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UNIVERSIDAD TÉCNICA FEDERICO SANTA MARÍA

SEDE VIÑA DEL MAR – JOSÉ MIGUEL CARRERA

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN MUESTRAS


DE SUSHI DE VENTA AMBULANTE EN LA
CIUDAD DE VIÑA DEL MAR

Trabajo de titulación para optar al Título de


TÉCNICO UNIVERSITARIO EN
CONTROL DE ALIMENTOS.

Alumnos:
Karina Madalice Prado Gallardo.
Gisella Araceli Rojas Cortes.

Profesor Guía
Dr. Bernardo Prado Alderete

2019
AGRADECIMIENTOS

Agradecer a todas las personas que hicieron posible esta investigación, a todos los
profesores, por la orientación y conocimientos aportados a lo largo de mi carrera universitaria,
que fue sin duda una de las etapas de mayor aprendizaje y crecimiento. A mi compañera de
tesis Gisella Rojas por su apoyo durante estos años de estudio y por su confianza y dedicación
para poder cumplir con los objetivos propuestos.
Finalmente, a mi hermana y a mis padres, mi mayor inspiración, gracias por todo el
amor, comprensión y apoyo incondicional, esto es por y para ustedes.

Karina Madalice Prado Gallardo


Quiero agradecer a cada persona que me ha enseñado un poco de su sabiduría a lo
largo de mi vida, a mi familia, profesores, amigos y al prójimo. A Benjamín que me ha apoyado
en todo. Este paso por la universidad me ha ayudado a realizarme más como persona y cada día
aprendí algo nuevo que he intentado transmitir hacia los demás, porque no hay que ser egoístas
con los conocimientos. Además, quiero agradecer a Karina Prado, mi compañera de tesis y
amiga, que con mucho esfuerzo hemos podido realizar este trabajo pese a la distancia y tiempo
restringido.

Gisella Araceli Rojas Cortes


ÍNDICE

SIGLAS Y/O SIMBOLOGÍA


SIMBOLOGÍA
SIGLAS
INTRODUCCIÓN 1
OBJETIVOS 2
OBJETIVO GENERAL 2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 2

CAPITULO 1:CONTAMINACIÓN MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS E


INCIDENCIA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS 3
1.1. VENTA DE ALIMENTOS EN LA VÍA PÚBLICA 5
1.2. ALIMENTOS DE VENTA CALLEJERA 6
1.2.1. Alteración de alimentos 6
1.2.2. Clasificación de los alimentos por la facilidad con la que se alteran 7
1.3. ALIMENTO ANALIZADO Y VÍAS DE CONTAMINACIÓN 9
1.3.1. Origen del sushi 9
1.3.2. Ingredientes 9
1.4. RECOMENDACIONES PARA LA FABRICACIÓN DEL SUSHI 19
1.5. EXPOSICIÓN Y VENTA 20
1.6. STAPHYLOCOCCUS AUREUS Error! Bookmark not defined.
1.6.1. Microorganismos 21
1.6.2. Crecimiento 22
1.6.3. Hábitat 24
1.6.4. Factores de virulencia 24
1.6.5. Enfermedad y síntomas 25

CAPITULO 2: PARTE EXPERIMENTAL 27


2.1. TOMA DE MUESTRA 30
2.2. PREPARACIÓN Y HOMOGENEIZACIÓN DE LA MUESTRA 30
2.2.1. Principales equipos y materiales utilizados 30
2.3. DILUCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO DE LA MUESTRA 36
2.3.1. Materiales y equipos 37
2.3.2. Reactivos y soluciones 37
2.3.3. Medios de cultivo 37
2.3.4. Procedimiento 37
2.3.5. Composición y fundamento de los medios de cultivo 37
2.4. COMPOSICIÓN Y FUNDAMENTOS DE LOS MEDIOS PARA LAS PRUEBAS
CONFIRMATIVAS 47
2.4.1. Materiales y equipos 47
2.4.2. Reactivos y soluciones 47
2.4.3. Medios de cultivo 47
2.4.4. Caldo extracto cerebro- corazón (B.H.I) 47
2.4.5. Coagulasa 48
2.4.6. Desoxirribonucleasa 49
2.4.7. Catalasa 51
2.4.8. Oxidasa 51
2.4.9. Agar tres azúcares hierro (TSI) 53
2.4.10. Agar Hierro Lisina (LIA) 54
2.4.11. Pruebas IMVIC 55
2.4.12. Medio Movilidad, Indol y Ornitina (MIO) 58
2.4.13. Hidrolisis de la Urea 59
2.5. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO CEPA DE REFERENCIA STAPHYLOCOCCUS
AUREUS 59
2.5.1. Liofilización 60
2.6. DESCRIPCIÓN EXPERIMENTAL 60
2.6.1. Procedimiento experimental 62

RESULTADOS Y RECOMENDACIONES 71
DISCUSIÓN 83
CONCLUSIÓN 87
BIBLIOGRAFÍA 88
ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1-1. Arroz para sushi Tucapel. 11


Figura 1-2. Pechuga de pollo. 12
Figura 1-3. Camarones. 13
Figura 1-4. Imagen del Alga nori 15
Figura 1-5. Queso crema tradicional. 16
Figura 1-6. Vinagre de arroz 17
Figura 1-7. Verduras utilizadas en el sushi. 18
Figura 1-8. Medio de transporte y venta. 21
Figura 1-9. Microfotografía de Staphylococcus aureus. 22
Figura 1-10. Mecanismo patógeno de intoxicación con enterotoxinas de 26
Staphylococcus aureus.
Figura 2-1. Esquema general de la parte experimental. 29
Figura 2-2- Mechero Bunsen. 31
Figura 2-3. Placa Petri. 31
Figura 2-4. Asa en argolla. 32
Figura 2-5. Frigorífico o cámara frigorífica. 32
Figura 2-6. Autoclave. 33
Figura 2-7. Desionizador de agua. 34
Figura 2-8. Micropipeta. 34
Figura 2-9. Microscopio óptico compuesto 35
Figura 2-10. Incubadora de CO2. 36
Figura 2-11. Tinción gram en laboratorio microbiología USM JMC. 45
Figura 2-12. Liofilización 60
Figura 2-13. Muestras de sushi analizadas 61
Figura 2-14. Placas Agar Manitol 62
Figura 2-15. Placas Baird Parker 62
Figura 2-16. Tinción Gram 63
Figura 2-17. Plasma liofilizado de conejo y tubos Coagulasa positivos 64
Figura 2-18. Prueba de confirmación Dnasa positivo 65
Figura 2-19. Referencia resultados catalasa 65
Figura 2-20. Tiras Prueba Oxidasa 66
Figura 2-21. Medio TSI 66
Figura 2-22. Tubo con medio LIA. 67
Figura 2-23. Prueba indol positiva. 68
Figura 2-24. Prueba Rojo Metilo. 68
Figura 2-25. Prueba Voges-Proskauer. 69
Figura 2-26. Prueba del citrato 69
Figura 2-27. Medio Movilidad, Indol y Ornitina 70
Figura 2-28. Hidrolisis de la Urea 70
Figura 29. Criterios microbiológicos Comidas y platos mixtos con ingredientes(s) 86
crudo(s) y/o cocido(s), incluidos emparedados.

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1-1. Descripción general de la fabricación del sushi alimentos 20


Tabla 1-2. Crecimiento microbiano 23
Tabla 2-1. Resultados prueba Agar tres azúcares hierro 54
Tabla 2-2. Composición muestras de sushi 61
Tabla 3-1. Cepa referencia 71
Tabla 3-2. Muestra 1 72
Tabla 3-3. Muestra 2 72
Tabla 3-4. Muestra 3 73
Tabla 3-5. Muestra 4 74
Tabla 3-6. Muestra 5 75
Tabla 3-7. Muestra 6 76
Tabla 3-8. Muestra 7 77
Tabla 3-9. Muestra 8 78
Tabla 3-10. Actividad de agua y temperatura de las muestras analizadas 79
Tabla 3-11. Cepas positivas y negativas 80
Tabla 3-12. Tabla con las cepas aisladas según el medio de cultivo 80
ÍNDICE DE GRÁFICOS

Gráfico 3-1. Gráfico de muestras 79


Gráfico 3-2. Gráfico de las cepas aisladas, positivas y negativas en general. 80
Gráfico 3-3. Gráfico con las cepas aisladas según el medio de cultivo. 81
SIGLAS Y/O SIMBOLOGÍA

SIMBOLOGÍA

- g: Gramo
- cm : centímetro
- ml : Mililitro
- g/l : gramos por litro
- µ/ml : Microgramo por mililitro
- L : Litro
- ng : Nanogramo
- N : Normalidad
- h : Hora
- s : Segundos
- %p/v : porcentaje peso/volumen
- %p/p : porcentaje peso/peso
- mm : milímetro
- CO2 : Dióxido de carbono
- N2 : Dinitrógeno
- H2O2 : Peróxido de hidrogeno
- NO2 : Dióxido de nitrógeno
- C : Carbono
- kDA : kiloDalton
- BP : Baird Parker
- M : Manitol
SIGLAS

- Atm : Atmósfera
- UTFSM : Universidad Técnica Federico Santa María
- JMC : José Miguel Carrera
- FAO : Food and Agriculture Organization.
- Aw : Actividad de agua.
- OMS : Organización Mundial de la Salud
- ETA : Enfermedades Transmitidas por Alimentos
- KOH : Hidróxido de potasio
- VP : Voges- Proskauer
- EY : Emulsión preparada de yema de huevo con telurito
- MIO : Medio Movilidad, Indol y Ornitina
- RM : Rojo Metilo
- TSI : Agar tres azúcares hierro
- LIA : Agar Hierro Lisina
- BHI : Caldo extracto cerebro- corazón
- HCl : Ácido clorhídrico
- NaCl : Cloruro de sodio
- UFC : Unidad formadora de colonias
1

INTRODUCCIÓN

La venta de alimentos en la vía pública es un tema de gran relevancia, puesto que se


encuentra presente en la mayoría de las ciudades del mundo, desempeñando un papel integral
en la vida cotidiana de millones de personas, ya que proporcionan alimentos de buen costo y
fácil acceso. Sin embargo, los estudios centrados en las consecuencias sociales, económicas o
incluso de salud pública que esta actividad conlleva, han generado una mínima producción de
investigaciones referente a estos casos.
Los alimentos de venta callejera ofrecen varias ventajas, generalmente están al alcance
de todos, son baratos, fáciles de conseguir en horarios y lugares no habituales para la venta y
consumo. Sin embargo, las condiciones insalubres a las que están expuestos día a día, entre
ellas la mala higiene del manipulador, la inadecuada cadena de refrigeración o conservación y
la localización de venta en lugares cercanos a alcantarillados o junto a la contaminación
automovilística, son factores perjudiciales que influyen directamente con la inocuidad del
alimento.
FAO (2001), menciona que la OMS estima que las enfermedades causadas por
alimentos contaminados constituyen uno de los problemas sanitarios más difundidos en la
actualidad. (Olea, A., Díaz, J., Fuentes, R., Vaquero, A. y García, M., 2012) aseguran que
“aproximadamente el 70% de las diarreas se originan por la ingestión de alimentos
contaminados con microorganismos o toxinas” (p.504).
Debido a esto es fundamental detectar eficientemente la presencia de
microorganismos, como por ejemplo Staphylococcus aureus el cual al encontrarse en altas
concentraciones evidencia una posible toxiinfección alimentaria.
El alimento utilizado para el análisis en este trabajo será el sushi de venta callejera, el
cual, por sus diversos componentes, presenta riesgo a la contaminación por los factores
mencionados anteriormente.
La presente investigación se enfoca en el patógeno Staphylococcus aureus y su
relación con los alimentos, y se demuestra la presencia de esta bacteria en las muestras de sushi
de venta ambulante en la ciudad de Viña del Mar.
De esta forma, se busca aportar a investigaciones realizadas en el área de microbiología
de los alimentos, a través de los resultados obtenidos en el periodo de análisis.
2

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

 Evaluar la calidad microbiológica y sanitaria de los puestos de venta ambulatoria de


sushi en la ciudad de Viña del Mar, mediante la identificación de Staphylococcus
aureus, un microorganismo causante de intoxicaciones alimentarias.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Analizar muestras de sushi con el fin de encontrar Staphylococcus aureus


 Aplicar protocolos a seguir para cada análisis, considerando el procedimiento de
enriquecimiento y aislamiento para Staphylococcus aureus
 Juzgar las condiciones higiénicas en que se desenvuelve el comercio del sushi callejero.
CAPITULO 1: CONTAMINACIÓN MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS E
INCIDENCIA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
4
5

1. CONTAMINACIÓN MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS E INCIDENCIA


DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

1.1. VENTA DE ALIMENTOS EN LA VÍA PÚBLICA

Entre los años 2005 y 2010 se notificaron en el sistema de vigilancia en Chile 5.689
brotes de ETA. El análisis en base a grupos de edad reportó que, en el período analizado, la
incidencia acumulada del grupo de edad más afectado correspondió al segmento de 15 a 44
años. La distribución por sexo fue similar en todo el período (49,7% mujeres y 50,3% hombres)
y a través de los años.
La sintomatología más frecuentemente reportada correspondió a diarrea y dolor
abdominal, seguido por náuseas o vómitos y fiebre.
Al analizar la ocurrencia de brotes por región durante el período 2005-2010, la Región
Metropolitana registró el mayor número de brotes de ETA (3.066 brotes) seguido por la Región
de Valparaíso (1.220 brotes), lo que representó 54 y 21% del total de brotes notificados en el
país para dicho período, respectivamente.
De los brotes con información alimentaria, el 21% registró consumo de comidas y
platos preparados, los ocasionados por consumo de carnes o productos cárnicos alcanzaron el
11%, y de estos últimos, las carnes de aves fueron las causantes de 36% de los brotes. Olea,
Díaz, Fuentes, Vaquero y García (2012)
(Olea, A., Díaz, J., Fuentes, R., Vaquero, A. y García, M., 2012) mencionan en su
artículo de investigación lo siguiente:
Los brotes estudiados reflejaron que el mayor porcentaje se asoció a la inadecuada
manipulación de alimentos durante su comercialización o preparación doméstica, lo cual está
relacionado a la deficiente conservación de los alimentos y hábitos de consumo. Se considera
que en la población chilena existe una baja cultura sanitaria en los manipuladores de alimentos,
incluyendo tanto el nivel comercial como domiciliario. (p. 508)
24 horas noticias, (2 de abril de 2013) afirman:
En el caso del sushi, hasta el año 2013 las intoxicaciones aumentaron en un 100%. De
un total de 400 fiscalizaciones, 12% de los locales han sido sumariados.
La Seremi de Salud ha detectado más de 10 brotes distintos, los síntomas de la intoxicación,
según la autoridad, son diarrea, vómitos, malestar general y decaimiento.
6

1.2. ALIMENTOS DE VENTA CALLEJERA

Según el documento titulado Aspectos socioeconómicos de los alimentos que se


venden en la vía pública, s.f afirman:
Los alimentos que se venden en la vía pública, definidos como "alimentos y bebidas
listos para el consumo, preparados y/u ofrecidos por vendedores no permanentes y otros
vendedores ambulantes, especialmente en las calles y en otros lugares públicos similares",
pueden encontrarse reunidos en las cercanías de los lugares de trabajo, escuelas, hospitales,
estaciones ferroviarias, estaciones terminales de autobuses, etc. Son poco costosos en
comparación con los alimentos de establecimientos comerciales y en algunos casos son más
baratos que los alimentos cocinados en el hogar.
Para un gran número de personas, los alimentos vendidos en las calles pueden ser el
medio más accesible de obtener una comida balanceada a nivel nutricional fuera del hogar,
siempre que los consumidores estén informados y sean capaces de escoger una apropiada
combinación de alimentos.
La preparación de los alimentos callejeros y su venta proporcionan una regular fuente
de ingresos a millones de hombres y mujeres de los países en desarrollo con escasa educación
o con habilidades limitadas, especialmente porque la actividad requiere una baja inversión
inicial.
En la actualidad, las organizaciones internacionales, autoridades locales, y las
asociaciones de consumidores son cada vez más conscientes de la importancia (impacto)
socioeconómica de los alimentos vendidos en las calles, pero también de sus riesgos. Muñoz
(2014) indica que la principal preocupación se refiere a la inocuidad de los alimentos, pero
también se presentan otros problemas como las cuestiones relacionadas con la sanidad
(acumulación de desechos en las calles y congestión de los desagües).

1.2.1. Alteración de alimentos

La alteración de los alimentos supone todo cambio que los convierte en inadecuados
para el consumo. Un alimento se considera descompuesto cuando es considerado por los
consumidores como inaceptable, debido a sus características sensoriales. Estas generalmente
incluyen la apariencia, el sabor, el olor y la textura del alimento; son subjetivas y dependen de
7

consideraciones culturales o de cambios en la agudeza de cada consumidor para percibir


cambios. (Microorganismos de alteración o deterioro, s.f)
Las causas más comunes de alteración de los alimentos son:

- Ataque de insectos.
- Lesiones físicas por golpes, presiones, heladas, deshidratación y radiación.
- Actividad de enzimas tisulares autóctonas, tanto vegetales como animales.
- Cambios químicos no producidos por microorganismos ni por enzimas autóctonas. En
estos cambios está implicado generalmente el oxígeno, y aparte del deterioro por
microorganismos, constituye una de las principales formas de deterioro alimenticio.
- Actividad de los microorganismos, sobre todo bacterias, levaduras y mohos. (Herrera,
1997, p.3)

1.2.2. Clasificación de los alimentos por la facilidad con la que se alteran

Según la facilidad con que se alteran los alimentos, se pueden clasificar en tres grupos:

- Alimentos estables o no perecederos En este grupo de alimentos, que no se alteran, a no


ser que se manipulen sin cuidado, se incluyen alimentos como el azúcar, la harina y las
alubias secas.
- Alimentos semiperecederos Si este tipo de alimentos se manipulan y conservan de forma
apropiada, permanecen sin alterarse durante bastante tiempo, por ejemplo, las papas,
ciertas variedades de manzanas, y las nueces desprovistas de cáscara.
- Alimentos perecederos Este grupo incluye los alimentos más importantes de consumo
cotidiano, los cuales se alteran con facilidad a no ser que se utilicen procedimientos de
conservación específicos. Las carnes, el pescado, las canales de aves de corral, la
mayoría de las frutas y hortalizas, los huevos y la leche pertenecen a este grupo.

La mayoría de los alimentos se pueden encuadrar en uno de los citados grupos, existen
algunos que se encuentran tan próximos al límite que separa unos de otros, que resulta difícil
clasificarlos.
Casi todos los alimentos frescos contienen una serie de bacterias, levaduras y mohos
y, según su procedencia, pueden contener enzimas animales o enzimas vegetales. Debido a las
8

condiciones especiales de cada medio, solamente una insignificante cantidad de los distintos
tipos de microorganismos existentes será capaz de multiplicarse rápidamente y producir
alteraciones en el alimento e incluso es posible que estos microorganismos no existieran en
abundancia en el alimento original.
El tipo y número de microorganismos que existirán tanto en la superficie como en el
interior del alimento, dependerán del tipo y grado de su contaminación, de las oportunidades
anteriores que hayan tenido los microorganismos para multiplicarse, y de los tratamientos
previos a los que se haya sometido el alimento.
La contaminación puede aumentar el número de microorganismos del alimento e
incluso puede incorporar al mismo nuevas especies. Por ejemplo, el agua con que se lava la
mantequilla puede incorporar a la misma bacteria que producen manchas en su superficie; el
equipo de la planta industrial puede incorporar a los alimentos microorganismos que producen
alteraciones en los mismos durante las distintas operaciones de su tratamiento; las máquinas
lavadoras pueden incorporar microorganismos a los huevos; y los barcos sucios pueden
incorporarlos al pescado.
Frazier y Westhoff (1993) afirman:
Los tratamientos previos a los cuales se someten los alimentos pueden eliminar o
destruir determinados tipos de microorganismos, añadir microorganismos, modificar la
proporción de los existentes o inactivar parte o la totalidad de los enzima, reduciendo por tanto
el número de agentes productores de alteraciones y, por consiguiente, el número de los tipos de
alteración posibles. El lavado de los alimentos, por ejemplo, puede eliminar microorganismos
de su superficie o puede añadir algunos existentes en el agua que se utiliza para lavarlos. Si se
realiza el lavado con una solución antiséptica o germicida, el número de microorganismos se
puede reducir de forma importante y se pueden eliminar algunos tipos de los mismos. Los
tratamientos con radiaciones, con ozono, con dióxido de azufre, o con vapores germicidas,
reducirán su número y actuarán como selectivos al eliminar de los alimentos determinados
tipos. Por lo que se refiere a las temperaturas elevadas, conforme aumente la intensidad del
tratamiento térmico, cada vez destruirán mayor cantidad de microorganismos y cada vez
dejarán menor número de tipos de los mismos. La conservación de los alimentos bajo
condiciones no constantes, tanto puede aumentar como reducir la cantidad de microorganismos
y el número de sus tipos. (p.93)
9

1.3. ALIMENTO ANALIZADO Y VÍAS DE CONTAMINACIÓN

1.3.1. Origen del sushi

El sushi es un plato de origen japonés a base de arroz cocido adobado con vinagre de
arroz, azúcar, sal y otros ingredientes, incluyendo pescados o mariscos. Este plato es uno de los
más reconocidos de la gastronomía japonesa y uno de los más populares internacionalmente.
Normalmente, este plato se asocia el sushi con el pescado y el marisco, también puede
llevar verduras, quesos, carnes blancas o cualquier otro acompañante. Además, los productos
frescos tradicionales que acompañan al arroz no tienen que ir siempre crudos. Se incluyen
también preparaciones hervidas, fritas o marinadas. Es decir que el nombre "sushi" refiere a la
preparación del arroz y que el acompañamiento, si bien es relevante en el sabor, no hace al plato
en sí. Si bien existe una variedad de acompañamientos de sushi internacionalmente reconocidos
y acostumbrados, lo ideal es que cada región adopte acompañamientos típicos del lugar con
pescados o frutos de la región que estén identificados con el gusto y la gastronomía local. Sin
embargo, debe abstenerse el uso de pescado de agua dulce crudo dado que, a diferencia del
pescado de mar, puede contener salmonella. (Castro, N.,Corrales ,N., 2010)

1.3.2. Ingredientes

En su mayoría los alimentos listos para consumir como el sushi están más expuestos a
la contaminación porque sus insumos pollo, pescados (salmón), vegetales (palta), queso crema
y otros requieren mayor manipulación en la preparación. A lo anterior se suma la naturaleza.

1.3.2.1. Arroz

El arroz es un alimento con un pH casi neutro, formado por hidratos de carbono,


proteína y grasa; en menor cantidad, vitaminas y minerales. Por tanto, representa un excelente
medio de crecimiento para ciertas bacterias, sobre todo cuando el arroz se procesa por
ebullición.
10

Principales microorganismos implicados en la alteración del arroz:

Si el arroz hervido se encuentra a temperatura ambiente, se crea un entorno rico en


humedad, ideal para que las bacterias se multipliquen, el cual representa una potencial fuente
de intoxicaciones debido a la Bacillus cereus, presente en la mayoría de los arroces crudos. La
enfermedad se genera porque el arroz es expuesto a condiciones que propician la germinación
de esporas y la multiplicación celular, la población de células vivas puede alcanzar los niveles
altos necesarios para causar enfermedad.
Las células de Bacillus cereus se destruyen al encontrarse en alimentos en condiciones
de cocción, pero no las esporas, las cuales son mucho más resistentes a las altas temperaturas y
pueden permanecer en el alimento.
Si el arroz se mantiene a temperatura ambiente, las esporas de Bacillus cereus se
multiplican y pueden producir toxinas, responsables de la intoxicación alimentaria. Es por esta
razón que el arroz hervido debe consumirse tan pronto como se haya cocinado. Si no es posible,
debe enfriarse, en menos de una hora debe refrigerarse, por no más de 48 horas (Chavarrias, M.
, 2012)
ABC color (2013) indica en que “el arroz del sushi, que se sirve a temperatura
ambiente, tiene la particularidad de estar condimentado con una mezcla de vinagre de arroz y
azúcar, un medio ácido que inhibe el crecimiento de la bacteria Bacillus cereus” (párr. 6).
Castañeda, Braña, Rosario y Martínez (2013), mencionan en su texto, a modo general,
algunas de las medidas que pueden ayudar a prevenir esta intoxicación son:
Mantener la comida caliente (por encima de los 60ºC) o, por el contrario, por debajo
de los 5ºC. Deben desecharse los alimentos cocidos que queden fuera de la nevera durante más
de cuatro horas.
- Evitar preparar la comida con demasiada anticipación.
- Separar los alimentos crudos de los cocinados y evitar que entren en contacto.
11

Fuente: Jumbo

Figura 1-1. Arroz para sushi Tucapel.

1.3.2.2. Carnes blancas (pollo)

Las consideradas carnes blancas son el pollo, el pavo y el conejo, se destacan por su
contenido en hierro, proteínas, vitamina B12 y aminoácidos esenciales. La característica
nutritiva esencial es su bajo aporte en grasa, contiene menos del 10% de grasa por cada 100
gramos de carne. (Fernández, 2018)

Principales microorganismos implicados en la alteración de la carne

Después del sacrificio y curtir la piel, los cadáveres de aves contienen muchos tipos
de microorganismos, sobre todo bacterias provenientes de la piel, las plumas y el tracto
gastrointestinal, entre otros; del ambiente en que se les alimentó y de la pastura (alimento, agua,
suelo y estiércol); y del ambiente en los mataderos (equipo, aire, agua y el hombre). Por lo
general los cadáveres contienen un promedio de 101−3 celulas bacterianas / pulgada (2.54 cm)
cuadrada. Suelen estar presentes, pero en un nivel bajo, diferentes patógenos entéricos, tales
como Salmonella, Yersinia enterolitica, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Clostridium
perfringens y Staphylococcus aureus, tanto de aves, animales o seres humanos, (…). Parte del
equipo usado puede ser fuente importante de microorganismos, como cintas transportadoras,
trituradoras, rebanadoras y tipos similares del equipo que son difíciles de limpiar. La carne
refrigerada tiene mesófilos, como Micrococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Bacillus,
12

Clostridium, Lactobacillus, Coliformes y otras Enterobacterias, incluidos patógenos entéricos.


Sin embargo, debido a que la carne es almacenada a temperatura baja (-1 a 5⁰C), los psicrótrofos
constituyen uno de los principales problemas. Los psicrotrofos que predominan en las carnes
crudas son algunos Lactobacilos y Leuconostocos, Brochothrix thermosphacta, Clostridium
laramie, algunos Coliformes, Serratia, Pseudomonas, Alteromonas, y Proteus. Los patógenos
psicrotroficos incluyen Listeria monocytogenes y Yersinia enterolítica. La carga microbiana de
la carne fresca varía ampliamente, pero predominan las bacterias, (…). Si los productos se
mantienen en condiciones aeróbicas, los aerobios psicrotróficos crecen rápido, sobre todo los
bastoncillos gramnegativos, como Pseudomonas, Alteromonas, Proteus y Alcaligenes, además
de levaduras. Bajo un empacado anaeróbico, predomina el crecimiento de anaerobios
facultativos psicrotróficos y de anaerobios tales como Lactobacillus, Leuconostoc, Brochotrix,
Serratia, algunos Coliformes y Clostridium.
El pH de la carne de aves es de casi 6.0, el alto contenido de proteínas y el nivel bajo
de carbohidratos, junto con el ambiente, determinan los tipos que predominan durante el
almacenamiento, (…). El tratamiento con calor, en especial a una temperatura interna de 70⁰C
o superior, mata a la mayoría de los microorganismos, excepto algunos termorresistentes, entre
los que se incluyen Micrococcus, algunos Enterococcus y quizás algunos Lactobacillus y
esporas de Bacillus y Clostridium. El nivel microbiano puede ser de 101−2/g. Despues del
calentamiento, las carnes se siguen manipulando y están en contacto con el equipo, el personal,
el aire y el agua, (…). Durante el almacenamiento prolongado en empaques sellados al vacío o
con aire modificado, incluso con un nivel bajo de microorganismos, la población bacteriana
puede elevarse y afectar en forma adversa la seguridad y la vida útil de los productos. Esto se
agrava al variar la temperatura de almacenamiento y de productos que son bajos en grasa, con
un pH alto y una 𝐴𝑤 alta. (Ray y Bhunia, 2011, p.25)

Fuente: Ingredienta.com

Figura 1-2. Pechuga de pollo.


13

1.3.2.3. Mariscos (camarones)

Este grupo incluye crustáceos (camarones, langosta, cangrejos) y moluscos (ostras,


almejas, y ostiones). Los mariscos son recolectados de ambientes acuáticos, son ricos en
proteínas y compuestos de nitrógeno no proteicos; su contenido de grasa varía dependiendo del
tipo y la temporada.

Fuente: Food Network

Figura 1-3. Camarones.

Principales microorganismos implicados en la alteración de mariscos

La población microbiana en estos productos varía ampliamente con el nivel de


contaminación y la temperatura del agua. Puede haber bacterias de muchos grupos, además de
virus, parásitos y protozoarios, presentes en los materiales crudos. Los músculos de los mariscos
son estériles, pero en los intestinos albergan microorganismos. Los crustáceos pueden tener
103−8 celulas bacterianas/ g. Los productos recolectados de ambientes marinos pueden tener
vibrios halofilicos, además de Pseudomonas, Alteromonas, Flavobacterium, Enterococcus,
Micrococcus, Coliformes y Clostridium botulinum tipo E, (…). Si se recolectan de agua
contaminada, los microorganismos pueden crecer rápido en crustáceos debido a la 𝐴𝑤 alta y el
pH alto del tejido y la disponibilidad de grandes cantidades de compuestos de nitrógeno no
proteicos. Como muchas de las especies bacterianas son psicrotroficas, pueden crecer a
14

temperaturas de refrigeración. Los patógenos pueden permanecer viables por un largo tiempo
durante el almacenamiento. Las cargas microbianas se reducen en gran medida durante el
procesamiento por calor para producir diferentes productos. (Ray y Bhunia, 2011, p.26)

1.3.2.4. Alga nori

Alga nori o Porphyra umbilicales L, se encuentra en forma natural en las orillas del
mar, también crece en superficies duras y se puede unir a otras algas.
El alga nori se encuentra en el grupo de las algas pardas, las cuales se caracterizan por
tener pigmentos fotosintéticos de color marrón-amarillento (xantofilas). (propiedades del alga
nori, s.f)
"Una vez recogida fresca, se seca al sol o en hornos extendida en pequeñas cantidades
sobre esteras de bambú. Por eso tiene un lado liso y otro rugoso, apariencia característica y un
color que cambia dependiendo de su estado: por ejemplo, cuando es cocida su apariencia es
verde, mientras que cuando se seca su color se torna negro." (alga nori: propiedades, beneficios
y cómo usarla, s.f). Se utiliza generalmente en la cocina japonesa, está disponible en láminas
delgadas que se cortan o rompen en pedazos más pequeños para envolver el rollo de sushi. El
nori se cultiva, procesa y es empaquetado industrialmente. El producto tiene forma laminar de
tamaño estándar de 18 x 21 cm. Destaca por su alto contenido en proteínas, vitamina C y
minerales y fibra dietética.

Principales microorganismos implicados en la alteración de algas

Las algas marinas son colonizadas por bacterias del entorno acuático. En un trabajo de
la Universidad Nacional de La Patagonia San Juan Bosco (Argentina), se estudió la población
microbiana asociada a Porphyra umbilicales L, entre las cepas que se lograron identificar por
sus características morfológicas y pruebas metabólicas como miembros del género
Pseudomonas (35%), Vibrios (25%),otras cepas fueron comparables con los géneros
Flexibacter (8%), Moraxella (6%), Aeromonas (4%), Alteromonas (4%), Flavobacterium (4%),
Acinetobacter (2%), Agrobacterium (2%), Cytophaga (2%). Los cocos Gram positivos aislados
fueron identificados como pertenecientes a los géneros Staphylococcus (6%) y Streptococcus
(2%). Los géneros predominantes fueron; Pseudomonas y Vibrios.
15

Fuente: gastronosfera.com

Figura 1-4. Imagen del Alga nori

1.3.2.5. Queso crema

Según la norma del Codex para el queso crema, realizado por FAO (2018):
El queso crema (queso de nata) es un queso blando, untable, no madurado y sin corteza
(…) el queso presenta una coloración que va de casi blanco a amarillo claro. Su textura es suave
o ligeramente escamosa y sin agujeros y el queso se puede untar y mezclar fácilmente con otros
alimentos. (p. 1)
Rodríguez (2012) indica que el queso fresco, se caracteriza por:
ser un producto poco fermentado, ligeramente ácido (pH en torno a 5,3), muy líquido
(actividad del agua de 0,9), con un bajo porcentaje de sal (menor al 3%) (…) estas condiciones
permiten el desarrollo de muchos microorganismos propios de la leche y de contaminación
ambiental. Por este motivo, es esencial que en este producto se realice siempre una
pasteurización previa de la leche. (párr. 3)
16

Fuente: Líder

Figura 1-5. Queso crema tradicional.

Principales microorganismos implicados en la alteración del queso

La refrigeración del queso es muy importante, debe mantenerse de forma constante la


cadena del frío, puesto que rupturas de esta inducirán a la multiplicación de bacterias de riesgo,
(…). Hay una gran cantidad de microorganismos que podrán crecer en el queso fresco
dependiendo de los animales de los que procede o el procesado al que se ha sometido el queso
no ha sido suficiente. A esto se suma la limpieza de las instalaciones en la cual ha sido
procesado, los sistemas de moldeado y los de refrigeración suelen estar contaminados en la casi
totalidad de las instalaciones, sobre todo si son de tipo artesanal. Sobre todo, si se emplean
procesos de picado o troceado, entre otros, que requieren una manipulación o corte del producto
final, se contaminan con facilidad, quedando los microorganismos adheridos a las superficies.
En estos casos es realmente complicada la eliminación de los patógenos, lo que hace que la
instalación y el producto en general se encuentre contaminado de forma recurrente. (Rodriguez,
2012)

1.3.2.6. Vinagre de arroz

El vinagre de arroz resulta de la fermentación alcohólica y acética de azúcares


derivados del arroz o concentrado de arroz sin destilación, de esta forma el vinagre obtiene un
sabor dulzón y poco ácido.
Es un ingrediente fundamental en el arroz sushi. Los vinagres de arroz chinos son algo más
penetrantes y tienen un color rojo o blanco, dependiendo del arroz utilizado.
Cuando hablamos del vinagre de arroz que usamos para la producción de sushi este
recibe el nombre de sushizu o vinagre de sushi. Esta es una mezcla a base de vinagre de arroz
17

más la suma de sal y azúcar que le dan el toque característico de este. Al ser condimento del
sushi, “un medio acido que inhibe el crecimiento de la bacteria Bacillus cereus. Por ese motivo,
conviene aliñar el arroz recién cocinado con vinagre para evitar intoxicaciones” (ABC color,
2013, párr. 6).
"La adición de vinagre al arroz produce una acidificación que dificulta el crecimiento
de gérmenes y la formación de toxinas. En un medio ácido, con un pH inferior a 4,6 no hay
crecimiento de microorganismos, a excepción de algunas especies como salmonella o
Escherichia Coli enteropatógena." (Microservices,2015, p.4).

Fuente: Jumbo

Figura 1-6. Vinagre de arroz

1.3.2.7. Frutas y verduras

Las verduras proceden de diversas partes de las plantas, es importante indicar las
diferentes verduras según a la parte a la que pertenecen.
La palta es un fruto que proviene de un árbol (Persea americana) de la familia de las
lauráceas, por otro lado, el pimentón es un fruto pertenece a la familia de las Solanáceas,
proviene de una planta del mismo nombre.
En general, los vegetales son relativamente altos en carbohidratos, con valores de pH
de 5.0 a 7.0. Por lo tanto, pueden crecer diferentes tipos de bacterias, levaduras y mohos si las
condiciones son favorables (Ray y Bhunia, 2011, p.27)
18

Herrera (1997) menciona que:


Las frutas y verduras luego de su recolección experimentan cambios fisiológicos,
algunos de los cuales determinan perdidas de calidad. Continua la actividad respiratoria
implicada en la degradación de carbohidratos por las enzimas y los cambios inducidos, se ven
influenciados por la madurez del fruto en el momento de la recolección, por ende, los productos
vegetales habitualmente pueden ser almacenados durante un tiempo proporcionado con
pequeños cambios de calidad, si se cosechan y recolectan en el momento preciso.

Fuente: nutricionesencial.es

Figura 1-7. Verduras utilizadas en el sushi.

Principales microorganismos implicados en la alteración de las verduras

Los microorganismos en los vegetales pueden provenir de diversas fuentes, como


suelo, agua, aire, animales salvajes o domésticos, insectos, aves o el equipo, y varían
dependiendo de los tipos de vegetales. Un vegetal con hojas tiene más microorganismos
provenientes del aire, en tanto que un tubérculo tiene más provenientes del suelo. Los niveles
y tipos microbianos de estos productos también varían mucho dependiendo de las condiciones
ambientales, del cultivo y la recolección. En general los vegetales tienen 103-5
microorganismos/ cm2 o 104-7/. Algunos de los tipos predominantes de bacterias son las de ácido
láctico, Eorynebacterium, Enterobacter, Pproteus, Pseudomonas, Micrococcus, Enterococcus
y las que forman esporas. También tienen diferentes tipos de mohos, como Alternaria,
Fusarium y Aspergillus. Los vegetales pueden tener patógenos entéricos, sobre todo si se usan
desechos animales y humanos, y agua contaminada, para la fertilización e irrigación. Éstos
19

incluyen Lis. Monocytogenes. Salmonella, Shigella, Escherichia coli patogénica (Esc. Coli
O157:H7), Campylobacter, Clo. Botulinum y Clo. Perfringers. También puede tener
protozoarios y parásitos patogénicos (Cyclospora, ISospora, Giardia). Si los vegetales están
dañados, entonces también pueden predominar los patógenos vegetales (p. ej., Erwinia).
Muchos de los microorganismos causan diferentes tipos de descomposición (de putrefacción)
de los productos crudos. Pueden crecer patógenos en los productos vegetales y provocar
enfermedades originadas en el alimento (p. ej., col fermentada). Diferentes métodos usados para
procesar los vegetales y los productos vegetales reducen en gran medida la población
microbiana. (Ray y Bhunia, 2011, p.27)

1.4. RECOMENDACIONES PARA LA FABRICACIÓN DEL SUSHI

Los alimentos congelados se descongelarán en entre 0 y 4ºC, mediante un horno de


microondas o bajo agua fría corriente y se han de mantener a esta temperatura hasta su
manipulación.
La comida descongelada se ha de manipular y servir al consumidor tan pronto como
sea posible. No se debe volver a congelar y descongelar la comida.
Las carnes y el pollo se han de cocinar hasta alcanzar 75ºC en el centro de la pieza.
Hay que asegurarse que los jugos que desprende son claros y no rosados.
Los ingredientes que supongan un riesgo potencial (ej. pollo cocido) se han de
mantener en condiciones de refrigeración después de cocinados, mientras no se sirvan.
Los establecimientos con poco espacio para el almacenaje y la exposición tan solo
elaborarán una cantidad de sushi proporcional a este espacio y al final del día se debe tirar el
sushi que haya sobrado.
20

Tabla 1-1. Descripción general de la fabricación del sushi alimentos

Alimento Ingredientes Preparación Almacenamiento


Queso crema Leche, nata Porcionado Refrigeración
Arroz Cereal Lavado, Cocción Recipiente
hermético en un
área fresca y seca
Carnes blancas pollo Porcionado, cocción Refrigeración 0-7
Mariscos Kanikama, camarón Cocción Congelación -12
a -18
Alga nori Porphyra Porcionado Envase hermético
umbilicales L plástico en un
lugar oscuro y
fresco
Verduras varias Cebollín, Sanitización, picado Refrigerado
champiñón, y/o frito
ciboulette, palta,
pimentón
Vinagre fermentación del arroz Sazonar el arroz Refrigerado
Sal NaCl Mezcla con el Recipiente
vinagre hermético
Azúcar Sacarosa Mezcla con el Recipiente
vinagre hermético
Fuente: elaboración propia

1.5. EXPOSICIÓN Y VENTA

Durante el tiempo de exposición para la venta, el sushi se ha de mantener fuera la luz


solar directa y en condiciones de refrigeración (menos de 8ºC) y un máximo de 24 h desde su
elaboración.
Las vitrinas expositoras tendrán puertas para proteger los alimentos de contaminantes
externos y han de estar cerradas cuando no se utilicen.
21

Las vitrinas expositoras se han de limpiar y desinfectar al final de cada jornada.


Todos los equipos utilizados en la manipulación del sushi han de estar limpios en todo
momento y se han de desinfectar al final de cada jornada.

Fuente: Sodimac

Figura 1-8. Medio de transporte y venta.

1.6. STAPHYLOCOCCUS AUREUS

1.6.1. Microorganismos

Dentro de la familia Micrococcaceae se encuentran los géneros Micrococcus y


Staphylococcus. A esta última pertenece la especie Staphylococcus aureus, Ray, B. y Bhunia,
A. (2011) indican que se caracteriza por ser un coco Gram positivo, que por lo regular se
presenta en grupos semejantes a racimos, no son móviles, capsulares ni esporuladores.
22

Fuente: elaboración propia

Figura 1-9. Microfotografía de Staphylococcus aureus.

1.6.2. Crecimiento

La mayoría de las cepas fermentan el manitol, y producen coagulasa, termonucleasa y


hemolisina, pero varían en su sensibilidad a los bacteriófagos. Los Staphylococcus aureus son
anaerobios facultativos, pero prosperan con rapidez en condiciones aeróbicas. Las células
mueren a una temperatura de 66ºC en 12 min, y a 72ºC en 15 s. Son mesófilos y crecen a una
temperatura de 7 a 48ºC, con proliferación mayor entre 20 y 37ºC. Entre otras características
importantes de su crecimiento son que se multiplican a una 𝐴𝑊 relativamente baja (0,86), pH
bajo (4,8) y en altas concentraciones de sal y azúcar (15%). No son buenos competidores en
presencia de diversos microorganismos que se encuentran en los alimentos, pero debido a su
capacidad para crecer en condiciones desfavorables, les da ventaja para crecer en muchos
alimentos donde otros no crecen de manera favorable.
Staphylococcus aureus se caracteriza por su crecimiento rápido en medios sólidos,
agrupándose en estructuras redondas y de bordes bien definidos. Entre los medios selectivos
desarrollados para el crecimiento de S. aureus, los más utilizados son Agar Baird Parker y el
Agar manitol sal.
El Agar Baird Parker es un medio que posee piruvato sódico como estimulante del
crecimiento selectivo. Contiene litio y telurio potásico para inhibir el desarrollo de otros
microorganismos y permitir el crecimiento de Staphylococcus aureus. Los pocos
23

microorganismos distintos a Staphylococcus aureus que pueden crecer, son Staphylococcus


saprophyticus y algunas cepas de Bacillus. Staphylococcus aureus produce en este medio
colonias negras (por la reducción de telurito a teluro), convexas y con un halo claro del medio
debido a la actividad proteolítica.
El Agar manitol sal o medio de Chapman, basa su formulación en un alto contenido
de sal, lo que inhibe el crecimiento de la mayoría de los microorganismos, a excepción de
Staphylococcus aureus. Esta bacteria fermenta el manitol para dar colonias de color amarillo.

Tabla 1-2. Crecimiento microbiano

AW ALIMENTOS Crecimiento microbiano


En este rango de Aw crecen sin
impedimento alguno todos los
Carnes y pescados frescos, las frutas,
microorganismos causantes de
0,98 o hortalizas y verduras frescas, la leche, las
toxiinfecciones alimentarias y los
superior hortalizas en salmuera enlatadas, las frutas
que habitualmente dan lugar a
enlatadas en jarabes diluidos
alteraciones, excepto los xerófilos
y halófilos extremos.
Leche concentrada por evaporación, el
concentrado de tomate, los productos
Todos los microorganismos
cárnicos y de pescado ligeramente salados,
conocidos causantes de
las carnes curadas enlatadas, los embutidos
0,98 a toxiinfecciones alimentarias
fermentados (no secos), los embutidos
0,93 pueden multiplicarse al menos a
cocidos, los quesos de maduración corta,
los valores más altos de Aw
queso de pasta semidura, las frutas
comprendidos en este intervalo.
enlatadas en almíbar, el pan, las ciruelas
con un alto contenido en agua.
Entre las bacterias conocidas, sólo
una (Staphylococcus aureus) es
Los embutidos fermentados y madurados,
0,93 a capaz de producir intoxicación
el queso Cheddar salado, el jamón tipo
0,85 alimentaria a estos niveles de Aw,
serrano, la leche condensada azucarada.
pero pueden crecer muchos mohos
productores de micotoxinas.
Las bacterias patógenas no crecen
Las frutas secas, la harina, los cereales, las
en este intervalo de Aw. La
0,85 a confituras y mermeladas, las melazas, el
alteración, cuando ocurre, se debe
0,60 pescado muy salado, los extractos de carne,
a microorganismos xerófilos,
algunos quesos muy madurados, las nueces.
osmófilos o halófilos.
24

Los microorganismos no se
Dulces, el chocolate, la miel, los fideos, las multiplican por debajo de una Aw
inferior
galletas, las papas fritas, las verduras secas, de 0,60 pero pueden permanecer
a 0,60
huevos y leche en polvo. vivos durante largos períodos de
tiempo.
Fuente:
1.6.3. Hábitat

Staphylococcus aureus y otros estafilococos se hallan de manera natural presentes en


la nariz, garganta, piel y cabello de los seres humanos saludables, animales y plantas. Puede
estar presente en infecciones por cortes en la piel y abscesos en humanos, animales y aves, en
cortes en las manos y erupciones faciales por acné.
Sin duda, la fuente usual de infección estafilocócica es la colonización de las fosas nasales,
cuya diseminación se realiza por la aerolizacion desde las fosas nasales anteriores o, en menor
medida, por contacto directo entre un individuo sano y uno portador y erupciones faciales por
acné.

1.6.4. Factores de virulencia

Staphylococcus aureus posee la particularidad de formar un amplio espectro de


sustancias asociadas a enfermedades, que van desde compuestos presentes en la estructura de
la pared celular, como el ácido teicoico, hasta la formación de numerosas exoenzimas y toxinas.
Las enzimas con actividad patogénica formadas por Staphylococcus aureus son:
catalasa, coagulasa, hialuronidasa y betalactamasa, entre otras. Entre las toxinas se encuentran:
la alfa, beta, gama y delta toxina, leucocidina, exfoliacina y enterotoxinas.
Son las enterotoxinas producidas por Staphylococcus aureus las responsables de
diversos cuadros asociados a toxiinfecciones alimentarias en seres humanos. Las cepas
enterotoxigénicas de Staphylococcus aureus producen 17 diferentes enterotoxinas: A, B, C1,
C2, C3, D y E hasta la R (también designadas como SEA, SEB, etc). Proteínas serológicamente
distintas, estables al calor, con peso molecular de 26 a 30 kDA y diferente toxicidad.
Las toxinas se pueden producir al dejar los alimentos a temperatura ambiente por un
tiempo prolongado. Las toxinas resisten a una temperatura de 60ºC por 16 h. Las toxinas son
termorresistentes, no se destruyen a temperatura ambiente, ni en el procesamiento o cocción de
los alimentos, son producidas en cantidades muy pequeñas durante la mayor parte del
crecimiento exponencial, logrando un aumento considerable al final de la fase de crecimiento
25

o al principio de la fase estacionaria logrando acumular hasta 350 µ/ml, dependiendo de la cepa
reproductora.

1.6.5. Enfermedad y síntomas

Staphylococcus aureus es capaz de producir cuadros clínicos en la piel y tejidos


blandos, infecciones profundas y diseminadas e intoxicaciones por enterotoxinas.
Las toxinas estafilocócicas son entéricas y, por ello, causan gastroenteritis. Un adulto
saludable puede consumir unos 30 g o ml de un alimento que contenga 100 a 200 ng de toxinas
producidas por una población de células de 106 a 107 por gramos o mililitro; los niños, los
ancianos y los enfermos resisten cantidades menores. Después de que son ingeridas, las toxinas
estimulan el nervio vago estomacal e inducen vomito intenso.
Los síntomas se presentan en un lapso de 2 a 4 h, que se relaciona directamente con la
potencia y las cantidades de toxinas ingeridas, así como con la resistencia del individuo. La
recuperación es rápida, por lo general, dentro de 48 horas.
Los primeros síntomas que provocan las toxinas al estimular el sistema nervioso
autónomo son salivación, nausea, vómito, calambres abdominales y diarrea. Algunos síntomas
secundarios incluyen sudación, escalofríos, dolor de cabeza y deshidratación. Sin embargo, los
síntomas y su intensidad varían de un individuo a otro, aunque se trate del mismo brote.
En la actualidad, casi la totalidad de intoxicaciones provocadas por Staphylococcus
aureus en establecimientos de alimentación colectiva son atribuidas a manipuladores de
alimentos que inoculan los productos durante la preparación y favorecen las condiciones para
el desarrollo de esta bacteria y posterior producción de toxinas durante la etapa de
almacenamiento.
26

Las toxinas estimulan al


nervio vago en el estómago

Inducen vomito en 1 a 6
horas

Fuente: Elaboración propia.

Figura 1-10. Mecanismo patógeno de intoxicación con enterotoxinas de Staphylococcus


aureus.
CAPITULO 2: PARTE EXPERIMENTAL
29

2. PARTE EXPERIMENTAL

La parte experimental, consta de diferentes procesos, los cuales están nombrados de


forma general en la siguiente figura.

Fuente: Elaboración propia

Figura 2-1. Esquema general de la parte experimental.

Cada proceso consta con su propia metodología para realizarse, las cuales serán
descritos a continuación:
30

2.1. TOMA DE MUESTRA

Se debe realizar una recolección de muestras en diferentes partes de la ciudad de viña


del mar.

2.2. PREPARACIÓN Y HOMOGENEIZACIÓN DE LA MUESTRA

Luego de la compra de la muestra, se coloca en un cooler para transportarse sin que se


altere. Una vez en el laboratorio se mantiene de forma refrigerada para la posterior preparación
y homogeneización de la muestra.
La preparación de la muestra se realiza de forma aséptica extrayendo del alimento una
porción representativa para el análisis.
En la homogeneización se procederá al triturado y mezclado de la muestra con el
objetivo de obtener una suspensión homogénea de alimento.
Para lo anteriormente nombrado se utilizará lo siguiente:

2.2.1. Principales equipos y materiales utilizados

El laboratorio para realizar cultivos microbiológicos es un lugar habilitado para


estudiar y analizar microorganismos. El estudio requiere ser realizado conforma a los estándares
técnicos y de seguridad de un laboratorio de microbiología.
Es relevante recordar que la meta es determinar el microorganismo como ausencia o
presencia en la muestra por lo que es necesario tomar precauciones para evitar contaminaciones
que den lugar a resultados erróneos. Todas las muestras deben ser manejadas con precaución
por su potencial patogenicidad.
A continuación, se describen los principales equipos y materiales a utilizar en el
trabajo.
Mechero bunsen
Instrumento utilizado en laboratorio para calentar muestras, sustancias químicas y
esterilizar. El mechero bunsen está constituido por un tubo vertical que va atornillado a un pie
31

metálico con entrada para el flujo de gas, el cual se regula a través de una llave sobre la mesa
de trabajo.

Fuente: Laboratorio químico

Figura 2-2- Mechero Bunsen.

2.2.1.1. Placas Petri

Es un recipiente redondo, hecho de vidrio o de plástico, posee diferentes diámetros, es


de fondo bajo, con una cubierta de la misma forma de la placa, pero un poco más grande de
diámetro, ya que se puede colocar encima y cerrar el recipiente, como una tapa. Es utilizado
para poder observar diferentes tipos de muestras tanto biológicas como químicas, las cuales se
encuentran dentro de la placa.

Fuente: Laboratorio químico

Figura 2-3. Placa Petri.


32

2.2.1.2. Asa loop

Asa loop o asa en argolla es un instrumento de laboratorio que consiste en una base
que puede estar hecha de acero, platino y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o
platino que termina o en una argolla o en punta.
Se utiliza para transportar, arrastrar, transferir inóculos desde la solución de trabajo,
también llamada “solución madre” al medio de cultivo o para resiembras. Además, sirve para
la realización del frotis.

Fuente: Manual práctico de bacteriología médica.

Figura 2-4. Asa en argolla.

2.2.1.3. Frigorífico o Cámaras refrigeradas

Se utilizan para conservar tanto microorganismos como materiales (medios de cultivo,


reactivos, muestras). Generalmente están a una temperatura bajo 8°C, ya que es cuando los
microorganismos empiezan a multiplicarse.

Fuente: Laboratorio químico

Figura 2-5. Frigorífico o cámara frigorífica.


33

2.2.1.4. Autoclave

Un autoclave es un recipiente metálico de paredes gruesas con cierre hermético que


permite trabajar con vapor de agua a alta presión y alta temperatura, que sirve para esterilizar
material médico o de laboratorio. El autoclave inactiva todos los virus y bacterias, aunque se
ha llegado a saber que algunos microorganismos pueden soportar las temperaturas del
autoclave. La esterilización con vapor de agua es el método más efectivo, ya que actúa
coagulando las proteínas de los microorganismos llevando así a su destrucción.

Fuente: Laboratorio química

Figura 2-6. Autoclave.

2.2.1.5. Desionizador de agua

Equipo que tiene por función realizar un proceso físico que utiliza resinas de
intercambio iónico en el que se sustituyen las sales y minerales en el agua, H + iones OH. En
el agua los elementos más pequeños son las sales, por lo que requiere un tratamiento poco
convencional, la desionización produce un agua de alta pureza que es generalmente similar a la
del agua destilada.
34

Fuente: Elaboración propia

Figura 2-7. Desionizador de agua.

2.2.1.6. Micropipetas

Instrumento que se utiliza para transferir o medir pequeños volúmenes de líquidos de


un recipiente a otro, con gran exactitud. Las micropipetas son dispositivos de amplia utilización
en laboratorios clínicos y de investigación.

Fuente: Biodiagnostica

Figura 2-8. Micropipeta.


35

2.2.1.7. Microscopio óptico compuesto

El microscopio es un instrumento creado para observar objetos pequeños, en el cual


por medio de la distancia focal y uso de lentes permite ver aumentados estos objetos u
organismos que no se pueden apreciar a simple vista.
El microscopio óptico compuesto utiliza un objetivo cercano al objeto que se está
visualizando para recolectar luz que enfoca una imagen real del objeto dentro del microscopio.
Esa imagen es entonces magnificada por un segundo objetivo o grupo de lentes que le da al
espectador una imagen virtual invertida agrandada del objeto. Utiliza una combinación de
objetivo y ocular compuesto permitiendo una magnificación mucho más alta.
Los microscopios ópticos compuestos ofrecen lentes objetivos intercambiables, lo que
permite al usuario ajustar rápidamente la ampliación. También permite configuraciones más
avanzadas de la iluminación, tales como contraste de fase.

Fuente Arquimed

Figura 2-9. Microscopio óptico compuesto


36

2.2.1.8. Incubadora de CO2

Dispositivo que sirve para mantener y hacer crecer cultivos microbiológicos o cultivos
celulares. La incubadora mantiene la temperatura, la humedad y otras condiciones en grado
óptimo, tales como el contenido de dióxido de carbono (CO2) y de oxígeno en su atmósfera
interior.

Fuente: Equipos y laboratorios

Figura 2-10. Incubadora de CO2.

2.3. DILUCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO DE LA MUESTRA

Luego de la homogeneización viene la dilución y enriquecimiento de la muestra de


sushi, esta tiene por objetivo la preparación de una solución madre de muestra de alimento, a
partir de la cual se realiza inoculación y siembra microbiológica en los diversos medios de
cultivo. El caldo utilizado corresponde a Caldo Sal y Manitol, el cual es un caldo de
enriquecimiento selectivo para el aislamiento de Staphylococcus aureus.
37

2.3.1. Materiales y equipos

- Autoclave
- Incubadora de CO2
- Mechero bunsen
- Cámara refrigerada
- Balanza analítica
- Pipetas
- Cuchillo estéril
- Espátula estéril
- Bolsas de polietileno (16 x 25). Estériles
- Placas Petri
- Asa loop

2.3.2. Reactivos y soluciones

- Agua destilada

2.3.3. Medios de cultivo

- Caldo con sal y manitol (10% NaCl)


- Agar Baird Parker
- Agar manitol
- Agar nutritivo

2.3.4. Procedimiento

- Se limpian cuidadosamente las manos con jabón y agua.


- Limpieza y sanitizado de la superficie de trabajo con Etanol.

2.3.5. Composición y fundamento de los medios de cultivo


38

2.3.5.1. Caldo con sal y manitol

Uso: Es una fórmula modificada para la detección y aislamiento de estafilococos


patógenos en alimentos.
Principios: Contiene como carbohidrato fermentable solamente manitol, rojo fenol,
como indicador para una fácil detección y una concentración anormalmente alta de sal para
inhibir organismos no deseados.
Formula, ingredientes por litro de agua destilada:

Triptona 17g
Digestivo pancreático de caseína, Soytona 3g
Digestivo papaico de judía de soja, Manitol 2,5g
Cloruro sódico 100g
Fosfato dipotásico 2,5g
Rojo fenol 0,025g
pH final 7,3 ± 0,2 a 25°C

Método de preparación:

1. Suspender 125g en 1 L de agua destilada o desionizada. Caliente hasta la ebullición para


disolver por completo.
2. Dispense en matraces de 100 ml una cantidad de 50 ml para cada uno.
3. Esterilice en autoclave durante 15 min a 121°C
4. Deje enfriar al menos a 37°C, e inocule con cultivo.
5. Incube a 35°C durante 18-48 h. 72 h pueden ser requeridas para algunos organismos.

Almacenamiento:

- Caldo con sal y manitol por debajo de los 30°C


- Medio preparado de 15-30°C
- Control de calidad, especificaciones de identificación:
- El polvo deshidratado debe estar de color rosa, homogéneo, fluido
39

- La reacción de la solución al 12,5% pH 7,3 ± 0,2 a 25°C

Resultado típico al cultivo:

+ = positivo, amarillo
− = negativo, sin cambios, rojo

Para Staphylococcus aureus el crecimiento es de bueno a excelente mientras que la


producción de ácido es positiva.
Procedimiento experimental:

- Se pesan 5 g de muestra homogeneizada en una bolsa estéril de polietileno.


- Se agrega parte de caldo sal manitol a la bolsa conteniendo la muestra y se homogeniza.
- Se traspasa la solución homogénea preparada al matraz conteniendo Caldo sal manitol.
- Se procede a incubar el matraz conteniendo la muestra a 37°C por 24 h lo que permitirá
un enriquecimiento de la muestra, para el posterior análisis microbiológico.

Determinación de Staphylococcus aureus por enriquecimiento previo y aislamiento


La determinación de Staphylococcus aureus se realiza a través del método de
enriquecimiento y aislamiento en la cual, luego de un enriquecimiento previo de la muestra en
caldo sal manitol, se inocula y se siembra en la superficie de los medios adecuados, se
seleccionan las colonias y se aíslan para posterior tinción gram y pruebas confirmativas.

2.3.5.2. Agar manitol

Según Difco & BBL Manual. (s.f) el agar manitol se caracteriza por:
Uso: Es un medio selectivo usado para el aislamiento de estafilococos patógenos.
Introducción/ Principios:
Se prepara de acuerdo con la fórmula sugerida por Chapman. El crecimiento de la
mayoría de las bacterias diferentes a estafilococos queda inhibido por la alta concentración de
sal.
Koch, informó que sobre medios sólidos los estafilococos no eran inhibidos por una
concentración de cloruro de sodio 7,5%. Chapman confirmó esta observación y notó que la
adición de un 7,5% de cloruro sódico a agar con manitol y rojo fenol proporcionaba un medio
40

sobre el cual los estafilococos que coagulaban el plasma de conejo crecían de forma exuberante,
produciendo colonias con zonas amarillas. Los estafilococos no patógenos producían colonias
pequeñas sin cambio de color en el medio circundante. Otras bacterias eran generalmente
inhibidas, haciendo posible el empleo de un inoculo grande sin peligro de sobrecrecimiento.
Chapman recomendó la incubación durante 36 h a 37°C. en un estudio de resistencia a mastitis
bovina estafilococal crónica con terapia masiva de penicilina, McClullon manifestó que los
estafilococos resposnsables de la mastitis crecían bien y formaban ácido en agar con manitol y
rojo fenol al cual se le había añadido un 7,0% de cloruro sódico. Velilla, Faber y Pelczar usaron
agar con sal y manitol para el aislamiento de estafilococos productores de coagulasa en leche
con mastitis bovina. Ellos recomendaron el uso de agar con sal y manitol y medio para
estafilococos para asegurar la máxima recuperación de estos organismos.
Formula, ingredientes por litro de agua destilada:

Peptona proteosa número 3, Difco 10g


Extraco de carne 1g
D-manitol 10g
Cloruro sódico 75g
Agar 15g
Rojo fenol 0,025g
pH final 7,4 ± 0,2 a 25°C

Método de preparación:

1. Suspender 111g en 1 L de agua destilada o desionizada y caliente hasta la ebullición


para disolver por completo.
2. Esterilice en autoclave durante 15 min a 121°C.
3. Enfríe a 45-50°C.
4. Disperse en placas Petri estériles.

Almacenamiento:
- Agar con sal y manitol por debajo de los 30°C
- Medio preparado de 2-8°C
- Control de calidad, especificaciones de identificación:
41

- El polvo deshidratado debe estar beige rosáceo, homogéneo, fluido


- La reacción de la solución al 11,1% pH 7,4 ± 0,2 a 25°C

Medio preparado debe ser rojo, muy ligeramente opalescente


Procedimiento

- Inocular la muestra contenida en caldo sal manitol mediante asa loop.


- Sembrar en agotamiento por estrías en la superficie de Agar Manitol
- Incubar las placas por 48 h a 37⁰C.

Resultado típico al cultivo:


Para Staphylococcus aureus el crecimiento es de bueno a excelente mientras que el
color de la colonia es amarillo.

2.3.5.3. Agar base de Baird Parker

Según Difco & BBL Manual. (s.f) el agar Baird-Parker se caracteriza por:
Uso: El Agar base de Baird Parker, cuando se suplementa con enriquecimiento con
telurito EY se recomienda para la detección y enumeración de estafilococos positivos a la
coagulasa en alimentos y en otros materiales.
Introducción/ Principios:
El medio completo se prepara añadiendo, asépticamente, enriquecimiento con telurito
EY al agar base de Baird Parker. El medio permite la detección, enumeración y aislamiento de
estafilococos positivos a la coagulasa, después de 24 horas de incubación en una variedad de
especímenes, tales como productos alimenticios, aire, suelos, especímenes fecales de la piel y
membranas mucosas.
El medio contiene litio y telurito potásico para suprimir el crecimiento de organismos
no deseados, en tanto que permite crecer Staphylococcus aureus. Además, incluye piruvato y
glicina para potenciar el crecimiento de estafilococos. El telurito y los componentes de la yema
de huevo son los responsables de la diferenciación de estafilococos positivos a la coagulasa por
la formación de colonias convexas, de color negro, brillantes, rodeadas por una zona
transparente debida a los estafilococos negativos a la coagulasa. El crecimiento de estos últimos
se puede observar sólo ocasionalmente, y las colonias, con anchas zonas opacas, que aparecen
42

después de 24 h de incubación a 37°C, se distinguen fácilmente por su irregular apariencia.


Proteus o especies de Bacillus pueden también crecer, pero como colonias de color marrón.
Formula, ingredientes por litro de agua destilada:

Triptona 10g
Extracto de carne 5g
Extracto de levadura 1g
Glicina 12g
Piruvato sódico 12g
Cloruro de litio 5g
Agar 20g
pH final 7,0 ± 0,2 a 25°C

Método de preparación:

1. Suspender 63g en 950 ml de agua destilada o desionizada. Caliente hasta la ebullición


para disolver por completo.
2. Esterilice en autoclave durante 15 min a 121°C.
3. Deje que se enfríe a 45-50°C. Entre tanto, caliente el enriquecimiento con telurito EY a
45-50°C.
4. Agite el enriquecimiento completamente para suspender el precipitado.
5. Asépticamente, añada 50 ml de enriquecimiento para preparar la base. Mezcle
totalmente y disperse como desee. Se recomiendan 15 ml aproximadamente para placas
Petri estándar, al fin de conseguir un espesor suficiente para observar las zonas
transparentes.
6. Deje que se sequen las superficies, después extienda 0,1 ml de inóculo sobre las placas.
7. Incube a 37°C y lea después de 24-26 h. Si el resultado es negativo para estafilococos,
vuelva incubar durante 24 h más y vuelva a leer.

Almacenamiento:
- Agar base de Baird Parker por debajo de los 30°C
- Enriquecimiento con telurito EY de 2-8°C
- Medio preparado de 2-8°C
43

Control de Calidad, especificaciones de identificación:

- El polvo deshidratado debe estar tostado claro, homogéneo, fluido.


- El enriquecimiento debe ser amarillo canario, opaco con precipitado que se puede volver
a suspender.
- La reacción de la solución al 6,3% pH final 7,0 ± 0,2 a 25°C
- La base preparada debe estar ámbar claro a medio, muy ligeramente opalescente
- Placas preparadas de color amarillo, opaco
- Para Staphylococcus aureus el crecimiento es de bueno a excelente mientras que el color
de la colonia es de color negra con presencia de lecitinasa halos.

Procedimiento:

- Inocular la muestra contenida en caldo sal manitol mediante asa loop.


- Sembrar en agotamiento por estrías en la superficie de Agar Baird Parker
- Incubar las placas por 48 h a 37⁰C.
Resultado típico al cultivo:
- Agar Baird Parker serán colonias de color negro o gris oscuro, brillantes, convexas, de
2- 3 mm de diámetro, de consistencia cremosa y que presenten una o más de las
siguientes características:
- Discreta zona de precipitado debajo de la colonia.
- Una zona clara o halo alrededor de la colonia, con una zona de precipitado debajo de
ella.
- Una zona clara o halo alrededor de la colonia, sin precipitado.

2.3.5.4. Agar nutritivo

Uso: Se utiliza para el cultivo de la mayoría de los microorganismos menos exigentes.


Introducción:
Se emplea para el análisis común de rutina del agua, aguas residuales, y productos
alimenticios; Para el transporte de cepas; para el transporte de cepas; para el cultivo preliminar
de muestras sometidas a exámenes bacteriológicos; y para aislar organismos en cultivos puros.
Medio de cultivo no selectivo, en la cual la peptona
44

Formula, ingredientes por litro de agua destilada:


Método de preparación:

Extracto de carne 3g
Peptona 5g
Agar 15g
pH final 6,8 ± 0,2 a 25°C

1. Suspender 23g en 1L de agua destilada o desionizada y caliente hasta la ebullición


para que se disuelva por completo.
2. Esterilice en autoclave durante a 120°C por 15 min a 1 atm de presión
3. Disperse como desee.

Almacenamiento:
- Agar con nutritivo por debajo de los 30°C
- Medio preparado de 15 a 30°C

Control de calidad, especificaciones de identificación:


- El polvo deshidratado debe estar beige, homogéneo, fluido
- La reacción de la solución al 2,3% pH 6,8 ± 0,2 a 25°C
- Medio preparado debe ser ámbar claro, de transparente a ligeramente opalescente, sin
precipitado de importancia.
- Para Staphylococcus aureus la recuperación es de buena a excelente
Procedimiento
- De las colonias típicas crecidas para cada medio, se inoculan y aíslan en Agar nutritivo
inclinado, los que se incuban a 37°C por 24 h para su posterior identificación
taxonómica.
- Para agar manitol las colonias deben ser de color amarillo y un medio circundante de
color amarillo. Y para agar Baird Parker serán colonias de color negro o gris oscuro,
brillantes, convexas, de 2- 3 mm de diámetro, de consistencia cremosa y que presenten
una o más de las siguientes características:
- Discreta zona de precipitado debajo de la colonia.
- Una zona clara o halo alrededor de la colonia, con una zona de precipitado debajo de
ella.
45

- Una zona clara o halo alrededor de la colonia, sin precipitado.

2.3.5.5. Tinción de Gram

Es uno de los procedimientos de tinción más útiles porque divide a las bacterias en dos
grandes grupos: gram negativos y gram positivos. Las bacterias reaccionan de forma diferente
a la tinción de Gram debido probablemente a diferencias químicas de sus paredes celulares, que
afectan a la retención o salida del complejo cristal violeta-yodo. Entre otras diferencias las
bacterias Gram positivas tienen una pared más gruesa compuesta de péptido glucano y la pared
de las Gram negativas tiene una capa externa con lipopolisacaridos.

Fuente: Elaboración propia.

Figura 2-11. Tinción gram en laboratorio microbiología USM JMC.

Materiales y equipos

- Microscopio óptico compuesto

Reactivos y soluciones

- Cristal Violeta
- Yodo
- Yoduro de Potasio
46

- Safranina
- Etanol 95% p/p

Preparación de soluciones

- Solución 0,5 g de cristal violeta


Pesar 0,5 g de cristal violeta.
Disolver en 100 ml de agua destilada.
Agitar, filtrar.
Guardar la solución en frasco gotario.
- Solución Lugol
Pesar 1 g de yodo y 2 g de yoduro de potasio.
Moler
Disolver en 300 ml de agua destilada
Agitar y guardar la solución en un frasco ámbar.
- Solución de safranina
Pesar 1 g de safranina y disolver en 10 ml de etanol
Agregar 90 ml de agua destilada
Filtrar y guardar en frasco gotario.

Procedimiento:

- Preparar un frotis y fijarlo a la llama.


- Adicionar el colorante cristal violeta durante 1 minuto, como imprime un color morado
a toda la preparación se denomina tinción primaria.
- Lavar el frotis con agua.
- Adicionar Lugol, un mordiente por 1 min
- Lavar el frotis con agua, cuando se lava el yodo tanto las bacterias gram-positivas como
gram-negativas aparecen de color violeta oscuro o morado.
- Adicionar etanol por 10 s, esta solución es un agente decolorante que elimina el color
morado de las células de algunas especies, pero no de otras.
- Lavar el frotis con agua.
- Adicionar safranina por 30 s.
- Lavar el frotis con agua.
47

- Secar al aire.
- Observar al microscopio con objetivo de inmersión.

2.4. COMPOSICIÓN Y FUNDAMENTOS DE LOS MEDIOS PARA LAS


PRUEBAS CONFIRMATIVAS

Las pruebas o ensayos bioquímicos son aquellas que ponen en evidencia la existencia
de una enzima o pasos metabólicos determinados y se realizan para la identificación de
microorganismos.

2.4.1. Materiales y equipos

- Balanza analítica
- Autoclave vertical
- Incubadora de CO2
- Sistema de purificación de agua

2.4.2. Reactivos y soluciones

- Etanol al 95% p/p


- Ácido Clorhídrico 1N

2.4.3. Medios de cultivo

- Plasma de conejo con ácido etilodiaminotetracetico. (EDTA)


- Caldo extracto cerebro-corazón (B.H.I)
- Agar Dnsa

2.4.4. Caldo extracto cerebro- corazón (B.H.I)

La infusión cerebro-corazón es una fórmula muy rica que puede emplearse, ya sea
como caldo o medio sólido, con sangre adicional o sin ésta, para el crecimiento de una gran
48

variedad de microorganismos. Los componentes clave incluyen infusión de distintos tejidos


animales con el agregado de peptona, tampón fosfato y una pequeña concentración de glucosa
que proporciona una fuente de energía fácilmente accesible a los microorganismos. Los caldos
infusión cerebro-corazón se emplean con frecuencia como medio para hemocultivo y como
medio base para muchas pruebas metabólicas, en especial para la identificación de
estreptococos.
Formula, ingredientes por litro de agua destilada:

Triptona 10g
Extracto cerebro de ternera 12,5g
Extracto corazón de buey 5g
Cloruro sódico 5g
Fosfato disódico 2,5g

Preparación:

- Disolver por calentamiento hasta ebullición.


- Ajustar el pH a 7,4.
- Repartir en tubos de ensayo a razón de 10 ml.
- Esterilizar a 121°C durante 20 min.
- Se conserva varios meses en refrigeración.

2.4.5. Coagulasa

Permite separar Staphylococcus aureus, que posee coagulasa, de las otras especies de
estafilococos que genéricamente se denominan coagulasa negativos.
Staphylococcus aureus posee dos tipos de coagulasa:

- Una endocoagulasa o coagulasa ligada o "clumping factor" que está unida a la pared
celular. Esta actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la formación de
coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado
(test en lámina).
49

- Una exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de un factor


(CRF), formándose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno
produciéndose un coágulo de fibrina (test en tubo).

Reconstitución del plasma:

- Se reconstituye el plasma de conejo añadiendo agua estéril destilada o desionizada al


vial indicado en la etiqueta del envase (3 ml).
- Girar el vial con suavidad hasta que el producto se haya disuelto por completo. Si el
producto no se disuelve por completo o si contiene fibras o coágulos de fibrina, no
utilizar el producto.

Prueba de Coagulasa:

- De las colonias aisladas en Agar nutritivo se siembra sobre tubos conteniendo medio
BHI, incubar a 35⁰C por 24 h.
- Mediante una micropipeta estéril de 1 ml, añadir 0,3 ml de Plasma reconstituido y 0,1
ml de cepa contenida en medio BHI a un tubo de ensayo.
- Incubar a 35°C por y examinar periódicamente por un lapso de 6 h para observar la
formación de coagulo, solamente un coagulo firme y completo que permanece en su
lugar al agitar o invertir el tubo, es considerado positivo para Staphylococcus aureus. Si
se obtiene una coagulación parcial, estas colonias deben ser confirmadas mediante la
prueba Dnasa.

2.4.6. Desoxirribonucleasa

Permite diferenciar Staphylococcus aureus que es la única especie dentro del género
Staphylococcus que posee DNAsa de las otras especies. La desoxirribonucleasa es una poderosa
enzima elaborada por las cepas patógenas de Staphylococcus aureus. Se caracteriza por
depolimerizar el ADN y por su termorresistencia, razón por la que se denomina termonucleasa.
Se basa en la presencia de la enzima que es capaz de separar los enlaces fosfodiester internos
de la molécula de DNA. Se utiliza un medio sólido que contiene verde de metilo el cual se
combina con DNA altamente polimerizado.
50

Cuando la combinación no ocurre, por acción de la enzima DNAsa, se produce una


decoloración del medio.
Formula, ingredientes por litro de agua destilada:

Triptona 20g
Acido desoxirribonucleico 2g
Cloruro sódico 5g
Agar 12g

Preparación

- Disolver por calentamiento.


- Ajustar el pH a 7,3
- Esterilizar en autoclave 15 min a 121⁰C.
- Preparar placas de Petri.
- El pH óptimo para la elaboración de la Dnasa por Staphylococcus aureus es 8,3.

Procedimiento

- De las colonias aisladas en Agar nutritivo se siembra en estrías radicales o en una sola
estría, sobre la superficie de agar DNasa.
- Incubar a 37⁰C durante 18 a 24 h.
- Sobre el crecimiento se vierte ácido clorhídrico 1N y se espera unos minutos a que se
produzca la reacción, que consiste en la aparición de una zona transparente a su
alrededor, lo que indica que el germen en estudio ha liberado desoxirribonucleasa
(DNasa).
- Se puede sustituir el ácido clorhídrico 1N por solución de azul de toluidina. En este
caso, la reacción positiva se manifiesta por la aparición de un halo rosa que rodea la
zona de crecimiento.
51

2.4.7. Catalasa

La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y


anaerobias facultativas que contienen citocromo, la excepción principal el género
Streptococcus. Cuando hay oxígeno, se produce la descomposición aerobia de los azúcares. El
peróxido de hidrógeno H2O2, si se acumula es tóxico para las bacterias y causa su muerte. Para
evitar esto los microorganismos lo descomponen a través de la acción de la enzima catalasa.

𝐶𝐴𝑇𝐴𝐿𝐴𝑆𝐴
2H2O2 > 2H2O + O2

Procedimiento:

Se siembra en un vidrio portaobjeto el microorganismo a analizar. Se añade una gota


de agua oxigenada (peróxido de hidrógeno) al 3% y se observa el resultado de la reacción.
Para la realización de esta prueba, se utiliza un cultivo de 18-24 h de incubación de
Staphylococcus aureus.

Resultados:

La prueba positiva produce burbujas, producto del oxígeno liberado. La prueba


negativa no de producción de burbujas.

2.4.8. Oxidasa

El objetivo de esta prueba es determinar la presencia de la enzima citocromo oxidasa.


La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo que activa la oxidación
del citocromo reducido por el oxígeno, el que a su vez actúa como aceptor de electrones en la
etapa terminal del sistema de transferencia de electrones.
El oxígeno oxida a un sustrato en la respiración con la intervención del sistema de
transporte de electrones. El oxígeno es el aceptor de hidrógenos final, produciendo agua o
peróxido de hidrógeno, según le especie.
Todas las especies que producen una enzima oxidasa, cuando se encuentran en
presencia de oxígeno atmosférico, citocromo C y un reactivo de oxidasa, oxidan el reactivo para
formar un compuesto coloreado. Los colorantes para esta prueba son aceptores de electrones
52

artificiales, actuando como reductores del sistema citocromo C oxidasa, el reactivo N,N dimetil,
1,4 fenilendiamina clorhidrato es a la vez aceptor y dador de electrones. La prueba se realiza
utilizando un papel filtro que se impregna con el reactivo oxidasa en una solución acuosa al
1%, el cual es muy sensible a la luz y al aire.
Los microorganismos utilizan una gran variedad de compuestos orgánicos, incluyendo
carbohidratos. Los polisacáridos, trisacáridos y disacáridos son muy complejos para entrar en
la célula bacteriana, por lo que primero son catabolizados a monosacáridos, siendo estos una
fuente energética de muchos microorganismos. Las vías y los productos finales de la
fermentación dependen del sustrato, de las enzimas presentes y de las condiciones en las que se
lleva a cabo la reacción. Las bacterias pueden clasificarse en fermentadores con producción de
ácido y fermentadores con producción de ácido y gas. Algunas bacterias pueden fermentar la
glucosa anaeróbicamente, otros la oxidan y algunos microorganismos pueden metabolizarla por
ambos mecanismos, mientras otras bacterias son incapaces de utilizarla.
Los productos finales detectables, característicos en una prueba bioquímica
relacionada con carbohidratos son:

a) ácido láctico
b) ácido láctico y fórmico
c) ácido láctico y alcohol etílico (etanol)
d) acetilmetilcarbinol (acetoína) y dióxido de carbono
e) etanol
f) ácido succínico -----> ácido propiónico y CO2
g) CO2 y acetona a alcohol isopropílico
h) ácido butírico a butanol

Procedimiento:

El cultivo de los microorganismos debe ser de 18-24 h, sembrados en agar inclinado.


Se toma un inoculo del cultivo y se coloca en contacto con el papel filtro impregnado con el
reactivo de oxidasa utilizando un asa de vidrio, ya que un asa de metal puede dar falsos
resultados si se le desprende un metal.
53

Resultados:

La reacción positiva se verá al obtener un color violeta oscuro al extender la masa


bacteriana sobre el papel de filtro impregnado con el reactivo de oxidasa. La reacción negativa
no dará coloración.

2.4.9. Agar tres azúcares hierro (TSI)

Es un medio diferencial según la fermentación de tres azúcares (lactosa, sacarosa y


glucosa) y producción de ácido sulfhídrico además de gas.
La degradación del azúcar con formación de ácido se detecta por el viraje a amarillo
del indicador, mientras que la alcalinización vira a rojo violeta. Si sólo se degrada la glucosa,
la producción de ácido es débil y en la superficie se evapora el dióxido de carbono producido
por la oxidación de la glucosa, y el microorganismo utiliza las peptonas, quedando el medio de
color rojo violeta y en el fondo en cambio, el medio permanece de color amarillo, debido a que
se ha seguido la fermentación de la glucosa, lo que produce ácidos fuertes no volátiles. Si se
degrada la lactosa y la sacarosa, la producción de ácido es intensa, y todo el medio (fondo y
superficie) quedan amarillos. La producción de gas se detecta por la formación de burbujas, y
eventualmente un agrietamiento del agar. La producción de ácido sulfhídrico ya sea a partir
del tiosulfato, como de los aminoácidos azufrados de las peptonas, se detecta por la formación
de precipitados negros de sulfuro de hierro cuando reacciona el ácido sulfhídrico producido con
las sales de hierro del medio.

Procedimiento:

El medio se utiliza en tubos inclinados, con fondo abundante y una cuña corta, que se
siembra en estría en la superficie y picadura en el fondo. Es recomendable utilizar tubos con
tapones de algodón para permitir la re-oxidación del indicador. Si se utilizan tapones de rosca,
estos deben aflojarse para permitir el intercambio gaseoso.

Resultados.

K/A = Superficie alcalina sobre fondo amarillo ácido


A/A = Superficie ácida amarilla sobre fondo ácido amarillo
54

R/R = El medio no sufre cambios


K/K = Superficie alcalina sobre fondo alcalino
K/R = Superficie alcalina sobre fondo sin cambio

Tabla 2-1. Resultados prueba Agar tres azúcares hierro

Color y aspecto Superficie Fondo


A Amarillo Fermentación de Fermentación de
lactosa y/o sacarosa glucosa y
con producción de formación de ácido.
ácido.
K Rojo intenso No hay No se fermenta la
fermentación de glucosa y se
lactosa ni de la produce formación
sacarosa y hay de álcali
formación de álcali.
R Sin cambios No hay No hay
fermentación de fermentación de
lactosa ni de glucosa
sacarosa.
G Aparición de Formación de gas a
grietas o burbujas partir de glucosa
H2S + ennegrecimiento Negro
-negativo
Fuente:

2.4.10. Agar Hierro Lisina (LIA)

Es un medio diferencial, se basa en la reacción de descarboxilación del aminoácido


lisina, o bien en la desaminación del aminoácido, y la producción de ácido sulfhídrico.
El medio contiene glucosa (dextrosa), que es rápidamente fermentada por el
microorganismo, produciendo acidificación en el cual aparece una coloración amarilla en el
medio.
Los microorganismos capaces e descarboxilar la lisina producen alcalinización en el
medio, donde el color amarillo formado se transforma en un color violeta, debido a que el
indicador pasa a su forma básica. La producción de ácido sulfhídrico queda en evidencia por la
aparición de una coloración negra en el tubo.
55

Procedimiento:

Se siembran un inoculo del microorganismo por picadura hasta el fondo del tubo y por
estría en la superficie de la cuña. Se deja incubar durante 24 h a 37°C.

Resultados:

K= Alcalinización (color morado violeta)


A= Acidificación (color amarillo)
R= Rojo (color rojo, desaminación de la lisina)
+= Sulfatorreductora
-= No reductora del sulfato

Prueba positiva: Color púrpura turbio o púrpura amarillento apagado (producido por
la cadaverina).
Prueba negativa: Color amarillo claro y brillante (solamente fermentación de la
glucosa).
Producción de hierro: Precipitado negro en el fondo del tubo.

2.4.11. Pruebas IMVIC

Son un conjunto de cuatro pruebas bioquímicas que sirven para caracterizar bacterias
e diferente géneros que existen en la naturaleza. Estas cuatro pruebas son Indol, Rojo de Metilo,
Voges-Proskauer y Citrato.

2.4.11.1. Indol

Se determina la capacidad de un microorganismo para producir Indol a partir de la


molécula de triptófano, presente en el caldo peptonado, a través de la enzima triptofanasa.
El triptofano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar
3 metabolitos indólicos principales: Indol, escatol e indolacético. Diversas enzimas
intracelulares que intervienen en este proceso reciben el nombre colectivo de triptofanasa, lo
que implica un complejo sistema de enzimas vinculadas a la producción de Indol.
56

Procedimiento:

El medio de cultivo para realizar esta prueba es agua peptonada (rica en triptofano), la
peptona se agrega al 1%.
Se distribuye en tubos de hemólisis a razón de 3 ml y de 5 ml en tubos de ensayo según
se utilice y se esteriliza en autoclave durante 15 min a 121ºC.
Se siembran los microorganismos problemas y se incuban a la temperatura adecuada durante
48 h.
La lectura se realiza con el reactivo de Kovacs, cuya composición es la siguiente:

p-dimetilaminobenzaldehido 5g
Alcohol isoamílico 75 ml
HCl concentrado 25 ml

Se disuelve el aldehído en alcohol, luego se añade lentamente el ácido. Se filtra si es


necesario.
Si se produce Indol, se formará un complejo con el aldehído, de color rojo. El HCl es
para favorecer la formación del complejo, que ocurre a pH ácido. El alcohol amílico es para
concentrar el color en la superficie del tubo.
En el resultado positivo se forma un anillo rojo en la superficie del tubo, mientras que
el resultado negativo no presenta ninguna coloración.

2.4.11.2. Prueba del rojo de Metilo

La prueba del rojo de metilo (RM) se basa en el empleo de un indicador de pH, rojo
de metilo, para determinar la concentración de iones hidrogeno presente cuando una bacteria
cataliza la glucosa.
Por medio de esta prueba se investiga si el microorganismo actúa por la vía ácido-
mixta sobre los azúcares. Ésta es una vía metabólica en la que se producen ácidos del tipo
fórmico, acético y succínico (ácidos muy fuertes dentro de la debilidad de los ácidos orgánicos).
Procedimiento:
El medio es líquido, se prepara y se distribuye a razón de 5 ml por tubo de ensayo y se
esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 min.
57

La lectura se realiza agregando solución de rojo de metilo, en solución alcohólica al


0,2% (p/v).
Una vez que se siembra, se deja incubar por 48 h y leer los resultados.
Resultados:
Si el microorganismo ha producido ácidos a partir de la glucosa el medio mantendrá
el color del indicador. El indicador amarillo naranja significara que el medio está neutro dando
negativo para rojo de metilo.

2.4.11.3. Prueba de Voges-Proskauer

La reacción de vogues-proskauer se basa en la detección del acetilmetilcarbinol


(acetoína) a partir de la fermentación butanodiólica de la glucosa.
Las bases bioquímicas de la prueba consideran que, a partir del ácido pirúvico, una
bacteria puede seguir vías metabólicas diferentes para la obtención de energía, según la
composición de su sistema enzimático. Una de estas vías es la fermentación butanodiólica, cuyo
producto final es el 2,3 butanodiol, en que la acetoína es su precursor. La prueba de VP se basa
en la detección de este último metabolito.
La acetoína que se produce en la fermentación cuando reacciona con el hidróxido de
potasio (al 40% p/v) es oxidada a diacetilo, el que a su vez reacciona con los grupos
guanidínicos de la arginina, que está presente en las peptonas que constituyen el medio, dando
una coloración rojiza.
Procedimiento:
Para esta prueba se utiliza el mismo medio que se usa para la prueba del rojo de metilo.
Se siembra un inoculo del microorganismo y se incuba a 37°C durante 48 h.
La lectura se realiza agregando al cultivo 6 a 8 gotas de una solución de KOH al 40%
y luego 1ml de solución alcohólica de alfa naftol al 5% (p/v).
Se debe esperar hasta 20 min para realizar la lectura, tiempo en el cual se deja en la
estufa, el cultivo con los reactivos agregados.
Resultados:
La formación de un anillo rosa fluorescente en la superficie del tubo indica que la
prueba es positiva. Para un resultado negativo no se forma el anillo.
58

2.4.11.4. Prueba del citrato

En esta prueba se determina si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como


única fuente de carbono para el metabolismo, provocando una alcalinización en el medio.
Los microorganismos que utilizan el citrato tienen la enzima citrato permeasa, que
permite el paso del citrato a través de la membrana celular.

Procedimiento:

El medio para la prueba es el Kocer citrato (líquido) o citrato de Simmons (sólido e


inclinado en tubo). Estos medios contienen citrato como única fuente de carbono, sales
minerales y además un indicador de pH, el azul de bromocresol.

Resultados:

Para que el resultado sea positivo el medio vira de verde a azul, ocurriendo una
alcalinización de este. Si el medio permanece igual (verde) será un resultado negativo.

2.4.12. Medio Movilidad, Indol y Ornitina (MIO)

Es un medio diferencial que se utiliza para la identificación de enterobacterias en base


a su movilidad, actividad de la enzima ornitina descarboxilasa y producción de indol.
Procedimiento:
El medio de cultivo se encuentra preparado comercialmente y se suspende a razón de
31 g por litro de medio. Se calienta hasta ebullición para la disolución de los componentes, se
distribuye en tubos de ensayo a razón de 5 ml por tubo y se esteriliza en autoclave a 121ºC por
15 min. Se deja solidificar en posición vertical.
El microorganismo se siembra por picadura, y se deja incubar durante 24 h a 37°C.
Como es un agar semisólido, la movilidad se demuestra por un enturbiamiento del
medio o un crecimiento que difunde desde la línea de inoculación.
59

Resultados:

La reacción de la ornitina se indica mediante un color púrpura en todo el medio, este


color puede variar en intensidad y puede blanquearse a un color pálido debido a la reducción
del indicador. La reacción se debe a que el organismo fermenta la dextrosa del medio,
reduciendo su pH, esta condición ácida origina que el indicador púrpura de bromocresol se
vuelva amarillo y proporcione las condiciones óptimas para la descarboxilación de la ornitina.
Si ocurre esta reacción, el pH sube como resultado y el indicador se vuelve púrpura. Los cultivos
negativos a la ornitina producen un tubo amarillo que puede ser púrpura en la parte superior.

2.4.13. Hidrolisis de la Urea

Se determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos


moléculas de amoníaco por acción de la enzima ureasa.
La urea es una diamina del ácido carbónico (carbamida), la hidrólisis de la urea es
catalizada por una enzima específica la ureasa (urea aminohidrolasa), para dar dos moléculas
de amoníaco. En solución, la urea se hidroliza, dando carbonato de amonio como producto final.
Esta enzima está vinculada con la descomposición de los compuestos orgánicos. La ureasa
rompe por hidrólisis el enlace entre el N2 y el C siendo el N2 disociado a amoníaco.

Resultados:

- Prueba positiva: color rosado intenso


- Prueba negativa: color rosado.

2.5. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO CEPA DE REFERENCIA


STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Con el objetivo de realizar verificación y comparación de resultados, se realizan las


pruebas bioquímicas a una cepa liofilizada de Staphylococcus aureus, la cual está identificada
Staphylococcus aureus ATCC 25923
60

2.5.1. Liofilización

La liofilización es un método utilizado para preservar las bacterias, en la investigación,


así como en la industria. La liofilización consiste en un proceso mediante el cual el agua es
retirada de un producto congelado por sublimación bajo presión reducida. Este proceso se
realiza en tres fases: primero el producto es pre congelado para asegurar una estructura inicial
sólidamente congelada, después se procede con el secado primario durante el cual el 90 a 95%
de agua es retirada y finalmente el producto es sometido a un secado secundario para retirar el
agua restante. No toda el agua es retirada y lo que resta representa la humedad residual. Para
volver a su estado inicial los cultivos liofilizados necesitan ser rehidratados y colocados en un
medio de cultivo adecuado.

Fuente: elaboración propia

Figura 2-12. Liofilización

2.6. DESCRIPCIÓN EXPERIMENTAL

Se realizo un total de 8 muestreos durante los meses de mayo, agosto y noviembre de


2017. La toma de muestras ambulantes fue colectada en diferentes partes de la ciudad de Viña
del Mar.
61

Tabla 2-2. Composición muestras de sushi

COMPOSICION MUESTRAS DE SUSHI


MUESTRA Palta (envoltura), arroz, alga nori, pollo y queso
1 crema.
MUESTRA
2 Queso crema (envoltura), arroz, alga nori y pollo.
MUESTRA
3 Palta (envoltura), arroz, alga nori, pollo y queso crema.
MUESTRA
4 Palta (envoltura), arroz, alga nori, pollo y queso crema.
MUESTRA Arroz con sésamo (envoltura), alga nori, pimentón, pollo y
5 queso crema.
MUESTRA
6 Alga nori (envoltura), arroz, camarón y queso crema.
MUESTRA
7 Palta (envoltura), arroz, alga nori, camarón y queso crema.
MUESTRA
8 Alga nori (envoltura), arroz, pollo y queso crema.
Fuente: elaboración propia

Fuente: elaboración propia


62

Figura 2-13. Muestras de sushi analizadas


2.6.1. Procedimiento experimental

- Se limpian cuidadosamente las manos con jabón y agua.


- Limpieza y sanitizado de la superficie de trabajo con Etanol.

2.6.1.1. Homogeneización:

- Se pesan 5 g de muestra homogeneizada en una bolsa estéril de polietileno.


- Se agrega parte de caldo sal manitol a la bolsa conteniendo la muestra y se homogeniza.
- Se traspasa la solución homogénea al matraz con Caldo sal manitol.
- Se incuba el matraz a 37°C por 24 h
- Sembrar en agotamiento por estrías en la superficie de Agar Manitol y Agar Baird
Parker.
- Incubar las placas por 48 h a 37⁰C.

Fuente: elaboración propia

Figura 2-14. Placas Agar Manitol

Fuente: elaboración propia


63

Figura 2-15. Placas Baird Parker


- De las colonias representativas crecidas para cada medio, se inoculan y aíslan en Agar
nutritivo inclinado, los que se incuban a 37°C por 24 h para su posterior identificación
taxonómica.

2.6.1.2. Tinción gran

- Preparar un frotis utilizando un inoculo del agar nutritivo y fijarlo a la llama.


- Adicionar el colorante cristal violeta durante 1 min
- Lavar el frotis con agua.
- Adicionar Lugol, un mordiente por 1 min
- Lavar el frotis con agua
- Adicionar etanol por 10 s
- Lavar el frotis con agua.
- Adicionar safranina por 30 s
- Lavar el frotis con agua.
- Secar al aire.
- Observar al microscopio con objetivo de inmersión

Fuente: elaboración propia

Figura 2-16. Tinción Gram


64

2.6.1.3. Pruebas de confirmación bioquímica

Coagulasa:

- De las colonias aisladas en Agar nutritivo se traspasan a tubos con medio BHI, incubar
a 35⁰C por 24 h
- Mediante una micropipeta estéril de 1 ml, añadir 0,3 ml de Plasma reconstituido y 0,1
ml de cepa contenida en medio BHI a un tubo de ensayo.
- Incubar a 35ºC y examinar periódicamente por un lapso de 6 h para observar la
formación de coagulo.

Fuente: elaboración propia

Figura 2-17. Plasma liofilizado de conejo y tubos Coagulasa positivos

Desoxirrinonucleasa:

- De las colonias aisladas en Agar nutritivo se siembra en estrías radicales o en una sola
estría, sobre la superficie de agar DNasa.
- Incubar a 37⁰C durante 18 a 24 h
- Sobre el crecimiento se vierte ácido clorhídrico 1N.
65

Fuente: elaboración propia

Figura 2-18. Prueba de confirmación Dnasa positivo

Catalasa:

Se siembra en un vidrio portaobjeto un inoculo del agar nutritivo. Se añade una gota
de peróxido de hidrógeno al 3% y se observa el resultado de la reacción.

Fuente: elaboración propia

Figura 2-19. Referencia resultados catalasa


66

Oxidasa:
Del agar nutritivo se extrae un inoculo de cultivo y coloca en contacto con el papel
filtro impregnado con el reactivo de oxidasa utilizando un asa de vidrio.

Fuente: elaboración propia

Figura 2-20. Tiras Prueba Oxidasa

Agar tres azucares hierro (TSI):

- Sembrar un inoculo del agar nutritivo por estría en la superficie y picadura en el fondo
del medio TSI.
- Incubar durante por 24 h a 37°C.

Fuente: elaboración propia

Figura 2-21. Medio TSI


67

Agar Hierro Lisina (LIA):

- Se siembran un inoculo del agar nutritivo por picadura hasta el fondo del tubo y por
estría en la superficie de la cuña en el tubo con medio LIA.
- Se deja incubar durante 24 h a 37°C.

Fuente: elaboración propia

Figura 2-22. Tubo con medio LIA.

Pruebas IMVIC
Indol:

- Se siembra un inoculo del agar nutritivo con asa loop y se traspasa a tubos con agua
peptonada.
- Incubar durante 48 h a 37°C
- Leer con reactivo kovacs
68

Fuente: elaboración propia

Figura 2-23. Prueba indol positiva.

Prueba del rojo de Metilo:

- Se siembra un inoculo del agar nutritivo en Caldo Rojo de Metilo/Voges-Proskauer


(RM/VP)
- Se deja incubar por 48 h a 37°C
- Realizar lectura agregando solución de rojo metilo, en solución alcohólica al 0,2% (p/v).

Fuente: elaboración propia

Figura 2-24. Prueba Rojo Metilo.


69

Prueba de Voges-Proskauer:

- Se siembra un inoculo del agar nutritivo en Caldo Rojo de Metilo/Voges-Proskauer


(RM/VP)
- Se incuba durante 48h a 37°C
- Se realiza la lectura con KOH al 40%

Fuente: elaboración propia

Figura 2-25. Prueba Voges-Proskauer.

Prueba del citrato:

- Se siembra un inoculo del agar nutritivo utilizando asa loop en un tubo con citrato de
Simmons inclinado.
- Incubar durante 24 a 48 h a 37°C.

Fuente: elaboración propia

Figura 2-26. Prueba del citrato


70

Medio Movilidad, Indol y Ornitina (MIO):

- Se siembra un inoculo del agar nutritivo en un tubo con el medio de cultivo por picadura.
- Se deja incubar durante 24h a 37°C

Fuente: elaboración propia

Figura 2-27. Medio Movilidad, Indol y Ornitina

Hidrolisis de la Urea:

- Se siembra un inoculo del agar nutritivo con un asa loop a un tubo con caldo urea
- se incuba durante 24 h a 37°C

Fuente: elaboración propia

Figura 2-28. Hidrolisis de la Urea


71

RESULTADOS Y RECOMENDACIONES

El proceso de elaboración de sushi requiere de una gran manipulación en donde está


expuesto a un alto riesgo de contaminación cruzada. Los factores de riesgo se deben disminuir,
para que el consumidor reciba alimentos inocuos y de calidad.
Muchas de las enfermedades transmitidas por los alimentos tienen su origen en la
manipulación de los alimentos.

Tabla 3-1. Cepa referencia

PRUEBAS CEPA REFERENCIA


PRUEBA MORFOLOGICA TINCION GRAM +
COAGULASA +
Dnasa +
CATALASA +

MEDIO MOVILIDAD, INDOL


(-) (+) (-)
Y ORNITINA (MIO)

PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN LIA K/K


BIOQUIMICA TSI A/A
CITRATO -
INDOL +
ROJO DE METILO +
VOGES-PROSKAUER +
UREASA -
OXIDASA -
Fuente: Elaboración propia
72

Tabla 3-2. Muestra 1

MUESTRA 1
PRUEBAS CEPA A (BP) CEPA B (BP) CEPA C (M) CEPA D (M)
TINCION GRAM + + + +
COAGULASA + + - -
Dnasa + + + -
CATALASA + + + +
MEDIO MOVILIDAD, INDOL Y
(-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)
ORNITINA (MIO)
LIA K/K K/K K/A A/A
TSI A/A A/A A/A A/A
CITRATO - - + +
INDOL + + + +
ROJO DE METILO + + + +
VOGES-PROSKAUER + + + -
UREASA - - - -
OXIDASA - - - -
Fuente: Elaboración propia

Tabla 3-3. Muestra 2

MUESTRA 2
PRUEBAS CEPA A (BP) CEPA B (BP) CEPA C (M)
TINCION GRAM + + +
COAGULASA + + +
Dnasa + + +
CATALASA + + +
MEDIO MOVILIDAD, INDOL Y ORNITINA
(-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)
(MIO)
LIA K/K K/K K/K
TSI A/A A/A A/A
CITRATO - - -
INDOL + + +
ROJO DE METILO + + +
VOGES-PROSKAUER + + +
UREASA - - -
OXIDASA - - -
Fuente: Elaboración propia
73

Tabla 3-4. Muestra 3

MUESTRA 3
CEPA A CEPA B CEPA C CEPA D CEPA D
PRUEBAS (BP) (BP) (BP) (M) (M)
TINCION GRAM + + + + +
COAGULASA + + + + +
Dnasa + + + + +
CATALASA + + + + +
MEDIO
MOVILIDAD,
INDOL Y ORNITINA
(MIO) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)
LIA K/K K/K K/K K/K K/K
TSI A/A A/A A/A A/A A/A
CITRATO - - - - -
INDOL + + + + +
ROJO DE METILO + + + + +
VOGES-
PROSKAUER + + + + +
UREASA - - - - -
OXIDASA - - - - -
Fuente: Elaboración propia
74

Tabla 3-5. Muestra 4

MUESTRA 4
PRUEBAS CEPA A (BP) CEPA B (BP) CEPA C (BP) CEPA D (M)
TINCION GRAM + + + +
COAGULASA + + + +
Dnasa + + + +
CATALASA + + + +

MEDIO MOVILIDAD, INDOL


(-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)
Y ORNITINA (MIO)

LIA K/K K/K K/K K/K


TSI A/A A/A A/A A/A
CITRATO - - - -
INDOL + + + +
ROJO DE METILO + + + +
VOGES-PROSKAUER + + + +
UREASA - - - -
OXIDASA - - - -
Fuente: Elaboración propia
75

Tabla 3-6. Muestra 5

MUESTRA 5
CEPA A CEPA B CEPA C CEPA D CEPA E
PRUEBAS (BP) (BP) (BP) (M) (M)
TINCION GRAM + + + + +
COAGULASA + + + - +
Dnasa + + + + +
CATALASA + + + + +
MEDIO
MOVILIDAD,
(-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)
INDOL Y ORNITINA
(MIO)
LIA K/K K/A K/K A/A K/K
TSI A/A A/A A/A A/A A/A
CITRATO - + - - +
INDOL + + + + +
ROJO DE METILO + + + + +
VOGES-
+ + + - +
PROSKAUER
UREASA - - - - -
OXIDASA - - - - -
Fuente: Elaboración propia
76

Tabla 3-7. Muestra 6

MUESTRA 6
PRUEBAS CEPA A (BP) CEPA B (BP) CEPA C (M)
TINCION GRAM + + +
COAGULASA + + +
Dnasa + + +
CATALASA + + +

MEDIO MOVILIDAD, INDOL Y ORNITINA


(-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)
(MIO)

LIA K/K K/K K/K


TSI A/A A/A A/A
CITRATO - - -
INDOL + + +
ROJO DE METILO + + +
VOGES-PROSKAUER + + +
UREASA - - -
OXIDASA - - -
Fuente: Elaboración propia
77

Tabla 3-8. Muestra 7

MUESTRA 7
CEPA A CEPA B CEPA C CEPA D CEPA E CEPA F CEPA G
PRUEBAS (BP) (BP) (M) (M) (M) (M) (M)
TINCION
+ + + + + + +
GRAM
COAGULASA + + + + + + +
Dnasa + + + + + + +
CATALASA + + + + + + +
MEDIO
MOVILIDAD,
INDOL Y (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)
ORNITINA
(MIO)
LIA K/K K/K K/K K/K K/K K/K K/K
TSI A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A
CITRATO - - - - - - -
INDOL + + + + + + +
ROJO DE
+ + + + + + +
METILO
VOGES-
+ + + + + + +
PROSKAUER
UREASA - - - - - - -
OXIDASA - - - - - - -
Fuente: Elaboración propia
78

Tabla 3-9. Muestra 8

MUESTRA 8
PRUEBAS CEPA A (BP) CEPA B (BP) CEPA C (M) CEPA D (M)
TINCION GRAM + + + +
COAGULASA + + - +
Dnasa + + + +
CATALASA + + + +

MEDIO MOVILIDAD, INDOL Y


(-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)
ORNITINA (MIO)

LIA K/K K/K K/A K/K


TSI A/A A/A A/A A/A
CITRATO - - - -
INDOL + + + +
ROJO DE METILO + + + +
VOGES-PROSKAUER + + + +
UREASA - - - -
OXIDASA - - - -
Fuente: Elaboración propia
79

Fuente: Elaboración propia

Gráfico 3-1. Gráfico de muestras

Tabla 3-10. Actividad de agua y temperatura de las muestras analizadas

NUMERO DE MUESTRA Aw T⁰
MUESTRA 1 0.926 22.93
MUESTRA 2 0.930 23.71
MUESTRA 3 0.936 23.91
MUESTRA 4 0.924 23.70
MUESTRA 5 0.914 23.11
MUESTRA 6 0.899 22.15
MUESTRA 7 0.933 23.90
MUESTRA 8 0.897 22.12
Fuente: Elaboración propia
80

Tabla 3-11. Cepas positivas y negativas

Nº de cepas %
Positivas 31 89%
Negativas 4 11%
Total 35 100%
Fuente: Elaboración propia

Cepas Aisladas

11%

Positivos

Negativos

89%

Fuente: Elaboración propia

Gráfico 3-2. Gráfico de las cepas aisladas, positivas y negativas en general.

Tabla 3-12. Tabla con las cepas aisladas según el medio de cultivo.

Medio Cepas aisladas %


Agar Baird Parker 19 54%
Agar Manitol 16 46%
Total 35 100%
Fuente: Elaboración propia
81

Nº de cepas aisladas segun


medio

46%
Baird Parker
54% Manitol

Fuente: Elaboración propia

Gráfico 3-3. Gráfico con las cepas aisladas según el medio de cultivo.
83

DISCUSIÓN

El método de enriquecimiento para la determinación de Staphylococcus aureus en


alimentos, es una técnica que, mediante el uso de un medio selectivo líquido, permite el
desarrollo del microorganismo en estudio, a partir de una muestra que contiene una gran
variedad de microorganismos. Así, aquellos microorganismos para los que el ambiente sea más
favorable crecerán más que los otros y finalmente serán predominantes. Y, por consiguiente, la
técnica de aislamiento tiene por objetivo separar las células microbianas, unas de otras. Una
vez separadas, estas pueden ser resembradas separadamente, obteniéndose así un cultivo puro.
Entre los inconvenientes que presenta esta metodología es la duración del análisis,
debido a que el enriquecimiento previo de la muestra antes de la siembra dura 24 horas,
posterior a la siembra deben transcurrir 48 horas de incubación.
El análisis consistió en un enriquecimiento previo de la muestra durante 24 horas en
Caldo Sal y Manitol, siembra en agotamiento por estrías en la superficie de medios Baird Parker
y Manitol para la detección de la bacteria en estudio, aislamiento para la obtención de cultivos
puros, luego se realizan pruebas morfológicas y confirmativas.
En la Figura 2-14. se observan las placas preparadas correspondientes a cada medio,
para Agar Manitol las colonias típicas crecidas son amarillas y un medio circundante de color
amarillo, y en la Figura 2-15. para Agar Baird Parker las colonias típicas se presentan de color
de gris oscuro a negro debido a la reducción del telurito.
La tinción de gram es una tinción diferencial que permite distinguir el tipo de bacteria,
según la reacción que se obtenga. Permite diferenciar dos clases de bacterias estas son:
Bacterias grampositivas y las gramnegativas. Las grampositivas se tiñen de morado ya que el
colorante se queda atrapado en la capa gruesa de peptidoglucanos que rodea a la célula
Las gramnegativas tienen una capa de petidoglucano mucho más delgada, es por ello
por lo que no retiene el violeta cristal y por esto las células se tiñen con safranina y se observan
rojas.
El método de Gram es una de las técnicas de tinción más importante en microbiología
médica. La reacción es más reproducible cuando se aplica a bacterias jóvenes en crecimiento
(cultivos de 18 – 24 horas). En la Figura 2-16. se encuentra uno de los frotis realizados en la
parte experimental, en el cual se observan cocos en forma de racimos, de coloración azul/
violeta correspondiente a una pared gram positiva.
84

Se realizó análisis a un total de 8 muestras de sushi, cuya composición se encuentra en


detalle en la tabla Tabla 2-2. Entre los principales ingredientes de las muestras analizadas se
encuentran: Arroz, queso crema, alga nori, palta, pollo y camarón. Los análisis fueron
realizados durante los meses de Septiembre de 2017 y Marzo de 2018.
Las muestras fueron adquiridas en bandejas plásticas, una de ellas en alusa metálica y
cartucho de papel.
De las 8 muestras analizadas se aislaron 35 cepas para estudio taxonómico, cuyos
resultados se observan en las tablas Tabla 3-2 hasta la Tabla 3-9.
Se realizó análisis a una cepa liofilizada de Staphylococcus aureus, con el objetivo de
comparar resultados, la cual fue inoculada en Caldo BHI, traspasada a Agar Baird Parker y
Agar Sal Manitol, y aislada para su posterior identificación taxonómica.
Al observar las tablas Tabla 3-2 hasta la Tabla 3-9. se infiere que, del total de 35 cepas,
31 resultaron ser positivas para Staphylococcus aureus, lo que equivale a un 89% y 4 cepas
negativas lo que equivale 11% del total, lo que se muestra en el Gráfico 3-2. Los resultados
anteriores, se atribuyen, posiblemente, al exceso de manipulación para la elaboración del
alimento analizado, sumado a las deficientes prácticas higiénicas y condiciones de
almacenamiento, lo que se refleja en los resultados obtenidos.
Del total de cepas 19 fueron aisladas de Agar Baird Parker y 16 de Agar Sal Manitol,
lo que corresponde a un 54% y 46% respectivamente, lo que se observa en el grafico Gráfico
3-3.
Además, se realizó medición de actividad de agua a cada una de las muestras
analizadas, este parámetro es uno de los factores intrínsecos que posibilitan o dificultan el
crecimiento microbiano en los alimentos. Por ello la medición de la actividad de agua es
importante para controlar dicho crecimiento.
En la Tabla 3-10. se observan los resultados obtenidos para las muestras analizadas.
Las muestras que presentaron mayores valores de 𝐴𝑊 corresponden a aquellas cuya
composición tenía como ingrediente principal y en mayor cantidad palta y queso crema,
mientras que el menor valor de actividad de agua obtenido corresponde a la muestra nº 8.
Los resultados de actividad de agua son directamente proporcionales a la temperatura
de la muestra, dado que ésta influye también sobre la presión de vapor de agua de las soluciones,
pero el efecto es pequeño con la mayoría de los solutos salvo que las soluciones sean saturadas.
En tales casos, las cantidades de algunas sustancias de la solución, y, por tanto, la Aw, puede
variar marcadamente con la temperatura. Los resultados obtenidos se encuentran entre rangos
de 0,897 a 0,936, intervalos en los que se multiplican microorganismos responsables de
85

intoxicaciones alimentarias. Staphylococcus aureus se multiplica a partir de una 𝐴𝑤


relativamente baja 0,86. Por otro lado, las temperaturas obtenidas se encuentran por sobre el
nivel de mayor proliferación para el microorganismo analizado las cuales se encuentran entre
20 y 37ºC. A partir de los valores anteriormente señalados, se confecciono el grafico que se
muestra en la Figura 3-1. actividad de agua y temperatura.
El punto 15.2 del Reglamento Sanitario De Los Alimentos establece criterios
microbiológicos correspondientes al tipo de alimento analizado. Entre los parámetros a analizar
se encuentra: Recuento Aerobios Mesófilos, E.coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,
Clostridium perfringens y Salmonella.
Con respecto a Staphylococcus aureus se establece un límite inferior de 50 U.F.C. /g
y 500 U.F.C./g como límite superior. La técnica de enriquecimiento y aislamiento de
Staphylococcus aureus permite evaluar presencia o ausencia del microorganismo, por lo que no
es posible realizar una comparación de resultados. Félix, Campas y Meza afirman que "se
necesitan cuentas mayores de 105 U.F.C./g del microorganismo para que se produzca la
enterotoxina en el alimento."

Fuente: Reglamento Sanitario de Los Alimentos Dto. Nº 977/96, Julio 2018.

Figura 29. Criterios Microbiológicos Comidas y platos mixtos con ingrediente(s) crudo(s) y/o
cocido(s), incluidos emparedados

De acuerdo con los resultados obtenidos, se infiere que existen medidas sanitarias
insuficientes en la elaboración de este producto, para evitar intoxicaciones alimentarias es
importante la preparación de los manipuladores de alimentos con el objetivo de cumplir con
adecuadas medidas de higiene al procesar los alimentos.
86

Para el consumidor, al adquirir el producto, es importante percatarse de las buenas


condiciones higiénicas que deben mantenerse en el almacenamiento y expendio, hasta el
consumo de los alimentos.
Los resultados del presente trabajo demuestran el alto riesgo de contraer alguna enfermedad
transmitida por los alimentos a la población que está expuesta día a día.
Es importante tomar conciencia del riesgo sanitario y contar con las medidas adecuadas para
mejorar el control sanitario de los alimentos disponibles al público, es necesaria una mayor
regulación en este tipo de ventas y educación sanitaria en el manejo de alimentos, tanto del
preparador de alimentos, como del consumidor.
87

CONCLUSIÓN

A partir del trabajo realizado se concluye que:

- El método de enriquecimiento y aislamiento es una técnica efectiva para la


determinación de Staphylococcus aureus en alimentos, pues se evidencia la presencia
de este microorganismo en las 8 muestras analizadas.
- Con respecto a los medios de cultivos empleados, en ambos se aisló el microorganismo
en estudio, sin embargo, la mayor cantidad de cepas aisladas corresponden a las
obtenidas en medio Baird Parker.
- De 35 cepas aisladas 31 resultaron positivas y solo 4 negativas, lo que equivale a un
89% y 11% respectivamente.
- Las cepas que coincidieron con los resultados obtenidos en la cepa de referencia
corresponden a 19 cepas aisladas de Agar Baird Parker y 12 cepas aisladas de Agar Sal
Manitol.
- Las cepas negativas a Staphylococcus aureus corresponden a cepas aisladas
provenientes de Agar Sal Manitol.
- Es importante la preparación de los manipuladores de alimentos con el fin de cumplir
con las medidas de higiene adecuadas, controlar los de peligros asociados y garantizar
la inocuidad en cada etapa de la cadena alimentaria desde la producción hasta la
cosecha, el procesamiento, el almacenamiento, la distribución, hasta la preparación y el
consumo final.
88

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