Estudio del crecimiento de Escherichia coli bajo diferentes

condiciones
Study of the growth of Escherichia coli under different conditions

Patricia M. Álvarez1, Daniel Salamone2, Jesús Vegas3

Universidad de Carabobo, Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología. Departamento

de Biología, Naguanagua, EDO. Carabobo.

RESUMEN. Escherichia coli es un bacilo ABSTRACT. Escherichia coli is a gram

gram negativo con gran importancia a nivel
industrial, clínico, y biotecnológico, por
esta razón, la comprensión del
comportamiento de esta bacteria es clave
para el desarrollo en el área investigativa.
Con este fin, se llevó a cabo un estudio en el
crecimiento de la bacteria sometiéndola a
distintos parámetros externos como la
acción de SDS (detergente), NaCl y la
Cefalotina (antibiótico), y también
variaciones de pH y temperatura que
modifican el crecimiento bacteriano. Para la
cuantificación del crecimiento se emplearon
los métodos de la turbidimetría y plaqueo y
se determinaron las curvas de crecimiento
de E. coli en las diferentes condiciones.
Se calculó el tiempo generacional y la tasa
máxima de crecimiento de la bacteria y se
reportaron las curvas de crecimiento en
cada ocasión. Se concluyó que todos los
parámetros evaluados son capaces de
retardar e incluso inhibir el crecimiento de
la cepa de E. coli.
negative bacillus with great importance at
an industrial, clinical and biotechnological
level, for this reason, the understanding of
the behavior of this bacterium is key for the
development in the research area. To this
end, a study was carried out on the growth
of the bacteria by subjecting it to different
external parameters such as the action of
SDS (detergent), NaCl and Cefalotin
(antibiotic), and also variations of pH and
temperature that modify bacterial growth. .
For the quantification of the growth, the
turbidimetry and plating methods were used
and the growth curves of E. coli were
determined in the different conditions.
The generational time and the maximum
growth rate of the bacteria were calculated
and the growth curves were reported on
each occasion. It was concluded that all
parameters evaluated are capable of
retarding and even inhibiting the growth of
the E. coli strain.
 INTRODUCCIÓN.
A diferencia de otros organismos, en los
cuales el crecimiento implica un aumento
de tamaño, el crecimiento bacteriano está
más relacionado al número de UFC
(unidades formadoras de colonias) que se
forman, lo cual es debido a que las
dimensiones por lo general, tienden a ser
estables entre miembros de la misma
especie [1].
Las poblaciones microbianas en medios de
cultivos pueden presentar distintos
comportamientos de crecimiento, lo cual
por lo general es representado en muchas
ocasiones mediante una curva en la que se
distinguen cuatro fases: Latencia. Donde se
sintetizan las moléculas estructurales y
metabólicas. Fase exponencial o (mediante flagelación perítrica), que crece
logarítmica. Las células se duplican
constantemente. Fase estacionaria. El
número de células permanece constante a
causa de un equilibrio entre los individuos
que nacen y mueren. Y la Fase de
declinación o muerte. El número de células
muertas supera a las vivas, con lo cual hay
decrecimiento en la población [1,2].
Con base en el crecimiento exponencial del
cultivo microbiano, se dice que la velocidad
de incremento de bacterias en un tiempo
dado es proporcional al número de bacterias
presentes, con lo cual se obtienen ciertos
parámetros de estudios, como el de la
constante de velocidad de crecimiento (µ),
que está estipulada como:
μ= ⁄
Donde n es el número de generaciones y t el
tiempo generacional. También puede
expresarse como:
log( ) − log ( )
=
log(2) ( − )
Donde N y son el número de células en
un determinado momento y al tiempo cero
respectivamente.
Otro parámetro cinético de relevancia es el
tiempo generacional g (1/k=g), que es el
tiempo requerido para que la población
microbiana duplique su tamaño [3].
La bacteria Escherichia coli es un
microorganismo perteneciente a la familia
Enterobacteriaceae [5]. Es un bacilo Gram
negativo, no esporulador, usualmente móvil
óptimamente a 37 ºC y a pH neutro [6]. Se
sabe además que en condiciones óptimas su
tiempo generacional es de 21 min [7]. Un
aspecto clave a considerar durante el
estudio del crecimiento bacteriano, es que
su comportamiento puede variar según
cambios en las condiciones estándares, es
así como modificaciones en la temperatura,
pH, salinidad del medio, y otros factores
como la acción de antibióticos, pueden
ocasionar una disminución o aumento en el
crecimiento poblacional [1,8].
En el presente estudio, se describe el
proceso de determinación del crecimiento
de E. coli mediante turbidimetría y siembra
en placa. También se evalúa la influencia
del pH, la temperatura, la salinidad, la
acción de SDS y de la cefalotina en el
crecimiento de dicha bacteria. Se
construyeron las curvas de crecimiento para
cada caso y se determinó el tiempo
generacional, la tasa de crecimiento y la
productividad celular para la muestra de
E. coli.
MATERIALES Y MÉTODOS
Determinación del crecimiento
bacteriano por espectrofotometría. Para
las investigaciones realizadas se empleó una
cepa de E. coli la cual se dejó crecer en
70.0mL de caldo de cultivo a 37°C por 24h,
de este primer caldo se inoculó 1.0mL para
9 fiolas con 70.0mL caldos de cultivo, que
posteriormente fueron sometidos a la acción
de diferentes agentes físicos y químicos que
afectarán el crecimiento bacteriano. El
tiempo de incubación de los medios fue de
6h, y se realizó cuantificación de la
concentración bacteriana en cada uno de los
medios empleando espectrofotometría con
una calibración de 540nm. Se realizaron
mediciones en intervalos de una hora. Los
factores que se tomaron en cuenta fueron:
Temperatura:
1-Un medio a 37°C y pH 7 (Estándar).
2-Un medio a 25°C y pH 7.
3-Un medio a 55°C y pH 7.
pH:
4- Un medio a 37°C y pH 3.
5- Un medio a 37°C y pH 9.
Sustancias químicas:
6- Un medio a 37°C con SDS.
7- Un medio a 37°C con NaCl 5%.
8- Un medio a 37°C con Cefalotina.
Agitación:
9- Un medio a 37°C con agitación.
Determinación del crecimiento
bacteriano por siembra en placa. Se tomó
un inoculo de 500µL del cultivo estándar
después de cada medición con el
espectrofotómetro y se diluyó en un tubo de
ensayo con 4.5mL de agua destilada
obteniendo una solución con volumen de
5mL y factor de dilución 1/10, a partir de
este se elaboraron diluciones de 1/1000,
1/100.000 y 1/1.000.000 empleando agua
destilada. De estas diluciones, se inoculó
100µL en un par de placas (una placa A y
una placa B). En las placas correspondientes
a las horas 1, 2, 3 y 4 el inoculo contuvo un
factor de dilución de 1/1.000, las placas de
las horas 5 y 6 fueron sembradas con
inoculos de 1/100.000 y 1/1.000.000
obteniendo un total de 8 pares de placas
correspondientes a las 6 horas de
crecimiento. Pasadas 24h se contabilizó el
número de colonias en cada una de las
placas y se graficaron los datos en función
del tiempo. También se calculó la tasa de
crecimiento y el tiempo generacional a
partir de las ecuaciones 1 y 3
respectivamente.
Determinación de datos cinéticos. Los
parámetros cinéticos fueron determinados
con base en las metodologías empleadas en
trabajos anteriores [3,4].
La tasa máxima de crecimiento (µmax) se
definió como la mayor masa celular o
número de células producidas por unidad de
tiempo, y viene dada por la expresión:
 ( ⁄ ) crecimiento y tiempo de generación de
μ á = (1)
− 0.687h y 1.008h respectivamente. A 55°C
se determinó una tasa máxima de
Donde y representan las absorbancias crecimiento de 0.314h y tiempo de
medidas en los tiempos y generación de 2.20h (ver Tabla. 2).
respectivamente. En una regresión lineal,
µmax equivale al valor de la pendiente de la
recta. Para hacer lineal una curva de
Efecto de la temperatura
crecimiento se expresa: 0,3

( )=μ á ∗ + ( ) (2) 0,25

Donde µmax es la pendiente de la recta y 0,2

Absorbancia
( ) el punto de corte con el eje Y. 0,15

El tiempo de generación ( , h) se define 0,1

como el tiempo necesario para que la
0,05
población bacteriana duplique su tamaño
[4, 5]. Se calculó mediante la ecuación: 0
0 2 4 6 8
(2) -0,05
= (3) Tiempo (h)
μ á

Métodos de graficación. Se usó el 25°C 55°C Estándar

programa Microsoft Office Excel 2007 para

la determinación de las curvas de
crecimiento en cada uno de los cultivos.
Para ello se graficó las absorbancias con
respecto al tiempo. Para obtener el valor de
µmax de cada medio, se la ecuación (2)
usando los datos registrados en la tabla 1.
Conteo de colonias en superficie. Se
contabilizó el número de colonias en cada
placa, descartando aquellas que presentaran
tamaños y formas desproporcionales a la
media.
RESULTADOS
MEDICIÓN DE ABSORBANCIAS.
La Fig. 1 presenta las curvas de crecimiento
a 25°C y 55°C. Se observó un crecimiento
óptimo a 25°C con una tasa de máxima de
Fig. 1: Curva de crecimiento de E. coli bajo
los efectos de la temperatura.
Paralelo a la temperatura, se observó una
mayor tasa de crecimiento a pH 9 siendo su
valor respectivo de 0.751h por tanto se
obtuvo un tiempo generacional de 0.92h.
Para la cepa incubada en pH 3, se calculó
un R de 0.415 en la regresión lineal, lo cual
evidencia estadísticamente una poca
correlación entre la curva de crecimiento y
la regresión lineal. Sin embargo se procedió
a calcular el promedio y desviación estándar
de los valores observados en la absorbancia,
obteniendo 0.0171 y 0.0022
respectivamente. Por cuanto el valor de la
desviación es muy bajo, se puede interpretar
que la absorbancia medida en el caldo con
pH 3 se mantiene en un valor casi constante
de 0.0171, dando a entender que la bacteria a) Efecto de sustancias
no tolera este pH. químicas
0,3

0,25
SDS
0,2
a) Efecto del pH

Absorbancia
NaCl 5%
0,15
0,3
Cefalotina
0,25 0,1
Estándar
0,2 0,05
Absorbancia

0,15
0
0,1 0 2 4 6 8
-0,05
0,05 Tiempo (h)
0
-0,05 0 2 4 6 8 0,03
Tiempo (h)
b)
Absorbancia 0,025

0,02
pH 3 pH 9 Estándar
0,015

0,035 0,01
b) 0,03 0,005
0,025 0
Absorbancia

0,02 0 2 4 6 8
0,015 Tiempo (h)
0,01
0,005 SDS NaCl 5% Cefalotina

0
0 2 4 6 8 Fig. 3: Curva de crecimiento de E. coli bajo
Tiempo (h)
los efectos de agentes químicos.
a) Comparación con medio en ausencia de
pH 3 pH 9 agentes químicos. b) Comparación detallada
de las curvas de crecimiento en presencia de
Fig. 2: Curva de crecimiento de E. coli bajo agentes químicos.
los efectos del pH. a) Comparación con pH
neutro. b) Comparación detallada de pH 3 y
pH 9.
Los factores químicos, como la respectivamente, por lo que la fase
concentración de sales (NaCl), la presencia exponencial duró aproximadamente 4 horas.
de SDS (Dodecilsulfato de Sodio) y la
cefalotina, tienen impactos negativos sobre Efecto de la agitación
la velocidad de crecimiento de la E. coli
0,8
(Ver Fig. 3), afectando el crecimiento 0,7
exponencial de la bacteria, en especial en el 0,6
caldo con cefalotina, donde no se observó

Absorbancia
0,5
fase exponencial. Las absorbancias tomadas 0,4
en cuenta para la graficación fueron a partir 0,3
de 1h, ya que considerando absorbancias en 0,2
tiempo de 0h se generan valores de muy 0,1
0
por debajo del valor mínimo necesario (0.5)
-0,1 0 2 4 6 8
para que exista una relación lineal
Tiempo (h)
significativa.

El medio con agitación fue donde se Agitacion Estándar

registró la mayor tasa de crecimiento y

productividad celular. Se observó inicio de Fig. 4: Curva de crecimiento de E. coli bajo
la fase exponencial y de latencia en 1h y 5h los efectos de la agitación.

Tabla. 1: Absorbancias medidas en cada cultivo en lapsos de 1h.

Tiempo (h)
Condición del medio
0 1 2 3 4 5 6
Temperatura (°C) Absorbancia medida
25 0 0.004 0.012 0.019 0.05 0.112 0.180
55 0.027 0.009 0.044 0.030 0.090 0.092 0.085
pH
3 0.017 0.016 0.015 0.016 0.017 0.017 0.022
9 0 0.001 0.001 0.009 0.017 0.017 0.031
Sustancias químicas
SDS 0.020 0.001 0.016 0.019 0.019 0.019 0.025
NaCl 5% 0.015 0.003 0.004 0.005 0.007 0.012 0.019
Cafelotina 0.010 0.005 0.003 0.002 0.006 0.006 0.007
Agitación 0.009 0.023 0.134 0.282 0.494 0.668 0.707
Estándar 0.002 0.004 0.104 0.106 0.171 0.234 0.274
 Datos cinéticos R de las líneas. También se observa que los
Medios µmax tg agentes químicos y pH 3 actuaron como fuertes
( ) (h) inhibidores del crecimiento bacteriano.
25°C 0.687 1.008 0.671
55°C 0.314 2.207 0.632 SEMBRADO EN PLACA Y CONTEO DE
pH 3 0.036 19.254 0.415 COLONIAS. Los resultados obtenidos al
pH 9 0.751 0.922 0.867 contar el número de colonias formadas en cada
SDS 0.474 1.462 0.530
placa dan a entender que el número de colonias
NaCl 0.367 1.888 0.974
aumenta con respecto al tiempo si se mantiene
Cefalotina 0.138 5.022 0.283
Agitación 0.754 0.919 0.891 constante el factor de dilución. Esto debido a
Estándar 0.835 0.830 0.793 que en cada hora la población bacteriana habrá
Tabla. 2: Datos cinéticos obtenidos de la aumentado, por tanto la concentración de
regresión lineal y valores de R . células por tubo de ensayo también aumenta. Si
se aumenta el factor de dilución la concetración
La mayor tasa de crecimiento fue medida en bacteriana disminuye viéndose reflejado como
el medio estándar, sin embargo este un menor número de colonias en las placas.
resultado no se ajusta con la Fig. 4, esto Cada colonia contada se asume que proviene de
puede deberse a una menor relación lineal una UFC. Se graficaron los resultados en la
Fig. 5, la tasa de crecimiento fue de 1.337 h y
de la curva estándar, en comparación con la
el tiempo generacional de 31.10min.
curva de agitación, esto se evidencia en el

N° Colonias Colonias totales

Hora Placa Factor de dilución Promedio (UFC)
(UFC) (UFC)

A 1/1000 348 348.000

1 365.000
B 1/1000 382 382.000
A 1/1000 1582 1.582.000
2 1.393.000
B 1/1000 1204 1.204.000
A 1/1000 2434 2.434.000
3 2.108.000
B 1/1000 1782 1.782.000
A 1/1000000 23 23.000.000
4 36.500.000
B 1/1000000 50 50.000.000
A 1/100000 170 17.000.000
B 1/100000 140 14.000.000
5 47.750.000
A 1/1000000 89 89.000.000
B 1/1000000 71 71.000.000
A 1/100000 1061 106.100.000
B 1/100000 1211 121.100.000
6 287.800.000
A 1/1000000 408 408.000.000
B 1/1000000 516 516.000.000
Tabla. 3: Número estimado de unidades formadoras de colonias por placa
 Crecimiento de E. coli
350.000.000
300.000.000
250.000.000
200.000.000
N° de UFC
150.000.000
100.000.000
50.000.000
0
-50.000.000 0 1 2
Tiempo (h)
Fig. 5: Crecimiento de E. coli en unidades formadoras de colonias bajo condiciones estándar
DISCUSIÓN
Crecimiento estándar por
espectrofotometría. Según se pudo
observar (Fig. 1), el crecimiento en primera
hora fue nulo, siendo esta la fase
estacionaria, fase en la cual las células están
sintetizando nuevos componentes, debido a
que fueron inoculadas en un nuevo medio y
por tanto están en fase de adaptación. A
partir de la primera hora se observa un
crecimiento exponencial, el cual constituye
la fase del mismo nombre, siendo esta en la
cual los microorganismos crecen y se
dividen hasta el nivel máximo posible [6].
Entre las 2 y 3 horas se observaron
fluctuaciones, esto puede deberse a haber
dejado por mucho tiempo fuera de la estufa
el caldo de cultivo mientras se realizaban
las diluciones seriadas, así como también
no haber agitado suficientemente la fiola
antes de medir en el espectrofotómetro.
Crecimiento a 25°C y 55°C. Las enzimas,
encargadas de catalizar todos los procesos
UFC
3 4 5 6 7
metabólicos de los microorganismos,
poseen una temperatura óptima de
funcionamiento, si dicha temperatura es
cambiada, la actividad enzimática se verá
afectada en cierto grado, pues la
temperatura rompe o desnaturaliza las
proteínas al dañar los puentes de hidrógeno
y disulfuro en las estructuras secundaria y
terciaria [7] disminuyendo así la velocidad
del crecimiento bacteriano, tal como se
observa en la curva obtenida (Fig.1). El
crecimiento a 55 ºC fue aún menor que el
crecimiento a 25 ºC, esto se puede explicar
ya que la diferencia entre la temperatura
optima de crecimiento de E. coli (37 ºC [8])
y los 55 ºC es de 18 unidades, en
comparación con 15 unidades en los 25 ºC.
Crecimiento a pH 3 y pH 9. El pH afecta
también la actividad enzimática de las
bacterias, lo que ocurre es que los
aminoácidos que forman las proteínas que
conforman enzimas, poseen grupos
ionizables, lo cuales participan en los
enlaces peptídicos [6,7]. Si se aumenta o
disminuye el pH en relación con el pH
óptimo (neutro en este caso) entonces
dichos enlaces sufrirán rupturas, y las
enzimas se verán afectadas. Por esta razón
un pH muy alejado del rango de
crecimiento óptimo de la bacteria afectará
negativamente su desarrollo.
Crecimiento en presencia de agentes
químicos. Estos factores influyeron de tal
forma a la bacteria que inhibió el
crecimiento bacteriano. Las altas
concentraciones de NaCl, propiciaron la
formación de un medio hipertónico, que
ocasionó la perdida de agua de la de la
célula de la bacteria deshidratándola por
osmosis, en la cual se trataban de igualar las
concentraciones de sal del medio
intracelular y extracelular [1]. Esto se ve en
la curva, ya que una vez que se aumenta un
poco la concentración de la bacteria, esta se
mantiene constante, lo que indica que ya no
quedaban células vivas ya que estas
murieron por deshidratación o que se llegó
a un punto de equilibrio dinámico en la cual
la cantidad de células que nacían era la
misma cantidad que moría. El SDS también
inhibió el crecimiento de la bacteria, ya que
este es un detergente aniónico [9], que
provoca una gran disrupción de la
membrana de la bacteria alterando la
disposición ordenada de los lípidos y
proteínas presentes, lo cual ocasiona una
lisis en la célula de la bacteria. La
cefalotina es una cefalosporina, por lo que
actúa de la misma manera que las
penicilinas, interfiriendo en la síntesis de
peptidoglicano de la pared celular
bacteriana, e inhibiendo la transpeptidación
final, necesaria para la reticulación. Esto
genera un efecto bacteriolítico [10].
Crecimiento medido con base en el
conteo de UFC. En comparación a los
resultados obtenidos por espectrofotometría
se calculó un tiempo de generación de
aproximadamente 20min menor, este valor
se encuentra más ajustado al valor real de
20min que trabajos anteriores han
demostrado. Esta diferencia puede deberse
a la incapacidad del espectrofotómetro de
diferenciar células vivas de muertas,
incluyendo en la cuantificación células que
no son viable o que están muertas. La
dilución seriada y posterior siembra en
superficie, permite hacer una estimación del
número de células viables, ajustando mejor
los datos cinéticos a los valores reales.
CONCLUSIONES
La fase estacionaria de la cepa empleada
dura entre 0 y 3 horas en condiciones
estándares. A partir de ese momento, la
población empezó a crecer
exponencialmente.
La temperatura es un factor físico que
afecta el crecimiento bacteriano, la muestra
de E. coli crece lentamente en comparación
con el crecimiento estándar. A 25 ºC la
bacteria crece más rápidamente que a 55°C.
El pH afecta la velocidad de crecimiento
del microorganismo en cuestión. A pH 3
E. coli no manifiesta crecimiento, por otra
parte, a pH 9 mantiene un leve crecimiento,
a pH neutro adquiere una mejor tasa de
crecimiento.
La cefalotina es más eficaz en la inhibición
de crecimiento de E. coli, el cloruro de
sodio al 5% y SDS disponen de menor [5] Madigan, M. T., & Martinko, J. M.
capacidad inhibitoria, siendo este ultimo el (2007). Brock. Biologia dei
agente químico con la menor capacidad microrganismi/Microbiologia generale.
inhibitoria de los tres. CEA.

El conteo en placa resulta ser más eficiente [6] Prescott L, Harley J, Donald K.
para determinar el número de células Microbiología. 4ta edición. Madrid:
viables o UFC en una población de McGraw Hill- Interamericana; 2000. Pp
bacterias, lo cual a su vez aproxima más los 1005.
parámetros cinéticos a los valores reales. Es
[7] Lehninger A. Bioquímica: las bases
recomendado aumentar el factor de dilución
a medida que transcurra el tiempo debido a moleculares de la estructura y función
que la población bacteriana será más grande celular. 2da edición. Barcelona: Ediciones
Omega, S.A.; 1978. p 1117.
en cada hora, por tanto es necesario reducir
el número de UFC que se siembran en [8] Sussman M. Escherichia coli:
placas para evitar sobrecargar el agar, mechanisms of virulence. Cambridge:
resultando en un numero incontable de Cambridge University Press; 1997. p 643.
colonias.
[9] Tortora G, Funke B, Case C.
REFERENCIAS Introducción a la Microbiología. Madrid:
[1] Negroni M. Microbiología Editorial Médica Panamericana, S.A; 2007.
p 959.
Estomatológica. 2da edición. Buenos Aires:
Edición Medica Panamericana S.A; 2009. p [10] Murray, P. R., Rosenthal, K. S., &
656. Pfaller, M. A. (2017). Microbiología
médica. Elsevier Health Sciences.
[2] Granados P, Villaverde M.
Microbiología. Madrid: Ediciones
Paraninfo, S.A; 2003. p 352.

[3] Zwietering, M. H., Jongenburger, I.,

Rombouts, F. M., & Van't Riet, K. (1990).
Modeling of the bacterial growth curve.
Appl. Environ. Microbiol., 56(6), 1875-
1881.

[4] Streit, N. M., Ramírez-Mérida, L. G.,

Queiroz Zepka, L., Jacob-Lopes, E., &
Queiroz, M. I. (2017). Producción de
pigmentos por Aphanothece microscópica
Nageli a partir de residuos industriales
lácteos. Ingeniare. Revista chilena de
ingeniería, 25(2), 350-358.