testul catalazei la 68°C şi respectiv hidroliza Tween 80 sunt negative
pentru ambele specii (hidroliza Tween 80 poate fi pozitivă pentru M.tuberculosis). M.
tuberculosis se dezvoltă pe mediul cu TCH în timp ce M.bovis (sau M.bovis-BCG este inhibat de
către această substanţă). Testul este util în special în cazul tulpinilor de M.bovis care prezintă
reacţii pozitive (sau slab pozitive) la primele 2 teste.
Mycobacteriile, datorită structurii particulare a peretelui celular au o rezistenţă mai mare atât în
mediul extern cât şi faţă de diferite substanţe chimice. Diferiţi coloranţi, precum verde malachit,
care au efecte bacteriostatice faţă de alte bacterii, pot fi incorporati în mediul de cultură fără a
inhiba multiplicarea bacililor tuberculoşi. Acizii şi bazele pot fi utilizate în procesul de
decontaminare al produselor patologice (ex. al sputei) distrugând microorganismele din flora
asociată, dar permiţând supravieţuirea M.tuberculosis.
Bacilii tuberculoşi sunt rezistenţi la uscăciune şi rezistă mult timp în sputa uscată, la întuneric.
Sunt sensibili la acţiunea radiaţiilor UV.
Constituenţii peretelui celular sunt recunoscuţi pentru capacitatea de a induce apariţia unui
răspuns imun de tip celular şi respectiv a unei hipersensibilităţi de tip IV. Se acceptă faptul că
aceşti constituenţi sunt implicaţi în inducerea unui grad de rezistenţă faţă de o nouă infecţie
(premuniţie).
Mycobacteriile prezintă la nivelul peretelui celular o cantitate importantă de lipide, inclusiv acizii
mycolici (cu lanţ lung de atomi de carbon, C78-C90), ceruri (ex. ceara D) şi fosfatide. Ceara D
pare a fi implicată în inducerea stării de hipersensibilitate. Lipidele sunt cuplate cu proteine şi
polizaharide.
Apare atât un răspuns imun de tip umoral (anticorpii anti-mycobacterieni pot fi evidenţiaţi prin
diferite tehnici, de ex. ELISA, însă metodologia nu este încă standardizată) cât şi un răspuns
413
imun de tip celular. Mecanismele imunităţii celulare sunt implicate atât în protecţia faţă de
îmbolnăvire cât şi în unele evenimente patologice care apar î n cursul tuberculozei.
Lipoarabinomananul (un glicolipid) din peretele mycobacterian inhibă activarea LT, acelaşi efect
avându-l şi antigenul 85 (proteic) care are capacitatea de a lega fibronectina.
Factorul cord (acid mycolic parietal, 6-6 dimicolat de trehaloză) pare a fi implicat în producerea
leziunilor tisulare şi în inhibarea migrării leucocitare.
Totuşi trebuie menţionat că în ciuda a numeroase studii realizate în peste 100 de ani, nu s -a
stabilit de fapt care este structura implicată cu certitudine în patogenitatea mycobacteriană şi
nici care este mecanismul exact care face ca rezultatul interacţiunii microorganism-gazdă să fie
atât de diferit de la un caz la altul.
Nucleii de picătură care au diametrul de 1-3 μm au capacitatea de a ajunge după inhalare până
la nivel alveolar. Intraalveolar chiar dacă sunt fagocitate, o parte dintre mycobacterii rămân
viabile şi chiar se pot multiplica în interiorul celulelor. Pe cale limfatică se poate realiza
diseminarea la nivelul majorităţii organelor (foarte rar însă apare o multiplicare necontrolată
414
mycobacteriană la nivelul ficatului, splinei sau măduvei hematogene). Microorganismele care
colonizează lobii superiori pulmonari, rinichiul, ţesutul osos, etc. se pot multiplica considerabil
înaintea dezvoltării imunităţii specifice.
Imunitatea specifică este de obicei capabilă să limiteze multiplicarea bacililor; gazda rămâne
asimptomatică şi leziunile se vindecă. În general, la numai aproximativ 5% dintre persoanele
infectate controlul multiplicării microorganismelor este inadecvat şi tuberculoza-boală poate
apare în primul an după infecţie. În alte 5% dintre cazuri diminuarea imunităţii organismului la
un moment mai îndepărtat de momentul infecţiei face ca boala să apară. Astfel aproximativ
10% din persoanele infectate cu M.tuberculosis vor dezvolta o formă de tuberculoză clinic
manifestă în cursul vieţii.
Capacitatea de apărare a organismului poate fi diminuată în cursul unor boli precum silicoza,
diabetul zaharat sau boli asociate cu imunodepresie (ex. infecţia cu HIV / SIDA), sau datorită
corticoterapiei sau medicaţiei imunosupresoare. În aceste circumstanţe probabilitatea
dezvoltării tuberculozei este mult mai mare. Susceptibilitatea la tuberculoză poate fi de
asemenea mare în primii doi ani de viaţă, la pubertate şi în adolescenţă.
Tuberculoza poate avea localizări extrem de variate, dar cea mai frecvent întâlnită este
tuberculoza pulmonară. Pe de altă parte din punct de vedere epidemiologic, pacienţii cu
tuberculoză pulmonară a căror spută este pozitivă microscopic, reprezintă sursa de infecţie cea
mai importantă. Tratamentul corect şi complet al acestor pacienţi este esenţial.
52. 4. Diagnosticul de laborator n infecţiile produse de M. tuberculosis
Tuberculoza poate avea localizări variate, dar cea mai frecvent întâlnită este tuberculoza
pulmonară. Din punct de vedere epidemiologic, pacienţii cu tuberculoză pulmonară (care
elimină prin spută BAAR) reprezintă sursa de infecţie cea mai importantă. Diagnosticul,
tratamentul corect şi complet al acestor pacienţi este .
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim trei frotiuri din
produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu AM, Gram şi
415
respectiv Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează
prezenţa de la nivelul tractului respirator (ex. macrofage alveolare), prezenţa
(ex. leucocite) şi prezenţa . În ţesuturile animalelor bolnave bacilii tuberculoşi
apar ca bastonaşe subţiri, rectilinii, cu dimensiunea de 0,4 / 3 µm, acid -alcool rezistenţi (apar
roşii pe fond albastru, toate celulele şi bacteriile non-AAR sunt colorate în albastru, la coloraţia
Ziehl-Neelsen), imobili, necapsulaţi, nesporulaţi. Se poate utiliza şi coloraţia fluorescentă.
Examenul microscopic rămâne o în diagnosticul unei infecţii mycobacteriene
atât în momentul examinării unui produs patologic (examenul microscopic direct) cât şi în
momentul când prin microscopie se confirmă (sau infirmă) morfologia şi tinctorialitatea
microorganismelor dintr-o colonie izolată.
Din momentul obţinerii unui rezultat pozitiv la examenul microscopic direct se poate elabora
strategia de diagnostic pentru stabilirea cu exactitate a speciei implicate, urmat de precizarea
sensibilităţii la antibiotice. În momentul de faţă avem la dispoziţie 2 tipuri de abordare (eventual
utilizate concomitent, în măsura în care există dotarea tehnică necesară) şi anume folosirea
unor metode de diagnostic convenţionale şi respectiv folosirea unor metode de diagnostic
moderne, mai rapide. Metodele rapide pot fi utile atât după izolarea M.tuberculosis (sau a unei
alte mycobacterii) în culturi, cât şi direct, pornind de la produsul patologic.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine o cultură pură, care se va identifica. În momentul actual, la nivel mondial, există o mare
varietate de medii de cultură. Mycobacteriile se dezvoltă în general pe medii complexe. Mediile
de cultură utilizate în diagnosticarea unei infecţii mycobacteriene se împart în 3 grupe
principale: medii de cultură lichide (ex. bulion 7H9), medii de cultură pe bază de ou (ex. mediul
) şi medii de cultură bazate pe compoziţia în agar (tip Middlebrook). Pentru izolarea
primară a mycobacteriilor se pot folosi medii foarte variate, din fiecare grup menţionat. Mediile
pe bază de ouă au ca ingrediente: ouă sau gălbenuş de ouă, făină de cartof, săruri, asparagină şi
glicerol. Mediul este solidificat prin coagulare. Aceste substanţe reprezintă elementele de bază
ale mediului clasic Löwenstein-Jensen la care se adaugă verde malachit pentru selectivitate (în
acelaşi scop se pot adăuga antibiotice). Dezvoltarea M.bovis,M.africanum precum şi a
tulpinilor de M.tuberculosis rezistente la HIN este favorizată de suplimentarea cu 0,4% piruvat
de sodiu a mediului Löwenstein-Jensen.
416
Atunci când încercăm să realizăm izolarea primară, este necesar ca mediile de cultură să se
incubeze într-o atmosferă de 8-10% CO2. Culturile se incubează de rutină la o temperatură de
35-37°C. Mediile de cultură solide se vor examina zilnic în prima săptămână după inoculare iar
apoi săptămânal până la împlinirea a 6-8-12 săptămâni deoarece mycobacteriile tuberculoase
au o rată de diviziune de 12-27 ore.
Se pot utiliza şi sisteme de cultivare „rapidă” (ex. MB-Bact, Bactec) cu depistarea creşterii
mycobacteriene în 4-25 de zile. În România aceste sisteme au început să fie utilizate în unele
centre începând cu anul 1998. Aceste sisteme permit testarea sensibilităţii la medicamentele
anti-mycobacteriene pentru tulpinile izolate, conform recomandărilor programului naţional.
Caractere de cultură:
Caractere biochimice:
primele 3 teste dau rezultate pozitive pentru M.tuberculosis (în timp ce pentru M.
bovis numai al 3-lea test este pozitiv);
testul catalazei la 68°C şi respectiv hidroliza Tween 80 sunt negative pentru ambele
specii (hidroliza Tween 80 poate fi pozitivă pentru M.tuberculosis);
417
M.tuberculosis se dezvoltă pe mediul cu TCH în timp ce M.bovis (sau M.bovis-BCG
este inhibat de către această substanţă); testul este util în special în cazul tulpinilor
de M.bovis care prezintă reacţii pozitive (sau slab pozitive) la primele 2 teste;
Alte caractere / teste utilizate în identificare: se pot utiliza (la nivelul unor centre de referinţă)
teste care se bazează pe proprietăţi fenotipice moleculare (ex. studiul cromatografic al acizilor
graşi din peretele celular) sau genotipice (fragmente de restricţie ale materialului genetic, sonde
nucelotidice, PCR); există şi posibilitatea testării sensibilităţii faţă de anumiţi mycobacteriofagi
etc.
418
52. 5. Tratament
52. 6. Epidemiologie
Pacienţii cu tuberculoză pulmonară a căror spută este pozitivă microscopic, reprezintă sursa de
infecţie cea mai importantă. Transmiterea se face de obicei pe cale respiratorie, fiind favorizată
de contactul prelungit, intrafamilial sau în colectivităţi. Transmiterea prin intermediul laptelui
contaminat şi netratat termic corespunzător este posibilă.
Apariţia bolii este influenţată în mod decisiv de particularităţi ale gazdei, majoritatea încă
neelucidate. Totuşi se cunoaşte că anumite condiţii socio-economice, aglomerarea
populaţională, vârsta (copilărie şi 16-21 de ani), o anumită structură genetică (ex. HLA BW15) şi
imunodepresia, se asociază mai frecvent cu apariţia tuberculozei manifestă clinic.
Pe lângă problematica TB, cunoscută de mai multe secole, în momentul de faţă se discută din ce
în ce mai frecvent epidemiologia TB produsă de microorganisme rezistente şi multi-rezistente la
antibiotice şi chimioterapice. De circa 15 ani s-au luat în considerare tulpinile de M.tuberculosis
numite „MDR-TB / multi-drug resistant”. Tulpina MDR-TB este definită drept acea tulpină de M.
tuberculosis rezistentă cel puţin la hidrazida acidului izonicotinic (izoniazidă, HIN) şi la
rifampicină.
Din anul 2005, în limbajul medical internaţional a intrat şi „tulpina XDR-TB” (Mycobacterium
tuberculosis extensiv rezistent la medicamente anti-TB). Tulpina XDR-TB este definită drept acea
tulpină de M.tuberculosis rezistentă atât la majoritatea medicamentelor anti-TB de „primă
linie” (inclusiv la izoniazidă şi rifampicină), cât şi la cele mai utilizate medicamente anti -TB de
„linia a doua” (ex. fluorochinolone şi la cel puţin unul din cele 3 medicamente injectabile, cum ar
fi amikacina, kanamicina sau capreomicina).
În România incidenţa tuberculozei a depăşit la un moment dat valoarea de 140 0/0000. Luând ca
punct de reper anul 1985 (incidenţa TB fiind de 56 0/0000, cea mai mică valoare istorică a
incidenţei TB în România) şi respectiv anul 2002 (anul în care incidenţa TB s-a menţinut
staţionară, pentru al doilea an consecutiv, valoarea incidenţei pentru cazurile noi fiind
1210/0000), putem spune că în ultimii ani, numărul de cazuri raportate şi respectiv incidenţa, au
scăzut, an de an. Cel mai mare număr de cazuri din ultima perioadă a fost raportat în 2002
(număr total de cazuri 31.075, număr de cazuri noi 26.637, număr de recidive prin TB 4.438,
număr de cazuri la copii 1.878). Numărul de cazuri noi de TB înregistrate ulterior (la adulţi) a
419
fost de 25.245 (2003), 24.776 (2004), 22.860 (2005) şi respectiv 20.842 de cazuri în 2006, cu o
incidenţă care s-a „întors către” valoarea înregistrată în anul 1994 (96,6 0/0000). La copii, numărul
de cazuri raportate a scăzut de la 1.519 (2003) până la 1.066 cazuri în 2006.
În SUA s-au înregistrat 21.337 cazuri în 1996 (incidenţă 8,040/0000), 19.851 cazuri în 1997
(7,420/0000), 18.361 cazuri în 1998 (6,790/0000) şi respectiv 17.531 cazuri în 1999, corespunzând la
o incidenţă de 6,430/0000. De altfel, numărul de cazuri de TB în SUA a scăzut an de an în perioada
1998-2005. În 2005 au fost raportate 14.097 cazuri de TB (incidenţă 4,8 0/0000).
52. 7. Profilaxie
Vaccinarea BCG este utilă cel puţin pentru prevenirea meningitei tuberculoase la nou -născut
(afecţiune extrem de gravă). Prima vaccinare se realizează în primele zile de viaţă, în
maternitate. Revaccinările se pot face numai la persoane IDR negative.
Pentru prevenirea TB, se recomandă în anumite situaţii chimioprofilaxia (de ex. administrarea
HIN la membrii de familie, contacţi ai unei persoane cu TB pulmonară pozitivă la microscopie).
Eradicarea tuberculozei la vite şi pasteurizare laptelui sunt de asemenea măsur i utile profilactic.
Aceasta este o istorie adevărată care arată că expunerea la microorganisme „periculoase” este
posibilă (chiar dacă transmiterea nu are loc în 100% din cazuri).
Este luată în discuţie situaţia în care un cetăţean american de srcine greacă a decis în luna mai
a anului 2007 să călătorească, pentru a se căsători, cu toate că ştia că este bolnav de
tuberculoză. Anterior plecării, tânărul a mers la Departamentul de Sănătate Publică din statul
american Georgia, unde locuia (este vorba chiar de statul unde se află cel mai important centru
de supraveghere, prevenire şi control al bolilor, CDC, Atlanta, GA). Aici însă, după afirmaţiile
„călătorului” (neconfirmate de autorităţi) mai că nu i s-ar fi urat drum bun şi ar fi fost informat
că dacă îşi ia medicamentele regulat, nu ar fi multe şanse ca să infecteze şi alţi cetăţeni. În
aceste condiţii, tânărul A.S. a plecat spre Europa.
420
medicamentelor anti-TB de „primă linie” (inclusiv la izoniazidă şi rifampicină), cât şi la cele mai
utilizate medicamente anti-TB de „linia a doua” (ex. fluorochinolone şi la cel puţin unul din cele
3 medicamente injectabile, cum ar fi amikacina, kanamicina sau capreomicina).
Aşadar, A.S. a călătorit din SUA până în Europa, cu escală în Italia, într-un avion plin cu cetăţeni
americani şi de alte naţionalităţi.
Datorită faptului că această călătorie a durat suficient de multe ore pentru ca riscul de
transmitere al infecţiei să fie semnificativ, după primirea datelor privind rezistenţa t ulpinii
implicate, autorităţile de sănătate publică au luat toate măsurile posibile pentru identificarea
călătorilor aflaţi la risc, respectând protocolul elaborat de Organizaţia Mondială a Sănătăţii, atât
în USA cât şi în celelalte ţări. Şi România a primit această informaţie şi a contribuit prin măsuri
specifice la identificarea şi informarea câtorva cetăţeni care au călătorit împreună cu A.S. Istoria
a continuat intra-european, înainte, în timpul şi după căsătorie, în călătoriile efectuate după
nuntă şi respectiv în călătoria spre casă.
Se pare că A.S. care a fost sfătuit să se interneze într-un spital din Italia şi să primească
tratamentul adecvat în aşa fel încât să poată porni la drum numai după certificarea stării de
„neinfecţios”. Nu a acceptat să urmeze aceste recomandări menţionând că nu are încredere
decât în spitalele americane. Pentru a evita vigilenţa autorităţilor a preferat să se întoarcă în
SUA prin Canada, cu un alt zbor de lungă durată, o durată suficient de lungă pentru ca riscul de
transmitere al infecţiei să existe.
În ciuda „strategiei” de întoarcere, cu plecare din Republica Cehă şi aterizare în Canada, domnul
A.S. a fost aşteptat la graniţă de către autorităţi. A fost internat „forţat” şi supus tratamentului,
această atitudine reprezentând o situaţie cu totul deosebită (unică în ultimele 4 decade; se pare
că ultima „carantinare forţată” a avut loc, în SUA, în cazul unui pacient cu variolă, în anul 1963).
Ulterior, după alerta generală în sistemele de sănătate, alerta mediatică şi respectiv implicaţiile
umane (stres-ul negativ creat tuturor celor care au zburat cu cele două avioane de „lungă
durată”, dar şi altor călători, participanţi la nuntă etc), testele efectuate pe tulpina de M.
tuberculosis izolată se pare că ar fi relevat faptul că respectiva tulpină nu ar fi fost XDR-TB ci
MDR-TB (multi-drug resistant TB). Tulpina MDR-TB este definită drept acea tulpină de M.
tuberculosis rezistentă cel puţin la hidrazida acidului izonicotinic (izoniazidă, HIN) şi la
rifampicină.
Evoluţia nu a fost chiar excepţională; pacientul a fost supus atât tratamentului anti -TB cât şi
unei intervenţii chirurgicale (lobectomie la nivelul plămânului drept). Dacă iniţial se pare că se
gândea să acţioneze în justiţie autorităţile americane (datorită internării „forţate”), se pare că,
ulterior, a fost chiar el acţionat în justiţie, pentru daune morale (costisitoare) din partea unor
pasageri care au călătorit în acelaşi avion (iar două surori se pare că doresc să solicite plata
contravalorii vacanţei în Montreal pe care nu au mai putut sa o petreacă în linişte, datorită
anxietăţii provocate). În plus, tânărul nu este încă vindecat complet, continuă tratamentul şi
este supus, repetat, controlului medical şi bacteriologic.
421
Dintre cele mai importante probleme legale de acest caz ar fi de amintit inexistenţa unei legi
care să definească şi soluţioneze modul în care se poate institui carantina şi respectiv efortul
substanţial şi dificultatea cu care autorităţile (din diferite ţări) au putut identifica persoanele
care au călătorit în aceleaşi avioane cu pacientul cu XDR-TB / MDR-TB.
Apariţia Regulamentului Sanitar Internaţional (votat la nivel mondial) şi despre care ne -am
propus să discutăm într-un capitol separat, probabil primul capitol de carte din România care
tratează acest subiect, ar putea rezolva întrucâtva aceste probleme; totuşi mai sunt foarte
multe aspecte de rezolvat.
Microorganismul tipic se prezintă sub forma unor spirale subţiri, măsurând aproximativ 0,25 -0,3
m lăţime şi 6-15 mm lungime. Între buclele spiralei există o distanţă constantă m.
Prezintă mobilitate activă, putându-se roti în jurul filamentului axial central, chiarde
şi 1după ce se
ataşează de celule prin capetele efilate. Spiralele sunt atât de subţiri încât nu se pot vizualiza
decât prin imunofluorescenţă sau la microscopul cu câmp întunecat (prin examinarea
preparatului proaspăt între lamă şi lamelă). Aspectele morfologice pot fi evidenţiate prin
colorarea frotiurilor prin metode speciale (Giemsa, Fontana - Tribondeau sau impregnarea
argentică).
422
53. 2. 3. Caractere de cultură
Primul test utilizat în diagnosticul serologic al sifilisului a fost un test având la bază reacţia de
fixare a complementului (reacţia Bordet-Wassermann, RBW). Iniţial antigenul utilizat a fost
extras din ficatul unui fetus uman (cu sifilis congenital). Ulterior s- a descoperit faptul că acest
antigen, lipoidic (difosfatidil glicerol), numit cardiolipină, poate fi extras din muşchiul cardiac
precum şi din alte structuri. De fapt structura antigenică a T.pallidum se apreciază a fi complexă
şi este incomplet elucidată până în prezent.
În structura treponemelor există antigene proteice, un antigen specific de grup, extras din T.
reiter şi altul specific de tip.
Este descris şi un antigen cu structură polizaharidică, specific de tip, diferit de antigenele extrase
din T.reiter, responsabil pentru testul de imobilizare şi care se poate extrage din tulpina Nichols.
Rezistenţa la reinfecţie a fost verificată atât la om (voluntari) cât şi la iepure şi debutează la circa
3 săptămâni după apariţia leziunilor primare. Persistenţa unei infecţii latente previne reinfecţia,
423
dar în cazul în care boala este tratată corect, gazda redevine susceptibilă la infecţie. În vederea
obţinerii rezistenţei la infecţie este necesar atât răspunsul imun umoral cât şi celular.
T.pallidum este patogenă prin multiplicare şi invazivitate. T.pallidum afectează numai omul şi
se transmite de regulă prin contact sexual. Alte modalităţi de transmitere posibile ar fi pe cale
sanguină sau de la mamă la făt. Infectarea indirectă, ex. prin intermediul unor obiecte
contaminate, se apreciază că ar fi posibilă î n circa 0,1% din cazuri.
Infecţia naturală cu T.pallidum este limitată la gazda umană. Infecţia se transmite de obicei prin
contact sexual, iar leziunile de primoinfecţie sunt cantonate la nivelul tegumentelor şi
mucoaselor din zona genitală. Totuşi în 10-20% din cazuri, sunt localizate la
nivel rectal, perianal sau oral. T.pallidum poate probabil penetra mucoasele intacte sau
pătrunde printr-o soluţie de continuitate de la nivelul epidermului.
În aproximativ 30% din cazuri, infecţia sifilitică precoce progresează spontan către vindecare
completă în absenţa tratamentului. În alte 30% din cazuri, infecţia netratată rămâne latentă
(evidenţiată în special prin teste serologice pozitive). În celelalte cazuri, boala progresează spre
, caracterizat prin dezvoltarea de leziuni granulomatoase (gome) în piele, oase,
ficat, prin modificări degenerative la nivelul SNC (sifilis meningovascular, pareze, tabes), sau prin
leziuni cardiovasculare (aortită, anevrism aortic, insuficienţă aortică). În toate leziunile terţiare
treponemele sunt foarte rare, iar reacţiile exagerate ale ţesuturilor se datorează
hipersensibilităţii la antigene treponemice.
424
produce anticorpi antitreponemici de tip IgM. Pentru prevenirea sifilisului congenital, femeile
însărcinate trebuie să fie testate pe parcursul sarcinii, recomandarea fiind făcută de doctorul
obstetrician încă de la prima vizită (recomandarea trebuie făcută de asemenea şi de medicul de
familie).
Atât leziunile primare, cât şi cele secundare sunt bogate în spirochete şi foarte contagioase. În
cele ce urmează vom aborda diagnosticul de laborator în cazul sifilisului primar sau secundar.
Diagnosticul porneşte de la elemente şi , dar trebuie confirmat prin
metode de laborator.
În cazul şancrului, vom recolta p.p. după îndepărtarea cu grijă (fără a produce sângerare) a
crustelor care acoperă leziunea. Ar putea fi necesar să comprimăm baza leziunii pentru a
stimula acumularea de lichid (clar) din care vom efectua 2-3 preparate microscopice. Prelevăm
lichidul fie cu ajutorul ansei bacteriologice, fie cu ajutorul unei pipete Pasteur, fie aplicând pur şi
simplu lama de sticlă pe „leziunea umedă”. Acoperim cu o lamelă şi eliminăm prin uşoară
apăsare eventualele bule de aer. Transportul trebuie să fie realizat foarte rapid, de preferat în
maxim 20 de minute astfel încât se recomandă ca recoltarea să fie realizată într-un spaţiu
corespunzător, în imediata vecinătate a laboratorului. Este o etapă .
425
introduce celelalte 2 preparate într-o cutie Petri în care există puţină vată sau hârtie de filtru
umezită, pentru a păstra atmosfera umedă şi a preveni uscarea. Preparatul microscopic trebuie
examinat sistematic (minim 10 minute în cazul unui rezultat aparent negativ), iniţial cu
obiectivul uscat, ulterior, după vizualizarea unor microorganisme care par să aparţină genului
Treponema, cu obiectivul de imersie. Este necesar ca examinatorul să aibă experienţă în acest
tip de examinare. Microorganismele caracteristice sunt foarte subţiri şi lungi (0,25-0,3m / 6-14
m), spiralate, prezentând 8-14 spire (regulate, strânse, adânci şi rigide), mobile (spirele nu se
deformează), deplasarea în câmpul microscopic nu este foarte rapidă dar seamănă cu o mişcare
de înşurubare (există şi microorganisme care sunt imobile dar păstrează mişcările de translaţie,
rotaţie lentă, flexie uşoară de la un cap la celălalt sau flexie mediană cu revenire ca un resort),
luminoase
recoltarea pe fondul negruÎnalanumite
şi examinarea. câmpului microscopic.
situaţii se poateÎnrecomanda
cazul unui începerea
rezultat negativ putem repeta
tratamentului, iar
evoluţia va fi monitorizată clinic şi serologic (rezultatul negativ nu elimină diagnosticul de sifilis).
Rezultatul pozitiv, atunci când poate fi exclusă prezenţa unor treponeme saprofite, pune
diagnosticul de sifilis primar înainte ca anticorpii să poată fi detectaţi serologic.
În laboratoarele de referinţă ar mai putea fi utilizate şi alte metode în scop diagnostic (mai rar)
sau pentru cercetare:
426
·
Inocularea p.p. la animale de laborator reprezintă cea mai sensibilă metodă pentru detectarea
T.pallidum. Pentru menţinerea în laborator a unor treponeme viabile sau pentru determinarea
infectivităţii au fost utilizate diferite animale (hamsteri, cimpanzei etc) însă cel mai util este
iepurele. Iepurele poate fi inoculat (intratesticular sau cutanat) cu orice tip de p.p. cu condiţia ca
între momentul recoltării şi inoculare să nu treacă mai mult de 60 minute. În caz contrar, p.p.
trebuie adus rapid la o temperatură de cel puţin -70ºC (ex. în azot lichid) şi menţinut astfel până
în momentul inoculării. Testul infectivităţii la iepure (RIT) rămâne metoda standard; cu ajutorul
RIT se apreciază sensibilitatea şi specificitatea oricărei alte metode care este propusă pentru
diagnosticul sifilisului.
În centrele de referinţă au mai fost utilizate şi tehnici ale biologiei moleculare (sondele
nucleotidice, PCR). Tehnica PCR ar putea avea utilitatea diagnostică atunci când p.p. este
reprezentat de lichidul amniotic.
Antigenele nontreponemice sunt lipide care pot fi extrase din diferite ţesuturi. este
un difosfatidil-glicerol. Pentru creşterea sensibilităţii, cardiolipina este cuplată cu colesterol şi
lecitină. Anticorpii anti - cardiolipină au fost numiţi „reagine”. Sunt depistaţi în serul pacienţilor
la 2-3 săptămâni şi în LCR la 4-8 săptămâni de la debutul infecţiei, în cazurile netratate.
427
Reacţia de fixarea a complementului Bordet-Wasserman (RBW) a fost utilizată o lungă perioadă
de timp, începând cu 1906. Datorită faptului că RFC este o metodă laborioasă şi în special
datorită apariţiei unor alte tehnici, RBW este discutată în prezent din punct de vedere istoric.
Există şi RFC Kolmer, care se execută la 4ºC.
Pregătirea serului de cercetat include controlul aspectului serului (se clarifică prin centrifugare),
inactivarea timp de 30 minute la 56ºC şi o nouă centrifugare (în cazul apariţiei unor particule în
suspensie). Nu vor fi testate serurile infectate sau hemolizate. În cazul în care trec mai mult de 4
ore din momentul inactivării, serul va fi inactivat din nou timp de 10 minute la 56ºC.
Temperatura din camera de lucru trebuie să fie între 23-29ºC. Testul se efectuează pe ser
nediluat (pentru monitorizarea evoluţiei sub tratament se pot face diluţii binare). Se pot testa
mai multe seruri concomitent şi este necesară o notare clară a godeurilor, pentru fiecare godeu
în parte. Fiecare test va include martori (seruri cu reactivitate cunoscută, martor pentru Ag). În
fiecare godeu punem câte 0,05 ml ser (în godeul pentru martor Ag punem soluţie salină
fiziologică). După agitarea flaconului cu suspensia antigenică, utilizând o seringă cu ac calibrat
depunem câte o picătură (1/60 ml) în fiecare godeu. Acoperim placa şi o aşezăm pe un agitator
care poate fi reglat la 180 turaţii pe minut, pe o durată de 4 minute.
Citim rezultatul, prin transiluminare pe fond negru, cu ajutorul unei lupe, începând cu
martorii (negativ, slab pozitiv, pozitiv, martorul pentru Ag) şi continuând cu serurile de testat.
428
Rezultatul este negativ dacă lichidul nu prezintă flocoane şi este asemănător martorului negativ
şi martorului Ag. Rezultatul este slab pozitiv atunci când vizualizăm flocoane de dimensiuni mici
într-un lichid uşor turbid în timp ce rezultatul este intens pozitiv atunci când vizualizăm flocoane
de dimensiuni mari iar lichidul este clar. Repetăm rezultatele slab pozitive sau dificil de
interpretat. În cazul în care suspicionăm existenţa fenomenului de prozonă (inhibiţia totală sau
parţială a floculării prin exces de Ac), vom repeta testarea se va repeta pe diluţii de ser.
Testul VDRL semi-cantitativ, efectuat pe 2 probe consecutive de ser este util în următoarele
situaţii: scăderea de 4 ori a titrului în sifilisul recent, tratat, semnifică de regulă eficaci tatea
tratamentului; creşterea de 4 ori a titrului sugerează o infecţie activă în evoluţie, o reinfecţie
sau ineficacitatea tratamentului.
429
Testul (Rapid Plasma Reagin) este executat pe carduri din material plastic pe care apar mai
multe cercuri de 18 mm. Antigenul este preparat dintr-o suspensie antigenică tip VDRL
modificată (pentru a elimina etapa de inactivare prin căldură). Reactivul conţine şi particule de
cărbune. Antigenul RPR este amestecat cu serul de cercetat în cercul de pe card. Daca Ac anti-T.
pallidum sunt prezenţi, se combină cu particulele lipidice din Ag şi produc aglutinarea lor.
Particulele de cărbune coaglutinează cu Ac şi duc la apariţia unor granule negre pe fondul alb al
cardului. În absenţa Ac rezultă un aspect gri uniform. Testul se poate realiza calitativ şi cantitativ
(diluţii de ser).
Au fost realizate şi tehnici serologice care utilizează antigene treponemice extrase din T.reiter
(specifice de grup) de tipul RFC şi CIE.
430
·
De mare utilitate practică sunt reacţiile serologice care utilizează antigene treponemice extrase
din tulpina Nichols de T.pallidum, cu o mare specificitate.
Pentru o lungă perioadă de timp, tehnica standard a fost testul imobilizării treponemelor ( ).
Tehnica a fost pusă la punct în anul 1949. Serul de cercetat era diluat şi amestecat cu
complement şi treponeme vii, mobile, obţinute din şancrul testicular de la iepure. În prezenţa
Ac specifici, treponemele erau imobilizate, în timp ce în lipsa acesto ra, mobilitatea era păstrată
(examinarea se făcea cu microscopul pe fond întunecat).
431
·
Tehnica ELISA
Tehnica ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM anti- T.pallidum; este utilă pentru documentarea
infecţie intra-uterine.
Tehnica Western blot poate detecta atât Ac de tip IgM cât şi de tip IgG.
Aşa cum am mai menţionat, interpretarea rezultatelor obţinute se face ţinând cont de contextul
, şi de . Luând în considerare numai rezultatele de laborator pentru
testele menţionate în acest capitol, ar putea rezulta mai multe variante. Spre exemplu, dacă
testul VDRL este negativ şi testul TPHA este tot negativ, de regulă infecţia este exclusă. Dacă ne
gândim că pacientul este la debutul bolii iar anticorpii sunt încă nedectabili, repetăm testele
după 3 săptămâni. În cazul în care testul VDRL este pozitiv iar testul TPHA este negativ, este
posibil să ne aflăm în situaţia de mai sus, la debutul bolii şi repetăm testele după 3 săptămâni.
Dacă rezultatele rămân nemodificate, este vorba de o reacţie fals-pozitivă. Pot fi luate în
432
astfel încât aceştia să fie trataţi, 3. igienă sexuală, 4. profilaxia la momentul expunerii. Atât
profilaxia mecanică (prezervative), cât şi chimioprofilaxia (penicilină după expunere) au limite.
În 1997, în România, s-au raportat 7.704 cazuri de sifilis, ceea ce corespunde la o incidenţă de
34,20/0000. Numărul de cazuri raportate, la adulţi a crescut, anual, până în 2002 (12.702 cazuri
raportate, incidenţă 58,280/0000). Începând cu 2003, numărul de cazuri de sifilis la adulţi a scăzut,
raportându-se 9.698 cazuri în 2003, 8.838 cazuri în 2004, 6.862 cazuri în 2005 şi 5.661 cazuri în
2006, un număr istoric de mic, corespunzând la o incidenţă de 26,2 0/0000. În aceeaşi perioadă de
timp, numărul de cazuri de sifilis congenital a crescut anual, atingând valoarea maximă de 423
cazuri raportate în 2002, ulterior raportându-se 202 cazuri în 2003, 136 cazuri în 2004, 38 cazuri
în 2005 şi 16 cazuri în 2006. Comparând tendinţa evolutivă a sifilisului în România şi SUA, ne
putem întreba dacă datele raportate reprezintă situaţia reală, la fel cum ne puneam această
întrebare şi în cazul gonoreei.
Incidenţa sifilisului primar şi secundar în SUA, în anul 1997, a fost de 3,19 0/0000 cu 8.550 cazuri;
în anul 1998 au fost declarate 6.993 cazuri, în anul 1999, 6.657 cazuri iar în anul 2000 au fost
raportate 5.979 cazuri. Tendinţa de scădere a luat sfârşit în anul 2000; începând cu anul 2001,
numărul de cazuri de sifilis primar şi secundar, împreună, a crescut an de an, valoarea maximă
înregistrându-se în anul 2005 (8.724 cazuri).
Luând în considerare numărul total de cazuri de sifilis raportate în SUA în anul 1999 (35.628),
cifra corespundea la o incidenţă de 13,07 0/0000, în continuă scădere, în ultimii 12 ani. Cel mai mic
număr de cazuri (indiferent de formă) a fost înregistrat în anul 2000 (31.575), însă începând cu
anul 2001, numărul de cazuri a crescut, depăşind în fiecare an cifra de 32.000, cu un maxim în
2003 (34.270 cazuri) şi peste 33.000 cazuri raportate în 2004 şi 2005.
Toate aceste boli sunt date de treponeme care nu pot fi deosebite de T.pallidum. În toate
cazurile apar reacţii pozitive la testele treponemice şi nontreponemice pentru sifilis, iar unele
reacţii încrucişate pot fi demonstrate la animalele de laborator şi probabil la oameni. Nici una
dintre aceste boli nu se transmite sexual; ele se transmit de obicei prin contact direct. Nici unul
dintre germenii implicaţi nu a fost cultivat pe medii artificiale.
Bejelul se întâlneşte în Africa, Orientul Mijlociu, Asia de Sud -Est şi în alte zone. În mod
particular apare la copii şi produce leziuni cutanate foarte contagioase; complicaţiile viscerale
tardive sunt rare. Penicilina este antibioticul de elecţie.
Pianul este o infecţie endemică, ce apare în mod particular la copii, în ţările cu climat cald şi
umed. Agentul cauzal este T.pertenue. Leziunea primară, o papulă ulcerativă, apare de obicei
pe braţe sau picioare. Transmiterea se face prin contact direct la copii sub 15 ani. Nu au fost
433
raportate infecţii congenitale, transplacentare. În mod obişnuit se constată leziuni cutanate cu
cicatrizare şi distrucţii osoase, dar complicaţiile nervoase sau viscerale sunt excepţionale. S-a
discutat dacă pianul reprezintă o variantă de sifilis cu transmitere nesexuală în ţările cu climat
cald. Se pare că există reactivitate imună încrucişată între pian şi sifilis. Procedurile de diagnostic
şi tratament sunt similare celor pentru sifilis. Răspunsul la tratamentul cu penicilină este
prompt.
Dorim să prezentăm cazul unui coleg, viitor medic, care în timpul primului an de studenţie a
constatat dureri la nivelul articulaţiilor şi limfadenopatie inghinală stângă, precedate de o colică
renală însoţită de transpiraţii abundente.
Tânărul s-a prezentat de urgenţă la spitalul cel mai apropiat de locuinţa sa, unde medicul de
gardă i-a făcut trimitere către o unitate cu profil de boli infecţioase din capitală. Din amintirile
tânărului coleg, medicul de gardă a „fost , ca şi cum ar fi avut
deja în faţă rezultatul analizelor).
La clinica de boli infecţioase s-a recoltat exsudat faringian şi pacientul a fost trimis acasă. În ziua
următoare, s-au recoltat urină pentru urocultură şi sânge pentru testul ELISA (detectare Ac anti-
HIV), VDRL, detectare Ag HBs şi alte analize, de rutină (număr leucocite, formulă leucocitară,
VSH, reactanţi de fază acută etc). Toate rezultatele au fost „negative”, iar valorile pentru testele
bioumorale s-au situat în limitele normale. Totuşi, s-a indicat tratament antiinflamator
(indometacin, supozitoare) şi antibioterapie în scop profilactic (ciprofloxacină), timp de 7 zile.
Starea pacientului nu s-a ameliorat, apărând în plus adenopatie inghinală de parte opusă
(dreaptă). Revenind la spital după încheierea tratamentului zile, medicul curant i-a spus („pe un
ton destul de ridicat”) că în acest caz nu mai are ce să facă şi i-a recomandat un consult de
specialitate, în zona psihiatriei.
În perioada următoare, tânărul viitor medic, sigur de faptul că simptomele sale erau reale şi
puteau evolua, s-a prezentat la medicul de familie, care i-a recomandat o vizită la urolog, fără a-i
face o recomandare concretă, în acest sens.
Fiind student la medicină şi având în apropierea facultăţii un spital, s-a hotărât să se prezinte la
cabinetul de urologie al unităţii medicale, unde i s-a explicat că nu există legătură între
adenopatie şi sistemul urinar dar, la cabinetul privat din incinta spitalului a plătit consultaţia
respectivă (medicamentele prescrise anterior nu au fost „compensate”, toate cheltuielile
revenind tânărului coleg). A fost consultat şi de un alt medic din acelaşi spital, care a cer ut
efectuarea câtorva analize suplimentare (radiografie cardio-toraco-pulmonară, ecografie
abdominală). Acestea nu au relevat modificări patologice. În acest context s-a recomandat
434
efectuarea unor noi analize, fiind trimis din nou la spitalul cu profil de boli infecţioase (tânărul
coleg consideră că aceste analize ar fi putut să fie făcute, local).
În clinica de boli infecţioase, este consultat de către un alt medic, care recomandă internare
pentru investigaţii şi stabilirea diagnosticului şi atitudinii de urmat. Tânărul refuză internarea,
datorită faptului că urma să înceapă sesiunea de examene. În aceste condiţii semnează că
refuză internarea şi analizele nu se mai efectuează.
Astfel, primul an de facultate se încheie, suferinţa se menţine (exceptând durer ile de tip
colicativ), fără diagnostic.
Având în memorie periplul din anul precedent, tânărul coleg nu mai solicită sprijin medical, dar,
înainte de începerea noului an, după încheierea celor trei săptămâni de „practică de vară”
efectuate sub atenta îndrumare a unuia dintre profesorii de la facultate, la „presiunea” familiei
şi a unor colegi apropiaţi, tânărul solicită sfatul medical de la respectivul profesor.
Datorită faptului că nu existau semne sau simptome care să orienteze pentru recoltarea unui
anumit produs şi nu existau evidenţe că metodele de laborator ar putea rezolva problema în
mod individual, profesorul de la facultate ia legătura cu un coleg şi prieten, în vederea realizării
unui consult de specialitate, competent şi făcut cu dăruirea care trebuie să fie caracteristică
fiecărui medic.
435
54. 1. Definiţie. Încadrare
Sunt treponematacee cu spire largi şi inegale care produc spre exemplu febra recurentă, boală
transmisă de artropodele hematofage. Borreliozele transmise prin căpuşe poartă de obicei
numele regiunii geografice în care se găsesc preponderent.
Despre febra recurentă s-a discutat în special după un episod din Edimburgh (1843); după 30
ani, agentul etiologic a fost numit Spirochetarecurrentis. Numele definitiv a fost stabilit în 1907,
în amintirea şi onoarea lui A. Borrel ( Borreliarecurrentis).
Borreliile sunt germeni strict paraziţi, care nu se întâlnesc niciodată în stare liberă în natură,
existenţa lor nefiind posibilă decât în organismele parazitate (rozătoare, artropode, om).
Microorganismul poate fi cultivat pe medii fluide ce conţin sânge, ser sau ţesuturi, dar îşi pierde
rapid patogenitatea pentru animale când este transferat în mod repetat in vitro. Multiplicarea
are loc rapid în embrionul de găină când sângele de la pacient este inoculat în membrana
chorioalantoidiană.
Se cunosc destul de puţine date cu privire la necesităţile metabolice sau activitatea biochimică a
boreliilor. Sursa majoră de energie este reprezentată de carbohidraţi (în special, glucoza).
B.recurrentis supravieţuieşte mai multe luni în sângele contaminat sau în culturi la 4°C. În
anumite căpuşe, bacteriile sunt transferate din generaţie în generaţie.
Tulpinile de B.recurrentis izolate în diverse părţi ale lumii, de la diferite gazde şi de la vectori
diferiţi (căpuşe sau purici) au primit denumiri variate sau au fost catalogate drept subtipuri ale
speciei principale.
436
În urma infecţiei apare un răspuns imun umoral, putând fi detectaţi anticorpi aglutinanţi şi
anticorpi fixatori de complement. De remarcat faptul că, inclusiv în decursul unei singure infecţii
apar modificări antigenice, care explică recăderile. Ultima vindecare (după 3-10 recăderi) este
asociată cu prezenţa anticorpilor împotriva mai multor variante antigenice. Imunitatea
consecutivă infecţiei este de obicei de scurtă durată.
După o perioadă de incubaţie (3-10 zile), debutul este brusc, cu frisoane şi creşterea rapidă a
temperaturii. În acest timp, spirochetele se află în număr mare în sânge. Febra persistă 3-5 zile,
apoi scade. Perioada afebrilă durează 4-10 zile şi este urmată de un al doilea atac de frisoane,
febră, cefalee intensă şi stare de rău. Pot apare succesiv până la 10 asemenea recăderi, a căror
severitate scade în general progresiv. Puseele febrile se asociază cu bacteriemie.
Febra recurentă este endemică în multe zone ale globului. Principalul rezervor este reprezentat
de rozătoare, sursă de infecţie pentru căpuşe. Distribuţia focarelor endemice şi incidenţa
sezonieră a bolii sunt în mare parte determinate de modul de răspândire al căpuşelor. La aceste
insecte, Borrelia poate fi transmisă transovarian din generaţie în generaţie. Spirochetele sunt
prezente în toate ţesuturile căpuşelor, care pot transmite bacteriile prin muşcătură sau atunci
când sunt zdrobite. În cazul păduchilor, infecţia nu se transmite generaţiilor următoare, iar
boala la om se datorează contactului păduchilor zdrobiţi cu leziunile determinate de înţepătură.
La populaţiile infectate cu păduchi pot apărea epidemii severe, transmiterea fiind favorizată de
aglomeraţii, malnutriţie şi de climatul rece.
Marea variabilitate a remisiunilor spontane în cazul febrei recurente, face foarte dificilă
evaluarea eficacităţii chimioterapiei. Tetraciclina, eritromicina (şi alte macrolide), penicilina şi
cefalosporinele de generaţia a 3-a sunt considerate utile.
putea recolta şi vectori (păduchi, căpuşe) sau LCR, lichid sinovial etc, în funcţie de manifestarea
clinică. Sângele recoltat în perioadele febrile. În cazul în care produsele nu se pot
examina imediat, recomandăm transportul acestora la temperatura frigiderului (+4ºC) sau
inocularea unor animale receptive (ex. şoareci albi sau şobolani tineri) şi transportul acestora
către laborator.
437
spire largi şi inegale, foarte mobile (cu mişcări de rotaţie şi răsucire), pe fondul negru al
preparatului. Se pot realiza frotiuri subţiri sau examenul picăturii groase, colorate Giemsa
prelungit, May-Grünwald-Giemsa sau Wright precum şi cu acridin-orange sau cu Ac monoclonali
marcaţi fluorescent şi cu examinare la microscopul cu fluorescenţă. Pe frotiul colorat Giemsa
prelungit spirochetele apar albastre, lungi, cu capetele efilate, situate printre hematii. Examenul
microscopic realizat de către un medic experimentat permite identificarea borreliilor în circa
70% dintre cazuri, în condiţiile respectării normelor diagnosticului bacteriologic.
În ultima perioadă s-a introdus tehnica PCR pentru identificarea ADN-ului borrelian, pornind de
la produsul patologic.
Se pot inocula animale de experienţă sensibile (ex. şoareci sau şobolani), cu inoculare
intraperitoneală. Animalele vor fi monitorizate zilnic clinic şi prin examinarea microscopică a
sângelui (p.p. se poate recolta de la nivelul venei cozii). Se mai pot inocula vectori (păduchi sau
căpuşe) sau oul de găină embrionat (la nivel intra alantoidian sau în membrana
chorioalantoidiană).
Se pot utiliza şi medii de cultură artificiale speciale (cu agenţi reducători, N -acetilglucozamină,
acizi graşi nesaturaţi cu catenă lungă, ser de iepure), în condiţii de microaerofilie, cu incubare la
32-37ºC. Se recomandă şi utilizarea mediilor selective care includ o combinaţie de agenţi
antimicrobieni precum rifampicină, amfotericină B şi fosfomicină. Datorită faptului că mediile de
cultură sunt lichide, nu se obţin colonii izolate. Creşterea microbiană trebuie verificată prin
realizare de preparate proaspete examinate la microscopul cu fond întunecat la fiecare 3 zile,
pentru o durată de 2-6 săptămâni.
Caracterelor morfotinctoriale
sunt spirochete luminoase de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 mm / 8-30 mm), cu spire
largi şi inegale, foarte mobile (cu mişcări de rotaţie şi răsucire), pe fondul negru al
preparatului;
438
·
Caracterelor de cultură
dacă are loc multiplicarea borreliilor pe mediul de cultură acesta rămâne limpede, fără
sediment, dar îşi modifică culoarea (ex. virează de la roşu-portocaliu spre roz-gălbui)
Caracterelor biochimice
Borreliile sunt microaerofile, fermentează glucoza producând bioxid de carbon şi acid lactic (dar
aceste teste nu sunt utilizate de regulă în diagnostic);
54. 3. 2. 2. Diagnosticul serologic nu a fost considerat ca fiind foarte util, datorită variaţiilor
antigenice (care au loc inclusiv pe parcursul bolii) şi complexităţii fenomenului de recurenţă.
În ser pot fi decelaţi anticorpi aglutinanţi, imobilizanţi şi fixatori de complement. Sunt foarte
puţine laboratoare
febră recurentă care practică
epidemică aceste
(purtători dereacţii,
păduchi)depot
obicei în scop
apărea de cercetare.
aglutinine faţă deLaProteus
pacienţii
OXKcuşi o
reacţie VDRL fals-pozitivă.
În momentul de faţă se recomandă utilizarea unor tehnici de tip ELISA sau reacţia de
imunofluorescenţă. Dacă aceste reacţii sunt negative, rezultatul este considerat negativ. Dacă
reacţiile sunt pozitive sau „indeterminate”, confirmarea se face prin Western Blot.
439
54. 4. Borrelia burgdorferi (Boala Lyme)
Boala a fost denumită astfel după numele oraşului unde au fost identificate iniţial câteva cazuri.
Este determinată de spirocheta B.burdogferi care se transmite la om prin muşcătura unei mici
căpuşe din genul Ixodes. Rezervorul animal principal este reprezentat de şoareci şi cerbi, dar pot
fi infectate şi alte animale precum şi păsări. Cele mai frecvente expuneri apar vara, atunci când
căpuşele sunt foarte frecvente.
Răspunsul imun este foarte complex şi neelucidat în totalitate, însă reacţiile autoimune se pare
că joacă un rol important. Structura genetică a gazdei, pare a influenţa reactivitatea particulară
ce apare în cursul bolii Lyme.
Din punct de vedere clinic boala are manifestări precoce şi manifestări tardive. Faza precoce
este frecvent marcată de o leziune epitelială unică numită erithemacronicummigrans, la
început este o leziune plată eritematoasă în jurul muşcăturii căpuşei, care se extinde lent şi se
clarifică în zona centrală. În asociere cu leziunea tegumentară apare frecvent stare patologică
asemănătoare gripei, cu febră, frisoane, mialgii şi cefalee.
Cele mai frecvente manifestări clinice tardive (apărute după săptămâni sau luni de la momentul
infectant) sunt reprezentate de: 1) artralgii şi artrite ce se pot manifesta intermitent ani de zile;
2) manifestări neurologice: meningită, paralizie de nerv facial, radiculopatie dureroasă; 3)
afectare cardiacă cu tulburări de conducere şi miopericardită. Spirochetele au fost izolate din
toate aceste zone ale corpului, fiind probabil ca aceste manifestări să fie datorate unui
mecanism de hipersensibilitate cu depozitare de complexe antigen-anticorp.
În primele 2 săptămâni care urmează contaminării, serologia este negativă. În primul stadiu de
boală, serologia devine slab pozitivă, astfel încât un rezultat negativ, nu exclude diagnosticul.
440
Tratamentul cu tetraciclină ameliorează simptomele precoce şi ajută la vindecarea leziunilor
tegumentare. Tetraciclinele pot fi mai eficace decât penicilinele în prevenirea manifestărilor
tardive. Artrita răspunde frecvent la doze mari de penicilină. În cazurile refractare, ceftriaxona s -
a dovedit eficace.
S-a recomandat consult neurologic şi examen prin rezonanţă magnetică nucleară (leziuni
constatate: câteva zone de infarctizare, vechi, la nivel temporal).
Soţia şi-a amintit că pacientul a fost muşcat de către o insectă de culoare neagră în timpul celei
mai recente călătorii, faţă de care nu au avut nici o reacţie.
Avându-se în vedere toate aspectele menţionate, s-a indicat efectuarea unei puncţii lombare şi
recoltare de sânge pentru hemoculturi şi pentru examene serologice. Au fost evidenţiate
următoarele: LCR uşor hipertensiv, conţinut crescut de proteine (97 mg / dl), glicorahie în limite
normale, 52 leucocite / mm3 (78% monocite), foarte rare hematii.
ELISA pentru Ac anti-Borrelia a arătat prezenţa Ac specifici de tip IgM, nu şi de tip IgG, faţă de
Borreliaburgdorferi . Testul Western-blot a confirmat aceste rezultate.
441
Starea pacientului s-a îmbunătăţit considerabil în următoarele zile şi s-a decis externarea
acestuia, cu tratament antibiotic până la o cură completă de 4 săptămâni, sub strictă
supraveghere medicală, propunere acceptată de familie şi pusă în practică.
Cu toate că au existat numai semne şi simptome în sfera neurologică (situaţie rar întâlnită în
boala Lyme) şi nu au existat nici alte leziuni foarte sugestive pentru această patologie, datele
obţinute prin anamneză (ex. călătorie într-o zonă endemică pentru boala Lyme) au orientat
cercetările diagnostice. Lipsa de „tipicitate” a tabloului clinic, dar şi punerea în final a unui
diagnostic care părea improbabil iniţial, arată încă o dată afirmaţia „excepţia întăreşte regula”.
Instituirea tratamentului („empiric”), având la bază flerul medicului curant, s-a dovedit a fi a
atitudine foarte potrivită.
Agentul etiologic al leptospirozei face parte din familia Spirochaetaceae, genul Leptospira. Se
cunosc mai bine speciile L.interrogans şi L.biflexa, denumirea derivând din forma particulară a
extremităţilor celulei bacteriene. Genul include peste 200 de serotipuri (numite serovaruri, de
alţi autori). Din specia L.interrogans fac parte 170 serotipuri patogene (complexul interrogans)
care pot determina boala la animale şi om, varietatea acestor serotipuri determinând şi
numeroasele forme de manifestare a leptospirozei. Specia L.biflexa reuneşte peste 50 de
serotipuri saprofite.
Prima a fost descoperită specia saprofită (numită iniţial Spirochetabiflexa, 1914), ulterior una
dintre speciile patogene (Spirochetaicterohaemorrhagiae , 1915, în Japonia).
442
Pe frotiul fixat, impregnat şi colorat prin tehnica Fontana-Tribondeau (impregnare argentică),
examinat la microscopul obişnuit, leptospirele apar ca filamente regulat spiralate cu
extremităţile fin îngroşate sub formă de „buton”, de culoare maro.
Leptospirele utilizează ca sursă de carbon acizii graşi şi alcoolii graşi cu lanţuri lungi. Mediile de
cultură, atât cele clasice (mediul Korthof) cât şi mediile mai noi care conţin acizi graşi, vitamine
din grupul B şi fracţiunea 5 a albuminei bovine, necesită îmbogăţirea cu ser normal de iepure.
Utilizează amoniacul ca sursă de azot.
Deoarece sunt uşor microaerofile, leptospirele necesită medii de cultură lichide şi recipiente
înguste pentru cultivare. În condiţiile amintite leptospirele ating un nivel optim de dezvoltare în
7-10 zile.
Din cauza rezistenţei scăzute a leptospirelor patogene în mediul exterior, îmbolnăvirea omului
prin intermediul apelor de suprafaţă (mai ales a celor stătătoare) sau a solului contaminat este
explicată printr-o continuă alimentare cu leptospire dintr-o sursă stabilă (de exemplu numărul
mare de animale purtătoare de leptospire prin lipsa deratizării).
Leptospirele patogene sunt distruse de alcoolul alb, acizi, alcali, cloramină. Dintre antibiotice,
beta-lactaminele injectabile (mai ales penicilina) au efect bactericid.
Antigenele cunoscute sunt antigenul somatic specific de gen şi antigenele de suprafaţă specifice
de grup şi tip.
443
Anticorpii apăruţi în cursul bolii conferă protecţie de grup şi tip pentru o perioadă variabilă (de
ordinul anilor).
Antigenele de suprafaţă sunt imunogene in vivo. Anticorpii rezultaţi din trecerea prin boală pot
conferi protecţie pentru o perioadă variabilă, de ordinul anilor. Imunitatea postinfecţie este
specifică serotipului tulpinii infectante, respectiv tulpinii vaccinale. În cursul infecţiei apar
anticorpi aglutinanţi, fixatori de complement şi litici, care sunt evidenţiaţi în ser începând cu
zilele 4-6 de la debutul bolii, ating nivelul maxim între săptămânile 3-6 de boală şi scad apoi
progresiv.
Sunt proprii speciei L.interrogans, care este patogenă prin multiplicare şi invazivitate. Virulenţa
este explicată până în prezent prin mobilitate, gradul de încovoiere a extremităţilor celulei
bacteriene şi prin prezenţa factorului de virulenţă Vi existent la suprafaţa unor tulpini. Cu câ t
extremităţile celulei bacteriene sunt mai curbate, cu atât puterea de penetrare a ţesuturilor de
către leptospire este mai mare.
După o perioadă de incubaţie de 1-2 săptămâni, debutul bolii poate fi marcat de febră.
Microorganismul circulă pe calea torentului sanguin şi se cantonează în organele
parenchimatoase (ficat şi rinichi), determinând hemoragii, necroză tisulară şi disfuncţii de organ
(pot apărea icter, hemoragii, manifestări datorită retenţiei azotate etc). Boala are destul de
frecvent un aspect bifazic: după o ameliorare iniţială urmează faza a doua a bolii, marcată de
creşterea titrului de anticorpi IgM. Leptospiroza se poate manifesta ca meningită „aseptică” (cu
lichid clar, asemănător macroscopic cu LCR recoltat de la pacienţii cu meningită virală).
Afectarea renală la multe specii de animale este cronică, având drept efect eliminarea unui
număr de leptospire prin urină; acesta reprezintă probabil principalul mod de contaminare la
om. Urina umană poate conţine spirochete în a doua şi a treia săptămână de boală.
Deşi din leptospire nu a fost izolat un factor toxic bine diferenţiat toxicitatea care conduce la
apariţia principalelor manifestări este determinată de eliberarea unei endotoxine. Intervenţia
endotoxinei explică modificările tisulare macro şi microscopice de tip toxic degenerativ;
eficienţa mai scăzută a terapiei cu antibiotice după 7-12 zile de la debutul bolii; producerea
şocului endotoxic (datorită lizei masive a leptospirelor), febra cu valori de peste 38,5ºC cu
aspect bi şi uneori trifazic (relativ caracteristică pentru leptospiroză) sau instalarea
hipersensibilităţii celulare de tip IV în leptospiroza acută.
444
55. 4. Diagnosticul de laborator n infecţiile produse de Leptospira
55. 4. 1. Diagnosticul bacteriologic este relativ dificil, laborios, respectând etapele cunoscute şi
este cel mai frecvent realizat la nivelul centrului de referinţă; este laborios şi costisito r.
Unii autori recomandă realizarea de frotiuri colorate Giemsa prelungit sau prin impregnare
argentică (Fontana-Tribondeau), mai ales pentru preparatele histo-patologice; leptospirele apar
ca filamente regulat spiralate cu extremităţile fin îngroşate sub formă de „buton”, de culoare
maro. A fost recomandată şi colorarea imunofluorescentă (IF directă) în cazul suspicionării
diagnosticului de leptospiroză. În ultima perioadă, pornind de la p.p. (ser, urină, LCR etc) au fost
puse la punct tehnici PCR.
Există şi posibilitatea inoculării p.p. la cobai sau alt animal de laborator, intraperitoneal. Starea
clinică trebuie monitorizată zilnic. Identificarea infecţiei se poate face prin diagnostic serologic,
prin izolarea leptospirelor (hemocultură) sau anatomopatologic şi bacteriologic după decesul
sau sacrificarea animalului respectiv.
În cazul utilizării mediilor de cultură este recomandat ca toate p.p. să fie însămânţate atât pe
medii de cultură selective cât şi neselective. Mediul de cultură cel mai cunoscut este mediul
Korthof (cu acizi şi alcooli graşi, care conţine şi ser de iepure), pregătind în acest scop mai multe
tuburi în care însămânţăm cantităţi progresive de p.p. (ex. pornim de la o picătură, continuăm
cu 2 picături etc). Mediile selective includ neomicină şi / sau 5-fluorouracil.
445
Realizăm incubarea la 28ºC. Multiplicarea bacteriană nu determină o tulburare a mediului
(apariţia turbidităţii reprezintă cel mai frecvent o contaminare cu o altă bacterie). După 3 zile,
respectând cu stricteţe normele de asepsie, realizăm preparate native pe care le examinăm la
microscopul cu fondul întunecat. În cazul în care rezultatul este negativ, repetăm această
examinare la interval de circa 3 zile pentru o durată totală de minim 4 săptămâni, sau până la
obţinerea unui rezultat pozitiv. În general creşterea bacteriană are loc în 3-14 zile de la
momentul însămânţării.
Costul şi durata diagnosticului cresc şi datorită faptului că, pentru identificare sunt necesare cel
puţin 1-2 repicări pe un alt mediu lichid, după detectarea microscopică a unor microorganisme
care ar putea fi implicate patogenic. O alternativă (şi mai costisitoare, utilizată mai ales dacă
presupunem contaminarea culturii cu o altă bacterie) este reprezentată de inocularea
intraperitoneală a culturii respective la cobai. După 30-60 minute, având în vedere faptul că
leptospirele invadează sistemul circulator mai rapid în comparaţie cu alte bacterii, după
anestezierea animalului se recoltează sânge (prin puncţie cardiacă) şi realizăm o hemocultură.
Caractere morfotinctoriale:
se pot realiza frotiuri colorate Giemsa prelungit sau prin impregnare argentică
(Fontana-Tribondeau) precum şi prin IF directă;
446
·
Caractere antigenice:
tehnici ale biologiei moleculare (amplificarea prin PCR a fragmentelor obţinute prin restricţie
endonucleazică etc).
5. Antibiograma nu se realizează (nu a fost pusă la punct o tehnică în acest scop). Este cunoscut
faptul că leptospirele sunt sensibile la penicilină, amoxicilină, tetraciclină, doxiciclină etc dar
tratamentul se stabileşte în funcţie de forma şi gravitatea bolii.
Anticorpii specifici se pot evidenţia în serul pacienţilor începând cu a 4 -6-a zi de la debutul bolii,
atingând un nivel maxim între săptămânile 3-6 de boală, după care scad progresiv.
Trebuie să menţionăm că pentru unii pacienţi seroconversia are loc mai tardiv. O altă problemă
este reprezentată de faptul că se utilizează leptospire vii în calitate de Ag cunoscut, motiv
pentru care această reacţie nu se poate practica decât în centrul de referinţă.
La nivelul altor unităţi sanitare se pot practica reacţii de tip ELISA, reacţia de hemaglutinare
indirectă sau reacţia de aglutinare pe lamă utilizând Ag preparate din tulpini saprofite
(sensibilitatea şi specificitatea acestor reacţii este mai scăzută). Tehnica ELISA de identificare a
anticorpilor de tip IgM pune diagnosticul infecţiei acute dar nu poate permite dete rminarea
serogrupului implicat aşa cum se reuşeşte în cazul tehnicii de referinţă.
447
55. 5. Tratament
55. 6. Epidemiologie
Leptospirozele sunt, în esenţă, infecţii ale animalelor, infecţia umană apărând accidental, de ex.
prin contactul cu apa sau cu alte materiale contaminate cu excremente ale animalelor.
Principalele surse de infecţie sunt reprezentate de şobolani, şoareci, rozătoare sălbatice, porci,
câini sau vaci. Acestea excretă leptospire prin urină şi fecale atât în timpul bolii active, cât şi în
timpul evoluţiei asimptomatice. Leptospirele rămân viabile mai multe săptămâni în apele
stătătoare, omul putându-se infecta prin îmbăiere, înot, prin consumul acestor ape sau prin
ingestia de mâncăruri contaminate. Persoanele cu cea mai mare probabilitate de a intra în
contact cu apa contaminată de şobolani (mineri, lucrătorii din canalizare, fermieri, pescari) au
cel mai mare risc de infecţie. Copiii se pot infecta cu leptospire de la câini, mult mai frecvent
decât adulţii.
În SUA, în 1974, au fost raportate 8.351 cazuri de leptospiroză. În perioada 1975-1994 au fost
raportate între 31 şi 110 (o singură dată, în rest numărul de cazuri a fost ≤ 100) cazuri pe an. Din
1995 leptospiroza nu mai face parte din lista de boli cu declarare obligatorie.
55. 7. Profilaxie
Evoluţia ştiinţei în domeniul medical produce noi informaţii; viitorii medici şi medicii ar trebui să
le cunoască şi să le utilizeze, în interesul pacienţilor. Pentru a ajunge un bun medic este nevoie
de rezistenţă (fizică şi psihică), de sute şi mii de ore de învăţat, de studiu individual, practică şi
de „absorbit” orice lucru util de la colegii mai mari, cu experienţă.
Este nevoie de studiu, pentru că este nevoie de performanţă. Este nevoie să acumulăm
cunoştinţe, care să consolideze o „construcţie” care apare şi se întăreşte în ani şi ani de muncă,
iar la început (de viaţă în clinică) trebuie să învăţăm în primul rând să punem cele mai potrivite
întrebări şi să înţelegem importanţa anamnezei. Pe această bază se poate adăuga examenul
448
clinic, iniţial pe segmente, dar care trebuie să ajungă să fie complet, până (cel târziu) în finalul
celui de-al treilea an de studiu.
Pentru a exemplifica cele de mai sus, din literatura internaţională am extras următorul caz.
În discuţia cu pacientul, s-a putut afla că s-a simţit bine până în urmă cu 4 zile, moment în care
„s-a simţit febril” (nu a pus termometrul), a avut dureri în articulaţiile membrelor inferioare,
dureri musculare şi dureri la nivel lombar.
După primele faze ale anamnezei, datele aflate nu permiteau orientarea spre cauza acestui
sindrom febril.
Continuând discuţia cu pacientul, au mai fost aflate următoarele informaţii: a avut gonoree la
vârsta de 20 de ani, a consumat droguri (atât pe cale orală cât şi pe cale intravenoasă), a
călătorit recent în California, fiind vânător şi lucrând în domeniu, intră frecvent în contact cu
animalele (inclusiv cele de la o fermă), a consumat frecvent carne de vânat (inclusiv „în sânge”)
şi nu a avut nici o problemă în a consuma lapte nefiert sau nepasteurizat.
Aceste elemente, foarte variate, nu au putut să direcţioneze foarte mult diagnosticul (pacientul
ar fi putut să aibă orice infecţie cu transmitere sexuală, orice infecţie transmisă prin injectare -
probabil în condiţii la „limita igienei”, sau ar fi putut să aibă orice infecţie comună animalelor şi
care se poate transmite omului, de ex. tularemie, bruceloză, leptospiroză sau ciumă). Şi, ca
întotdeauna, chiar dacă discuţia noastră se poartă la microbiologie, nu trebuie să uităm faptul
că semnele şi simptomele pot avea şi cauze ne-infecţioase.
Medicul curant, a apreciat că febra de peste 39ºC ar putea fi datorată unei infecţii sistemice
(chiar dacă nu a exclus o cauză ne-infecţioasă). Având în vedere că semnul febră, poate să
semnifice o cauză ameninţătoare de viaţă, este important ca investigarea etiologiei şi stabilirea
unui tratament adresat cauzei, sunt foarte importante. În cadrul diagnosticului diferenţial,
medicul curant a luat în considerare existenţa unei infecţii virale (virus hepatitic, virus Epstein -
Barr, virus citomegalic, arbovirus, HIV) sau a unei infecţii bacteriene ( Francisellatularensis ,
Brucellaspp., Salmonellaspp., Campylobacterspp., Leptospiraspp. sau Coxiellaburnetii).
449
Nici analizele de laborator (probe bioumorale) nu au fost foarte utile în diagnosticul diferenţial
(număr crescut de leucocite, procent de neutrofile în limite normale, VSH la limita unui rezultat
crescut, transaminaze cu valori mai mari decât normal). În ambulatoriu, un medic, a
recomandat şi efectuat recoltarea sângelui pentru hemoculturi, care au rămas negative până în
a 5-a zi (2 zile anterior internării şi încă 3 zile, după internare).
În spital s-a recoltat sânge pentru alte hemoculturi şi pentru diferite examene serologice
(pentru HBV, HCV, HIV, EBV, CMV, Francisellatularensis , Brucellaspp., Leptospiraspp., Borrelia
spp. şi Coxiellaburnetii), un adevărat „arsenal” serologic. Radiografiile cardio-toraco-pulmonară
şi craniană nu relevat nimic patologic în schimb tomografia computerizată a sugerat existenţa
unei adenopatii situată pelvian.
În a treia zi de spitalizare, la nivel tibial a apărut o erupţie eritematoasă, iar la nivelul faringian
posterior şi palatin, au apărut vezicule de mici dimensiuni.
Prin consultarea cu alţi colegi, medicul curant a aflat că au existat şi alte situaţii, în care pacienţi
cu leptospiroză au prezentat leziuni la nivel tibial; totuşi aspectul nu era caracteristic şi s -a decis
aşteptarea rezultatelor de laborator (serologice).
450