Actividad enzimática

Andrea Salinas

Pedagogía Educación Media en Biología y Ciencias Naturales

Laboratorio de Biología General
Mayo, 15 del 2019
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................ 1

1.1. Enzimas .................................................................................................................................... 1

1.1.1. Funcionamiento de las Enzimas: Energía de activación y temperatura. ....................................................... 1
1.1.2 Tripsina .......................................................................................................................................................... 3
1.1.3. Amilasa salival............................................................................................................................................... 3

2. OBJETIVO ...................................................................................................................................... 3

3. METODOLOGÍA ............................................................................................................................. 4

3.1. Determinación cualitativa de actividad enzimática. ................................................................. 4

4. RESULTADOS ................................................................................................................................ 5

4.1. Resultados para determinación de actividad enzimática: tubos sin presencia de enzimas. ... 5
4.1. Resultados para determinación de actividad enzimática: tubos con presencia de enzimas. .. 5

5. DISCUSIONES ................................................................................................................................ 7

5.1. Respecto de los ensayos sin presencia de enzimas en la solución. ....................................... 7

5.2. Respecto de los ensayos con presencia de enzimas en la solución. ...................................... 7

6. CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 9

7. REFERENCIAS ............................................................................................................................. 10
1. INTRODUCCIÓN

En el presente informe se presentarán los resultados para los ensayos realizados

en laboratorio, que tenían como propósito determinar la actividad y especificidad de las
enzimas. Para ello, es necesario comprender qué es una enzima, y cuáles son sus
características generales que sean de relevancia en este informe.

1.1. Enzimas

Una enzima es una proteína catalítica; es decir, una proteína que funciona como un
agente químico que acelera una reacción (Campbell y Reece, 2007), sin afectar el equilibrio
de esta. Las enzimas son necesarias en el metabolismo de cualquier organismo, ya que
hay reacciones que, a pesar de que incluso puedan ejecutarse de manera espontánea (sin
necesidad de energía externa), podrían ser tan lentas que casi no se percibirían. Esto indica
que, sin las enzimas, el tráfico de reacciones de un metabolismo podría volverse demasiado
lento, lo cual daría paso a problemas metabólicos. Usualmente las enzimas favorecen
reacciones químicas de síntesis y degradación de moléculas, desencadenando así los
procesos cruciales de cualquier organismo, como la obtención de energía, la transducción
de señales, el movimiento, entre muchísimos otros. (Campbell y Reece, 2007).

1.1.1. Funcionamiento de las Enzimas: Energía de activación y temperatura.

En los organismos, hay reacciones que pueden darse de manera espontánea, pues
las moléculas tienen el potencial de descomponerse, por ejemplo. Sin embargo, si no
hubiese una cantidad de energía mínima para que estas reacciones se desencadenaran,
muchas moléculas imprescindibles para el organismo no persistirían, descomponiéndose y
volviendo a formarse continuamente. A esta cantidad de energía mínima requerida para
empujar a los reactantes más allá de una barrera energética e iniciar o desencadenar la
reacción, se le llama Energía de activación (EA) (Campbell y Reece, 2007).
La EA es aportada usualmente en forma de calor, que las moléculas absorben de su
entorno. Recordar que,

“los enlaces de los reactivos se rompen únicamente cuando las moléculas han absorbido
suficiente energía como para volverse inestables (…). La absorción de energía térmica

1
 incrementa la velocidad de las moléculas de reactivo, de modo que colisionan con mayor
frecuencia y más fuerza. Además, la agitación térmica de los átomos en la molécula
determina que sea más probable que se rompan los enlaces.” (Campbell y Reece, 2007)

Para algunas reacciones, la EA no es tan alta, por lo que con la energía térmica del
ambiente es suficiente para desencadenar la reacción. Sin embargo, en la mayor parte de
los casos (y en muchos procesos necesarios para la vida), la EA es alta que necesita más
energía, que no es viable de aportar a través de calor, ya que, por un lado, el aumento de
temperatura desnaturalizaría las proteínas dentro de las células; y, por otro lado, el aumento
de esta energía térmica aceleraría TODAS las reacciones, no solamente aquella que se
desea. Por lo mismo, las enzimas catalizan reacciones determinadas, disminuyendo la EA
solo de la reacción necesaria dependiendo de la especificidad de la misma enzima con el
sustrato. (Campbell y Reece, 2007).
El sustrato de una enzima es el reactivo sobre el cual actúa. Cuando la enzima se
une al sustrato (o sustratos), forma un complejo llamado “enzima-sustrato”. La enzima, por
su parte, no se consume, ni tampoco cambia el equilibrio de una reacción. Además, según
Campbell y Reece (2007), la reacción catalizada por cada enzima es muy específica y esta
especificidad es consecuencia de su secuencia de aminoácidos. Mientras funciona este
complejo enzima-sustrato, la enzima va convirtiendo el sustrato en productos de la reacción.
También es importante reconocer las partes que posee una enzima. La unión donde
la molécula enzimática se une al sustrato se llama sitio activo, donde interactúan
molecularmente sustrato y enzima. Luego de interactuar y una vez que la enzima cataliza
el sustrato en producto, este sale del sitio activo, el cual queda listo para unirse con otra
molécula de sustrato en su sitio activo (Campbell y Reece, 2007).
En cuanto a los factores importantes en la acción de una enzima, existe el pH y la
temperatura, que son los que determinan las condiciones óptimas que favorecen el proceso
enzimático. En cuanto a la temperatura, al aumentar, se incrementa la reacción enzimática.
Esto porque, por la energía cinética de los átomos derivada de la energía térmica, los
sustratos colisionan mayormente con los sitios activos, debido a que las moléculas se
mueven con mayor rapidez. Sin embargo, sobre cierta temperatura, la reacción de la
enzima comienza a caer, lo cual no es otra cosa que el producto de la desnaturalización de
la estructura proteica de la enzima, que es la que determina su especificidad, su función,
su sitio activo, etcétera. Según Campbell y Reece, “La mayoría de las enzimas humanas

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tienen temperaturas óptimas entre 35° C Y 40° C, cercanas a la temperatura corporal
humana.” (Campbell y Reece, 2007).

1.1.2 Tripsina

La tripsina es una proteasa, es decir, una “enzima proteolítica, segregada por el

páncreas exocrino, que fracciona las proteínas en peptonas, péptidos y aminoácidos”
(Clínica Universidad de Navarra, Diccionario Médico). En otras palabras, es una enzima
cuya función específica es degradar las proteínas a través de la hidrólisis, rompiendo los
enlaces entre aminoácidos (peptídicos). Las proteasas abundan en las células humanas,
ya que son necesarias para realizar muchas de las funciones del organismo (National
Academies of Sciences, Engineering, and Medicine).

1.1.3. Amilasa salival

La saliva es una secreción mixta que se produce por las glándulas salivales
mayores, menores y del fluido crevicular. Además de otros compuestos, contiene enzimas,
las cuales sirven para la primera instancia de degradación de proteínas en la cavidad bucal.
Una de las enzimas principales contenidas en la saliva es la alfa-amilasa, la cual se sintetiza
principalmente en las células acinares de las glándulas salival parótida (Hernández y
Arazanzu, 2012). Respecto a su importancia y función específica de degradación,
Hernández y Aranzanzu (2012), indican que “la función predigestiva está mediada por un
número de enzimas, incluida la amilasa (…). La amilasa puede descomponer féculas y
glicógenos en componentes más pequeños, como las dextrinas y la maltosa”. Su
mecanismo sería mediante la catálisis de la ruptura de los enlaces polimerizantes (1-4),
acción determinada por la estructura de su centro activo (García et al., 2012). En otras
palabras, la amilasa es una enzima predigestiva, responsable de la degradación de
carbohidratos.

2. OBJETIVO

Comprobar la acción específica de la enzima sobre el sustrato.

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3. METODOLOGÍA

3.1. Determinación cualitativa de actividad enzimática.

I) Rotular seis tubos de ensayo, cada uno con distintas soluciones de material biológico, en
cantidades y concentraciones determinadas (Figura 1) (Tabla 1). Este material servirá para
la apreciación cualitativa de la actividad enzimática. Los tubos deben contener,
respectivamente:
1. Almidón + Lugol
2. Albúmina + Biuret
3. Saliva + Almidón + Lugol
4. Tripsina + Almidón + Lugol
5. Saliva + Albúmina + Biuret
6. Tripsina + Albúmina + Biuret

Figura 1. Tubos rotulados, cada uno conteniendo una solución de material biológico según lo
indicado (con sus coloraciones correspondientes).

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 Tabla 1. Cantidades y concentraciones de cada solución de material biológico, en cada tubo de
ensayo (del 1 al 6).
Tubos
Soluciones 1 2 3 4 5 6
a) Extracto de saliva 1 ml 1 ml
b) Tripsina 1 ml 1 ml
c) Almidón 1 % 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
d) Albúmina 1% 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
e) Lugol 3 gotas 3 gotas 3 gotas
f) Reactivo Biuret 15 gotas 15 gotas 15 gotas

II) Observar y registrar la coloración y características visibles de cada solución.

III) Incubar los tubos a 37°C por 10 minutos.
IV) Verificar la actividad en cada uno. Observar y registrar los cambios de color y otras
comparaciones con el estado inicial de cada solución.

4. RESULTADOS

4.1. Resultados para determinación de actividad enzimática: tubos sin presencia de

enzimas.

Se observó que las soluciones que no contienen las enzimas como la tripsina y la
amilasa salival (extracto de saliva), reaccionaron negativamente, es decir, no hubo ningún
cambio de coloración luego de incubarlos por 10 minutos a 37°C (ver Tabla 2).

4.1. Resultados para determinación de actividad enzimática: tubos con presencia de

enzimas.

Se observó que las soluciones en los tubos 3 y 6 que sí contienen enzimas (tripsina
y amilasa salival) reaccionaron positivamente, es decir, hubo cambios en la coloración de
la solución luego de su incubación por 10 minutos a 37°C.
Para los ensayos en los tubos 4 y 5, que sí contienen enzimas (tripsina y amilasa,
respectivamente), no se observó cambio en la coloración de la solución (ver Tabla 2).

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 Tabla 2: Resultados comparativos para cada ensayo, luego de 10 minutos incubados a 37°C.
Color inicial (y otras Color final (y otras
Tubo Reacción
observaciones) observaciones)

Tubo 1 • Marrón / Negro • Marrón / Negro

Negativa
(Almidón + Lugol) • Homogénea • Homogénea
Tubo 2 • Morado • Morado
(Albúmina + Negativa
Biuret)
• Homogénea • Homogénea
• Verde
• Café abajo,
Tubo 3 • Se observa un
(Saliva + Almidón blanquecino arriba. Positiva
precipitado en la parte
+ Lugol) • Heterogénea.
inferior (heterogénea).
Tubo 4 • Café • Café
(Tripsina + Negativa
Almidón + Lugol)
• Homogénea • Homogénea
Tubo 5 • Blanquecino, morado • Blanquecino y
(Saliva + y celeste (tres capas). morado Negativa
Albúmina +
Biuret) • Heterogénea • Heterogéneo
Tubo 6 • Lila • Amarillo
(Tripsina + Positiva
Albúmina + Biuret)
• Homogénea • Homogénea

Figura 2. Coloraciones de cada ensayo posterior a los 10 minutos de incubación a 37° C.

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5. DISCUSIONES

5.1. Respecto de los ensayos sin presencia de enzimas en la solución.

Para los ensayos que no poseen enzimas en la solución (tubos 1 y 2), la incubación
a una temperatura a 37°C no habría arrojado un cambio en la coloración, ya que tanto la
albúmina (proteína) como el almidón (carbohidrato) no han generado ninguna reacción de
degradación (razón por la cual tanto el reactivo Lugol como el reactivo Biuret siguen
marcando el compuesto de la misma manera). Puede desprenderse de lo anterior que,
incluso agregando calor y, por consiguiente, aumentado la energía del sustrato, esta
cantidad de energía no ha sido suficiente para desencadenar algún tipo de reacción en
ellos.

5.2. Respecto de los ensayos con presencia de enzimas en la solución.

Para los tubos de ensayos que sí poseían enzimas en las soluciones, en los tubos
3 y 6 se observó una reacción positiva, porque se generó una reacción de degradación
(excepto en el tubo 4, por lo explicado en la discusión anterior), la cual se puede observar
en su cambio en la coloración. En los tubos 4 y 5 no hubo reacción positiva, debido a que
la especificidad de la enzima no correspondía con el sustrato. De esta manera:

• Tubo 3 (Saliva + Almidón + Lugol)  En este caso, la saliva contiene la enzima

amilasa, la cual degrada carbohidratos. Dado lo anterior, si el sustrato contiene almidón,
evidentemente habría una reacción de degradación. Esto puede observarse en el cambio
de coloración de la solución, de café con blanco a verde, dejando una porción de precipitado
en la parte inferior del tubo. El Lugol, que marca carbohidratos a través de la introducción
de sus cadenas de poliyoduros en la estructura helicoidal del polisacárido, ya no podría
realizar esta acción, debido a que la molécula de almidón se habría degradado.

• Tubo 4 (Tripsina + Almidón + Lugol)  Según lo revisado en la bibliografía, la

tripsina es una proteasa, es decir, una enzima que degrada proteínas; el almidón es un
hidrato de carbono, por lo cual no corresponde a un sustrato que logre interacción con la
tripsina. Esto debido a que el sitio activo de la enzima, al tener especificidad con las
proteínas, no encontrará en el almidón (sustrato) una ensambladura molecular compatible
para lograr la interacción. Esta es la razón por la cual este ensayo da negativo a la tripsina.

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• Tubo 5 (Saliva + Albúmina + Biuret)  Como ya se ha mencionado, la amilasa
presente en la saliva degrada carbohidratos. La albúmina corresponde a una proteína,
razón por la cual la especificidad del sitio activo de la enzima amilasa no encontraría
acoplamiento con con el sustrato, por lo cual no existiría reacción positiva. En este caso, de
hecho, el color inicial de la solución tenía tres capas, blanquecino, morado y celeste, en una
mezcla heterogénea, donde el blanquecino correspondía a la saliva, el morado a una
fracción proteica de la solución (albúmina) reaccionando con el Biuret, y el celeste
probablemente fuese el Biuret mismo, aún sin reaccionar con la proteína. Al moverlo e
incubarlo, el Biuret termina de reaccionar con la albúmina, formando el color morado (y
desapareciendo el celeste); mientras que la saliva (y, por ende, la amilasa salival)
permanece sin reaccionar, manteniendo la heterogeneidad y el color blanquecino en la
solución.

• Tubo 6 (Tripsina + Albúmina + Biuret)  En este caso, la tripsina, que, como ya

se ha mencionado, es una proteasa (enzima que degrada proteínas), genera una reacción
de hidrólisis (degradación a través del rompimiento de los enlaces peptídicos) con la
albúmina (proteína), razón por la cual se produce el cambio de coloración desde el lila (color
de la proteína reaccionando con el Biuret) al amarillo. Nuevamente, observamos cómo la
descomposición de la molécula no permite que el Biuret siga colorando, debido a que la
estructura molecular ha cambiado (la proteína está degradada).

Para todos los casos, es importante mencionar que la temperatura a la cual fueron
incubados los tubos no fue azarosa, pues, como ya mencionó en la revisión bibliográfica,
es relevante al momento de la actividad enzimática. Esta actividad tiene condiciones
óptimas para funcionar, que pueden incluso incrementar la velocidad de una reacción. Los
tubos del ensayo se incubaron a una temperatura favorable para estas enzimas (37° C,
temperatura corporal), que era la temperatura necesaria y óptima para que las reacciones
enzimáticas se desencadenaran.

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6. CONCLUSIONES

6.1. • Para el ensayo 1, de Almidón + Lugol, la incubación a 37°C por 10 minutos generó
una reacción negativa, ya que no existe alguna enzima que desencadene algún tipo de
reacción.

6.2. • Para el ensayo 2, de Albúmina + Biuret, la incubación a 37°C por 10 minutos

generó una reacción negativa, ya que no existe alguna enzima que desencadene algún tipo
de reacción.

6.3. • Para el ensayo de Saliva + Almidón + Lugol, la incubación a 37°C por 10 minutos
generó una reacción positiva, cambiando la coloración de la solución, debido a que la saliva
posee alfa-amilasa, una enzima que degrada carbohidratos como el almidón.

6.4. • Para el ensayo de Tripsina + Almidón + Lugol, la incubación a 37°C por 10 minutos
generó una reacción negativa, ya que la tripsina es una enzima que produce degradación
de proteínas específicamente, razón por la cual su sitio activo no puede interactuar con el
almidón, al ser un carbohidrato.

6.5. • Para el ensayo de Saliva + Albúmina + Biuret, la incubación a 37°C por 10 minutos
generó una reacción negativa, ya que la saliva contiene la enzima alfa-amilasa, enzima
específica para carbohidratos, por lo cual su sitio activo no puede interactuar con la
albúmina, al ser una proteína.

6.6. • Para el ensayo de Tripsina + Albúmina + Biuret, la incubación a 37°C por 10

minutos generó una reacción positiva, cambiando la coloración de la solución, debido a que
la tripsina es una enzima específica para la degradación de las proteínas como la albúmina.

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7. REFERENCIAS

Campbell, N. y Reece J. B. (2007). Biología (7ª edición). Cap. 8: Introducción al

metabolismo. Médica Panamericana: Buenos Aires – Madrid.
Conlan, R. (2000). El desarme de una enzima mortal: las proteasas y sus inhibidores.
Beyond DiscoveryTM: The Path from Research to Human Benefit. Recuperado el 17
de mayo de 2019, de:
http://www7.nationalacademies.org/spanishbeyonddiscovery/El%20desarme%20de%
20un%20virus%20mortal_%20las%20proteasas%20y%20sus%20inhibidores.html
CUN (2019). Diccionario Médico. Recuperado el 17 de mayo de 2019, de:
https://www.cun.es/diccionario-medico/terminos/tripsina
García, B., Delfín, O., Lavandero, A., Saldaña, A. (2012). Principales proteínas salivales:
estructura, función y mecanismos de acción. Revista Habanera de Ciencias Médicas,
11(4), 450-456. Recuperado en 17 de mayo de 2019, de
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1729-
519X2012000400004&lng=es&tlng=en.

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