TRABAJO PRÁCTICO

ENSAYO DE PERMEABILIDAD DE FÁRMACOS

PAMPA
(Parallel Artificial Membrane Permeability Assay)

Los ensayos que predicen la absorción pasiva de fármacos se han hecho cada vez más importantes
en el proceso de descubrimiento de éstos. La capacidad de una molécula para ser absorbida, es
uno de los aspectos más importantes en la decisión si la molécula es un potencial candidato a ser
fármaco. Ensayos celulares, como aquéllos usando HeLa y/o Caco-2, comúnmente son usados
como un modelo para la absorción de fármacos; sin embargo, la técnica emplea mucha mano de
obra y a menudo es realizada tarde en el proceso de descubrimiento de éstas. Existen diferentes
opciones de ensayos in vitro disponibles para predecir la absorción de fármacos, incluyendo el
ensayo de permeabilidad, que usa una membrana de hexadecano como una barrera lipofílica, y un
método conocido como PAMPA (Parallel Artificial Membrane Permeability Assay), que usa una
membrana lipídica para simular la bicapa lípidica de distintos tipos de células, incluyendo el
sistema nervioso central (SNC). Este ensayo de permeabilidad no celular es relativamente rápido
(4-24 horas) y de bajo costo. En general, son usados cada vez con mayor frecuencia para
determinar las propiedades de permeabilidad pasiva transcelular de compuestos potencialmente
medicinales. La mayoría de los fármacos entran en la circulación sanguínea por difusión pasiva a
través del epitelio intestinal. Por consiguiente, los ensayos de permeabilidad miden el transporte
pasivo por barreras lipofílicas, éstos tienen correlación con los valores de absorción en humanos o
con provenientes de métodos publicados.
El análisis se realiza en una placa PAMPA MultiScreen-IP en donde se mide la capacidad de un
compuesto de difundir desde un compartimiento donor a uno aceptor separados por un filtro
impregnado con una solución de fosfatidilcolina en dodecano (figura 1).

Placa Aceptora

Placa Donora

Figura 1 Placa de Pampa compuesta por placas aceptora y donora, separada por membrana
artificial de fosfolípido.
Figura 2 Ampliación de 1 pocillo de la placa de Pampa y su comparación con la
mucosa intestinal.

Objetivos del trabajo practico

1) Estudiar la permeabilidad del tiopental sódico y del azul de Evans a través de una
membrana fosfolipídica.

2) Relacionar el pKa del ácido salicílico con el paso a través de la membrana fosfolipídica al
variar el pH (Acido o Básico)

Trabajo Práctico
En el ensayo se utilizarán TIOPENTAL SÓDICO y Azul de Evans como moléculas de estudio
de permeabilidad:

Materiales
Pipeta aforada de 2 mL
Pipeta automática 1000 µL
Pipeta automática 200 µL
Tubos Eppendorf 2 mL
Tubos de ensayo 10 mL
Cubetas de cuarzo (1 cm paso óptico)
Placas para PAMPA
Disolución de PBS (Buffer Fosfato, pH 7.4) 1L.
Disoluciones de Tiopental
PAMPA: 200 µg/ml (2ml)
Stock: 80 µg/mL (8ml)

Disolución de Azul de Evans

PAMPA: 200 µg/ml (2ml)
Stock: 80 µg/mL (8ml)

Disolución de Acido Salicílico

PAMPA: 300 µg/ml (0,5ml)

Curvas de Calibración

TIOPENTAL S. 40 20 10 5 PBS V final Abs

(µg/ml) Stock µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml 288
nm
Blanco 4 ml 4 ml -
40 2 ml 2 ml 4 ml
20 2 ml 2 ml 4 ml
10 2 ml 2 ml 4 ml
5 2 ml 2 ml 4 ml
2,5 2 ml 2 ml 4 ml

Azul de S. 40 20 10 5 MES V final Abs

Evans Stock µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml 570
(µg/ml) nm
Blanco 4 ml 4 ml -
40 2 ml 2 ml 4 ml
20 2 ml 2 ml 4 ml
10 2 ml 2 ml 4 ml
5 2 ml 2 ml 4 ml
2,5 2 ml 2 ml 4 ml
Ensayo PAMPA

 De la disolución del fosfatidilcolina en dodecano (20 mg/ml) tomar 4 µL y coloca4rlos

sobre la membrana de PVDF, esperar aproximadamente 5 minutos para evaporación del
dodecano.
 Poner 300 µL de PBS en la placa aceptora (TIOPENTAL o Azul de Evans respectivamente).

 Colocar 300 µL de MES (pH 2) en la placa aceptora (Ácido salicílico a pH 2)

 Colocar 300 µL de PBS (pH 9) en la placa aceptora (Ácido salicílico a pH 9)

 De los tubos eppendorf rotulados como PAMPA tomar 300 µL y ponerlos en la placa
dadora, se ensamblan las placas y se deja en agitación a 250 rpm durante 2 horas.

 Para determinar la concentración a T0: se ponen 200 µL de la disolución PAMPA de cada

fármaco en un eppendorf de 2 ml (FD = 8) y se agregan 1.4 ml de PBS (según sea el caso),
luego se lee al UV.
Para determinar la concentración a T2h: Una vez transcurridas las 2 horas de ensayo, se toman 200 µL
de cada pocillo (dador y aceptor) y se agregan 1.4 ml de PBS (según sea el caso) (FD = 8), luego leer
al UV.
Con los valores de concentración obtenidos mediante la interpolación de las absorbancias
obtenidas en la curva de calibración se procede a calcular el % de los fármacos en cada
compartimento.

Figura 3: Ensamblaje de las placas utilizadas para el ensayo PAMPA.

Fórmula utilizada para el cálculo de la permeabilidad efectiva en el ensayo PAMPA:

Donde:
t = Tiempo de medición en horas.
CA = Concentración del compuesto en la placa aceptora a tiempo t.
CD = Concentración del compuesto en la placa donora a tiempo cero.
 Resultados del ensayo PAMPA.
% de PE **
Compuesto Abs. t0 Abs. tt Conc. a t0 Conc. a tt
Permeabilidad (cm/s)

TIOPENTAL

Azul de Evans

**Permeabilidad efectiva de cada compuesto.

Compuesto Reacción con Nitrato Férrico

(indicar si es + o -)*
Acido Salicílico (pH 2)
Acido Salicílico (pH 9)

* El ácido salicílico se detectará utilizando como reactivo de color nitrato

férrico que forma un complejo con el acido salicílico.