Preparación de un Frotis Bacteriano

Camacho, Alejandro1., Castañeda, Jenifer2., Pérez, Dayana3., Salamanca, Laura4

Unisangil, Facultad de Ciencias Naturales e Ingeniería
Ingeniería Ambiental
Yopal, Colombia

alejandrocamacho@unisangil.edu.co
kareidy.1995@gmail.com
dalhay9603@hotmail.com
laurasalamanca@unisangil.edu.co

1
Ingeniería Ambiental; Alejandro Camacho
2
Ingeniería Ambiental; Jennifer Castañeda
3
Ingeniería Ambiental; Dayana Pérez
4
Ingeniería Ambiental; Laura Salamanca
Resumen — En esta práctica de laboratorio, se
aprendió a realizar un montaje de frotis bacteriano
utilizando bacterias de yogur, bacterias de vinagre y
bacterias de sarro dental para ser observadas por
medio del microscopio con objetivo de 10x, 40x y
100x, aplicando paso a paso dado por la guía de
laboratorio.
Palabras clave— Bacteria, Yogur, Vinagre, Sarro
Dental, Frotis.
Abstract- In this lab, he learned to assembling the
bacterial smear using bacteria yogurt bacteria vinegar
and bacteria from dental plaque to be observed
through the microscope objective 10x, 40x and 100x
applying step given by laboratory guide.
Keywords - Bacterium, Yogurt, Vinegar,
Dental Sarro, Smear
. -Coloraciones especiales
I. INTRODUCCIÓN
Para realizar el estudio microbiológico, ya sea
humana o animal, vegetal, industrial o del medio
ambiente, se debe someter a una serie de procesos
estandarizados de laboratorio, que permitan
reconocer los microorganismos. Las coloraciones
permiten diferenciar formas, agrupaciones,
características tintoriales y estructuras de los
diferentes microorganismos en las muestras.
COLORACIONES
Los colorantes biológicos tienen varias aplicaciones
en microbiología, se usan para clasificar las bacterias
en Gram positivas y Gram negativas, también para
observar las diferentes estructuras microbianas como
pared, capsula, espora, flagelo, núcleo y gránulos,
tienen utilidad para la observación de levaduras y
estructuras, en medios de cultivo se emplean como
indicadores o inhibidores selectivos.
La morfología bacteriana se puede observar
claramente por medio de coloración de las células.
En las técnicas de coloración, las bacterias están
muertas por el hecho de fijar con calor la muestra a
la lámina y por el mismo proceso de coloración.
Al aplicar un colorante a la preparación microbiana,
las bacterias se tiñen haciéndolas resaltar con
claridad, debido a la composición química tan
diferente con respecto al medio que las rodea,
además permite estudiar las características
morfológicas y emplear mayores amplificaciones
microscópicas.
Al poner en contacto una célula bacteriana con un
colorante, ocurre un intercambio de iones entre el
colorante y los sitios activos de la superficie o del
interior de la célula. Los iones tenidos del colorante
reemplazan a los iones de los componentes celulares,
por ejemplo, el catión azul de metileno, reemplaza el
catión de sodio, dándoles el color.
Según la estructura que el colorante tiñe en la
bacteria, las coloraciones se han clasificado en:
-Coloraciones simples
En las que se emplea un solo colorante para el
proceso, por ejemplo: azul de metileno, cristal
violeta, fucsina básica y safranina.
-Coloraciones compuestas y diferenciales
En estas se usa más de un colorante, y con la misma
coloración las células se tiñen de manera diferente.
Ejemplo: Tinción de Gram, ZiehlNeelsen.
Permiten la observación de estructuras especiales de
la bacteria como esporas, glicocálix, cápsulas,
flagelos, etc. Ejemplo: Wayson (esporo), Leifson
(flagelo), rojo congo (coloración ácida) (glicocalix,
cápsula), Van Stoltemberg (gránulos
metacromáticos).
ASAS DE SIEMBRA
-Coloración de Gram
La coloración de Gram fue descrita en 1884, por el
citólogo Christian Gram, para teñir bacterias
presentes en los tejidos. Actualmente continúa siendo
la más empleada en microbiología, está clasificada
como una coloración compuesta y diferencial, debido
a que en el proceso se utilizan dos colorantes: el
cristal violeta y la fuscina básica, y dependiendo del
colorante que toma la pared bacteriana y dos grandes
categorías denominadas: Gram positivas (se tiñen de
cristal violeta) y las Gram negativas (toman el color
de la fuscina básica.
I. EQUIPO A UTILIZAR EN LA PRACTICA
MECHERO DE ALCOHOL
Figura 1. Microscopio óptico compuesto
 YOGURT
VINAGRE
PALILLOS
II. MATERIALES A UTILIZAR EN LA CRISTAL VIOLETA
PRÁCTICA LUGOL
ALCOHOL- ACETONA
CANTIDAD DESCRIPCION
SAFRANINA
1 PORTAOBJETOS
METANOL
1 CUBREOBJETOS
1 ASAS DE SIEMBRA
1 CUBETA DE TINCION
1 PINZA
1 FRASCO LAVADOR
1 MECHERO DE ALCOHOL
1 PAPEL DE FILTRO

PORTAOBJETOS
CUBREOBJETOS

CUBETA DE TINCION

IV. PROCEDIMIENTO

ELABORACION DEL FROTIS

Si el frotis se va a realizar a partir de una muestra

sólida, se debe poner sobre una lámina limpia y
desengrasada una pequeña gota de agua con el asa
PINZA recta esterilizada, y con la punta del asa recta se toma
ya sea una colonia bacteriana empleadas en este
FRASCO LAVADOR
laboratorio, se emulsiona con la gota de agua y luego
se extiende sobre la lámina en un área no mayor de
0.5 cm de diámetro, de manera que sobre una misma
lámina se pueden realizar hasta 3 frotis diferentes.
El frotis se deja secar a temperatura ambiente y
nunca con calor, debido a que se facilita la formación
de abundantes aerosoles, precipitados de colorantes y
alteraciones de la forma de los microorganismos.
Si la muestra es líquida se emplea el asa con argolla
PAPEL FILTRO
y no se requiere emulsionar la muestra con agua, sino
que directamente se extiende en un área de 0.5 cm, se
deja secar a temperatura ambiente.

FIJACION

En el proceso de fijación del frotis consiste en pasar

la lámina por el lado contrario de donde se hizo el
frotis sobre la llama del mechero tres veces
consecutivas, evitando que se caliente la lámina para
III. REACTIVOS A UTILIZAR EN LA que no se dañen las estructuras celulares, esto se hace
PRACTICA debido a que tiene como fundamento matar y fijar a
la lámina los microorganismos presentes en el frotis.
CANTIDAD DESCRIPCION
Bacterias del Yogurt.

 Colocar una pequeña gota de agua en el centro
de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy
poca cantidad de agua, por lo que se puede usar
el asa de siembra.
 Tomar una muestra (gota) de yogur y expandirla
en el porta, mezclarla bien con el agua.
 Dejar secar y fijar con metanol.
 Teñir 2 o 3 minutos, lavar el exceso de colorante
y dejar secar.
 Esperar hasta que el líquido se evapore o
acelerar su evaporación acercando el
portaobjetos a la llama del mechero. En este
caso hay que tener mucha precaución de no
calentar demasiado el portaobjetos pues las
células pueden deformarse o romperse.
 Observar en microscopio con los objetivos de
10x, 40x y 100 x.
 Para el objetivo de 100x aplicar aceite de
inmersión, colocar cubre objetos y observar.
Bacterias Del Vinagre
 Colocar una pequeña gota de agua en el centro
de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy
poca cantidad de agua, por lo que se puede usar
el asa de siembra.
 Tomar una muestra (gota) de vinagre y
expandirla en el porta.
 Dejar secar y fijar al calor
 Teñir 2 o 3 minutos, lavar el exceso de colorante
y dejar secar.
 Esperar hasta que el líquido se evapore o
acelerar su evaporación acercando el porta a la
llama del mechero. En este caso hay que tener
mucha precaución de no calentar demasiado el
porta pues las células pueden deformarse o
romperse.
 Observar en microscopio con los objetivos de
10x, 40x y 100 x.
 Para el objetivo de 100x aplicar aceite de
inmersión, colocar cubre objetos y observar.
Bacterias Del Sarro Dental
 Colocar una pequeña gota de agua en el centro
de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy
poca cantidad de agua, por lo que se puede usar
el asa de siembra.
 Tomar con una aguja enmangada una porción
del sarro dental y expandirla en el porta.
 Dejar secar y fijar al calor
 Teñir 2 o 3 minutos, lavar el exceso de colorante
y dejar secar.
 Esperar hasta que el líquido se evapore o
acelerar su evaporación acercando el porta a la
llama del mechero. En este caso hay que tener
mucha precaución de no calentar demasiado el
porta pues las células pueden deformarse o
romperse.
 Observar en microscopio con los objetivos de
10x, 40x y 100 x.
 Para el objetivo de 100x aplicar aceite de
inmersión, colocar cubre objetos y observar.
FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS AL
PORTAOBJETOS
- Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos
por la llama durante unos segundos. Dejar
enfriar el portaobjetos entre los pases.
- Con metanol (para bacterias procedentes de
medio líquido). Añadir unas gotas de
metanol sobre la extensión completamente
seca. Golpear el portaobjetos por su canto
con cuidado contra la mesa de trabajo para
retirar de inmediato el exceso de metanol.
Esperar a que el metanol se evapore
completamente.
Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las
preparaciones pueden ser observadas al microscopio,
aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar
con el proceso de tinción.
RESUMEN
1. Preparar los frotis bacterianos.
2. Teñir con cristal violeta 1min.
3. Lavar con abundante agua el exceso de
colorante.
 4. Cubrir con Lugol 1min. 2. Realizar una revisión de las
aplicaciones de células bacterianas
5. Lavar con agua el exceso de Lugol. más importantes a nivel ambiental e
industrial.
3. Busque en esquemas (dibujos) las
6. Decolorar con alcohol-acetona o formas y agrupaciones bacterianas y
simplemente con alcohol hasta que la dibújelas
preparación deje de perder color (30seg) 4. De 3 razones por las que a una muestra
se le debe realizar la coloración de
7. Lavar con abundante agua para eliminar el Gram
resto de disolvente. 5. De acuerdo a la localización y tamaño
de las esporas como se clasifican.
8. Teñir con safranina 1min. 6. Mencione 5 bacterias Gram positivas y
5 Gram negativas.
9. Lavar con agua para eliminar el colorante
de contraste.
VI. DESARROLLO PROCEDIMIENTO
10. Secar la preparación.

11. Examinar al microscopio fijándose sobre VII. DESARROLLO DE LAS PREGUNTAS

todo en el color de cada preparación.

Los tiempos de exposición a los colorantes son

orientativos. Cada vez que se prepara la batería de
colorantes para realizar la tinción Gram presentan VIII. Referencias bibliográficas
algunas diferencias respecto a los preparados en otro
momento, por lo que puede ser necesario ajustar los
tiempos.

V. PREGUNTAS IX. CONCLUSIONES

1. Describa las características más

importantes de las bacterias, realizar
esquemas de las formas que presentan
y los tipos de agrupaciones que
presentan.

Muestra del yogurt 100x en el microscopio

VII. DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO
Se coloca una pequeña gota de agua en el
portaobjetos se esparce bien para después aplicar la
Bacterias del yogurt gota de yogurt se deja secar y se le aplica el aceite
Después de haber preparado el frotis de inmersión y se cubre con un cubre objetos. En
y estando completamente seco se coloca este se observa un color violeta y algunos puntos de
en el microscopio para ser observado un color brillante o claro.
Por los diferentes lentes.
Muestra del yogurt 10x en el microscopio

Se coloca una pequeña gota de agua en el

Portaobjetos se esparce bien para después aplicar
La gota de yogurt y se deja secar y fijar con el metanol.
En el cual podemos observar muchos puntos de un color
Brillante.

Muestras del vinagre 10x en el microscopio

Muestra del yogur 40x en el microscopio
Se coloca una pequeña gota de agua en el portaobjetos
Se esparce bien con el asa para después aplicar
La gota de yogurt la cual esta vez la observaremos con
El lente de 40 x en este ya se ve mas detalladamente los
Pequeños puntos que no son puntos si no cada uno de ellos
Tienen diferentes formas están agrupados o juntos
en pequeños grupos y hay unos pocos de color naranja
Muestra del sarro dental 10x en el microscopio
Se coloca una pequeña gota de agua en el
portaobjetos se esparce con el asa y despues se le
aplica la gota del vinagre se deja secar y se retira
con un poco de agua el exceso de colorante para
asi ponerla en el microscopio y ser observada con
el lente 10x, se observan algunas particulas negras
y unos pocos filamentos entre cruzados.

Se coloca una pequeña gota de agua en el

portaobjetos con una aguja enmangada tomar la
porción del sarro y expandirla en el portaobjetos
dejar secar y retirar el exceso de colorante y se
observa con el lente de 10x y podemos observar
filamentos de color negro y pequeñas manchas
naranjas.

Muestra del sarro dental 40x en el microscopio

Se coloca una pequeña gota de agua en el

Muetra del vinagre 40x en el microscopio
Se coloca una pequeña gota de agua en el portaobjetos
se
esparce con el asa y despues se le aplica la gota del
vinagre se deja secar y se retira con un poco de
agua el exceso de colorante para asi ponerla
en el microscopio y ser observada con el lente 40x
se observan mas cerca los filamentos y se ve mas
detalladamente su forma.
portaobjetos con una aguja enmangada tomar la
porción del sarro y expandirla en el portaobjetos
dejar secar y retirar el exceso de colorante y se
observa con el lente de 40x se observan manchas
grandes de color violeta donde se alcanzan a
detallar algunos filamentos muy unidos y otras
manchas de color naranja.

Muestra del vinagre 100x en el microscopio
Se coloca una pequeña gota de agua en el portaobjetos
Se esparce con el asa y después se aplica la gota del vinagreasí, de acuerdo a la teoría endosimbiótica, los cloroplastos y las
Se deja secar y se le aplica el aceite de inmersión para
Ser observado con el lente de 100x en el cual se ven muchos primitivas
Filamentos entrecruzados en diferentes grupos
VII DESARROLLO DE LAS PREGUNTAS
1. Realizar una revisión de las aplicaciones de células
bacterianas más importantes a nivel ambiental e
industrial.
Las bacterias y el medio ambiente
Las bacterias desempeñan un papel importante en el reciclado de
muchos elementos y compuestos químicos en la naturaleza,
muchos de ellos con una elevada toxicidad. En ausencia de
dichas actividades bacterianas, la vida en la Tierra no sería
posible. Las basuras y los desperdicios nos inundarían si las
bacterias no acelerasen la descomposición de
las plantas y animales muertos. Como resultado de su actividad,
los restos de sustancias orgánicas de las plantas y los animales se
descomponen en partículas inorgánicas. Este mecanismo es una
fuente importante de alimento para las plantas. Además, las
leguminosas enriquecen el suelo al incrementar el contenido de
nitrógeno gracias a la ayuda de la especie Rhizobium
radicicola bacteria que infecta las raíces de las plantas y origina
nódulos de fijación de nitrógeno. El proceso fotosintético en que
se basan las plantas fue desarrollado, originalmente, en bacterias,
mitocondrias de las células eucarióticas derivaron de bacterias
que parasitaron
Muestra del sarroadental
otras procariotas.
100x en el microscopio
Se coloca una pequeña gota de agua en el
Fijaciónportaobjetos
de nitrógeno con una aguja enmangada tomar la
Las bacterias
porción desempeñan
del sarro y una funciónen
expandirla muy importante en la
el portaobjetos
fertilidad del secar
dejar suelo.yEstos microorganismos
aplicar convierten
el aceite de inmersión parael
nitrógeno atmosférico
verla en de
con el lente amoníaco,
100x en un compuesto
este se observanitrogenado
los
que las plantas necesitan
filamentos para crecer;
detalladamente sonpoco
y un los únicos organismos
más grandes y
capacesse deobservan
realizar este proceso bioquímico
las manchas naranjas. que recibe el nombre
de fijación de nitrógeno. Las bacterias capaces de fijar el
nitrógeno atmosférico suelen vivir en asociación con las plantas.
Por ejemplo, las bacterias del género Rhizobium, forman nódulos
en las raíces de las judías y otras plantas de la familia de las
leguminosas
Quimiosíntesis
Las bacterias desempeñan una función fundamental en los ciclos
de otros elementos en el medio ambiente. Muchas bacterias
obtienen su energía mediante la oxidación de sustancias
orgánicas o inorgánicas; en general se les clasifica como
quimiótrofas: quimiolitótrofas si el compuesto oxidado es
inorgánico y quimiorganótrofas cuando oxidan sustancias
orgánicas. Las bacterias quimiolitótrofas emplean la
energía químicapresente en los compuestos inorgánicos, en lugar
de la energía de la luz utilizada por las plantas, para transformar
el CO2 en diferentes moléculas orgánicas de las que otros
organismos pueden nutrirse. La quimiosíntesis ocurre en las
grietas hidrotermales del fondo de los océanos, donde no se
dispone de luz para llevar a cabo la fotosíntesis pero hay grandes
cantidades de H2S.
Las bacterias en la industria alimentaria
El papel de las bacterias en la industria alimentaria es muy
diverso, según la óptica con la que se analice su impacto.
Algunas resultan muy nocivas al afectar la calidad de
los alimentos: los deterioran, afectando sus cualidades
organolépticas. Existen múltiples especies bacterianas asociadas
al deterioro de la carne, el vino, las verduras, la leche y otros
productos de consumo diario. Otras, aparentemente no alteran las
cualidades de los alimentos pero se multiplican en estos, o
excretan sus toxinas y resultan responsables de las
denominadas enfermedades transmitidas por alimentos.
 2. Describa las características más importantes
de las bacterias, realizar esquemas de las
formas que presentan y los tipos de
agrupaciones que presentan
.
Rta: son seres unicelulares procariotas, estan
formados por una sola celula,la cual carece de
nucleo y mantine su AND libre en el citoplasma.

 Otras tienen un nucleo bien definido, el cual

alberga el AND
 Segun su forma:

 Segun su alimento

 Las que requieren de oxigeno para vivir

aerobicas
 Las que no requieren de oxigeno para vivir
anaerobicas
Por otra parte, las bacterias potencian las
propiedades nutritivas y el sabor de los 5. De acuerdo a la localización y tamaño de las
alimentos y resultan de gran importancia en esporas como se clasifican.
muchas industrias. La capacidad fermentadora
de ciertas especies es aprovechada en  Zoosporas: puede moverse por medio de uno
la producción de queso, yogur, adobos y o mas flagelos y se pueden encontrar en
salazones. También resultan importantes en el algunas algas y hongos.
curtido de cueros, la producción de tabaco, la  Aplanoespora: no puede moverse sino que
conservación del grano, los tejidos, los crece sobre sus flagelos
fármacos, y en la elaboración de varios tipos de  Autoespora: no puede moverse y no tiene el
enzimas, polisacáridos y detergents. potencias de desarrollar ningun flagelo
 Ballestoespora: se descarga activamente del
Otras aplicaciones en la industria cuerpo de una fruta fungicida tal como la
Las bacterias también participan en la seta.
elaboración de otros productos, como
ciertos plásticos y enzimas utilizados en los 6. Mencione 5 bacterias Gram positivas y 5 Gram
detergentes, y en la producción de muchos negativas.
antibióticos, como la estreptomicina y la
tetraciclina. A partir de la década de 1980 las  Gram positivas:
bacterias adquirieron importancia en la  Staptylococous aureus
producción de muchas sustancias químicas,  Streptococcus pyogens (grupo A)
como el etanol. La obtención de productos  Streptococcus agalactiae (grupo B)
químicos mediante bacterias y otros  Streptococcus faecalis ( grupo D)
microorganismos es menos contaminante para el  Streptococcus pneumoniae
medio ambiente que la producción química ( neumococo)
convencional. El desarrollo de
la ingeniería genética ha allanado el camino para  Gram negativas:
un uso más frecuente de las bacterias en la  Neisseria meningitides
fabricación industrial a gran escala y en procesos ( meningococo)
menos agresivos al medio ambiente  Neisseria gonorrhoese (gonococo)
 Escherihia coli
3. Busque en esquemas (dibujos) las formas y  Salmonella typhi
agrupaciones bacterianas y dibujelas
 Salmonella enteritds

IX. Referencias bibliográficas

 http://datateca.unad.edu.co/contenidos/2015
04/micro/bact_clasif.htm.
 http://www.academia.edu/7437592/Preparac
i%C3%B3n_de_un_frotis_bacteriano
 http://www.monografias.com/trabajos81/bac
terias-su-impacto-medios-naturales-y-
industrias/bacterias-su-impacto-medios-
naturales-y-industrias2.shtml

X. CONCLUSIONES
 Se pudo analizar la morfología y las
diferentes formas que tiene las bacterias, la
mayoría fueron diplococos, que son la unión
4. De 3 razones por las que a una muestra se le de dos cocos formando una pareja,
debe realizar la coloración de Gram. estreptococos por la fila de cocos que se
observó como el Streptococcus salivarius
1- Se puede clasificar las bacterias ssp. Thermophilus gracias a la tinción de
2- Se puede diagnosticar presuntivos de color morado claro se llega a la conclusión
agentes infecciosos de que esta es una Gram positiva y Bacilos
3- Se puede valorar la calidad de la como el Lactobacillus, igualmente se
muestra clinica identificó que es Gram positiva que ayudan
en la fermentación del yogurt a través de
procesos de oxidación que generan está.
La mayoría de los enterococos,
estreptococos y demás grupos o genero
microbianos son algunos patógenos y
no patógenos, de estos se pueden preparar
fermentaciones, que mediante un largo
proceso, llegan a ser elaboradas en
productos comestibles, garantizando la
mayor seguridad al consumir ese producto
fermentado.

 Se analizó que fijar el frotis por calor o

por agentes químicos (metanol) se
evita la deformación de las células con
el colorante, para posicionar las
estructuras internas y externas de la
célula, además se mata al
microorganismo. Preserva la
morfología general pero no las
estructuras internas.