Universidad de Carabobo

Facultad de Ciencia y Tecnología

Departamento de Química
Laboratorio de Bioquímica
PARCIAL DE BIOQUIMICA

Instrucciones: lea detenidamente el parcial, cada parte tiene un valor de 5 ptos, los cuales se
distribuirán según se indique en las preguntas. La respuesta debe enviarla en otro documento
tipo Word con su apellido en mayúsculas seguido de la palabra PARCIAL. La entrega debe
realizarla una semana después de que el correo con este documento llegue a su bandeja de
entrada. Sea breve y conciso en sus respuestas. Éxito

PARTE I CARBOHIDRATOS

1.- Pruebas cualitativas de carbohidratos: Para el siguiente carbohidrato indique los posibles
resultados de las siguientes pruebas cualitativas: Molish, Benedict, Barfoed, Lugol, Ácido múcico,
Seliwanof, Explique brevemente el por qué de sus suposiciones. (2 ptos)

El carbohidrato es la trehalosa es un disacárido formado de dos moléculas de glucosa donde la

unión glucosídica de tipo α (1->1) involucra los grupos OH de los dos carbonos anoméricos.
Partiendo de dos glucosas reductoras dulces se consigue un disacárido no reductor, con un bajo
poder edulcorante.

Prueba de Molish: EL resultado sería positivo, detectando la presencia del carbohidrato, el mismo
se deshidrataría por acción de ácido sulfúrico concentrado para luego formar un complejo
coloreado en su reacción con α-naftol.

Prueba Benedict: El resultado sería negativo puesto que el disacárido es un carbohidrato no

reductor.

Prueba de Barfoed: EL resultado sería positivo para disacárido, compuestos que reaccionan a esta
prueba lentamente. Lo que ocurriría sería la reducción de Cu2+ a Cu+ en medio ácido, se observaría
una coloración rojiza debido al Cu2O que se forma lentamente.

Prueba de Lugol: El resultado sería negativo, puesto que el carbohidrato no se trata del
polisacárido Almidón.
Prueba de Ácido Mucico: El resultado sería negativo, ya que la Trehalosa es un disacárido
compuesto por dos moléculas de glucosa y no contiene galactosa para la que esta prueba da
positivo.

Prueba de Seliwanoff: El resultado sería positivo, ya que con esta prueba se pueden reconocer
aldosas como la trehalosa, sin embargo, su reacción no es tan rápido como para las cetosas. Lo
que ocurriría sería la deshidratación del carbohidrato en medio ácido y posteriormente la
formación de un complejo coloreado rojizo por la reacción con el resorcinol.

2.- Cuantificación de carbohidratos de la banana (2 ptos): Detalle la reacción del DNSA e indique
por qué se usa la misma para la cuantificación de azúcares libres en la banana.

El ensayo DNS es un ensayo colorimétrico basado en reacción redox entre un azúcar reductor
como la glucosa o fructosa y ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), (1) y tiene como resultado un
producto de reducción rojizo-marrón que es el ácido 3- amino-5-nitro salicílico.

(1)

Se puede utilizar este ensayo para la cuantificación de azúcares libres en la banana por lo ya
explicado anteriormente, que al reaccionar un azúcar reductor (presentes por ende en la banana)
con DNS, se forma una coloración, que puede ser medida mediante un método
espectrofotométrico en el cual se mida la absorbancia.

De acuerdo a los experimentos realizados por su grupo cuál banana resultó tener el mayor
contenido de azúcares libres (explique brevemente)

Teniendo en cuenta los porcentajes reportados para la cantidad de azúcares reductores en la

banana se pudo constatar que el mayor porcentaje de contenido de azúcares reductores lo
reportó la muestra de banana madura, esto se debe a que, el contenido total de carbohidratos de
un plátano permanece relativamente constante (~ 28% de muestra seca) y que durante la
maduración, el contenido de azúcar libre aumenta bruscamente mientras que el contenido de
almidón muestra una disminución significativa, esto debido a que el mismo sufre un proceso de
hidrólisis.
El contenido de azúcares libres de bananas con distintos grados de madurez resultó ser
significativamente distinto (utilice las herramientas estadísticas necesarias para explicar)

Sí, los porcentajes obtenidos de azúcares reductores fueron los siguientes:

 0.58 ±0.10%, para la banana verde.

 249.81±0.25%, para la banana madura.
 21.88±0.22%, para la banana conservada una semana en la nevera.

Para el caso de las bananas verde y madura, ya se explicó la razón de la discrepancia entre esos
valores. En el caso de la banana conservada por una semana en la nevera el contenido reportado
de azúcares reductores, está entre los valores intermedios para las bananas antes mencionadas,
esto se debe a que la hidrolisis del almidón se ve interrumpida a bajas temperaturas mientras que
a altas se favorece, por esta razón la de la banana madura es un valor bastante alto mientras que
para la banana conservada en nevera, producto de la refrigeración se mantenga por un tiempo
mayor que si se deja afuera de la misma.

3.- Teoría de carbohidratos: Responda brevemente (1 pto)

 Explique la diferencia entre las aldosas y hexosas

Las aldosas difieren de las cetosas en que tienen un grupo carbonilo al final de la cadena
carbonosa, mientras que el grupo carbonilo de las cetosas lo tienen en el medio.
 ¿Qué es un enlace glucosídico?
Es el enlace que resulta de la formación de un acetal (o cetal) entre el carbono carbonílico
de un monosacárido y un grupo hidroxilo de otro monosacárido, con pérdida de una
molécula de agua.

.
 ¿Qué es un carbono anomérico?
Un carbono anomérico hace referencia al carbono carbonílico que se transforma en un
nuevo centro quiral tras una ciclación hemicetal o hemiacetal.

 ¿Qué es un polisacárido y mencione ejemplos de este tipo de biomolécula?

Son biomoléculas que están formadas por la unión de muchos monosacáridos, de 11 a
cientos de miles. Sus enlaces son O-glucosídicos con pérdida de una molécula de agua por
 enlace. Algunos ejemplos de este tipo de biomoléculas son: el almidón, el glucógeno, la
celulosa, la quitina, la inulina, entre otros.

PARTE II PROTEÍNAS Y ENZIMAS

1.- Proteínas y enzimas: ¿Qué tipo de proteína es la bromelina de piña?

La bromelina de piña es una proteasa o una enzima proteolítica, cumple funciones de degradación
y síntesis por lo que se consideran a estas, obligatoriamente necesarias para los organismos vivos.

¿Cuál es su composición aminoacídica?

Bromelina de tallo: VPQSIDWRDYGAVTSVKNQNPCGACW

Proteína aislada: VPQSIDWRDYGAVTSVKNQNPCGAC

y ¿Qué información se ha revelado en relación a su estructura? ¿Existe relación entre su

composición aminoacídica y su estructura (explique)? (2 ptos)

Que los grupos -SH del centro activo son necesarios para la actividad de la bromelina. La relación
existente entre la composición amino acídica y su estructura es, que si ocurre la oxidación de ese
grupo -SH que tiene la enzima para la catálisis puede ocurrir la pérdida de actividad por
autoproteólisis y en consecuencia modificar su estructura

2.- Enzimas: ¿Explique brevemente cómo afectan el pH, la temperatura y la concentración de

sustrato a la actividad enzimática? (0,5 pto)

Los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas, Sin embargo, las proteínas, a
partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. Existe una temperatura a la
cual la actividad catalítica es máxima, a esta temperatura se le conoce como temperatura óptima,
por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura
es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, por
ende, la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.

De igual forma ocurre con el pH, debido a que la conformación de las proteínas depende, en parte,
de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la
actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo y ligeros cambios del mismo pueden provocar la
desnaturalización de la proteína.

En el caso del efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática, ocurre que la
velocidad de la reacción o catálisis varía dependiendo de ella, es decir que, al aumentar la
concentración de sustrato, la actividad enzimática aumenta, esto sucede hasta alcanzar la
velocidad máxima, punto donde la enzima se satura, debido a que se ocupan todos sus sitios
activos.
3.- Enzimas: En la práctica de caracterización de bromelina de piña (anananascomosus) Por qué se
realiza la cuantificación de proteínas totales con el método de Biuret y la actividad enzimática se
hace por el método de Lowry (justifique su respuesta) (0,5 pto)

La cuantificación de proteínas se lleva a cabo a través del método de Biuret que se basa en la
formación de un complejo púrpura-violeta con sales de cobre (II) alcalinas, el color se desarrolla
mediante la conformación de un ion coordinado, tetracúprico, con dos grupos amida adyacentes
(2), y la intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces
peptídicos) por esta razón es que se utiliza para la cuantificación delas mismas.

(2)

El método de Lowry, se basa también en la formación de complejos cúpricos, sin embargo, la

coloración se ve intensificada por el reactivo de Folin-Ciocalteau (3), que además reacciona con los
restos de Tirosinil de la proteína

(3)

La actividad enzimática se determina por este método ya que se puede realizar la medición de la
velocidad de liberación de Tirosina a partir de Caseína como sustrato (4).

Caseína Bromelina Tirosina + (AA) (4)

4.- Enzimas (2ptos): Busque un artículo científico reciente (del 2014 a la actualidad) en el que se
haga la caracterización de bromelina de piña y realice un breve análisis del mismo –máximo 3
párrafos-

El artículo científico tiene como título “Stability, purification, and applications of bromelain: A
review” en dicho artículo se referencia sobre la bromelina y lo que es, siendo esta una cisteína
proteasa que se encuentra en el tejido de piña. El artículo muestra que, debido a sus actividades
antiinflamatorias y anticancerígenas, así como a su capacidad para inducir la muerte celular
apoptótica, la bromelina ha demostrado ser útil en varias áreas terapéuticas y que
indudablemente el mercado para esta proteasa está creciendo.

Esta revisión se plantea como objetivo compilar datos sobre los estudios de las propiedades de
esta proteasa realizados anteriormente y resumir los principales hallazgos sobre la bromelina en la
literatura hasta la fecha. Además, se discuten las propiedades fisicoquímicas y la estabilidad de la
bromelina en diferentes condiciones.

Se reportan varios estudios sobre la purificación de la bromelina a partir de extractos crudos

usando una amplia gama de técnicas tales como extracciones líquido-líquidas mediante un sistema
acuoso de dos fases, ultrafiltración, precipitación y cromatografía. Por último, se presentan las
diversas aplicaciones de la bromelina.

Lencastre Novaes, L. C., Jozala, A. F., Lopes, A. M., de Carvalho Santos-Ebinuma, V., Mazzola, P. G.,
& Pessoa Junior, A. (2016) “Stability, purification, and applications of bromelain: A review”.
Biotechnology Progress, 32(1), 5–13. https://doi.org/10.1002/btpr.2190

5.- Los siguientes datos corresponden a una reacción catalizada por una enzima:

a). - Determine si la enzima sigue una cinética Michaeliana

La enzima sí sigue una cinética Michaeliana puesto que al graficar V vs [S] se puede observar como
la gráfica se comporta de forma hiperbólica, como se muestra en la figura 1.

Curva de Cinética Michaeliana

10
V (mmol/ mL. min)

9
8
7
6
5
4
3
-0.2 0.3 0.8 1.3 1.8 2.3
[S] mM

Figura 1. Curva de Comportamiento Cinético Michaeliano de una enzima.

b). - De ser cierto el inciso a, determine KM y Vmax

 Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más sencillo utilizar la representación
doble recíproca 1/v frente a 1/[S] (como se muestra en la figura 2), ya que es una línea recta. Esta
representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk.

 La pendiente es KM/Vmax

Es decir 0,02= KM/Vmax entonces, KM = 0,2

 La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM

-5=-1/KM , entonces KM = 0,2 mM

 La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax

0.1=1/ Vmax entonces, Vmax=10 mmol/ mL.min

Curva para Cálculo de Km y Vmáx

0.35
y = 0.02x + 0.1
0.3
R² = 1
1/V (mL.min/mmol)

0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
-10 -5 -0.05 0 5 10 15
1/[S] (1/mM)

Figura 2. Curva para el Cálculo de Km y Vmáx.

PARTE III LÍPIDOS

1.- ¿Qué cuantifica la reacción de Liebermann- Burchard? Y ¿para qué la utilizó en la práctica de
lípidos? (1 pto)

La reacción de Liebermann-Burchard se utiliza como un ensayo colorimétrico para detectar el

colesterol, lo que da un color verde intenso, se basa en formar un compuesto coloreado por la
acción del ácido sulfúrico concentrado sobre el colesterol en medio anhidro. El medio anhidro se
consigue con ácido acético y el producto final obtenido es el colesterileno (5) de color verdoso
cuya absorbancia se compara con la de un estándar de colesterol.

Colesterol + H2SO4 → Colesterileno (5)

Ya que esta reacción cuantifica colesteroles, se utilizó en la práctica de lípidos para cuantificar el
contenido de colesteroles presentes en la yema de huevo.
2.- ¿Qué cantidad de colesterol se estima que posee el huevo? ¿la cantidad de colesterol que
obtuvo en la práctica fue significativamente diferente? Explique usando las herramientas
estadísticas necesarias (1 pto)

El porcentaje de colesterol que se obtuvo en la práctica fue 1,75±0,04% frente a un 0,41 %

reportado por Barroeta (2016) que es lo que se estima tendría un huevo, la diferencias entre estos
valores son significativamente diferentes, y esa diferencia pueden deberse a que la repartición de
esteroles entre la fase acuosa y orgánica no fue la más eficiente ya que el proceso de agitación
para repartir los compuestos entre ambas fases fue manual, además también puede ser
consecuencia que la extracción de colesterol de la yema de huevo produce un ligero aumento en
las propiedades de flujo, el cual puede estar relacionado con el aumento de concentración de
proteínas.

Barroeta, A., Garcés, C. & Gil, P. (2016) “El huevo como alimento funcional y sus componentes”
Recuperado el 05 de julio del 2018 a las 2:42 pm del:
http://albeitar.portalveterinaria.com/noticia/15065/articulos-aves/el-huevo-como-alimento-
funcional-y-sus-componentes.html

3.- ¿Qué son las lipoproteínas y qué relación tienen con el colesterol? (1 pto)

Las lipoproteínas son complejos macromoleculares compuestos por proteínas y lípidos. Son
esféricas, hidrosolubles, formadas por un núcleo de lípidos apolares (colesterol esterificado y
triglicéridos) cubiertos con una capa externa polar de 2 nm formada a su vez por apoproteínas,
fosfolípidos y colesterol libre. La relación existente entre las lipoproteínas y el colesterol, es que
las lipoproteínas son las encargadas del transporte del colesterol por todo el organismo, es decir,
facilitan la incorporación del colesterol al cuerpo.

4.- Explique los procedimientos que se realizan para purificar el colesterol del huevo y diga por qué
se hacen (2ptos)

El procedimiento consiste en agregar acetona fría, luego de haber disuelto la yema en una mezcla
de cloroformo:metanol en proporción 2:1, esto se hace con el fin de purificar el colesterol
presente en la yema de huevo, puesto que la acetona fría es capaz de precipitar los fosfolípidos,
entre ellos la lecitina.

PARTE IV ADN

1.- ¿Qué estrategias microbiológicas deben utilizarse a fin de obtener ADN de bacterias del suelo?
(1,5 pto)

Las estrategias microbiológicas que deben utilizarse, consisten básicamente una serie de pasos
que se deben seguir para la obtener ADN de las bacterias posterior al cultivo e inoculación de las
mismas, entre ellos:
  Lisis celular: Se realiza mediante el uso de detergentes y se hace con el fin de romper la
membrana lipídica.
 Purificar y Aislar: Se realiza mediante el uso de diferentes alcoholes, entre ellos
isopropanol y etanol, se añaden con el fin de separar las histonas de la cadena de ADN.

2.- ¿Qué es el efecto hipercrómico y cómo se calcula la pureza del ADN extraído usando data
reflejada por este fenómeno? (1,5 pto)

La desnaturalización de la cadena de ADN provoca un incremento de la absorción de la luz y este

efecto se le conoce como efecto hipercrómico. Este fenómeno es utilizado para calcular la pureza
de ADN. En principio la muestra de ADN tiene los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases en
la doble hélice, y limitan el comportamiento de resonancia del anillo aromático de las bases, esto
se traduce en la disminución de la absorbancia UV de cadena de ADN. Luego de la
desnaturalización por calor, las bases se encuentran en forma libre y, por ende, no se permite la
formación de enlaces de hidrógeno con las bases complementarias, lo que implica un incremento
en la absorbancia de un 40% mayor a la misma concentración, es aquí donde se hace relevante el
aprovechamiento de ese fenómeno, denominado efecto hipercrómico para el cálculo de la pureza.
La fórmula que relaciona lo antes mencionado es la siguiente:

𝐴260 − 𝐴320
𝑃𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 = (5)
𝐴280 − 𝐴320

Donde 𝐴260 corresponde a la absorbancia de las bases nitrogenadas luego de la desnaturalización,

𝐴280 a la absorbancia del esquema (hélice) de ADN y 𝐴320 a la absorbancia de proteínas con
sistemas π (turbidez)

3.- ¿Qué objeto tiene la extracción y estudio del ADN extraído de las bacterias del suelo? (2 ptos)

Obtener un perfil microbiológico del suelo ya que indirectamente las bacterias cambian las
propiedades del mismo mediante la degradación de la materia orgánica, es decir, que son
indicadores de la salud del suelo.