PRACTICA N° 3 TINCIÓN DE ENDOSPORAS, CÁPSULA Y PRUEBA DE MOTILIDAD DE

MICROORGANISMOS

CURSO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

COLORACIÓN DE CÁPSULA

La cápsula se puede definir como una estructura superficial que está presente en muchas bacterias
en sus ambientes naturales, consiste en acumulación de material mucoso viscoso, situado
externamente respecto de la pared celular.

Las cápsulas son estructuras inertes “no vivas” carentes de papel activo (metabólico), pero que
confiere a las bacterias importantes propiedades:

• Adhesión a células hermanas, generando microcolonias y consorcios

• Adhesión a sustratos inertes o vivos, lo que les permite la colonización de sus nichos
ecológicos (p. ej. Tejidos de organismos superiores)
• Protección contra agentes antibacterianos

Su observación a microscopía óptica en fresco es difícil, ya que su índice de refracción es similar al

del medio. Al ser una estructura muy hidratada (99% de agua), su observación con las técnicas
habituales de microscopía electrónica de transmisión (MET) y de barrido (MEB) revela una notable
contracción de su estructura. Además, los colorantes habituales tienen poca afinidad hacia ella.

Cápsula

Figura 1. Fotografía de cápsula bacteriana de Lb. Plantarum 100X

La cápsula de las bacterias no tiene la misma afinidad por los colorantes que otros componentes de
las células y por eso exige el empleo de métodos de coloración especiales.

Algunos están destinados a colorear la célula y el fondo, pero no la cápsula de manera que en la
envoltura se aprecia por contraste, como el método de Anthony. Otros procedimientos producen un
efecto colorante diferencial, cuando la cápsula admite un contra colorante. Otro procedimiento utiliza el
principio de la coloración negativa como el método de tinta china.
MATERIALES

- Cristal violeta al 1%
- Sulfato de cobre al 20%
- Agua destilada en frasco lavador
- Papel limpiamente para objetivos
- Aceite de inmersión
- Gotero
- Mechero
- pinza de madera
- asas de inoculación
- Cultivos bacterianos (Klebsiella pneumoniae.)
- Bandejas de coloración

MÉTODO DE ANTHONY

1. Preparar un extendido fino y uniforme de un cultivo de Klebsiella pneumoniae extendiéndolo con un

portaobjetos en ángulo recto.
2. Secar al aire. No fijar al calor
3. Colorear con solución acuosa de cristal violeta al 1% durante 2 minutos
4. Lavar con solución de sulfato de cobre al 20%
5. Dejar secar al aire en posición vertical y observar al microscopio

La cápsula aparece sin colorear contra un fondo de color púrpura; las células se tiñen de violeta
intensamente (Fig. 1).

COLORACIÓN DE ESPORAS

Ciertas especies de bacterias producen en su interior estructuras especiales denominadas

endosporas. Las endosporas son células diferenciadas extraordinariamente resistentes al calor y
difíciles de destruir incluso recurriendo a compuestos químicos muy agresivos. Las bacterias que
forman esporas se encuentran habitualmente en el suelo y se puede decir que prácticamente cualquier
muestra del suelo contiene endosporas.

El descubrimiento de las endosporas bacterianas tuvo una gran trascendencia para la microbiología
porque el conocimiento de estas formas de gran resistencia al calor fue decisivo para el desarrollo de
métodos de esterilización, no solo para medios de cultivo sino también para alimentos y otros
productos perecederos. Aunque muchos otros organismos distintos a las bacterias forman esporas, la
endospora bacteriana es única en cuanto a su grado de termo resistencia. La endosporas son
resistentes igualmente a otros agentes nocivos como la desecación, radiación, ácidos y desinfectantes
químicos; pueden además permanecer en estado latente por períodos de tiempo muy prolongados.

Por lo tanto, los métodos de rutina para coloración como en la coloración de Gram aparecen como
cuerpos retráctiles no coloreados. Por lo general en métodos especiales de coloración se requiere que
el calor penetre para permitir que las esporas se coloreen. en la figura 2. Las formas de estas
estructuras se observan en la Figura 2. De acuerdo con la ubicación en la célula se clasifican en
terminales, sub-terminales y centrales.

MATERIALES

- Solución acuosa de Verde de Malaquita al 5%

- Solución acuosa de safranina al 0.5%
- Cultivo bacteriano de Bacillus cereus
- Bandejas de coloración
- Agua destilada en frasco lavador
- Papel limpialente para objetivos
- Aceite de inmersión
- Gotero
- Mechero
- pinza de madera
- asas de inoculación
- Bandejas de coloración
- Tira de papel filtro
- Baño maría 95°C para vaporización de placas
- Varillas de vidrio para el baño

A . B C

Figura 2. Microfotografias de esporas bacterianas. A. Centrales. B. Subterminales C. Terminales

MÉTODO

1. Realizar un extendido de una colonia de Bacillus cereus tomada del Agar con el asa microbiológica.
2. Cubrir el porta objetos con una tira de papel filtro
3. Bañar todo el porta objetos con solución acuosa de Verde de Malaquita al 5%
4. Calentar al vapor durante 3 a 6 minutos sin dejar secar
5. Enjuagar con agua destilada
6. Contra colorear con solución de Safranina al 0.5% durante 30 segundos y lavar
7. Al observar al microscopio las esporas se observan en forma de esférulas verdes y el citoplasma
coloreado de rojo o fucsia.

PRUEBA DE MOTILIDAD

Algunas bacterias presentan movilidad debido a la presencia de flagelos. Este hecho puede ser
fácilmente demostrable en condiciones de laboratorio.

MATERIALES

- Cultivo de Pseudomonas sp.

- Tubos con agua destilada

- Láminas cubreobjetos y portaobjetos
- Asas

MÉTODO

1. Colocar una gota de água sobre la lámina portaobjetos

2. Con un asa previamente esterilizada, tome suavemente un poco de muestra de cultivo bacteriano y
disolver en la gota de água sin esparcir.
3. Observar los movimientos y reportar

CUESTIONARIO

1. Investigue otro método de coloración de cápsulas y explíquelo.

2. ¿Como se vería reflejado la contaminación de bacterias con cápsulas en un alimento?
3. ¿En qué consiste la coloración positiva y negativa en las tinciones microbiológicas?
4. Investigue la presencia de bacterias con endosporas en los alimentos, ¿En que alimentos se reporta
con mayor frecuencia? ¿Qué tratamiento existe en la industria para la eliminación de estos
microorganismos?
5. ¿Qué otros métodos de coloración de endosporas existen?, nombre al menos dos y explíquelos.

Tome fotografías y señale las estructuras observadas de acuerdo con las coloraciones
diferenciales preparadas.