Prácticas Bioquímica

PRACTICA Nº 2

PROTEINAS

RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Desnaturalización de proteínas y actividad biológica
2. Identificación de la presencia de proteínas en la orina
3. Determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo
4. Electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo

INTRODUCCIÓN
La concentración de hidrogeniones en el medio en que se encuentra
disuelta una proteína, determina importantes variaciones en la carga eléctrica de
la misma. En general una proteína se carga positivamente cuando se encuentra
disuelta en un medio de pH inferior al de su punto isoeléctrico (pI), en tanto que se
carga negativamente cuando el pH del medio en que encuentra es superior al
valor de su pI. El punto isoeléctrico de las proteínas con un alto contenido en
aminoácidos básicos (histidina, lisina y arginina), es alto, como el caso del
citocromo c, que tiene un valor de pI de 10,7. Cuando una proteína tiene un alto
contenido en aminoácidos dicarboxílicos (aspártico y glutámico), tendrán un pI
bajo, como el caso de la pepsina que tiene un pI cercano a 1. En general la mayor
parte de las proteínas globulares tiene un pI que varia entre 5,0 y 9,0.

Cuando la proteína esta en un medio de pH que coincide con su valor de

pI, no solo es incapaz de migrar en un campo eléctrico sino que su solubilidad
llega al mínimo, incluso algunas llegan a precipitar.

La determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo es una

determinación de laboratorio muy utilizada en clínica. Es la cuantificación se suele
hacer por diversos métodos, sin embargo, aquellos que utilizan ciertas reacciones
de color, que dan las proteínas, son los más difundidos. Uno de ellos es el que
utiliza la reacción de Biuret.

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Desde hace mucho tiempo se conoce que al calentar la urea hasta 180°C,
se descompone para rendir amoniaco y un compuesto denominado biuret. Este
último en presencia de iones cúpricos y en medio alcalino, rinde una coloración
violeta. No solamente el biuret es capaz de dar esta reacción, otras sustancias
que tienen dos radicales CONH2 o CH2NH2, también pueden hacerlo; incluso
estos radicales están unidos mediante átomos de carbono o de nitrógeno. De la
misma manera, los péptidos con más de dos enlaces peptídicos dan positividad a
esta reacción, que es comúnmente conocida como la reacción de Biuret.

Con aplicación de la reacción de Biuret se ha estandarizado un método

para la determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo y que se
utilizará en la presente práctica. Los valores normales para este método son de 6
a 8 g%. Por debajo de 6 g% se habla de hipoproteinemia y por encima de 8g%
hablamos de hiperproteinemia.

A pesar de existir una concentración tan alta de proteínas en el suero,

normalmente no se detectan proteína en la orina, explicable por la incapacidad de
las proteínas (macromoléculas) de atravesar los poros de la membrana basal del
glomérulo renal. Por esta razón el encontrar proteínas en cantidades
demostrables en la orina de un paciente, es una situación de mucho cuidado
desde el punto de vista médico.

Las proteínas pueden ser identificadas en la orina, de manera muy sencilla,

al calentar una muestra de orina y apreciar la turbidez, lo cuál es indicativo de la
desnaturalización de las proteínas por el calor. Sin embargo debe tenerse en
cuenta que los fosfatos también pueden enturbiar la orina; la distinción puede
hacerse considerando que los fosfatos se vuelven solubles en medio ácido.

En muchos casos no resulta suficiente hacer la determinación de las

proteínas del suero sanguíneo, sino que es también necesario establecer las
concentraciones de las diferentes fracciones proteicas. En este sentido, se usa un

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procedimiento denominado electroforesis de las proteínas del suero, que nos

permite aislar las diferentes fracciones y cuantificarlas.

El procedimiento de la electroforesis está basado en el procedimiento de

las moléculas eléctricamente iónicas según el pH del medio, serán moléculas
susceptibles de ser separadas por electroforesis. La velocidad de migración de
estas macromoléculas dependerá de la intensidad de su carga eléctrica, su
tamaño y forma, la naturaleza del soporte sobre el cuál migran, la fuerza iónica
del medio, la temperatura, etc. Se entiende que este procedimiento también será
de utilidad para la separación de las proteínas de otros líquidos biológicos , como
liquido cefalorraquídeo, liquido amniótico, orina, etc.

La electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo, como comúnmente

se realiza, determina la separación de 5 fracciones proteicas, que ordenadas en
función de su velocidad de migración, son las siguientes: albúmina, alfa 1
globulina, alfa2 globulina, beta globulina y gamma globulina. La albúmina es la
más homogénea, no contiene lípidos, su peso molecular es de 69,000; su PI es
aproximadamente 4,9 y es la de mayor velocidad de migración. Tiene como
función importante su participación en el equilibrio hídrico y además el
transporte de una serie de sustancias como la bilirrubina, los ácidos grasos, etc
La albúmina también se une a drogas que son poco solubles en el agua, como
barbitúricos, digitálicos, aspirina, etc. Normalmente, el 50% del calcio plasmático
está unido a la albúmina y esto debe tomarse muy en cuenta para explicar las
manifestaciones de hipocalcemia asociadas a las situaciones en las cuales
disminuye la concentración de albúmina plasmática.

Las alfa globulinas incluye dos fracciones electroforéticas, las alfa 1 PI (5.1)
y las alfa 2 (5.5 – 5.8). Las principales alfa 1 globulinas, son la proteína C reactiva
y las lipoproteínas de alta densidad (HDL): en tanto que las alfa 2 globulinas son
la haptoglobina, ceruloplasmina y protrombina. La beta globulina (PI 5.4 – 6.3)
incluye la proteína transportadora de fierro (transferrina) y a las lipoproteínas de
baja densidad (LDL). Las gamma globulinas (PI 6.3 – 7.3), contiene las diferentes

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inmunoglobulinas, como la inmunoglobulina G (Ig G) que corresponde al 80%, la

inmunoglobulina A (Ig A) que representa un 13% y a otras inmunoglobulinas, que
se encuentran en menor concentración (Inmunoglobulinas M, D, E, etc.).

La técnica más comúnmente usada para la separación de las proteínas del

suero sanguíneo por electroforesis consiste en depositar unos microlitros de suero
en una tira de papel filtro humedecida con buffer barbital pH 8.6 . Los extremos
de la tira luego son introducidos en dos recipientes que contienen el mismo
tampón y que están en contacto con los electrodos. En vista que el PI de todas las
fracciones, es menor que el pH del tampón, se cargarán negativamente y por lo
tanto migrarán al polo positivo. Como quiera que la intensidad de carga de las
diferentes fracciones, es distinta, al igual que su tamaño, migrarán a diferente
velocidad. Esto quiere decir que una vez desconectado el aparato de la fuente
eléctrica, quedarán separadas las fracciones y será posible su identificación si las
teñimos con un colorante específico para proteínas (como el amido black). La
cuantificación de cada fracción se hará en función de la intensidad de color que
tiene cada banda y que puede hacerse por diversos métodos, como con el uso de
un aparato llamado densitómetro que nos grafica un pico para cada fracción y
cuya area es proporcional a su intensidad de color.

La tabla siguiente muestra los valores que podemos considerar como

normales tanto en valores absolutos (g%) como en valores relativos (porcentaje).

TABLA 1: VALORES NORMALES PARA LAS DIFERENTES FRACCIONES

PROTEICAS DEL SUERO SANGUINEO SEPARADAS POR
ELECTROFORESIS AL PAPEL

Albúmina Alfa 1 Alfa 2 Beta Gamma

globulina globulina globulina Globulina
PORCENTAJE 50 - 58 4-7 7 -11 11 - 15 14 – 22

gr POR 100
3,24 – 4,42 0,36 – 0,48 0,54 – 0,72 0,78 – 1,04 0,80 - 160
ml DE SUERO

En la tabla 2 se muestran las variaciones en la concentración de las

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diferentes fracciones electroforéticas de las proteínas del suero sanguíneo en

algunas enfermedades en donde este método es de gran ayuda en su
diagnóstico.

TABLA 2. VARIACION DE LAS FRACCIONES DEL ELECTROFORETOGRAMA

DE LAS PROTEINAS SÉRICAS EN ALGUNAS ENFERMEDADES.
ENFERMEDAD P.T. Albúmina Alfa-1 Alfa-2 Beta Gamma
Infecciones agudas N N A(+)
Endocarditis bacteriana N N A(++)
Plasmocitoma beta N N A(++)
Artritis reumatoide N D(+) A(+) A(++)
Hipogammaglobulinemia NöD N D(++)
Mieloma múltiple A N A(+++)
Síndrome nefrótico D(+) D(++) A(+)
Desnutrición D(+) D(+)
Cirrosis hepática D(+) D(+) A(+)

Rietmann y Daniels señalan que la electroforesis de las proteínas séricas

(“serum protein electrophoresis” SPE), junto con la determinación de las proteínas
séricas totales debe ser considerado como un procedimiento rutinario para
cualquier paciente, como ayuda en el diagnóstico y en el control de la enfermedad
que tiene.

EXPERIMENTO 1
DESNATURALIZACION DE PROTEINAS Y ACTIVIDAD BIOLOGICA

Objetivos
1. Verificar como la desnaturalización de la proteína determina la perdida de su
actividad biológica
2. Verificar la acción de varios agentes desnaturalizantes
Método
Estudio de la actividad de la catalasa de los hematíes en presencia de

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diversos agentes desnaturalizantes

Procedimiento
1. Rotular 4 tubos de ensayo del 1 al 4 y medir respectivamente, 0,1 ml de
sangre diluida (dos gotas de sangre en 100 ml de agua destilada), 0,1 ml de
sangre diluida hervida, sangre diluida en presencia de Urea 8 M y sangre
diluida en SDS al 3 % (0,1 ml)
2. Medir en cada tubo 5 ml de peróxido de hidrogeno 0,05 M y mezclar
3. Con ayuda de una varilla de vidrio depositar en el fondo de cada tubo un
circulo de papel filtro y tomar el tiempo que tarda en cada tubo para subir
hasta la superficie

Resultados

Complete la siguiente tabla

Catalasa En solución Desnaturalización En presencia En presencia
acuosa por calor de Urea 8 M de SDS
Tiempo de
flotación
Actividad
enzimática (+)

INTERROGANTES
1.- Junto al nombre de cada agente desnaturalizante describa su mecanismo de
acción

a) Urea 8 M
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

b) SDS :
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

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c) DTT :
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

2.- Escriba la reacción química catalizada por la catalasa

_______________________________________________________________

_______________________________________________________________

3.- Es la catalasa una proteína simple o conjugada?. Fundamente su respuesta

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

4.- Con qué experimento(s) podría demostrar que la desnaturalización no afecta la

estructura primaria de la proteína
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

5.- Que importancia podría tener en clínica la búsqueda de actividad catalasica en

la orina
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_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.- Una proteína desnaturalizada puede variar su movilidad electroforética ¿Por

qué?
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_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

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EXPERIMENTO 2
IDENTIFICACION DE LA PRESENCIA DE PROTEINA EN LA ORINA.

Objetivo
Aplicar un método sencillo que permita la identificación de la presencia de
proteínas en la orina

Método
Coagulación de las proteínas por el calor

Procedimiento
1.- Medir 5 ml de orina en un tubo de ensayo y calentar hasta la ebullición.
Observar lo que sucede
2.- En caso observe enturbiamiento, añada alguna gotas de solución de ácido
acético al 2%. Apreciar si la turbidez persiste o desaparece
3.- Haga el mismo procedimiento con todas las muestras de orina que le serán
proporcionadas.
Resultados
1.- Llene el espacio en blanco escribiendo + cuando hay turbidez y – cuando
no la hay o cuando desaparece la turbidez
ORINA X ORINA Y ORINA Z
Calentando la muestra
Añadiendo ácido acético

DIAGNOSTICO: Orina X ______________________________

Orina Y ______________________________
Orina Z ______________________________
INTERROGANTES
1.- Puede una proteína coagulada dar la reacción de biuret. Fundamente su
respuesta
_______________________________________________________________
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_______________________________________________________________

2.- Que puede decir de un líquido biológico que al ser calentado se pone turbio
y con el añadido de unas gotas de limón desaparece su turbidez
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_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

EXPERIMENTO 3
DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES DEL SUERO SANGUINEO

Objetivos
Mediante el uso de la reacción de Biuret y la aplicación del método de
fotocolorimetrias hacer la determinación cuantitativa de las proteínas de una
muestra biológica (suero sanguíneo).

Método
Determinación de las proteínas totales del suero por el método de biuret

Procedimiento
1. A 0,1 ml de suero sanguíneo añadir 1,9 ml de agua destilada y mezclar
2. Medir 1 ml de la solución anterior en un tubo de ensayo y añadir 4 ml del
reactivo de biuret. Mezclar
3. Dejar en reposo 30 minutos y medir la absorbancia en el fotocolorímetro
utilizando filtro verde
4. Preparar al mismo tiempo un blanco, que llevará 1 ml de agua destilada en
lugar del suero diluido
5. Durante el desarrollo de este experimento se proporcionará la lectura del
estándar, que se preparará en la misma forma que la muestra, solo que en
lugar de suero sanguíneo se usará una solución de proteínas, de
concentración 7 gr%.

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Resultados

Llenar los espacios en blanco :

Lectura bruta Lectura neta

Tubo Muestra ( M ) ___________ __________

Tubo Blanco ( B ) ___________ ___________
Tubo Estándar ( St ) __________ ___________

FACTOR DE CALIBRACION: __________________

Concentración de proteína de la muestra en el volumen del suero usado: _____en

g por 100 ml de suero

INTERROGANTES

1. Se puede hacer la determinación fotométrica de la concentración proteica, sin

utilizar una reacción de color ?. Fundamente su respuesta
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

2. Cuál es el objeto de preparar el blanco?

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

3. Porqué se utilizó el filtro verde del fotocolorímetro para medir la absorbancia de

la solución en el experimento 1?
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_______________________________________________________________
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EXPERIMENTO 4
ELECTROFORESIS DE LAS PROTEINAS DEL SUERO SANGUINEO

Objetivos
1.- Reconocer las diferentes fracciones proteicas que aparecen luego de
realizada la electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo
2.- Identificar las alteraciones cualitativas y cuantitativas en el
electroforetograma y proponer un diagnostico en los casos de alteración.

Método
Electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo en un medio de pH 8,6 y
usando como soporte papel filtro

Procedimiento
1.- En la figura adjunta se presentan seis electroforetogramas con sus
valores de proteínas totales, así como también los valores para cada fracción. El
primero (A) corresponde a una persona normal y los siguientes (B, C, D, E y F) a
pacientes.

2.- Utilizando la Tabla 2 proceda a hacer el diagnostico para cada uno de ellos

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Nombre % Prot. g% V.N.(%) Nombre % Prot. g% V.N.(%)

Albúmina 58.1 4.13 52.0 - 68.0 Albúmina 40.2 3.01 52.0 - 68.0
Alfa-1 2.9 0.15 2.0 - 4.0 Alfa-1 5.2 0.39 2.0 - 4.0
Alfa-2 9.8 0.52 7.0 - 11.2 Alfa-2 7.8 0.58 7.0 - 11.2
Beta 13.8 0.74 10.0 - 15.8 Beta 12.0 0.90 10.0 - 15.8
Gamma 15.4 0.83 11.0 - 18.0 Gamma 34.8 2.61 11.0 - 18.0
TOTAL 100 6.4 TOTAL 100 7.5

Nombre % Prot. g% V.N.(%) Nombre % Prot. g% V.N.(%)

Albúmina 26.5 0.66 52.0 - 68.0 Albúmina 50.1 2.75 52.0 - 68.0
Alfa-1 2.7 0.06 2.0 - 4.0 Alfa-1 10.2 0.56 2.0 - 4.0
Alfa-2 42.4 1.06 7.0 - 11.2 Alfa-2 11.2 0.61 7.0 - 11.2
Beta 16.1 0.40 10.0 - 15.8 Beta 14.8 0.81 10.0 - 15.8
Gamma 12.3 0.30 11.0 - 18.0 Gamma 13.7 0.75 11.0 - 18.0
TOTAL 100 2.5 TOTAL 100 5.5

Nombre % Prot. g% V.N.(%) Nombre % Prot. g% V.N.(%)

Albúmina 28.8 2.90 52.0 - 68.0 Albúmina 46.6 4.19 52.0 - 68.0
Alfa-1 2.7 0.27 2.0 - 4.0 Alfa-1 5.3 0.47 2.0 - 4.0
Alfa-2 7.3 0.73 7.0 - 11.2 Alfa-2 13.6 1.22 7.0 - 11.2
Beta 10.4 1.05 10.0 - 15.8 Beta 17.5 1.57 10.0 - 15.8
Gamma 50.8 5.13 11.0 - 18.0 Gamma 17.0 1.53 11.0 - 18.0
TOTAL 100 10.1 TOTAL 100 9.0

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Resultados
1.- Llene la Tabla con las cifras obtenidas.
PACIENTE P.T. Albúmin Alfa-1 Alfa-2 Beta Gamma
a
B Valor en %
Valor en g%
C Valor en %
Valor en g%
D Valor en %
Valor en g%
E Valor en %
Valor en g%
F Valor en %
Valor en g%

2.- El diagnostico probable es:

Paciente B _______________________________________________
Paciente C _______________________________________________
Paciente D _______________________________________________
Paciente E _______________________________________________
Paciente F _______________________________________________

INTERROGANTES
1.- Como será el electroforetograma de las proteínas del plasma sanguíneo
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
2.- Si en lugar de buffer de pH 8,6, se emplea otro de pH 3,8, que diferencias
importantes esperaría encontrar en el electroforetograma
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
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3.- Cuál sería la diferencia fundamental entre el procedimiento usado para la

separación de las proteínas séricas y para la separación de las lipoproteínas
séricas
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_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

4.- Un paciente con padecimiento renal crónico fue hospitalizado con edema
generalizado y una proteinuria de 13 g/24hrs. Si las proteínas totales del
suero fueron 4.74 g% y el porcentaje para las diferentes fracciones fue de
23.2%, 8.0 %, 31.1 %, 17.7% y 20.0 % para albúmina, alfa1, alfa2, beta y
gamma, respectivamente, estimar la concentración absoluta de cada
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

5.- Se puede hacer electroforesis de una muestra de orina, de un paciente

sospechoso de Proteinuria?. Fundamente su respuesta
_______________________________________________________________
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_______________________________________________________________

6.- Que fracciones proteicas se presentan en una electroforesis de líquido

cefalorraquídeo, cuáles serán las diferencias con el perfil del suero sanguíneo?
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_______________________________________________________________
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