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MAESTRÍA TECNOLÓGICA
TESINA
MAESTRÍA TECNOLÓGICA
2004
La presente tesina realizada por la alumna FABIOLA MAYRETH ELVIR
GUEVARA, bajo la dirección del Consejo Particular indicado, ha sido aprobada por el
MAESTRÍA TECNOLÓGICA
CONSEJO PARTICULAR
2004
ii
AGRADECIMIENTOS
proyecto.
iii
CONTENIDO Página
INDICE DE CUADROS v
INDICE DE FIGURAS vi
RESUMEN vii
ABSTRACT viii
1. INTRODUCCION 1
2. MATERIALES Y METODOS 7
2.2.1. DAS-ELISA 10
3. RESULTADOS Y DISCUSION 16
3.2.1. DAS-ELISA 17
4. CONCLUSIONES 26
5. LITERATURA 28
6. ANEXO 1 32
7. ANEXO 2 47
iv
INDICE DE CUADROS
Página
Honduras, 2004
v
INDICE DE FIGURAS
Página
2004.
2004.
INFOAGRO/SAG
INFOAGRO/SAG
INFOAGRO/SAG.
vi
DETECCIÓN DE LOS VIRUS MOSAICO Y MANCHA ANULAR DEL PAPAYO
RESUMEN
El presente estudio tuvo como objetivo detectar la presencia del virus del mosaico
(Papayo Mosaic Potexvirus, PapMV) y mancha anular del papayo (Papayo Ringspot
15 fincas de papayo criollo, tipo Solo y de las variedades Dama Roja y Tainung las
PRSV el 100% de las muestras. Un segundo muestreo se realizó el 15 de mayo del 2004,
DAS-ELISA fueron negativos para PRSV, pero positivos para PapMV en 6 fincas.
las muestras al género Potexvirus a través del microscopio de luz (inclusiones virales) y
vii
DETECTION OF PAPAYA MOSAIC VIRUS AND PAPAYA RING SPOT VIRUS
ABSTRACT
The present study had as objective to detect the presence of mosaic virus (Papaya
Mosaic Potexvirus, PapMV) and Papaya Ringspot Potyvirus (PRSV) in papaya tree
plantations (Carica papaya) located in the valley of Comayagua, Honduras, using three
foliar tissue were collected on February 15th 2004 in 15 farms of local papaya varieties,
Solo type and to the varieties Dama roja and Tainung presenting chlorotic lesions
growth, This material was analyzed in the Universidad del Valle laboratory with DAS-
ELISA in which 100% of the samples resulted negative for PapMV and PRSV. A
second foliar tissue collection was made on May 15th of the 2004, of plants leaves with
the symptoms described before, and were processed in the laboratory of Agricultural
Virology of the Universidad Autónoma Chapingo, Mexico. The results with DAS-
ELISA technique were negative for PRSV, but positive for PapMV in material of 6
detected in all samples trough the light microscope (viral inclusions) and electronic
area was elaborated. Trialeurodes spp., Empoasca spp. and Tetranichus mexicanus
viii
1. INTRODUCCIÓN
considera un excelente fruto por su alto contenido de vitamina A y C, además de ser una
buena fuente de calcio (Sudzuki, 1996). DICTA (2004), sugiere que los requerimientos
Aún así, este cultivo se ha convertido en una importante fuente de ingresos para países
puede ser desarrollado por contar con las condiciones climáticas ideales para el cultivo.
campesinos, los cuales en su inmensa mayoría, mantienen pequeñas áreas del cultivo, el
hasta 14 Kg. de peso, de sabor semidulce y color rojo tenue. Por tradición y tamaño,
estos materiales son los más populares para la comercialización local y regional
1
(mercado Centroamericano). Con la promoción de cultivos de exportación no
color y tamaño. Estos materiales aun y cuando ofrecen muchas ventajas en comparación
producción (Rodas, 2004)1. Según Chiriboga (2000), entre los principales factores que
tipo Solo, el cual se ha posicionado con éxito en los mercados internacionales de frutas.
plantaciones, como clorosis (en algunos casos en la totalidad del área foliar), mosaico,
literatura que las plantas infectadas por virus exhiben inicialmente una clorosis en las
hojas más jóvenes, la cual es seguida por un aclaramiento de las nervaduras, rugosidad y
1
Rodas, R. 2004. Caracterización del cultivo de papaya en el valle de Comayagua. VIFINEX – OIRSA.
Comunicación Personal.
2
La complejidad de las enfermedades virales puede variar dependiendo de las relaciones
(Palmieri, 2003). Los síntomas varían en intensidad dependiendo del aislamiento del
a las usadas en el diagnóstico de bacterias y hongos (Hansen y Wick, 1993). Uno de los
una prueba de diagnóstico. Estas podrán ser los síntomas, rango de hospedantes, tipo de
(Cárdenas, 1999).
Un virus es un agente genético que posee un ácido nucleico que puede ser ADN o ARN,
rodeado de una envoltura de proteína. Los virus contienen toda la información necesaria
para su ciclo reproductor pero necesitan para conseguirlo a otras células vivas de las que
1.1. Virus del mosaico del papayo (Papayo Mosaic Potexvirus, PapMV)
3
electrónico se determinó que las bandas están compuestas por partículas de virus
foliares irregulares y moteado en las hojas (Breman, 1997). Sobre los pecíolos, parte
En cuanto al manejo de la enfermedad se debe tener cuidado con las prácticas culturales
para evitar al máximo daño mecánico así como una adecuada limpieza de los
1.2. Virus de la mancha anular del papayo (Papayo Ringspot Potyvirus, PRSV)
semilla y es transferido de plantas infectadas a plantas sanas por medio de áfidos (más
de 25 especies), los más frecuentes son: Myzus persicae, Aphis gossypii, A. neerii, A.
4
La dispersión del PRSV depende principalmente de factores bióticos y abióticos que
Francki et al. (1985), sugiere que todos los Potyvirus inducen estructuras complejas en
electrónico. Las inclusiones inducidas por los Potyvirus, son de naturaleza proteica y en
microscopio de luz.
Los síntomas provocados por el PRSV en plantas de papayo inician con un reticulado
al., 1993). En los pecíolos y parte superior del tallo aparecen manchas de color verde
oscuro con apariencia grasienta o acuosa, que liberan látex cuando son heridas. Los
5
Este virus es uno de los más destructivos en casi todas las regiones dedicadas al cultivo
de China (Gonsalves, 1994). Está presente en Estados Unidos, Sur América, países del
Caribe, India, China, Medio Oriente, África (Brunt, et al., 1996) y México (Téliz, et al.,
1987).
Carrillo (1990), sugiere la integración de las siguientes medidas para reducir el efecto de
plantas enfermas.
objetivo principal, la detección del virus del mosaico (Papayo Mosaic Potexvirus,
6
2. MATERIALES Y MÉTODOS
los 14°-08´ latitud Norte, 87-02-08´ longitud Oeste, entre los departamentos de
550 a 700 msnm, registrando una temperatura media anual de 41 °C, una humedad
(DICTA,2004).
Se realizaron dos muestreos dirigidos en los meses de febrero y mayo del 2004 en 15
plantaciones de papayo. Se colectó tejido foliar (hoja completa con pecíolo), de plantas
de papayo de los estratos superior y medio que mostraban síntomas tales como: clorosis,
7
A B
Elvir, G. F. Elvir, G. F
C D
Elvir, G. F Elvir, G. F
E F
Elvir, G. F Elvir, G. F
8
Se utilizaron bolsas plásticas ziplock de 2.2 Kg. para guardar las hojas obtenidas de cada
planta, cuales se manipularon con guantes desechables y se cortaron con navajas Gillette
individuales para cada muestra y evitar así la contaminación cruzada entre muestras.
En promedio se tomaron dos muestras por finca, de las plantas con los síntomas antes
la finca y del cultivo con los siguientes datos: propietario, dirección, georeferenciación,
apoyaron con fotografías digitales por cada una de las plantas muestreadas. Finalmente,
se marcaron las plantas muestreadas en el tallo con pintura en aerosol de color rojo, para
utilizadas fueron las siguientes: se utilizo la letra “F” para finca seguida de un número
progresivo mas la letra “M” seguida de un número progresivo que indica el número de
muestra. Cada finca fue georeferenciada utilizando GPS de la marca GARMIN Modelo
EtrexVista para la elaboración del mapa de distribución de los virus en las plantaciones
de papayo.
9
2.2. Análisis de muestras
2.2.1. DAS-ELISA
Las 33 muestras del primer muestreo colectadas de las 15 fincas, se conservaron en una
los mismos se creó un registro de información de cada una de las muestras, adicionando
Para identificar a los virus PapMV y PRSV se utilizó la técnica de DAS - ELISA
Con el fin de confirmar los resultados obtenidos en el primer muestreo y aplicar otras
mayo del 2004, se realizó el segundo muestreo, tomando en promedio dos muestras por
finca (38 muestras en total), considerando las 15 fincas del primer muestreo. Se tomaron
hojas jóvenes del estrato superior y adultas del estrato medio de la planta, con los
anterior. Únicamente en aquellas fincas en que la planta marcada había muerto, se tomó
tejido foliar de una nueva planta también con síntomas. Las muestras se conservaron
dentro de bolsas plásticas ziplock de 2.2 Kg., envueltas en papel toalla humedecido y se
colocaron dentro de una hielera con hielo y se trasladaron vía aérea al Instituto de
10
para ser analizadas con las técnicas de DAS - ELISA, inclusiones virales y tinción
Clark y Adams (1997), modificado por Sutula (1993). Las placas de ELISA fueron
Inc.).
Los materiales utilizados para realizar esta prueba fueron los siguientes:
• Amortiguador de lavado
• Amortiguador de extracción
• Amortiguador de conjugado
• Amortiguador de cobertura
11
• Amortiguador de sustrato
• Matraces
• Pipetas
• Agitadores
• Bolsas plásticas
• Portaobjetos de vidrio
• Cubreobjetos
• Pinza
• Lija de agua
• Agua de la llave
12
• Etilenglicol monometil eter
• Glicerina
Procedimiento:
luego con una pinza se tomaron tiras de epidermis por el envés de la hoja, en aquellos
casos en que no fue posible obtener tiras de epidermis, se empleó lija de agua lijando
cuidadosamente la hoja por la parte del haz, hasta quedarnos con la epidermis de la
observó el tejido completamente clarificado. Una vez obtenido este tejido se colocó sobre
se dejó teñir durante siete minutos, luego se enjuagó con agua de la llave, hasta que ya el
Todas las muestras obtenidas en la segunda colecta realizada en mayo del 2004, excepto
Histopatología IFIT-CP. Lo anterior fue debido a que las muestras del resto de las fincas
13
Para la tinción negativa se utilizaron los siguientes materiales:
dicloroetano.
• Portaobjetos de vidrio
• Pipetas Pasteur
• Cajas de Petrí
• Papel filtro
• Navaja Gillette
• Lápiz
Procedimiento:
previamente se colocó una gota del ácido fosfotúngstico al 1%, se maceró con una
navaja limpia, hasta lograr extraer savia del tejido, luego con una pinza se sujetó una
14
humedecer la rejilla esperando un minuto para que secara un poco y luego se colocó en
una caja Petri sobre papel filtro, marcando con lápiz a un lado de la rejilla el número de
15
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
De las 15 fincas muestreadas en ambas fechas (febrero y mayo) el 73% están sembradas
con papayo criollo, el 13% con tipo Solo y únicamente un 7% con las variedades Dama
Cuadro 1: Características de las fincas y de las plantas de papayo (Carica papaya L.)
muestreadas en el Valle de Comayagua, Honduras, 2004.
Edad de las
No. Muestras Superficie
Variedad plantas Estado del cultivo
Finca colectadas (Mz.)
(meses)
1 3 0.75 criolla 10 Produccióna
2 3 1.5 criolla 15 Produccióna
3 2 8 tipo Solo 14 Abandonob
4 2 1.42 dama roja 9 Produccióna
5 2 1 criolla 7 Produccióna
6 2 1 criolla 12 Produccióna
7 2 0.75 criolla 13 Produccióna
8 2 1.7 criolla 10 Crecimiento vegetativoc
9 1 1 criolla 13 Produccióna
10 2 1 criolla 11 Crecimiento vegetativoc
11 2 0.5 criolla 15 Produccióna
12 1 2 criolla 11 Crecimiento vegetativoc
13 2 1.7 criolla 14 Produccióna
14 4 1 tainung 11 Produccióna
15 3 2 tipo Solo 15 Produccióna
a
La planta se encuentra en producción.
b
La plantación se encuentra sin ningún manejo agronómico.
c
La plantación se encuentra en desarrollo.
16
3.2. Análisis de muestras
3.2.1. DAS-ELISA
Guatemala fueron negativas a PapMV y PRSV. Este resultado negativo puede deberse a
momento del muestreo ya que se sabe que la técnica de DAS-ELISA no detecta virus en
negativos para el PRSV, pero positivos para el PapMV en muestras de seis fincas
(Cuadro 2):
17
Cuadro 2. Síntomas observados en tejido de papayo colectado en 15 fincas y
Tipo
No. Resultado
de Síntomas
finca DAS ELISA
papayo
1 criolla Hojas necróticas, lesiones cloróticas, planta enana +
2 criolla Hojas adultas con lesiones cloróticas +
3 tipo Planta con pocas hojas, hojas con reducción del área +
Solo foliar, planta sin fruto.
4 dama Hojas con abultamientos en el área foliar, lesiones -
roja cloróticas, planta enana
5 criolla Hojas con abultamiento en el área foliar, lesiones +
cloróticas, planta enana
6 criolla Hojas con abultamientos en el área foliar, lesiones -
cloróticas, planta presenta síntoma punta de lápiz, es
decir solamente hay hojas en el ápice y estas tienen su
área foliar reducida.
7 criolla Planta presenta defoliación, hojas adultas deformes, -
punta de lápiz.
8 criolla Hojas apicales con lesiones cloróticas -
9 criolla Hojas apicales con lesiones cloróticas -
10 criolla Hojas con moteado (contraste de color verde claro y +
verde oscuro)
11 criolla Punta de lápiz, ápice arrepollado +
12 criolla Hojas deformes, planta enana -
13 criolla Hojas con moteado -
14 tainun Hojas de todos los estratos con lesiones cloróticas -
- = Negativo
De las seis fincas positivas para PapMV , se observó que los síntomas encontrados en
observó que la detección del virus a través de la prueba (DAS-ELISA) tuvo variaciones
18
sólo en tejido joven, mientras que el 16.66% se presentó únicamente en tejido adulto, en
los casos en que el virus se encontró en ambos tipos de tejido fue de 16.66% y restante
16.66% corresponde a una muestra compuesta únicamente por tejido adulto (Cuadro 3).
2004.
Tipo de
No. De No. de
tejido Observaciones
Finca Muestra
analizado
F1 M1 Joven/Adulto El virus se manifestó únicamente en tejido joven
F2 M1 Adulto Únicamente se analizo tejido adulto
F3 M1 Joven/Adulto El virus se manifestó únicamente en tejido joven
F5 M1 Joven/Adulto El virus se manifestó únicamente en tejido adulto
F10 M1 Joven/Adulto El virus se manifestó en ambos tipos de tejido
F10 M2 Joven/Adulto El virus se manifestó en ambos tipos de tejido
F11 M2 Joven/Adulto El virus se manifestó únicamente en tejido joven
Como tejido apical se consideró el tejido joven tomado del estrato superior, mientras que
formadas y maduras pero aún turgentes. De las seis fincas en las que se detectó este
virus a través de la técnica DAS-ELISA, cinco se dedican a cultivar papayo criolla y una
encontraron inclusiones amorfas, densas, dentro del núcleo de las células del parénquima
situadas sobre las nervaduras (figura 2). En ocasiones se llegaron a observar granulosas
19
y estos gránulos con una disposición uniforme dando la apariencia de inclusiones
A B
Ochoa M.D. Ochoa M.D.
C D
Ochoa M.D. Ochoa M.D.
20
3.2.3. Tinción negativa
A B
Cardenas, S. E. Cardenas, S. E.
muestreadas:
• Trialeurodes spp.
• Empoasca spp.
• Tetranichus mexicanus McGregor
La identificación fue realizada por el Dr. Cesáreo Rodriguez Hernández del Instituto de
21
Las poblaciones de Trialeurodes spp. y Empoasca spp. se encontraron en poblaciones
22
Figura 4. Fuente: Hojas Cartográficas geoposicionadas en Arcview 3.2, 1628.sid. INFOAGRO/SAG.
23
Figura 5. Fuente: Hojas Cartográficas geoposicionadas en Arcview 3.2, 1628.sid. INFOAGRO/SAG.
24
Figura 6. Fuente: Mapa de Honduras geoposicionado en Arcview 3.2, 1628.sid. INFOAGRO/SAG.
25
4. CONCLUSIONES
anular del papayo (Papayo Ringspot Potyvirus, PRSV), mediante los tres
plantaciones muestreadas.
4. Para el diagnóstico del virus del mosaico del papayo (PapMV), se debe tomar
para el virus del mosaico del papayo (PapMV), fueron clorosis y enanismo.
26
6. Dado que el virus del mosaico del papayo (PapMV) se trasmite en forma
mecánica, se deben considerar prácticas culturales en todas las etapas del cultivo,
evitando el daño mecánico a las plantas y haciendo una correcta limpieza de las
herramientas.
• Trialeurodes spp.
• Empoasca spp.
27
5. LITERATURA CITADA
Editorial Universidad Estatal a distancia. San José, Costa Rica. pp. 45-72.
Breman, L.L. 1997. Papayo Mosaic Potexvirus in Portulaca spp. Plant Patology.
Brunt, A., Crabtree, K., Dallwitz, M., Gibbs, A., Watson, L. and Zurcher, E. 1996.
Viruses of Plants. Descriptions and list from the VIDE Database. CAB International. pp.
871-876.
Cárdenas, E., Téliz, D., Engleman, M. y Ortega, M.L. 1993. Patogénesis del virus de la
mancha anular del papayo en México. Revista Mexicana de Fitopatología 11: 154–162.
34 p.
28
Castaño, J., y Del Río, L. 1994. Guía para el diagnóstico y control de enfermedades en
Clark y Adams. 1997. Método de ELISA. Modificado por SUTULA (1993) para
fosfatasa alcalina. 15 p.
Chiriboga, G. 2000. Caracterización del cultivo de papaya como producto con potencial
2004.www.dicta.hn/paginas/valle_comayagua.htm.
Francki, R.I.B., Milne Robert G., Hatta, T. 1985. Atlas of Plant Viruses. Vol. III.183 -
217 p.
Gonsalves, D. 1994. Papayo Ringspot. Compendium of tropical fruit diseases. Pp. 67-
68.
29
Hansen, M. 1993. Plant Disease Diagnosis: Present Status and Future Prospects.
(eds.) Daniels, M.J., Hamilton, R.I., Ingram, D., Williams, P.H. In: Advances in Plant
Patology. Vol. 10. pp. 66-126. San Diego, Academic Press Inc. USA.
Purcifull, D.E., S. R., Christie, T. A., Zitter. 1971. Descriptions of plant viruses: Papayo
mosaic virus. p. 6.
Salazar, L.F. 1996. Potato Viruses and Their Control. International Potato Center (CIP).
Sudzuki, F. 1996. Frutales Subtropicales para Chile. Ed. Universitaria Santiago, Chile
218 p.
30
Téliz, D., G. Mora, D. Gonsalves, F. Durán, y C. Ávila. 1987. El virus de la mancha
Yeh, S.D., and Gonsalves, D. 1984. Translation of papayo ringspot virus RNA in vitro:
31
6. ANEXO 1
Fórmula:
(pH=7.4)
ATENCION: el fosfato dibásico de sodio forma terrones que al contacto con el agua, se
vuelven duros y se precipitan. Es recomendable deshacer los terrones con una espátula
hasta que el reactivo quede como polvo fino; agregarlo poco a poco. El control de las
velocidades del agitador magnético indicadas en los protocolos es importante para evitar
32
la formación de espuma en las mezclas.
Preparación:
velocidad media-alta.
4.- Pesar el fosfato dibásico de sodio; deshacer los terrones. Agregarlo poco a poco, hasta
que se disuelva.
9.- Llevar la mezcla a un volúmenes de 450 Ml con H2Od. Mantener en agitación por 30
6.8 -7.3.
11.- Mantener la mezcla en agitación a velocidad media, con el electrodo del pH-metro
33
el pH sobrepasa ese valor, puede bajar y ajustar el pH con una solución de HC 1N.
12.- Llevar la mezcla a un volumen final de 500 Ml con H2Od. Dejar en agitación por
Fórmula:
Preparación:
1.- Medir 100 Ml de PBSt 10X en una probeta y agregar a un matraz. Colocar el matraz
2.- Llevar la mezcla a un volumen final de 1000 Ml con H2Od. Dejar en agitación por
Fórmula:
34
Albúmina del huevo 0.300 g
(pH=7.4)
para que se disuelvan los grumos, después se añade otro poco de PBSt 1X y se agita de
Preparación:
velocidad baja.
2.- Pesar la albúmina de huevo; predisolverla como se indicó y agregar. Esperar a que se
disuelva.
35
3.- Pesar y agregar el sulfito de sodio; esperar hasta que se disuelva.
4.- Pesar el PVP-40; predisolverlo como se indicó y agregar. Esperar a que se disuelva.
7.- Llevar la mezcla a un volumen de 130 Ml con PBSt 1X. Mantener en agitación por
7.9.
9.- Mantener la mezcla en agitación a velocidad media, con el electrodo del pH-metro
7.4, o si al tratar de ajustar el pH baja ese valor, puede subir y ajustar el pH con una
10.- Llevar la mezcla a un volumen final de 150 Ml con PBSt 1X. Dejar en agitación por
Fórmula:
36
Albúmina del bovino 0.30 g
(n) el (los) reactivo (s) en un vaso de precipitado pequeño, se agrega un poco de PBSt 1X
una varilla de vidrio para que se disuelvan los grumos, después se añade otro poco de
Preparación:
velocidad baja.
2.- Pesar albúmina de bovino; agregarla poco a poco. Esperar a que se disuelva.
3.- Pesar el PVP-40; predisolverlo como se indicó y agregar. Esperar a que se disuelva.
5.- Llevar la mezcla a un volumen final de 150 Ml con PBSt 1X. Mantener en agitación
37
tiempo máximo de un mes a partir de la fecha de la preparación; como medida de
1.1.5.-Amortiguador de cobertura.
Fórmula:
(pH = 9.6)
Preparación:
velocidad media.
5.- Llevar la mezcla a un volumen de 130 Ml con H2Od. Mantener en agitación por 30 -
38
6.- Medir el pH de la mezcla con un pH-metro calibrado. Generalmente oscila entre 9.7 -
10.2.
7.- Mantener la mezcla en agitación a velocidad media, con el electrodo del pH-metro
ajustar el pH baja de ese valor, puede elevar y ajustar el pH con una solución de
NaOH 1N.
8.- Llevar la mezcla a un volumen final de 150 Ml con H2Od. Dejar en agitación por 30 -
de precipitado en el que se prepare debe estar cubierto con papel aluminio. Aunque puede
Fórmula:
39
Agua destilada (H2Od), aforar a, 25.0000 Ml
(pH=9.8)
Preparación:
velocidad media.
11.5.
6.- La Mantener la mezcla en agitación a velocidad media, con el electrodo del pH-metro
ajustar el pH queda debajo de ese valor puede subir y ajustar el pH con la solución de
NaOH 1N.
40
fosfato disódico (PNP, 5 mg/tableta3), se agrega con 10 minutos de anticipación.
1.- Calcular el volumen del amortiguador de sustrato necesario para cubrir los pozos del
pipeteo.
media.
3.- Agregar una pastilla de PNP por cada 10 Ml del amortiguador de sustrato. Mantener
homogenice.
PROTOCOLO ELISA-DAS.
1.- Definir la distribución de tratamientos y sus repeticiones en la (s) placa (s) de ELISA.
Es recomendable que para cada virus que se quiera detectar se consideren: testigo
positivo (planta enferma con el virus objetivo), testigo negativo (planta sana de cada
especie incluida en las muestras), testigo blanco (sin muestras vegetal) y muestras
2.- Calcular el volumen a utilizar de cada antisuero, de acuerdo con la sugerencia del
distribuidor. Se divide el volumen del amortiguador de cobertura requerido para < ese
41
algunos pozos mas de los requeridos, para compensar errores de pipeteo.
EJEMPLO: se requiere cubrir 24 pozos de una placa ELISA con antisuero el TSWV(el
por Agdia es 1.200, nuestra experiencia ha demostrado que se obtienen buenos resultados
con 1.500.
Dilución = 500
mechero para disminuir el riesgo de contaminación del antisuero. Agitar en un vórtex por
5.- Incubar la (s) placa (s) a temperatura ambiente y luz natural por 4 horas. Colocarla (s)
dentro de una bolsa de polietileno de tamaño adecuado conteniendo papel húmedo, para
6.- Por cada muestra, colocar 2 gramos del tejido vegetal fresco o congelado en una
42
bolsita de polietileno grueso. Añadir 2 µL de amortiguador de extracción y macerar con
un pistilo de mortero.
con las muestras. 2 – Es recomendable iniciar este paso treinta minutos o una hora antes
de cumplirse el tiempo de la incubación de la (s) placa (s), con el fin de tener las muestras
agua destilada para evitar que rompa la bolsa de polietileno. 4 – Las muestras se
deben conservarse en un recipiente con hielo para evitar la oxidación del tejido vegetal.
7.- Para cada muestra, añadir 200 µL del extracto obtenido en una bolsa u otro recipiente
que contenga 800 µL de amortiguador de la extracción. Con esto se obtiene una dilución
final 1:10(p/v).
líquido salga del pozo sin contaminar a los demás. 2 – Llenar los pozos con PBSt 1x,
vaciando directamente del matraz o con pipetas (no importa si se derrama el PBSt 1X).
3 – Repetir los pasos 1 y 2 en dos ocasiones. 5 –Repetir el paso 1 mas de vez, para
completar los tres lavados. 6 – Secar la placa con papel absorbente, golpeando la placa
invertida sobre dos o más hojas de papel colocado sobre una mesa.
9.- Añadir 100 µL de la muestra diluida (paso 7) en los pozos correspondientes según
43
10.- Incubar la (s) placas (s) a 4 °C (en el refrigerador) durante toda la noche.
11.- Medir el volumen del amortiguador de conjugado requerido en cada caso, que debe
incorporación.
12.- Lavar la (s) placa(s) con PBSt 1X tres veces, siguiendo el procedimiento del paso 8.
13.- Colocar 100 µL del conjugado diluido en cada pozo, de acuerdo con esquema previo
(paso1).
14.- Incubar la (s) placa(s) a temperatura ambiente y luz natural por 2 horas. Colocarla (s)
dentro de una bolsa de polietileno de tamaño adecuado conteniendo papel húmedo, para
15.- Preparar el volumen adecuado del amortiguador de sustrato (ver apartado 1.1.6).
Agregar una pastilla de PNP (Agdia, Inc.) por cada 10 µL de amortiguador de sustrato.
cumplirse el tiempo de incubación de la (s) placa (s). 2 – Mantener los recipientes del
44
amortiguador cubiertos con papel aluminio para evitar su fotodegradación, pues podría
haber color en todos los pozos aun en los negativos. 3 –Disolver siempre pastillas
completas de PNP en amortiguador de sustrato, utilizar 10 µL, 20 µL, 30 µL, etc., Del
16.- Lavar la (s) placa (s) con PBSt 1X tres veces, siguiendo el procedimiento del paso 8.
17.- Colocar 100 µL del amortiguador de sustrato +PNP en cada pozo, cubriendo todos
18.- Incubar la (s) placa (s) a temperatura ambiente y obscuridad total por 20 minutos.
Colocarla (s) dentro de una caja de cartón o cubrirla (s) con papel aluminio; mantenerla
19.- Revisar la (s) placa (s) para detectar la reacción positiva, que consiste en una
coloración amarilla. Si no hay reacción positiva (o ésta es débil) a los 20 minutos, incubar
por 10 minutos más. Repetir la operación cada 10 a 15 minutos hasta que el período de
positivos del (los) virus involucrado (s). 2 – Es posible mantener la (s) placa (s) en
incubación por más tiempo del señalado si la reacción tarda en aparecer, pero las
reacciones se consideran válidas solo mientras los testigos blancos se mantengan claros o
virtualmente claros. 3 – Una vez que la reacción positiva alcance la intensidad de color
hasta por dos semanas, este paso es opcional, pues la reacción puede evaluarse visual y/o
45
colorímétricamente sin necesidad de detener la reacción.
20.- Evaluar visualmente los resultados, o medir la absorbancia de cada pozo de la placa
46
7. ANEXO 2
ORGANISMO INTERNACIONAL REGIONAL DE SANIDAD AGROPECUARIA
OIRSA
PROYECTO REGIONAL DE FORTALECIMIENTO DE LA VIGILANCIA
FITOSANITARIA EN CULTIVOS DE EXPORTACIOIN NO TRADICIONAL
VIFINEX
MAESTRIA TECNOLÓGICA EN MEDIDAS SANITARIA Y FITOSANITARIAS
MSF
DETECCIÓN DE LOS VIRUS MOSAICO Y MANCHA ANULAR DEL
PAPAYO EN CARICA PAPAYA L.
EN COMAYAGUA, HONDURAS
Propietario: ____________________________________________________
UBICACIÓN
Dirección exacta:
47
ORGANISMO INTERNACIONAL REGIONAL DE SANIDAD AGROPECUARIA
OIRSA
PROYECTO REGIONAL DE FORTALECIMIENTO DE LA VIGILANCIA FITOSANITARIA EN
CULTIVOS DE EXPORTACIOIN NO TRADICIONAL
VIFINEX
MAESTRIA TECNOLÓGICA EN MEDIDAS SANITARIA Y FITOSANITARIAS
MSF
DETECCIÓN DE LOS VIRUS MOSAICO Y MANCHA ANULAR DEL PAPAYO EN CARICA
PAPAYA L.
EN COMAYAGUA, HONDURAS
Síntomas observados:
_______________________________________________________________________
Síntomas observados:
_______________________________________________________________________
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