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Biologia
Molecular
da Célula
1ºAno
2003/2004
FML – Biologia Molecular da Célula
Rita Luz
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FML – Biologia Molecular da Célula
1. Genes e Cromossomas
Genes:
− Nucleótidos com determinada sequência de bases no DNA
− Unidade dos cromossomas que transmite características de pais para filhos
− Unidade de diferença que torna distintos os indivíduos de uma população
− Registo histórico das alterações sofridas pelos organismos ao longo do tempo.
→ Os genes podem apresentar formas alternativas responsáveis pelos caracteres
contrastantes. As formas alternativas de um mesmo gene são chamadas genes alelos.
Genes autossómicos: são os genes que se localizam nos autossomas e o seu modo de
transmissão define a hereditariedade autossómica.
Factor dominante: é o factor que se manifesta quando os dois factores se encontram
em presença um do outro.
Factor recessivo: é o factor que não se manifesta quando em presença do dominante
correspondente.
Meiose: processo de divisão nuclear através do qual um núcleo diploide origina quatro
núcleos haplóides, isto é, há redução do número de cromossomas em cada nova
célula (passa a metade). Assim, os organismos que se reproduzem sexualmente
através da fecundação mantêm nas suas células somáticas o mesmo número de
cromossomas, de geração para geração. Durante a meiose, os cromossomas trocam
de material, levando à recombinação entre genes.
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2. Genes e Enzimas
Cada gene especifica a estrutura de uma única enzima: um gene Æ uma enzima.
4. Estrutura do DNA
Estrutura do DNA:
− São polímeros constituídos por nucleótidos
− A sua união é realizada por reacções de
condensação
− O grupo hidroxilo do C5 da desoxirribose reage com
o oxigénio do grupo fosfato (que está ligado ao C1)
resultando numa ponte fosfodiéster com libertação
de água.
− Cada novo nucleótido liga-se pelo grupo fosfato que
está ligado ao carbono 5' da base azotada, ao
carbono 3' da pentose do último nucleótido da
cadeia, repetindo-se o processo 5' → 3'.
− Segundo o modelo da dupla hélice de Watson e
Crick, cada molécula de DNA é constituída por duas
cadeias enroladas helicoidalmente à volta de um
mesmo eixo, antiparalelamente.
− A pentose e o ácido fosfórico são hidrofílicos por isso encontram-se no exterior da
estrutura do DNA. As bases azotadas são hidrofóbicas por isso encontram-se na
parte interior da estrutura do DNA.
− As bases que se emparelham são as bases complementares:
• a Adenina liga-se à Timina ( A = T) por duas ligações de hidrogénio;
• a Guanina liga-se à Citosina (G ≡ C) por três ligações de hidrogénio.
Se uma cadeia tiver mais ligações A = T torna-se mais instável.
− As duas cadeias polinucleotidícas da dupla hélice desenvolvem-se em direcções
opostas. Cada uma delas inicia-se por uma extremidade 5' e termina em 3'.
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5. Replicação do DNA
Replicação: provém do facto de as novas cadeias formadas serem uma réplica das
cadeias originais, o que leva a uma identidade entre as moléculas recém-formadas e
a molécula original.
Semiconservativa: pelo facto de permanecer, em cada uma das novas moléculas,
uma das cadeias polinucleotídicas da molécula original.
AZT
− Liga-se à extremidade 3’ da sequência de nucleótidos
− Impede a ligação do grupo fosfato do nucleótido seguinte
− É eficaz no tratamento da SIDA, pois o vírus HIV ao entrar na célula tem que se
replicar, se existir AZT na extremidade da sequência é impossível a adição de novos
nucleótidos
− Trava o crescimento do DNA, mas não para, pois existem muitas cadeias de DNA.
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3. Código Genético
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DNA Recombinante
1. Vectores de clonagem
− Moléculas de DNA que têm como função transportar o DNA de interesse para a
célula hospedeira.
− Geralmente são vectores plasmídicos que têm como base plasmídeos naturais que
são posteriormente modificados por técnicas de engenharia genética.
− Os plasmideos são pequenas moléculas de DNA circular que se replicam
independentemente (sem estarem associados ao cromossosma).
− As características mais importantes de um vector de clonagem são:
• Origem de replicação (ORI): permite que o vector e a molécula de DNA
recombinante, se mantenha na célula e seja transmitida à descendência.
• Marca de selecção: a maioria dos vectores plasmídicos possui um gene que
confere resistência a um antibiótico. Assim, apenas as bactérias que possuem o
DNA recombinante sobrevivem quando crescidas em presença desse
antibiótico.
• Local de policlonagem (MCS): pequena
Promotor
sequência de DNA (~100 pb) que contém
locais de corte únicos para várias enzimas de
Local de
restrição. É neste local que é introduzido o Origem de
policlonagem
fragmento de DNA que se pretende clonar. replicação
• Promotor: presente apenas em vectores de
Vector B
expressão e localizado a montante do local
de policlonagem. A maquinaria de
transcrição genética identifica a sequência
do promotor e transcreve a partir desse local.
Serve para quando se pretende a síntese de
proteínas. Resistência a ampicilina
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2. Enzimas de restrição
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− Por convenção, os géis de DNA são lidos da esquerda para a direita, com os poços
colocados no topo.
− A área do gel perpendicular ao poço designa-se “pista” ou lane.
− Ao olhar para uma lane analisam-se os fragmentos de DNA colocados nesse poço.
− Fragmentos de DNA com o mesmo tamanho migram a mesma distância no gel
dando origem a bandas.
− Por convenção, o tamanho de cada fragmento de DNA é expresso pelo número
de pares de bases que o constituem (bp).
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5. Sequenciação de DNA
Processo:
1. Desnatura-se o DNA a sequenciar
2. Incuba-se com um primer, na presença de DNA polimerase e dos quatro
desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dTTP, e dCTP), um dos quais é radioactivo.
3. O produto desta reacção é depois dividido por quatro tubos, a cada um dos quais
se junta um didesoxiribonucleosido-trifosfato (ddATP, ddCTP, ddTTP, e ddCTP).
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Processo:
• Desnaturação da cadeia por aquecimento
• Adição de um excesso de primers e de dNTP
• Ligação dos primers por arrefecimento
• Polimerização pela adição da DNA polimerase
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Southern Blotting
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Northen Blotting
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Imunoprecipitação
− As células são incubadas com aminoácidos radioactivos que vão marcar as suas
proteínas
− Os extractos celulares marcados são incubados com anticorpos que se ligam com
o seu antigénio-alvo
− Os complexos anticorpo-antigénio obtidos são isolados e sujeitos a electroforese
permitindo a detecção dos antigénios radioactivos por autoradiografia.
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1. Intrões e Exões
Gene: segmento de DNA que é expresso num produto funcional (RNA ou proteína)
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4. Número de Genes
Genoma bacteriano:
• Maioria do DNA codifica proteínas (90%)
• Aproximadamente 4300 genes
Genoma de leveduras
• Apenas 4% de genes possui intrões
• 70% dos genes codificam proteínas
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Cromossomas e Cromatina
1. Cromatina
Interfase:
− A maior parte da cromatina está relativamente descondensada (eucromatina) e
distribuída para fora do núcleo.
− Os genes são expressos e o DNA é replicado, em preparação para a divisão
celular.
− Os genes que são mais expressos estão num estado mais descondensado para
facilitar o acesso da maquinaria de transcrição.
− 10% da cromatina em interfase está altamente condensada (heterocromatina) e
está inactiva para transcrição e contém muitas sequências repetitivas.
Mitose: os cromossomas estão muito condensados e não podem servir de molde para
a síntese de RNA, assim a transcrição cessa durante a mitose.
2. Centrómeros
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3. Telómeros
− São sequências no final dos cromossomas eucarióticos que são importantes para a
replicação e manutenção.
− Consistem em sequencias simples de DNA repetidas, contendo resíduos G numa
cadeia.
− Estas sequências são repetidas milhares de vezes terminado com uma cadeia
simples de DNA.
− As sequências repetidas do telómero formam loops no final dos cromossomas aos
quais se juntam proteínas que protegem a terminação do cromossoma de ser
degradado.
− Os telómeros são importantes da replicação do final das moléculas de DNA linear.
DNA polimerase é capaz de estender uma cadeia de DNA em crescimento, mas
não é capaz de iniciar a síntese na terminação de uma cadeia de DNA linear.
− Assim, as extremidades dos cromossomas não podem ser replicados pela acção
normal da DNA polimerase.
− A manutenção dos telómeros parece determinar a capacidade reprodutiva das
células.
Telomerase
− Proteína capaz de produzir telómeros e dos associar à molécula que está a ser
replicada para continuar a replicação.
− É uma transcriptase reversa da classe das DNA polimerases que sintetiza DNA a
partir do RNA. Ela carrega consigo o RNA que lhe serve de molde e que é
complementar às sequências repetidas que sintetiza – os telómeros.
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Estrutura do RNA
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Transcrição em Procariotas
1. RNA polimerase
2. Promotor
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3. Transcrição
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RNA polimerases:
• São enzimas complexas (12 a 17 subunidades)
• Reconhecem promotores diferentes
• Transcrevem classes de genes distintas.
Factores de transcrição:
• Factores de transcrição gerais (envolvidos na transcrição de todos os
promotores da polimerase II)
• Factores de transcrição específicos para o gene (ligam-se a sequencias de
DNA que controlam a expressão de genes individuais)
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tRNA: o promotor não contém a sequência reconhecida por TFIIIA, logo o TFIIIC liga-se
directamente ao promotor formando o complexo com a ligação do TFIIIB e da
polimerase.
RNAs envolvidos em Splicing: o promotor contém a TATAA box (reconhecida pela TFIIIB
através da TBP) tal como um local de ligação para outro factor (SNAP). A polimerase
ligação posteriormente à TFIIIB.
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Tipos de controlo:
• Ao nível da iniciação da transcrição
• Ao nível do elongamento
• Proteínas reguladoras
• Enrolamento do DNA
• Metilação do DNA
Enhancers:
− São sequências que, embora estejam longe do local de transcrição, podem
estimulá-la.
− Funcionam, tal como os promotores, pela ligação de factores de transcrição que
regulam a RNA polimerase
− Isto é possível pela formação de um DNA looping que permite que os factores
ligados ao enhancer interajam com as proteínas associadas à RNA polimerase e
ao promotor.
− A ligação de factores aos enhancers é reponsável pelo controlo da expressão
genética durante o desenvolvimento e diferenciação, tal como durante a resposta
a hormonas e factores de crescimento.
− Os enhancers geralmente contêm inúmeros elementos sequenciais funcionais que
se ligam a diferentes proteínas reguladoras de transcrição.
− É a expressão específica de cada tecido em proteínas reguladoras que resultam
em diferentes combinados de diferentes elementos no enhancer.
1. Footprinting
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Activadores:
− Ligam-se a sequências de DNA reguladoras e estimulam a transcrição.
− Têm 2 regiões:
• Onde a proteína se liga especificamente ao DNA
• Outra que activa a transcrição interagindo com outros componentes
da maquinaria de transcrição.
4. Repressores eucariotas
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7. Metilação de DNA
Genomic imprinting
− Controla a expressão de alguns genes envolvidos no desenvolvimento embrionário
de mamíferos
− Na maior parte dos casos os 2 alelos são expressos em células diploides, no entanto
existem alguns genes “imprinted” cuja expressão depende de quem são herdados.
− A metilação é importante na distinção entre os alelos maternos ou paternos dos
genes “imprinted”.
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Eucariotas: o mRNA sintetizado no núcleo tem que ser transportado para o citoplasma
antes de ser usado como molde para síntese proteica.
Processamento do mRNA:
• Modificação das extremidades (caping e adenilação)
• Remoção de intrões (splicing)
2. Mecanismos de Splicing
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Spliceossomas:
− Complexos envolvidos no processo de splicing, compostos por proteínas e RNA’s
(snRNA’s: U1, U2, U4, U5, U6).
− Cada snRNA está complexado com 6 a 10 proteínas formando small nuclear
ribonucleoprotein particles (snRNP’s) que exercem o papel principal no processo:
• U1, U2 e U5 são moléculas isoladas
• U4 e U6 estão num complexo formando um único snRNP.
Associação do spliceossoma:
1. Ligação do snRNP U1 à extremidade 5´ do splicing site (devido à
complementaridade de bases com a extremidade 5´do snRNA U1)
2. snRNP U2 liga-se ao ponto de ramificação (também por complementaridade
de bases)
3. O complexo formado snRNP’s U4/U6 e U5 incorporam-se no spliceossoma,
ligando-se o U5 acima do ponto de ramificação.
snRNA’s:
• Reconhecem as sequências no ponto de ramificação e na extremidades
• Catalizam as reacções directamente
3. Splicing Alternativo
4. Edição de RNA
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5. Degradação de RNA
mRNA’s instáveis:
• Codificam proteínas reguladoras
• Contêm muitas sequências ricas em AU perto da extremidade 3’.
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7. Síntese Proteica
Tradução de mRNA
Intervenientes:
• mRNA: contém a informação genética para a síntese de proteínas
• Aminoácidos: moléculas básicas para a construção das proteínas.
• tRNA: selecciona e transporta o aminoácido apropriado e reconhece o codão
correspondente do ARNm. Funcionam como intérpretes entre a linguagem do
ARNm e a linguagem das proteínas.
• Ribossomas: sistemas de leitura. Promovem a ligação entre aminoácidos. Na sua
constituição entra o RNA ribossómico (rRNA) e proteínas.
• Enzimas: catalisam as reacções que ocorrem em todo o processo
• ATP: Transfere energia para o sistema.
2. Ribossoma
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4. Processo de Tradução
1. Iniciação:
• Verifica-se a ligação do mRNA e de um tRNA iniciador, que transporta
usualmente o aminoácido metionina à subunidade menor de um ribossoma.
• A subunidade maior do ribossoma liga-se ao conjunto.
• O ribossoma está então funcional.
• É necessário proteínas não ribossomais especificas – factores eucarióticas de
transcrição – que reconhecem a extremidade 5’ e 3’ do mRNA, sendo
responsáveis pela estimulação da poliadenilação durante a tradução.
2. Alongamento:
• É a fase de tradução dos codões sucessivos do mRNA e da ligação dos
aminoácidos.
• Os locais do ribossoma a que se liga o tRNA designam-se sítios P, A e E.
• O tRNA iniciador liga-se ao sítio P
• O próximo tRNA liga-se ao sitio A, pelo emparelhamento com o segundo
codão.
• Há a formação de uma primeira ligação peptídica entre o aminoácido que ele
transporta e a metionina.
• Durante este processo o ribossoma move 3 nucleótidos ao longo do mRNA,
posicionando o codão seguinte no sitio A vazio.
• O alongamento do péptido continua até que um codão STOP seja translocado
no sitio A do ribossoma.
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3. Finalização:
• Os codões de finalização não têm nenhum anticodão complementar, mas
existem factores de libertação que reconhecem os sinais e terminam a síntese
proteica.
• Estes factores ligam-se a um codão STOP no sitio A e estimulam a hidrólise do
polipéptido completo do ribossoma.
• O tRNA é libertado, as subunidades do ribossoma e o mRNA dissociam-se
5. Regulação da Tradução
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8. Núcleo
− A presença de núcleo é a principal diferença entre células eucariotas
eprocariotas.
− O núcleo serve como reservatório para a informação genética e como centro de
controlo da célula
Invólucro nuclear:
− Separa o conteúdo nuclear do citoplasma
− É consitituido por 2 membranas
− Impede a passagem livre de moléculas entre o núcleo e o citoplasma
− Mantém o núcleo como um compartimento bioquímico distinto
− É interrompido por poros que permitem a passagem de moléculas
− Permite um tráfico selectivo de proteínas e RNA’s.
2 membranas nucleares:
− São uma expansão do retículo endoplasmático
− A externa está directamente em contacto com o RE
− O espaço intermembranar contacta com o lúmen do RE
− A membrana externa tem ribossomas ligados à superfície citoplasmática
− São constituídas por uma bicamada fosfolipidica apenas permeável a moléculas
apolares (pequenas)
Lâmina nuclear
− Localiza-se na membrana interna
− Fornece suporte estrutural ao núcleo
− É consitituido por proteínas – as lâminas
− As proteínas filamentosas relacionam-se entre si formando filamentos
− Esta associação começa com a formação de dimeros, nos quais as regiões em α-
hélice enrolam-se entre si.
− Depois estes dimeros associam-se uns aos outros.
− Existem lâminas que servem como pontos onde a cromatina se vai juntar
− A organização normal da lâmina nuclear é essencial para a replicação do DNA e
na regulação da transcrição.
Poros:
− São canais que permitem a passagem de pequenas moléculas polares, iões e
macromoléculas (proteínas e RNA’s)
− Desempenha um papel fundamental na célula eucariótica visto que controlam a
passagem de substâncias entre o citoplasma e o núcleo
− São estruturas selectivas e complexas
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Moléculas pequenas:
− Passam livremente pelo poro nos 2 sentidos (núcleo Æ citoplasma; citoplasma Æ
núcleo)
− Passam por difusão passiva
Î Existem proteínas que entram e saem do núcleo: transportadores (p. ex. de RNA) ou
coordenadores de funções nucleares e citoplasmáticas.
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4. Transporte de RNA’s
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Nucléolo
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− Cada proteína pode ter diferentes destinos, consoante o seu tipo e função.
− Os destinos possíveis são:
• Núcleo
• Retículo endoplasmático
• Aparelho de Golgi
• Membrana Plasmática
• Lisossomas
• Secreção
• Citoplasma
• Peroxissomas
• Mitocondrias
Retículo Endoplasmático
Via de secreção:
RE rugoso Æ A. Golgi Æ Vesículas de Secreção Æ Lisossomas
Æ Membrana celular
Æ Exterior da célula
Translocação co-translacional
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Translocação pos-translacional
− A parte que está virada para o lúmen fica virada para o lado extracelular (no caso
de proteínas da membrana plasmática), pois a composição do lúmen do RE é
semelhante à do espaço extracelular.
− A porção que contacta com o citosol, permanece sempre em contacto com o
citosol.
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Chaperona Hsp70 (Bip): liga-se à cadeia polipeptidica durante a sua passagem para o
RE e medeia a moldagem e formação de subunidades nas proteínas.
Glicosilação:
− Ocorre nos resíduos de asparagina (N-glicolisação)
− Os oligossacarídeos (14 açucares) são sintetizados num lipido (dolicol) ligado à
membrana do RE.
− A enzima, oligossacarideo transferase, transfere o bloco para os resíduos de
asparagina
− 4 açucares (3 glicose e 1 manose) são removidos
− Processam-se várias alterações antes da proteína passar para o A. Golgi.
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− Muitas proteínas são degradadas assim que são produzidas, devido à sua
incorrecta formação
− Um papel do RE é marcar essas proteínas e dirigi-las para a via de degradação –
controlo de qualidade.
− Se ocorrerem mutações ao nível dos sinais que identificam as proteínas que ficam
no RE, vão ocorrer alterações no seu destino. Estas vão passar para o A. Golgi e
vão ser secretadas para fora da célula.
− A introdução do sinal KDEL vai fazer com que as proteínas que normalmente iriam
para o Golgi permaneçam no RE.
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Aparelho de Golgi
1. Organização do Golgi
− Estes resíduos de manose 6-P são depois reconhecidos por receptores ao nível da
membrana do trans Golgi que direcciona o transporte destas proteínas para os
lisossomas.
− O passo crítico deste processo envolve o reconhecimento da forma da proteína
lisossomas pela enzima que adiciona a N-acetilglucosamina fosfato.
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Lisossomas
pH
− O pH óptimo de actuação das hidrolases é ácido (5) ao contrário do pH do
citoplasma (7)
− O pH ácido fornece uma dupla protecção para a degradação incontrolada:
1. Inactiva as hidrolases fora dos lisossomas de modo a não destruírem tudo
2. Transporta protões (H+) para dentro da célula de modo a manter o pH ácido,
acompanhado pela hidrólise de ATP.
3. Fagocitose e Autofagia
Fagocitose
− Os macrofagos “apanham” e degrada partículas grandes (bactérias, células
velhas)
− As partículas são transportadas em vesículas facociticas (fagossoma) que se
fundem com os lisossomas
− Os lisossomas resultantes – fagolisossoma – podem ser grandes e ter diferentes
formas
Autofagia
− O organito envolvido por uma membrana formando uma vesícula –
autofagossoma
− A membrana de vesícula interage com a membrana do lisossoma, sendo o
organito posteriormente destruído.
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Mitocôndria
A matriz contém:
• DNA mitocondrial
• Enzimas do metabolismo oxidativo (ciclo de Krebs, via de degradação de
ácidos gordos e glicose)
Membrana interna:
Membrana externa
Espaço intermembranar
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Peroxissomas
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Endocitose
1. Facocitose
Hipercolesterolémia familiar:
• Elevada concentração de colesterol no sangue
• Não há internalização das LDL
• Mutações possíves:
9 Na zona do receptor que se liga às apoproteinas
9 Na zona do receptor que interage com a clatrina, impedindo a
internalização
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Nos neurónios:
− Os neurotransmissores a mais são endocitados
− Ficam no endossoma até que são exocitados aquando o disparar do potencial de
acção
Transcitose:
− Ocorre em células polarizadas (células epiteliais)
− Permite que os receptores internalizados sejam transferidos para o domínio oposto
da membrana plasmática.
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