Guia de Microbiologia y Toxicologia Agroindustrial 2018 Final

E.A.P.
Ingeniería Agroindustrial UNAMBA 2019-I

Guía de práctica: Microbiología y Toxicología Agroindustrial
UNIVERSIDAD NACIONAL
MICAELA BASTIDAS DE
APURIMAC
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA

AGROINDUSTRIAL
GUÍA DE LABORATORIO:
MICROBIOLOGÍA AGROINDUSTRIAL
DOCENTE: ING. SAUL MOREANO CARRASCO

JEFE DE PRÁCTICAS: BACH. CARLA TAIPE CARRASCO
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E.A.P. Ingeniería Agroindustrial UNAMBA 2019-I
INTRODUCCIÓN
Los laboratorios de microbiología constituyen ambientes de trabajo especiales, que pueden presentar
riesgos de enfermedades infecciosas para las personas que se encuentren en o cerca de ellos. El trabajo
diario en el laboratorio es un trabajo de grupo, en donde la actitud de cada uno de los integrantes ante
las prácticas, así como el entrenamiento que posean en las técnicas requeridas para el manejo de
material contaminado, determinan su propia seguridad, así como la de sus compañeros y la de la
colectividad en general.
Es por ello que antes de comenzar con las actividades prácticas, todas las personas involucradas
(estudiantes y profesores) tienen la obligación de conocer cuáles son las normas de seguridad a seguir
en el laboratorio de manera tal, que el trabajo se realice con un riesgo mínimo de exposición, tanto
para las personas que lo ejecutan como para el medio ambiente.
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PRINCIPIOS DE BIOSEGURIDAD
Conceptos básicos:
 Bioseguridad: La seguridad biológica o bioseguridad, es la aplicación del conocimiento, de

las técnicas y de los equipos necesarios para prevenir la exposición del personal, del área de
laboratorio y del medio ambiente a agentes potencialmente infecciosos o biopeligrosos.
 Agentes Biopeligrosos: Son todos aquellos agentes biológicos y materiales que son
potencialmente peligrosos para los seres humanos, los animales y las plantas. Entre ellos
podemos citar: bacterias, virus, hongos, parásitos, productos recombinantes, alergenos,
priones, etc.
 Riesgo Microbiológico: Se encuentra presente cada vez que se realiza una actividad práctica
en el Laboratorio, donde se requiera la manipulación de cultivos de microorganismos, los
cuales pueden alcanzar concentraciones muy elevadas y pueden llegar a provocar una
infección si no son manipulados adecuadamente. Para que se produzca un accidente por un
agente biológico deben estar presente básicamente 4 elementos: un huésped susceptible, un
agente infeccioso, una concentración suficiente de éste y una ruta de transmisión adecuada;
siendo este último punto el que mejor se puede controlar en el laboratorio.
 Vías de Infección: Los microorganismos pueden ingresar al organismo a través de: la boca (al
realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningún tipo de protección, o transferencia
indirecta de microorganismos a través de los dedos o utensilios contaminados como lápices,
bolígrafos, etc.), los pulmones (por la inhalación de microorganismos transportados por el
aire), la piel (intacta o lesionada, por la inoculación accidental con una aguja hipodérmica u
otros instrumentos punzantes o de vidrio, cortes o rasguños), los ojos (por salpicaduras de
materiales infecciosos, transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos
contaminados), etc.
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NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
 Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las mochilas, libros y otros objetos personales en el
lugar que se les indique para tal fin.
 Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe permanecer completamente
cerrada. Durante el periodo de prácticas, la bata no debe utilizarse fuera del laboratorio.
 Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesión
práctica.
 Lavar las manos con agua y jabón antes de realizar las actividades programadas, antes de salir del
laboratorio y siempre después de manejar materiales que se sabe o se sospecha que son
contaminantes.
 No comer, beber, fumar, masticar chicle, almacenar comida, objetos personales o utensilios, ni
aplicarse cosméticos en ningún área del laboratorio.
 Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades
indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna duda, diríjase al profesor.
 Mantener el área de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales,
exceptuando aquellos equipos y materiales necesarios para la realización del trabajo práctico.
 Se deben usar los mecheros Bunsen con precaución, no dejando material inflamable cerca y
evitando el posible contacto con pelo y ropas. Nunca se debe dejar desatendido.
 Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios y de manera
ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la actividad. Reporte cualquier daño de los
mismos al profesor.
 Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos para tal fin, por
ejemplo: los tubos y placas de Petri contaminados deben ser etiquetados para su posterior
esterilización y lavado, etc. El grupo encargado de la práctica se responsabiliza del lavado.
 Emplear la propipeta al medir líquidos. Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. De
igual manera las pipetas tendrán tapones de algodón para reducir la contaminación de estos
dispositivos de pipeteo.
 Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el profesor, no llevar a cabo experimentos
no autorizados. Cualquier estudiante que sufra de alguna deficiencia en sus defensas ante la
infección debe comunicarlo previamente al profesor.
 Reportar inmediatamente cualquier accidente al profesor (derrame de material contaminado,
heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como menor.
MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA
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A continuación, se mencionan los pasos que se deben seguir en caso de que ocurran los siguientes
accidentes:
 Derrame de material biológico sobre el cuerpo: Remover la ropa inmediatamente. Lavar

vigorosamente el área expuesta con agua y jabón por un minuto. Reportar el incidente al
profesor. Buscar atención médica si es necesario. La ropa contaminada debe ser colocada en
una solución desinfectante antes de ser lavada.
 Salpicaduras en los ojos con materiales biopeligrosos: Lavar inmediatamente el globo

ocular e interior de la superficie del párpado con abundante agua durante 15 minutos
aproximadamente. Abrir el ojo para asegurar efectivamente el lavado, comenzando por los
párpados. Reportar el incidente al profesor. Buscar atención médica inmediatamente.
 Cortadas menores y heridas por pinchazo: Lavar vigorosamente la herida con agua y jabón
por varios minutos. Aplicar un antiséptico adecuado. Reportar el incidente al profesor. Buscar
atención médica inmediatamente.
 En el caso de derrames: Colocarse guantes y cubrir con papel absorbente el área del derrame.
Verter un desinfectante adecuado y dejar actuar por el tiempo necesario. Retirar el material
absorbente junto al material roto y colocarlos en un recipiente para residuos contaminados o
bolsa de desechos, la cual debe esterilizarse junto con los guantes utilizados. Limpiar y
desinfectar nuevamente el área empleando nuevas toallas de papel y desinfectante. Lavarse las
manos con abundante agua y jabón.
El éxito de estas normas depende de la sinceridad, la constancia,

la participación activa y cooperativa de cada estudiante, por ello
antes de asistir al laboratorio, deben leer el fundamento y las
actividades a realizar, para así evitar posibles accidentes, con el
conocimiento y las técnicas de trabajo apropiadas.
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CONTENIDO
PRACTICA N° 1 Principios básicos para el análisis microbiológico de alimentos.
PRACTICA N° 2 Métodos de muestreo para el examen microbiológico de alimentos.
PRACTICA N° 3 Evaluación microbiológica de superficies vivas e inertes

PRÁCTICA Nº 4 Numeración de microorganismos mesófilos aerobios viables en alimentos no
fermentables, carne de res, pollo y pescado.
PRACTICA N° 5 Investigación y numeración de Bacillus cereus en productos de panificación.
PRACTICA N° 6 Investigación y numeración de Staphylococcus aureus coagulasa positivo.
PRACTICA N° 7 Investigación de Salmonella sp. en alimentos (ovoproductos).
PRÁCTICA Nº 8 Control de esterilidad de conservas.
PRACTICA N° 9 Numeración de coliformes totales y coliformes termotolerantes (E. coli) por el

método del número más probable de tubos múltiples NMP/ml/g.
PRACTICA Nº 10 Numeración de mohos y levaduras en cereales.
PRÁCTICA Nº 11 Aislamiento, purificación y cultivo de hongos comestibles y medicinales.
PRACTICA N° 12 Aislamiento y producción de inoculantes a partir de Rhizobium sp.
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PRACTICA Nº 1
PRINCIPIOS BÁSICOS PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS
I. OBJETIVO
 Conocer los principios básicos sobre la preparación de materiales para el examen

microbiológico de alimentos.
 Conocer las diferentes técnicas para la numeración de microorganismos en alimentos.
II. FUNDAMENTO TEORICO

2.1 MEDIDAS DE ASEPSIA DURANTE EL PROCESAMIENTO
Durante el procesamiento se utiliza un mechero Bunsen que, debido a la fuerza la circulación del aire
en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semiestéril en la zona inmediata
alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminación disminuyen
considerablemente. Durante el proceso de dilución se debe trabajar cerca al mechero. Normalmente se
emplea el calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, pipeta, etc. antes y
después de su utilización, a pesar de estar esterilizados previamente. El uso de gorra y mascarillas
durante el procesamiento de las muestras de alimentos debe ser obligatorio.
2.2 RE SUSPENSIÓN Y HOMOGENIZACIÓN DEL ALIMENTO
Los métodos de aislamiento y numeración de microorganismos presentes en las muestras de alimentos,

generalmente requieren de un tratamiento preliminar para liberar dentro del medio fluido, los
microorganismos que pudieran estar aprisionados en las estructuras del alimento o en superficies.
Comúnmente se utiliza un aparato eléctrico de trituración (licuadora o vortex) y mezcla. Así una
homogenización excesiva puede dar como resultado, recuentos bajos, por el contrario, una
homogenización insuficiente puede no liberar de todos los microorganismos que se encuentran
aprisionados, o no conseguir su distribución homogénea en la suspensión del alimento.
Todos los homogeneizados generan aerosoles, por lo que se debe tener mucho cuidado para evitar el
riesgo de la formación de los aerosoles, especialmente si se sospecha que el alimento puede contener
gérmenes patógenos. Durante este procedimiento se debe considerar medidas de asepsia.
Otro factor de gran importancia en la numeración de microorganismos en los alimentos la naturaleza

del diluyente usado, siendo el más adecuado el agua peptonada al 1%. Sin embargo, de acuerdo a la
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naturaleza del alimento se pueden utilizar otros diluyentes, tales como: solución salina peptonada,
solución tween o agua destilada estéril.
2.3 MÉTODOS DIRECTO DE RECUENTO DE MICROORGANISMOS
Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento. Se considera como

un indicador de las características higiénicas generales del alimento. En general se investiga la
presencia de microorganismos aerobios, anaerobios facultativos; aunque, en ciertas situaciones
(alimentos envasados al vacío), puede ser de interés hacer recuentos de anaerobios totales, coliformes,
mesófilos aerobios, mohos y levaduras, etc.
Se han desarrollado técnicas que hacen posible la automatización del proceso.
a.- Recuento en Placa
Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. El resultado
es función de una serie de factores como son el método de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo
de alimento y las características del medio de cultivo.
b.- Filtros de membrana
Utilizados cuando el número de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las
bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo
apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el
recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tiñe específicamente los
ácidos nucleicos).
c.- Contaje de microcolonias al microscopio
Se añade un pequeño volumen de agar-cultivo a un portaobjeto y se incuba para seguir la formación de

microcolonias al microscopio.
d.- Films secos (Petrifilm)
Son películas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de
la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubación se hace el recuento.
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2.4 MÉTODO INDIRECTO PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS
a.- Número Más Probable (NMP/g o ml)
Basado en series de diluciones y cálculo estadístico del número de bacterias presentes en las diluciones
más altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos.
b.- Métodos basados en la reducción de colorantes
Usando azul de metileno. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto
es medible. Usado en medios líquidos (lácteos).
2.5 COMPUTO DEL RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA
Completada la incubación seleccionar las placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Contar el
número de colonias, multiplicando por el inverso de la dilución redondeando la cantidad a dos cifras.
Reportar el número de colonias por gramo o mililitro de muestra. Se debe tomar en cuenta las
siguientes consideraciones:
 Cuando solo una dilución tiene el rango apropiado, se deberán contar las colonias,
multiplicando por el inverso de la dilución.
 Cuando hay dos diluciones cuyo rango es el apropiado, se deben contar las colonias de cada
dilución y luego se promedian las cuentas de dos diluciones.
 Cuando la dilución menor tenga menos de 30 colonias contar las colonias y multiplicar por el
inverso de la dilución.
 Cuando la dilución máxima tenga más de 300 colonias, se deberá escoger un área de la placa
donde la distribución colonial sea representativa, contando posteriormente las colonias
multiplicando por el factor adecuado para obtener la cuenta de la placa.
 Cuando en ninguna de las placas haya desarrollo de colonias, reportar como menor del inverso
de la menor dilución usada.
2.6.- CRITERIOS MICROBIOLÓGICOS
Los criterios microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad se sujetan de acuerdo a lo expresado en

la norma sanitaria de la Dirección General de Salud Ambiental- DIGESA.
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PRACTICA Nº 2
MÉTODOS DE MUESTREO PARA EL EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS
I. OBJETIVOS
 Preparar los materiales necesarios para la toma de muestras.

 Exponer los elementos básicos necesarios en los diferentes tipos de muestreo de alimentos.
Los métodos de muestreo y los procedimientos para la toma de muestras deberán basarse en
normas nacionales o internacionales referidas a alimentos y apropiadas para fines
microbiológicos.
La mayoría de las pruebas de control de calidad se realiza a petición del fabricante interesado
en demostrar al consumidor la calidad de su producto. El muestreo para el control de calidad
debe preestablecerse y programarse de modo que las mínimas variaciones que pueden
apreciarse en los lotes de ciertos productos, se detecten rápidamente para que puedan
introducirse de inmediato modificaciones en el proceso antes de que ocurran cambios
apreciables que alteren las preferencias del consumidor, en las grandes factorías se realiza el
muestreo al comienzo y al final de las operaciones de procesado así como también en la
facturación y durante su almacenamiento. En el caso que se sospeche de una toxiinfección
alimentario el muestreo se dirigirá directo y específicamente al alimento consumido,
sospechoso de haberla causado.
Un alimento de riesgo en salud pública es aquel que, en razón a sus características de

composición, especialmente en sus contenidos de nutrientes, actividad de agua (Aw) y pH,
favorece el crecimiento microbiano y, por consiguiente, cualquier deficiencia en su proceso,
manipulación, conservación, transporte, distribución y comercialización, puede ocasionar
trastornos a la salud del consumidor.
En el control de calidad de alimentos es necesario tomar en cuenta ciertas normas. El inspector

utiliza equipos y materiales diferentes durante la inspección, puede utilizar aquellos de uso
común, tales como cuchillos, cucharones, espátulas, bolsas, frascos estériles, etc. A veces se
puede necesitar material especializado termómetro para medir la humedad en los cereales y
caladores, etc.
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II.1 DEFINICIONES
Muestra: Una muestra consiste en una o más unidades de producto extraído de un lote. Es
definida como la fracción de un material sobre la que se estudian ciertas
características que posteriormente se generalizan a todo el conjunto.
Contra muestra: Es una porción adicional de la muestra tan parecida a la original como sea
posible, debe tomarse al mismo tiempo y en la misma forma y cantidad que la
muestra original para asegurar que las condiciones sean idénticas.
Muestreo: Acción organizada de extraer una muestra para su análisis. Se muestrea para
obtener una muestra representativa de todas las unidades del lote, es decir una
versión simplificada de la población que reproduzca de algún modo sus rasgos
básicos; con el propósito de aceptar o rechazar dicho lote.
Lote: Cantidad determinada de unidades de características similares fabricadas bajo

condiciones presumiblemente uniformes que se identifican por tener el mismo
código o clave de producción. Una cantidad determinada de un alimento producida
en condiciones esencialmente iguales.
Muestra representativa: Es aquella que es tomada conforme las normas de muestreo

establecidas, que toman en consideración el tamaño del lote, la naturaleza y la
forma de acondicionamiento del producto.
Alimento apto para consumo humano: Alimentos que cumplen con los criterios de calidad
sanitaria e inocuidad establecidos por la norma sanitaria.
Criterios microbiológicos: Define la aceptabilidad de un producto o un lote de un alimento

basado en la ausencia o presencia en cantidad de microorganismos por unidad de
masa, volumen, superficie o lote.
Agentes microbianos: Son los microorganismos de vida útil, indicadores y patógenos

señalados en la disposición.
2.2 PLANES DE MUESTREO
Los planes de muestro solo se aplican a lotes o lote de alimentos y bebidas, se sustentan en el
riesgo para la salud y las condiciones normales de manipulación y consumo del alimento. Los
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planes de muestreo se expresan en planes de 2 o 3 clases que dependen del grado de peligro
involucrado.
Un plan de muestreo de 2 clases de usa cuando no se puede tolerar la presencia o ciertos niveles
de microorganismo en ninguna de las unidades de muestra. Un plan de muestreo de 3 clases se usa
cuando se puede tolerar cierta cantidad de microorganismos en algunas de las unidades de
muestra. Al diseñar un plan de muestreo para un alimento en particular deben establecerse los
valores de n, m, M y c en donde:
Categoría: grado de riesgo que representan los microorganismos en relación a las condiciones
previsibles de manipulación y consumo del alimento.
n: número de unidades de muestra seleccionada al azar de un lote, que se analizan para

satisfacer los requerimientos de un determinado plan de muestreo.
c: número máximo permitido de unidades de muestra rechazables en un plan de muestreo de 2

clases o un número máximo de unidades de muestra que puedan contener un número de
microorganismos comprendidos entre n y m en un plan de muestreo de 3 clases. Cuando se
detecta un número de unidades de muestra mayor a c se rechaza el lote.
m: valor umbral o limite microbiológico que separa la calidad aceptable de la rechazable. En

general un valor igual o menor a “m”, representa un producto aceptable y los valores
superiores a “m” indican lotes inaceptables.
M: Los valores de recuentos microbianos superiores a “M” son inaceptables, el alimento

representa un riesgo para la salud.
El programa de muestreo se aplica a: Registro Sanitario y Certificación Sanitaria Oficial de

Exportación y se basa en el tipo y riesgo que conllevan las especies microbianas analizadas y
las condiciones previsibles de manejo y consumo a las que se someterá el alimento luego de su
fabricación o elaboración. Las categorías del Programa de Muestreo se indican en el cuadro
El plan de dos clases provenientes de un muestreo por atributos; en este caso la aceptación o el
rechazo estará definido por n y c.; el plan de tres clases proveniente de un muestreo por
atributos; en este caso la aceptación o el rechazo estará definido por n, m, M y c, donde c
tendrá como límites m y M. Se rechazarán todos aquellos resultados cuyos valores sean
superiores a M; ninguna de las muestras del plan de tres clases sobrepasará el valor de M.
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Cuadro 1. Planes de muestreo para combinaciones de diferentes grados de riesgo para la

salud y diversas condiciones de manipulación (*)
SEVERIDAD, TIPO DE CONDICIONES NORMALES DE MANIPULACIÓN Y

DE RIESGO PARA CONSUMO DEL ALIMENTO LUEGO DEL
RIESGO PARA LA
MUESTREO
SALUD
Condiciones que Condiciones que no Condiciones que
reducen el riesgo modifican el riesgo pueden aumentar el
riesgo
Sin riesgo directo para la Categoría 1 Categoría 2 Categoría 3
salud (contaminación 3 clases 3 clases 3 clases
general, vida útil y n=5 , c=3 n=5 , c=2 n=5 , c=1
alteración)
Riesgo para la salud bajo, Categoría 4 Categoría 5 Categoría 6
indirecto 3 clases 3 clases 3 clases
(indicadores) n=5 , c=3 n=5 , c=2 n=5 , c=1
Moderado, directo , Categoría 7 Categoría 8 Categoría 9

diseminación limitada 3 clases 3 clases 3 clases
n=5 , c=2 n=5 , c=1 n=10 , c=1
Moderado, directo , Categoría 10 Categoría 11 Categoría 12
diseminación potencialmente 2 clases 2 clases 2 clases
extensa n=5 , c=0 n=10 , c=0 n=20 , c=0
Grave directo Categoría 13 Categoría 14 Categoría 15
2 clases 2 clases 2 clases
n=15 , c=0 n=30 , c=0 n=60 , c=0
(*) Fuente: Métodos de muestreo para el análisis microbiológico, principios; principios y
aplicaciones especificas. International Commission on Microbiological Specification for Foods
(ICMFS)
2.3 EXCEPCIONES EN QUE “n” ES DIFERENTE DE 5
a) Número de unidades de muestra para registro sanitario de alimentos y bebidas
En número de unidades de muestra de alimentos y bebidas (n) para la inscripción en el registro

sanitario podrá ser igual a uno (n=1) y deberá ser calificada con los limites más exigentes (m)
indicadas en la presente disposición para este tipo de alimentos o bebidas.
b) Número de unidades de muestra para la verificación del plan HACCP
Para la verificación del Plan HACCP, el número de unidades de muestra de los planes de
muestreo podrá ser igual a uno (n=1) y deberá ser calificada con los limites más exigentes (m)
indicadas en la presente disposición para este tipo de alimentos o bebidas.
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Esto procederá si una persona natural o jurídica que opera o intervenga en cualquier proceso de
fabricación, elaboración, e industrialización de alimentos y bebidas, demuestre mediante
documentación histórica con un mínimo de de 6 meses, que cuentan con procedimientos
eficaces basados en los principios del sistema HACCP.
c) Número de unidades de muestra para la vigilancia sanitaria de alimentos preparados
Para el caso de la vigilancia sanitaria de alimentos y bebidas preparados provenientes de

establecimientos de comercialización, preparación y expendio, se podrá tomar una unidad
(n=1) de muestra por cada tipo de alimento preparado que deberán ser calificadas con los
limites más exigentes (m), indicados en la presente disposición.
2.4 MICROORGANIMOS QUE CONSTITUYEN PELIGRO Y GENERAN RIESGO PARA

LA SALUD DEL CONSUMIDOR
Los microorganismos correspondientes a las clases de criterios microbiológicos, se agrupan como:

(i) microorganismos que no implican riesgo para la salud, pero sí para la vida útil del producto, (ii)
microorganismos de riesgo indirecto bajo (indicadores), y (iii) microorganismos de riesgo directo
para la salud (patógenos).
Los microorganismos del grupo (i)

Las categorías 1, 2 y 3 definen los microorganismos asociados con la vida útil y alteración del
producto tales como:
a) Mohos
b) Levaduras, levaduras osmófilas
c) Aerobios mesófilos
d) Psicrotolerantes
e) Heterótrofos
f) Esporulados termófilos
g) Lactobacillus
h) Bacterias acido lácticas
Los microorganismos del grupo (ii)
Estos son los microorganismos indicadores de higiene, incluyen a las categorías 4,5 y 6 se
encuentran los microorganismos no patógenos que suelen estar asociados a ellos como:
a) Escherichia coli
b) Coliformes totales
c) Enterobacterias
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A excepción de preparación en polvo o fórmula para lactantes que se consideran en el grupo de

microorganismo patógenos
Los microorganismos del grupo (iii)

están subdivididos en:
(1) Microorganismos de riesgo moderado, directo de diseminación limitada:
Las categorías 7,8 y 9 corresponden a microorganismo patógenos cuya cantidad en los
alimentos condiciones su peligrosidad para causas enfermedades alimentarias tales como
a) Staphylococcus aureus
b) Clostridium perfringens
c) Bacillus cereus
d) Pseudomonas aeruginosa
e) Campylobacter jejuni
f) Yersinia enterocolítica
g) Vibrio cholerae
h) Vibrio parahaemolyticus
i) Listeria monocytogenes
(2) Microorganismos de riesgo para la salud moderado, directo, diseminación posiblemente
extensa: Están las categorías 10, 11 y 12
a) Salmonella
b) Shigella
c) Escherichia coli patógeno
(3) Microorganismos de riesgo para la salud grave directo:
Las categorías 13, 14 y 15
a) Brucella
b) Clostridium botulinum A, B, E y F
c) Clostridium perfringens tipo C
d) Shigella disenteriae
e) Vibrio cholerae O1
f) Virus de la hepatitis A
g) E. coli enterohemorrágico O 157:H7
h) Salmonella typhi
i) Salmonella paratyphi A, B y C
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2.5 INDICACIONES PARA EL MUESTREO
Las razones principales que llevan a la toma de muestra son:

 Para controlar la calidad y establecer la vida útil.
 Para controlar la higiene durante la producción y las técnicas de manipulación
 Cuando se sospecha que el alimento es la responsable de las toxi-infecciones alimentarias
o como consecuencia de denuncias de los consumidores.
 La mayoría de las de las pruebas de control de calidad se realizan a petición del fabricante,
interesado en demostrar la calidad de su producto.
2.6 MUESTRA NO REPRESENTATIVA
Se toma con fines de investigación en laboratorio, utilizando la técnica de muestreo casual y en

cantidades mínimas. Esta muestra se toma con la finalidad de: prevenir infracciones de la ley.
Cuando se muestrean en locales de producción, en las diferentes fases de transformación como en

producto terminado que aun no está comercializado o puede estar en comercio. También se realiza
con la finalidad de apoyar a los productores a mejorar la calidad de los alimentos y preservar al
mismo tiempo la salud pública.
Estas muestras no representan o no reflejan las características del lote. Sería un error escoger de un
lote solo las muestras deteriorada, el inspector también debe escoger muestras buenas.
2.7 MUESTRA REPRESENTATIVA
Se ejecuta muestreos representativos solo en casos particulares, esto es cuando después de un

control previo surgen algunas dudas como la calidad de la partida o lote.
La toma de muestra representativa puede ser motivada principalmente por razones de carácter
higiénico sanitario o para determinar la calidad del producto. Estas muestras representan las
características del lote.
2.8 TÉCNICAS DE MUESTREO SEGÚN EL TIPO DE MUESTRA
2.8.1 Toma de muestra de Productos a granel: Para productos ensacados o a granel el plan de
muestreo se aplica de acuerdo a la tabla 3. Cuando el producto es homogéneo es preciso
utilizar una sonda caladora para tomar las muestras del saco seleccionado. Cuando los
productos no son homogéneos es necesario extender el producto en el suelo y mezclar al azar
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para obtener una capa uniforme. La muestra se debe obtener de 5 puntos diferentes como
mínimo. Deben ser tomadas asépticamente, usando contenedores y utensilios estériles y
debidamente protegidos contra las contaminaciones externas, además estas deben ser
mantenidas en condiciones que no permitan la multiplicación o destrucción de la microflora
original presente.
2.8.2 Toma de muestra de Productos Acondicionados: Es necesario tomar las muestras de

acuerdo a la tabla 2, que toma en consideración el peso del embalaje y el tamaño del lote,
permitiendo así la toma de muestra representativa. Las muestras deben tomarse al azar de la
parte superior, central y de la base, evitando que la muestra sea de un solo lugar.
Por ejemplo, si tenemos un lote constituido por 1,200 cajas, que contiene cada uno 12 latas de
1 kg, para calcular el número total de unidades tenemos: 1,200 x 12 = 14,400 unidades, con
este número se busca en la tabla Nº 2 el número de muestras a recolectar, en la tabla se
observa 13 unidades.
Cuadro 2. Cantidad mínima de muestras para análisis

Tipo de alimento Cantidad
Cereales 1,000 g
Harinas 1,000 g
Masa alimentaría 1,000 g
Pan 1,000 g
Pasteles y kekes 300 g
Aceite 1,000 g
Grasa hidrogenadas 1,000 g
Cacao 200 g
Chocolate 200 g
Leche 1L
Leche en polvo 500 g
Pudín 250 g
Helado 200 g
Vinos 1L
Cerveza 1L
Vinagre 1L
Licores 750 g
Refrescos 1L
Miel 250 g
Café 250 g
Frutas, hortalizas frescas
Jugos 500 ml.
Carne fresca 250 g
Carne en conserva y embutidos 250 g
Conserva 1,000 g
Fuente: Dirección General de Salud Ambiental
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Cuadro 3. Plan de muestreo para productos acondicionados

Tamaño de lote (N) Tamaño de la muestra (N)
Peso neto igual o menor de 1 kg
4,800 o menos 6
4,801- 24,000 13
24,001- 48,000 21
48,001-84,000 29
48,001-114,000 38
84,000-240,000 48
144,001-240,000 60
Peso neto mayor de 1K pero menor de 4.5K
2,400 o menos 6
2,401 – 15,000 13
15,00 – 24,000 21
24,000 – 42,000 29
42,000 – 72,000 38
72,000 – 120,000 48
Mas de – 120,000 60
Peso neto mayor de 4.5 K
600 o menos 6
601 – 2,000 13
2,001 – 7,200 21
7,001 – 15,000 29
15,001 – 24,000 38
24,001- 42,000 48
Más de 42,000 60
Fuente Dirección General de Salud Ambiental DIGESA
Cuadro 4. Plan de muestreo para productos en sacos
Nº Total de Nº de sacos para Cantidad de cada Cantidad de Cantidad de muestra
sacos colectar la muestra muestra primaria muestra global definitiva (K)
(K) (K)
1-50 10 200 2 2
51-55 11 200 2 2
56-60 12 200 2.4 2
61-65 13 200 2.6 2
66-70 14 200 3 2
71-75 15 200 3 2
76-80 16 200 3 2
81-85 17 200 3.4 2
86-90 18 200 3.6 2
91-95 19 200 4 2
96-100 20 200 4 2
101-150 30 200 6 2
151-500 40 200 8 2
501-2500 50 200 10 2
2501-5000 70 200 14 2
5001-7000 80 200 16 2
7001-8000 90 200 18 2
8001-10000 100 200 20 2
Fuente: Dirección General de Salud Ambiental DIGESA
17
2.8.3 Muestreo de Alimentos de Venta Ambulatoria
La toma de muestra se realizará considerando a los productos de mayor riesgo epidemiológico,

de acuerdo a los productos de mayor preferencia por los consumidores. Entre los alimentos
considerados de alto riesgo para la salud del consumidor son aquellos con excesiva
manipulación, ejemplo ceviche de pescado, mariscos, ensaladas de verduras, salsa, ají a base
de queso, carnes, leches, refrescos, etc.
La cantidad de muestra a recogerse deberá ser de 100 a 200 g ó ml. La recolección de la

muestra se debe llevar a cabo en las mismas condiciones en que es distribuido en el punto de
venta. Deben ser recolectadas en frascos, en bolsas estériles y debidamente identificadas,
deben acondicionarse en cajas refrigerantes con paquete de hielo. El transporte de las muestras
al laboratorio deberá efectuarse en el menor tiempo posible.
De acuerdo al tipo de estudio que se esté realizando será necesario llenar formularios con datos
del lugar de muestreo, de los manipuladores, entre los datos del alimento se debe considerar los
siguientes datos:
 La hora en que fue preparada

 Tiempo aproximado de exposición del alimento
 Temperatura aproximada a la que se ha mantenido
 Fecha y hora de muestreo
 Lugar de recolección de la muestra.
2.9 ALIMENTOS DE MAYOR RIESGO EN SALUD PÚBLICA
 Carne, productos cárnicos y sus preparados.

 Leche y derivados lácteos.
 Productos de la pesca y sus derivados.
 Productos preparados a base de huevo.
 Alimentos de baja acidez empacados en envases sellados herméticamente (pH > 4.5).
 Alimentos o comidas preparados de origen animal listos para el consumo.
 Agua envasada.
 Alimentos infantiles.
18
2.10 TRANSPORTE DE MUESTRAS
Para obtener resultados microbiológicos confiables, la muestra debe ser examinada a la

brevedad posible y debe cumplir los siguientes requisitos:
Si no se procesa de inmediato la muestra debe mantenerse a temperatura baja de 6 oC en cajas

térmicas para su transporte. Si las muestras son enviadas de lejos, la muestra debe ser tomada
en material estéril y enviada en caja térmica u otro material resistente que permita mantener
temperaturas inferiores a 10 oC y convenientemente acondicionada para evitar la ruptura de
los frascos.
2.11 METODOS DE ENSAYO
Con el fin de que los resultados deben comprables y reproducibles, los métodos de ensayo
utilizados en cada una de las determinaciones deben ser métodos internacionales o nacionales
normalizados, reconocidos y acreditados por el organismo nacional de acreditación
2.12 REPORTE DE ENSAYO
Los informes de ensayo, certificados de análisis y otra forma de reporte emitidos por los
laboratorios, deberán indicar los métodos de análisis empleados y la expresión de resultados
acorde con el método debe expresarse en UFC/g, UFC/mL, NMP/g, NMP/mL, NMP/100 mL,
Ausencia o presencia/25 g o mL.
III. MATERIALES Y METODOS
3.1 MATERIALES
 Bolsa de polietileno estéril o de primer uso de 30 x 15 cm

 Frascos de muestreo con tapa rosca estériles de 250 ml de capacidad
 Caldo peptonado bufferado.
 Guantes descartables
 Papel toalla
 Plumones de tinta indeleble de punta gruesa
 Etiquetas
 Precinto de seguridad
 Tarjetas de identificación
19
 Guantes descartables
 Cajas conservadoras con paquete de hielo
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Procedimiento para el muestreo de alimentos
Esta actividad debe realizarse con materiales previamente estériles, para ello,
primero desinfectarse las manos con los guantes ya puestos, tomar el alimento con
una pinza y colocarla en una bolsa de primer uso, sellar con el precinto de
seguridad, anotar los datos correspondientes, este procedimiento es para el caso de
alimentos enteros.
Para muestras de alimentos a granel (ensaladas, coberturas, cremas, alimentos
preparados, etc.), coger la muestra con pinzas o el material que fuese necesario
(cucharas, cucharones, tenedor, etc.), y colocarla en taper de primer uso. Colocarlo
en cajas refrigerantes con gelpack, que mantengan una temperatura de refrigeración
(<10 °C). Transportar en el menor tiempo al laboratorio para su análisis.
3.2.2 Muestreo de Superficies vivas e inertes: se realizarán en la próxima práctica.
IV. RESULTADOS
Describir los resultados con tablas, ilustraciones y/o gráficos.

V. DISCUSIONES
Interpreta y explica los resultados en forma amplia con sustento bibliográfico y antecedentes
referidos al ensayo.
VI. CONCLUSIONES
En directa relación a los objetivos, es decir para cada objetivo una respuesta puntual.
20
PRACTICA N° 3
EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA DE SUPERFICIES VIVAS E INERTES
I. OBJETIVOS
 Evaluar la calidad microbiológica de superficies inertes.
 Evaluar la calidad microbiológica de manos de manipuladores de alimentos
II. FUNDAMENTO TEÓRICO
Sea por métodos rápidos o convencionales, los ensayos microbiológicos se realizan utilizando
métodos normalizados por organismos internacionales como la Organización Internacional
para la Estandarización (ISO). Métodos Oficiales de Análisis de la Asociación Internacional de
Químicos Analíticos Oficiales (AOAC), así como la Comisión Internacional de
Especificaciones Microbiológicas para Alimentos (ICMSF), entre otros, utilizando la técnica
de recuento en placa.
El procedimiento para seleccionar muestras debe estar en función de los riesgos sanitarios
relacionados a las diferentes etapas de la cadena alimentaria, sea la de fabricación, la
elaboración y/o expendio. Las evaluaciones microbiológicas de superficies, considera a los
indicadores de higiene como los Coliformes totales y Staphylococcus aureus. También se
considera patógenos como Salmonella sp. Vibrio Cholerae en caso signifiquen un peligro para
el proceso.
2.1. MUESTREO DE SUPERFICIES
a.- Superficies inertes: Se seleccionan aquellas que están o tendrán contacto directo con los
alimentos, que no serán sometidos a un proceso térmico posterior u otro que
disminuye la carga microbiana.
b.- Superficies vivas: Se seleccionarán las manos de los manipuladores, con o sin guantes que
estén en contacto con los alimentos destinados al consumo humano. Se
debe seleccionar el método de muestreo que debe estar en función de las
características de las superficies a muestrear.
21
2.2. MÉTODOS DE MUESTREO
a.- Método del hisopo: Se utiliza en superficies inertes regulares e irregulares, tales como tabla de
picar, bandejas, mesas de trabajo, utensilios, cuchillas de equipos, cortadora
de embutidos, cortadora de pan de molde, fajas transportadoras, tolvas,
mezcladoras, pisos, paredes y otros.
b.- Método de esponja: Se utiliza preferentemente para muestrear superficies de mayor área.
c.- Método del enjuague: Se utiliza para superficies vivas (manos) y para objetos pequeños o para el
muestreo de superficies interiores de envases, botellas, bolsas de plástico, etc.
2.3. PARÁMETROS PERMISIBLES
Cuadro 5. Límites microbiológicos permisibles

SUPERFICIES
Método de enjuague Superficies Vivas Superficies inertes
Ensayo Limite de Limite permisible Limite de detección Limite
detección método método permisible
Coliformes totales < 100 ufc/manos < 100 ufc/manos < 25 ufc/super. < 25 ufc/super.
Muestra Muestra
Staphylococcus aureus < 100 ufc/manos < 100 ufc/manos ----- -------
Patógenos Ausencia manos Ausencia manos Ausencia Ausencia
Fuente: Dirección General de Salud Ambiental - DIGESA
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. MATERIALES
 Hisopos de almidón u otro material equivalente de largo aproximado 12 cm.

 Esponja estéril de poliuretano o de celulosa de 5 cm x 5 cm
 Plantilla estéril con un área abierta en el centro de 5cm x 5 cm
 Frasco con tapa rosca de 250 ml con 100 ml de solución diluyente
 Pinzas estériles
 Bolsas de polietileno de primer uso
 Tubo de ensayo con tapa hermética de 10 ml.
 Solución diluyente estéril
 Plantilla estéril con un área abierta en el centro de 100 cm 2 (10 cm x10cm) o alternativamente,
plantilla estéril con un área abierta en el centro de 25 cm 2 (5cm x 5 cm).
22
 Guantes descartables de primer uso

 Caja térmica
 Refrigerantes
a. METODOS
3.2.1 Procedimiento para la toma de muestra
a.- Método del hisopo
 Colocar la plantilla 10 cm x 10 cm sobre la superficie a muestrear.

 Humedecer el hisopo, en la solución diluyente (10ml en tubo) y presionar ligeramente en la
pared del tubo con un movimiento de rotación para quitar el exceso de solución.
 Con el hisopo inclinado en un ángulo de 30° frotar 4 veces la superficie delimitada por la
plantilla. Asegurar el hisopado en toda la superficie.
 En el caso de utilizar la superficie de 5 cm x 5 cm repetir esta operación tres veces más, en
lugares diferentes de la misma superficie para obtener 100 cm 2.
 Colocar el hisopo en el tubo con la solución diluyente, quebrando la parte de hisopo que
estuvo en contacto con los dedos del muestreador.
 Para superficies irregulares en el caso de utensilios, se repetirá la operación con 3
utensilios más (total 4 como máximo) con el hisopo considerando el área que está en
contacto con el alimento o con la boca.
b.- Método de esponja
 Retirar la esponja de su envoltura con la pinza estéril o con guantes descartables.

 Humedecer la esponja con la solución diluyente estéril.
 En condiciones asépticas frotar vigorosamente el área a muestrear, en el caso de
superficies regulares frotar el área delimitada por la plantilla y en superficies irregulares
frotar abarcando la mayor cantidad de superficie.
 Colocar la esponja en el frasco con el resto de la solución diluyente o alternativamente
colocar en una bolsa con diluyente.
c.- Método de enjuague para manos de manipuladores
23
 El método consiste en realizar un enjuague (botellas frascos, utensilios) o inmersión (manos,

objetos pequeños) en una solución diluyente.
 Vaciar el diluyente del frasco (100ml) en una bolsa plástica de primer uso.
 Introducir las manos a muestrear hasta la altura de la muñeca
 Solicitar al manipulador que realice un frotado de los dedos y particularmente alrededor de las
uñas y la palma de las manos, adicionalmente el muestreador deberá realizar la misma
operación a través de las paredes de la bolsa.
 Luego de retirar las manos se regresa el líquido al frasco o se anuda la bolsa y esta se coloca en
otra bolsa para que quede segura.
3.2.3 Cálculo y expresión de resultados
Para superficies vivas, el numero de colonias obtenidas (ufc) se multiplica por el factor de
dilución y por el volumen de la solución diluyente utilizando en el muestreo (100ml). Para
objetos pequeños o para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas, bolas de
plástico, entre otros el número de colonias obtenidas se multiplica por el factor de dilución y
por el volumen de solución diluyente y se divide entre las 4 superficies muestreadas.
Los resultados se expresarán:
 Para superficies vivas: ufc/manos

 Para superficies inertes: ufc/superficie muestreada (envase, botellas)
IV. RESULTADOS
Describir los resultados con tablas, ilustraciones y/o gráficos, reportar la variabilidad
microbiana presente en manos de manipuladores y superficies de los utensilios. Reportar la
numeración de microorganismos indicadores de la mala higiene en manos y superficie inerte.
V. CONCLUSIONES
En directa relación a los objetivos, es decir para cada objetivo una respuesta puntual
VI. DISCUSIONES
24
PRÁCTICA Nº 4
NUMERACIÓN DE MICROORGANISMO MESÓFILOS AEROBIOS VIABLES EN

ALIMENTOS NO FERMENTABLES
I. OBJETIVOS
 Realizar el flujo de operaciones para la numeración de Microorganismos Mesófilos Aerobios

Viables.
 Realizar la técnica de siembra por incorporación en el medio Agar Plate Count la muestra de
alimento previamente diluido.
 Realizar el cálculo y reporte de resultados para rechazar o aceptar el producto.
Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento, esta prueba

permite determinar la calidad del alimento, los microorganismos mesófilos aerobios viables se
consideran como indicadores de las características higiénicas generales del alimento. En
general se investiga la presencia de microorganismos aerobios, anaerobios facultativos;
aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados al vacío), puede ser de interés hacer
recuentos de anaerobios totales, coliformes, mesófilos aerobios, mohos y levaduras, etc.

3.1. MATERIALES
 Muestra de alimento
 Medios de cultivo: Agar plate count
 Agua peptonada
 Equipos: incubadora, mechero Bunsen, balanza electrónica.
 Placas estériles.
 Pipetor
25
 Bolsas estériles.
3.2. METODOS
Numeración de microorganismos aerobios mesófilos por el Método de recuento estándar en

placa.
 Día 1: Pesar 10g de muestra y añadir 90ml de agua peptonada al 1%, homogenizar por 30
segundos. Sembrar tres diluciones distintas (10-1, 10-2, 10-3). Para ello pipetear 1ml de cada
dilución a placas estériles debidamente codificadas. Verter en la placa el agar fundido y
temperado a 44-46°C. Acto seguido, mezclar el inóculo con el medio fundido, inclinando y
girando las placas en diferentes direcciones. Una vez solidificado el agar, invertir las
placas e incubar a 35°C durante 48±2 horas.
 Día 3: Calcular el recuento estándar en placa estimado.
IV. RESULTADOS
Describir los resultados con tablas, ilustraciones y/o gráficos, reportar la variabilidad
microbiana presente en manos de manipuladores y superficies de los utensilios. Reportar la
numeración de microorganismos indicadores de la mala higiene en manos y superficie inerte.
V. CONCLUSIONES
VI. DISCUSIONES
26
PRACTICA N° 5
INVESTIGACIÓN Y NUMERACIÓN DE Bacillus cereus
I. OBJETIVOS
 Realizar la identificación y numeración de Bacillus cereus a partir de alimentos de

panadería.
 Conocer lo medios de cultivo y la técnica de aislamiento de Bacillus cereus
Recién a comienzos de 1950, se estableció que Bacillus cereus es un microorganismo capaz de

provocar una enfermedad transmitida por los alimentos. La estadística de varios países el
confieren porcentajes que varían de 1 al 23 % de los brotes de origen bacteriano confirmados
como agente de infecciones intestinales.
Este microorganismo es un bacilo gram positivo, móvil, anaerobio-anaerobio facultativo,

esporulado. Dos formas clínicas diferentes de gastroenteritis se producen por la ingesta de
alimentos contaminados, el denominado síndrome diarreico y el emético. Ambos síndromes se
producen por diferentes toxinas excretadas por el microorganismo.
Bacillus cereus se encuentra en el suelo y vegetación, sus esporas son resistentes a la cocción,
por lo que es importante realizar un tratamiento térmico efectivo. La contaminación de alimentos
por Bacillus cereus, puede ocurrir cuando los alimentos son conservados a medio ambiente por
varias horas antes de ser servidos, es por ello recomendable mantener los alimentos calientes a
mas de 65ºC o enfriarlos a menos de 5ºC. El consumo de alimentos que contienen mas de 10 6
ufc/g de alimentos de este microorganismo, puede ocasionar una infección alimentaría al ingerir
la toxina preformada en el alimento. Los principales alimentos implicados son el arroz hervido o
frito, sopas de pollo, budines, salsa, pastas con huevo, cereales, etc.
La variante emética, se manifiesta por náuseas, vómitos, cólicos abdominales y en ocasiones

diarreas; es autolimitada y la recuperación tiene lugar antes de las 24 horas. Comienza de 1 a 6
horas después de ingerir el arroz y en ocasiones paltillos a base de pastas. Cuando se cocina
grandes cantidades de arroz y este se deja enfriar lentamente, las esporas del Bacillus cereus
27
germinan y las células vegetativas producen toxinas durante la fase de crecimiento logarítmico o
durante la esporulación.
La variante diarreica, tiene un periodo de incubación entre 8 a 16 horas y se manifiesta por diarrea
profusa con dolor y cólicos abdominales; la fiebre y el vómito son poco comunes. La enterotoxina
puede preformarse en el alimento o producirse en el intestino, durante 12 a 24 horas. El tipo diarreico
de enfermedad es causado por una proteína de peso molecular grande, mientras que el tipo (emético)
causa el vomito es causado por una proteína de peso molecular bajo viene hacer un péptido
termoestable. (Jawetz, Melnick y Adelberg. 1999)
2.1 ESTRUCTURA Y COMPOSICION QUIMICA DE LA ENDOSPORA
a.- Protoplasto o núcleo: El citoplasma de la espora está muy deshidratado. Sus componentes están
inmovilizados en una matriz de quelatos de iones Ca ++ y ácido dipicolínico. El citoplasma de la
espora contiene altas concentraciones de ion Ca ++ (1-3% del peso seco de la espora), y de ácido
dipicolínico (DPA) (10% en peso); ambos están formando un quelato, llamado dipicolinato cálcico
(DPC), una sustancia exclusiva de las esporas bacterianas.
b.- Pared de la espora: Se ubica inmediatamente por encima de la membrana interna de la espora (ver
micrografía a microscopio electrónico, o el esquema de la ultraestructura). Composición a base de
un peptidoglucano (PG) similar al de la célula vegetativa, con sus característicos enlaces entre los
tetrapéptidos. Su función, al germinar la espora, dará lugar a la pared celular de la nueva célula
vegetativa, confiriéndole, mientras tanto, resistencia osmótica.
c.- Corteza o córtex: Su composición, un peptidoglucano (PG) especial, diferente en composición al

PG de la célula vegetativa y el ácido murámico.
d.- Cubiertas: La composición depende de las especies, pero en general, a base de una o varias
proteínas de tipo queratina, todas muy ricas en cisteína y en aminoácidos hidrófobos, y que llegan a
constituir el 60% en peso seco de la espora. Son muy insolubles e impermeables, e impiden la
entrada de numerosos agentes químicos, incluyendo sustancias tóxicas.
e.- Exosporio: En B. cereus es una estructura membranosa transparente, a modo de saco cerrado,
delgado y flojo, envolviendo al resto de la espora. Su ccomposición química: mezcla de proteínas,
polisacáridos complejos, y lípidos. Muy resistente a enzimas proteolíticas, lo que sugiere (pero no
28
prueba directamente) que el exosporio puede representar algún papel como barrera de defensa
externa de la espora.
2.2 DESENCADENAMIENTO DE LA ESPORULACIÓN
Para que se produzca la esporulación, se necesitan dos condiciones previas:

 Los cultivos bacterianos han de estar en buenas condiciones;
 Cuando cesa el crecimiento exponencial, la mayoría de las células entran en esporulación, aunque
el proceso no es sincrónico (hay desfases entre unas células y otras), de modo que en un lapso de
tiempo relativamente breve (5,5-8 horas en Bacillus subtilis) casi todo el cultivo aparece en forma
de esporas, habiendo desaparecido las células vegetativas.
3.1 MATERIALES
Medios de cultivo:
 Agar manitol yema de huevo polimixina (MYP) ISO:7932;1993
 Agar Bacillus cereus
 Agua peptonada
Reactivos y medios de confirmación

 Kit de coloración gram
 Glucosa (amarillo = +)
 Agar nitrato (nitrito rojo = +)
 Agar SIM (movilidad)
 Reactivo Voges Proskauer (color fucsia)
Equipos
 Estufa
 Microscopio
 Mechero Bunsen
3.2 MÉTODOS
29
3.2.1. Procedimiento

Se prepara el medio de cultivo según las indicaciones del frasco.

Preparar las diluciones con 10 g de muestra en 90 ml de agua peptonada y tubos de 9 ml
cada uno. Diluir el alimento hasta 10-3

Sembrar por duplicado 0.1 ml de volumen del inoculo de cada dilución en el medio
MYP y sembrar por diseminación con una espátula de Drigalsky.

Dejar incubar 48 horas a 30 °C

Seleccionar las colonias sospechosas: grandes, irregulares, rosadas lisas.

Escoger de cada placa 5 colonias y realice la prueba bioquímica

Realizar la confirmación bioquímica, pre cálculo y reporte en ufc/g de alimento
3.2.2 Tinción de esporas (Wirtz-Conklin)

La tinción específica de esporas requiere dos colorantes: verde malaquita capaz de teñir
las esporas en caliente y safranina, colorante de contraste que tiñe las formas
vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y
sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.
 Preparar los frotis bacterianos indicados

 Teñir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la
llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5 min.
 Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
 Teñir con safranina 1 min.
 Lavar con abundante agua el exceso de colorante y secar la preparación.
 Observar la preparación al microscopio.
Nota: evitar que la muestra hierva. Añadir más colorante si éste se evapora; es importante que
la muestra no se seque.
IV. RESULTADOS
Describir con tablas, ilustraciones y/o gráficos. Reportar las características de las colonias de
Bacillus cereus y las características de las endosporas. Reportar la numeración de B. cereus en
ufc/g de alimento, comparando con los estándares permisibles
30
V. DISCUSIÓN
Interpreta y explica los resultados de la cantidad de bacterias en ufc/g de alimento en forma
amplia con sustento bibliográfico y antecedentes referidos al ensayo. Explica también las
características de las colonias y forma de las endosporas de B. cereus.
PRACTICA N° 6
INVESTIGACIÓN Y NUMERACIÓN DE Staphylococcus aureus COAGULASA POSITIVO
I. OBJETIVOS
 Determinar numeración de Staphylococcus aureus en alimentos

 Evalúa las características de las colonias y las células bacterianas al microscopio óptico
Staphylococus aureus, es un microorganismo Gram +, anaerobio facultativo y se halla

ampliamente distribuido en carnes, leches, quesos y ambientes naturales como suelo, polvo,
aire, etc. Es altamente vulnerable a la destrucción por tratamiento térmico y a casi todos los
agentes sanitizantes. La presencia de esta bacteria o sus enterotoxínas en alimentos procesados
o en equipos de procesamiento de alimentos generalmente es un indicador de una sanidad
deficiente.
S. aureus ha sido identificado como el agente causante de muchos brotes de intoxicación

alimentaria. La presencia de gran cantidad de S. aureus en los alimentos puede indicar una
manipulación o condiciones sanitarias deficientes.
La presencia en los alimentos de números mayores de 10 4 por gramo de muestra, puede

producir cantidades suficientes de enterotoxina (1ng/g) de forma que desencadenan
intoxicación por estafilococos en los consumidores.
Los estafilococos son destruidos fácilmente por la cocción, pero las toxinas que producen
resistencia a este tratamiento son destruidas de 1 a 3 horas a 100 ºC y de 10 a 40 minutos a 120
ºC. Los alimentos almacenados de forma inapropiada han estado vinculados frecuentemente
con brotes de intoxicación por estafilococos. Los reportes indican que la contaminación del
alimento ocurre después de la cocción, dado que la bacteria se halla en números mayores y
raras veces iguales a la dosis infectante.
31
Los alimentos contaminados son principalmente productos de confitería, dulces y bocaditos,

pasteles de crema, natillas, etc. Otro alimento de alto riesgo es el jamón que contienen muchas
sales como conservantes o saborizantes, estos aditivos para el curado inhiben más a los otros
microorganismos presentes en el alimento.
2.1 FACTORES DE PATOGENECIDAD
Ocasiona el síndrome gastroentérico debido a la intoxicación en el consumidor mediante la

ingestión de alimentos que contienen la enterotoxina estafilococica preformada.
Se han identificado 7 diferentes toxinas que se denominan A, B, C1, C2, C3, D y F. Entre
otros factores presentan adhesinas, coagulasa, lipasa, hialuronidasa, estafiloquinasa,
nucleasa, toxina alpha, toxina beta, toxina delta, toxina gamma, leucocidina, exfoliatina,
exotoxinas pirógenas.
2.2 PERIODO DE INCUBACIÓN
La intoxicación estafilocócica se caracteriza por las nauseas, vómitos, cólicos abdominales

y diarrea.
Hábitat: S. aureus se encuentra muy difundido en la naturaleza y se localiza en la piel del

ser humano, así como en varias especies de animales, puede colonizar las mucosas de las
fosas nasales y originar un portador asintomático peligroso, ya que es la fuente de infección
para otros tejidos e individuos. Se encuentra comúnmente en la garganta y en la piel.
2.3 CONSIDERACIONES GENERALES
Para la investigación de Staphylococcus aureus (estafilococos coagulasa positivo) se han

propuesto diversos medios específicos. Estos medios difieren principalmente en los agentes
selectivos que contienen entre los que destacan el telurito de potasio, el cloruro de litio, el
azida sódico, la glicina y polimixina B. También se usa concentraciones elevadas de cloruro
sódico.
En la actualidad gozan de gran aceptación los medios que contienen yema de huevo junto a
uno de los agentes selectivos antes señalados. En este medio la mayoría de las cepas de S.
aureus utiliza la lipoproteína de la yema de huevo conocida como lipovitelina, dando lugar
a la aparición de áreas de aclaración alrededor de las colonias, también se genera la
32
aparición de un precipitado blanco en las áreas total o parcialmente aclarados debido a la

formación de sales de calcio y magnesio de los ácidos grasos liberados.
2.4 MORFOLOGÍA DE LAS COLONIAS
Las colonias Staphylococcus aureus son lisas, enteras, algo elevadas. Miden aproximadamente
de 1 a 3mm de diámetro a las 24 horas. Las colonias son grandes, estas siguen desarrollando si
se deja en incubación por unos días más. Son de borde entero de superficie lisa, la mayoría de
ellos forman pigmentos que van desde amarillo crema hasta el naranja.
2.5 MEDIOS DE CULTIVO
a.- Agar Baird parker
Para aislamiento y diferenciación de Estafilococos en alimentos y materiales farmacéuticos,

según Bair-parker (1962). Este medio de cultivo corresponde a las recomendaciones de ISO,
DIGESA.
Preparación: Disolver el medio de cultivo según las indicaciones del frasco, esterilizar en
autoclave por 15 minutos/15 libras de presión/121ºC. Enfriar a 45 a 50 ºC y añadir mezclando
50 ml de emulsión de yema de huevo telurito y eventualmente, 50 mg /litro de sulfametacina.
Verter en placas. pH 6.8 ±0.2.
b.- Caldo de Cerebro- Corazón (Brain Heart Broth)
Para el cultivo de diversos microorganismos patógenos exigentes. Este medio de cultivo

corresponde a las recomendaciones de los Standart métodos for Examination of Water and
Wastewater (1975).
c.- Emulsión de Yema de huevo Telurito
La emulsión de yema de huevo-Telurito se emplea como aditivo en el Agar Baird Parker

(medio base) y posibilita la demostración de la actividad lecitinasa y la reducción del Telurito.
Composición
33
Yema de huevo estéril 500 ml

Cloruro de sodio 4.25
Telurito potásico 2.1
Agua destilada hasta 1000ml
Empleo: Agitar el frasco con fuerza para suspender el posible sedimento formado. 50ml de la
emulsión de yema se mezcla con 950 ml de medio de cultivo esterilizado y enfriado a 45 – 50
ºC. Verter en placas. Al tomar la emulsión del frasco, cuidar de que se efectué de forma estéril.
Las placas que se preparan con emulsión de yema de huevo son estables aproximadamente 2
meses almacenadas a 4ºC.
2.6 PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN
a.- Coloración Gram: Hacer una coloración Gram de las colonias sospechosas y observar al
microscopio. Si se observan cocos gram positivos en racimos, realizar la prueba de la
catalasa.
b.- Acidez del manitol: Sembrar 1 colonia sospechosa a S. aureus, en agar manitol por estrias
y profundidad, incubar por 24 horas a 37ºC, el viraje de rojo a amarillo indica positividad.
c.- Prueba de la Catalasa: Determinar la presencia de la enzima catalasa, esta enzima

descompone el peróxido de hidrogeno en agua y oxigeno. (Peróxido de hidrogeno 3%).
Procedimiento:
 Con el asa de siembra recoger 1 colonia pura de 18 a 24 horas y colocar sobre un
portaobjeto limpio.
 Agregar 1 gota de H2O2 al 3% usando un gotero o una pipeta pasteur.
 No es necesario mezclar el cultivo con peróxido de hidrógeno.
 Observar inmediatamente la efervescencia (formación de burbujas) lo que indica una
prueba positiva, de lo contrario se considera la prueba negativa.
 Desechar el portaobjeto colocándolo en un desinfectante.
d.- Prueba de la Coagulasa: Se realiza para comprobar la facultad de la bacteria de coagular

el plasma por acción de la enzima coagulasa, la cual aumenta la velocidad de coagulación
del plasma. El resultado final es la formación de un coagulo de fibrina. Plasma de conejo
deshidratado. (reconstituir de acuerdo a las especificaciones del fabricante. El plasma
34
humano no puede ser usado al menos que haya sido cuidadosamente probado de no tener
algún agente infeccioso, capacidad de coagulación e inhibidores.
Procedimiento:
 Transferir 1 colonia aislada del medio de cultivo (agar sangre) a 0.5 ml de plasma
reconstituido en un tubo de ensayo estéril.
 Girar el tubo suavemente para lograr la suspensión del organismo. No agitar.
 Incubar la mezcla a 35 – 37 ºC (baño maría) de preferencia por 4 horas. Observar SI
hay formación de coagulo inclinado lentamente el tubo sin agitar. Cualquier grado de
coagulación es una prueba positiva.
 S. aureus forman coágulos dentro de la hora. Considerar que S.aureus produce
fibrinolisina, la cual puede lisar el coáagulo.
 Si son Staphylococcus coagulasa negativos, realizar las pruebas de resistencia a la
polimixina B y novobiocina.
3.1 MATERIALES
 Muestra: Pastel con crema

 Balanza analítica
 Placas petri
 Pipetas 1,5 y 10 ml
 Frascos tapa rosca
 Incubadora
 Refrigeradora
 Espátulas de Drigalski o varillas de vidrio curvadas estériles para siembra por
diseminación.
Medios de cultivo:
 Agar Baird Parker

 Agar tripticasa soya (conservar cepas)
 Agar manitol salado
 Caldo de Infusión Cerebro Corazón (BHI)
 Emulsión de yema de huevo con telurito de potasio al 1%
35
Reactivos y colorantes:
 Plasma de conejo con EDTA
 Reactivo para la catalasa (peróxido de hidrogeno)
 Kit para la coloración Gram.
 Patrones y Cepas de Referencia
III.2 METODOS
DIA 1 y 2: Pesar 10 gramos de muestra o medir 10 ml de muestras, colocar en un recipiente que

contiene 90 ml de agua peptonada al 0.1%, mezclar y homogenizar por 1 minuto y proceder a
preparar las diluciones.
Preparar diluciones hasta 10-3 e inocular 1 ml de cada dilución en placas petri de 140 mm, con agar
Baird Parker por duplicado para cada dilución. Incubar las placas 35° ó 37 ºC / 24 horas. Transferir
paralelamente
Seleccionar para la numeración 0.1 ml del homogenizado de sus diluciones respectivas a la

superficie del medio Baird Parker (placas secas) y extender el inoculo con la ayuda de las varillas
de vidrio, hasta que sea absorbido por el medio. Incubar las placas en posición invertidas a 35ºC
-37ºC durante 30 a 48 horas.
DIA 3: Elegir las placas que contengan colonias negras y brillantes de margen estrecho y blanco
rodeadas áreas claras. Para hacer un recuento elegir las placas entre 20 a 200 colonias aisladas y
contar. Seguidamente picar no menos de 5 colonias sospechosas de S. aureus en caldo cerebro
corazón, incubar 35ºC/24 horas. Sembrar en agar manitol, realizar la prueba de la catalasa,
coloración Gram., etc. Realice la prueba de coagulasa transfiriendo 0.3 ml de cultivo a tubos que
contienen 0.3 ml de plasma de conejo, incubar 4 a 6 horas/35ºC. Formación de coagulo da lugar a la
coagulasa +.
IV. RESULTADOS
Reporta los resultados de la numeración de S. aureus en ufc/g y compara con los parámetros
permisibles para este microorganismo. Reporta las características generales de las colonias en
el medio agar Baird Parker
V. DISCUSIONES
36
VI. CONCLUSIONES
En forma puntual interpreta los objetivos del ensayo
PRACTICA Nº 7
INVESTIGACION DE Salmonella sp.
I. OBJETIVOS
 Disponer de un método para detectar Salmonella sp. en alimentos (carne molida).

 Determinar la diferenciación bioquímica para la identificación de Salmonella.
Los miembros del género Salmonella son agentes causantes de infección intestinal en seres
humanos y animales. Entre los agentes de enfermedades transmitidas por los alimentos, el género
Salmonella es uno de los principales causantes de casos mortales por las complicaciones surgidas
entre los pacientes afectados. La tasa de mortalidad se sitúa alrededor de 4.1%. Los huevos, carnes
y productos cárnicos derivados son los alimentos que más comúnmente transmiten la Salmonella al
hombre.
El hábitat principal de los microorganismos de este género es el conducto intestinal del ser humano,
de los animales domésticos, de los pájaros y ocasionalmente de los insectos. Debido a que es una
bacteria de origen intestinal, es excretada por las heces que contaminan el ambiente y las aguas.
Cuando las aguas contaminadas o los alimentos contaminados son ingeridos por el ser humano o
por los animales, el microorganismo vuelve al sistema digestivo donde se multiplica y será
nuevamente eliminado a través de las heces y así continúa el ciclo.
Los insectos y roedores también participan en la diseminación ambiental de estos microorganismos.

La dosis infectante es variable, en general el número de células necesarias para desencadenar la
sintomatología (nauseas, vómitos, dolores abdominales, cefaleas escalofríos) oscila entre 10 3 y 106
UFC/g de alimento para algunos serotipos.
37
Cerca de 5% de las personas que sufren la enfermedad, siguen siendo portadoras por tiempo
considerable y pasan a ejercer un importante papel en la diseminación del agente especialmente si
participan en la cadena de producción y comercialización de alimentos. El agente etiológico lo
constituye la Salmonella entérica con 7 subespecie divididos en serovariedades.
Son bacilos gram negativos, aerobios, no esporulados, móviles por flagelos perítricos, no
encapsulados y poseen 3 tipos de antígenos: O somático, H ciliar y Vi de superficie.
2.1 CONSIDERACIONES GENERALES
Los métodos para el aislamiento e identificación de Salmonella a partir de los alimentos pueden
considerarse 5 etapas sucesivas:
 Enriquecimiento no selectivo
 Enriquecimiento selectivo
 Aislamiento selectivo, siembra en placa de medios sólidos selectivos y diferenciales
 Identificación bioquímica, estudio de las características bioquímicas de las colonias
sospechosas.
 Análisis antigénicos en dos fases: a) empleo del antisuero polivalentes O y del antisuero
polivalente H, y b) utilización de los antisueros específicos del grupo O y H.
 Tipificación por medio de bacteriófagos.
Los tres primero se refieren al aislamiento y los tres últimos a la identificación.
El primer paso tiene como fin la revitalizaron de las salmoneras dañadas por las diferentes condiciones
de tratamientos o de almacenamiento. El segundo paso es de enriquecimiento selectivo y sirve para
favorecer el crecimiento de las salmoneras en un ambiente que puede contener gran número de
bacterias diferentes. El tercer paso permite la visualización de las colonias sospechosas por su aspecto
característico. El cuarto paso se refiere a la identificación bioquímica.
El quinto paso conduce por medio de pruebas serológicas a la identificación definitiva de las cepas
sospechosas como miembro del genero Salmonella. El sexto paso logra aun más exacta la
identificación de los gérmenes aislados, identificación que es de particular interés para los propósitos
epidemiológicos, ya que los tipos serológicos de un grupo fágico común suelen tener el mismo origen.
2.2 MEDIOS DE CULTIVO PARA ANALISIS DE Salmonella
2.2.1.- AGUA PEPTONADA TAMPONADA
38
Para enriquecimiento previo no selectivo de bacterias especialmente de Enterobacterias

patógenas a partir de alimentos. Por su composición este medio de cultivo corresponde a las
recomendaciones de la International Organization for Estandarización (1975), a las normas
DIN 10181 Para el análisis de cárnico, así como de productos derivados de huevos del
ministerio federal Alemán (1975). Un enriquecimiento previo en este caldo conduce a mayores
cuotas de crecimiento de Enterobacterias patógenas.
a.- Forma de Acción
El caldo rico en sustancias nutritivas provoca una alta cuota de sobrevivencia de bacterias
dañadas subletalmente y un crecimiento intenso. El tampón fosfato evita una variación del pH
perjudicial para las bacterias.
Una vez preparado según las indicaciones, distribuir en cantidades de 225 ml en frascos,
esterilizar en autoclave 15min/15 Lb/121ºC.
Sembrar en el medio de cultivo y llevar a incubar a 18 horas/35ºC. Posteriormente sembrar en

medios nutritivos de enriquecimiento selectivo.
2.2.2.- CALDO DE ENRIQUECIMIENTO DE SALMONELLA SEGÚN RAPPAPORT Y

VASSILIADES (CALDO RV)
Para el enriquecimiento selectivo de Salmonella, con excepción de Salmonella thyphi y S.

parathyphi A, en alimentos. Este medio tiene mayor selectividad que otros medios,
consiguiéndose mayores rendimientos en Salmonella, especialmente a una temperatura de 43
ºC y previo enriquecimiento.
a.- Empleo e Interpretación: El medio de cultivo se siembra con el material objeto de

investigación, procedente de un enriquecimiento previo en agua peptonada tamponada y se
incuba hasta 24 horas a 43ºC.
2.2.3.- CALDO MULLER-KAUFFMANN TETRATIONATO – NOVOBIOCINA (MKTTn)
Para el enriquecimiento selectivo de Salmonella a partir de, alimentos y otros materiales. Para
su composición, este medio de cultivo corresponde a las recomendaciones de la Food and Drug
Administration (1962), de la America Public health Association (1984), de la United Status
Pharmacopoeia XXI (1985), de la Norma DIN 10181 para el análisis de leche y las
Prescripciones analíticas apartado 35 para la investigación de alimentos.
39
a.- Forma de Acción: El tetrationato y novobiocina inhibe el crecimiento de bacterias

coliformes y Enterococos en las primeras 6 a 12 horas siguientes al inicio de la incubación.
Después del efecto inhibidor disminuye lentamente. Por el contrario, Salmonella, Proteus y
Pseudomonas no son inhibidas.
2.2.4.-AGAR XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO
Para el aislamiento y diferenciación de Enterobacterias patógenas, especialmente de especies de

Shiguella y Salmonella. Para su formulación este medio de cultivo corresponde a las
recomendaciones de las United Status Pharmacopeia XXI (1980) y de la European Pharmacopeia.
En combinación con un enriquecimiento adecuado, con el agar XLD se puede detectar un numero
notablemente mayor de Salmonella y Shiguella que con otros medios de cultivo selectivos. La
siembra directa por estrías sobre el medio de cultivo para el aislamiento.
Forma de Acción: La degradación de la xilosa, sacarosa y lactosa a ácido produce un viraje al

amarillo del rojo de fenol. El tiosulfato y la sal de hierro revelan la formación de acido sulfhídrico
por la precipitación de sulfuro de hierro negro en las colonias
Empleo e Interpretación: Sembrar en el medio de cultivo en superficie, por estrías en capa fina.
Incubación 48 horas a 37ºC.
Cuadro 6. Características generales de las colonias de Salmonella en el medio XLD

Colonias Microorganismo
Amarilla, con zona amarilla alrededor, Escherichia coli, Enterobacter, Aeromonas.
opacas; halo de precipitación
Amarilla, con zona amarilla alrededor, Klebsiella
opacas mucosas; halo de precipitación
Amarilla, con zona amarilla alrededor, Citrobacter (cepas lactosa positivas)
opacas, a veces con centro negro.
Amarilla, con zona amarilla alrededor, Serratia, Hafnia
opacas
Amarilla, con zona amarilla alrededor, Proteus vulgaris, la mayoría de Proteus
transparente; centro negro. mirabilis
Del mismo color que el medio de cultivo, Salmonella
transparente, a veces con centro negro.
Del mismo color que el medio de cultivo, Shiguella, Providencia, Pseudomonas.
40
transparente.
Anaranjadas, ligeramente opacas. Salmonella tiphi (cepas xilosa positivas)
Fuente: Elaboración propia
2.2.5.- AGAR PARA SALMONELLA Y SHIGUELLA – (AGAR SS)
¡No esterilizar en autoclave!
Para el aislamiento de Salmonella y Shiguella a partir de heces, alimentos y otros materiales

objeto de investigación. El medio de cultivo correspondiente a las recomendaciones de la APHA
(1984) para la investigación de Alimentos.
Forma de actuación: El verde brillante, la bilis de buey y la elevada concentración de tiosulfato y

de citrato inhiben considerablemente la flora acompañante. Con el tiosulfato e iones de hierro se
pone en manifiesto la formación de sulfuros por el ennegrecimiento de las correspondientes
colonias. Las colonias de Coliformes quedan señaladas por la demostración de la degradación de
la lactosa a acido, a cargo del indicador de pH rojo neutro.
Empleo e Interpretación: Sembrar por estría en la superficie del medio de cultivo con el material
de muestra o con el procedente de un cultivo de enriquecimiento previo.
Incubación: 18 – 24 horas a 37ºC. Las colonias de gérmenes lactosa-negativos son incoloras y los
gérmenes lactosa positivos son rosadas hasta rojas. Las colonias formadoras de H 2S presentan un
centro negro.
Cuadro 7. Características generales de las colonias de Salmonella sp. en el medio de cultivo

Salmonella y Shiguella
Colonia Microorganismo
Incoloras, transparentes Shigellas y la mayoría de las Salmonellas

Transparentes con centro negro Proteus y algunas de las Salmonellas
Rosada hasta rojas Escherichia coli
Mayores que la E. coli, rosadas hasta de color Enterobacter aerogenes
cremoso-blanquecinas, opacas, mucosas
Fuente elaboración propia
2.2.6.- AGAR RAMBACH
Medio de cultivo para diagnostico de diferencial para identificación de Salmonella en alimentos y

muestras clínicas.
41
Forma de Acción: Los substratos de sustancias alimentarías contenidos en el Agar Rambach

permiten un buen crecimiento de enterobacterias. El desoxicolato sodico produce una inhibición
de la flora acompañante Gram positivo. El agar Rambach, mediante un nuevo procedimiento de
patente solicitada, permite diferenciar las Salmonellas claramente de otras bacterias. Esto es
posible por la adición de propilenglicol al medio de cultivo. Las Salmonellas forman acido a partir
de propilenglicol y en combinación con el indicador de pH producen colonias rojas características.
Para diferenciar las coliformes de las Salmonellas el medio de cultivo contiene un cromógeno, que
indica la presencia de la separación de B- galactosidasa característico para los coliformes. Los
coliformes crecen en forma de colonias verde azuladas/violeta azuladas, otras enterobacterias y
bacterias Gram negativas, Ej. Proteus, Pseudomonas, Shigella, S. thyphi, S. parathyphi A, crecen
en forma de colonias incoloras amarillentas.
¡EL MEDIO DE CULTIVO NO DEBE SOMETERSE A AUTOCLAVE!
Disolver en baño de agua a 40 – 50 ºC, agitar regularmente por balanceo el medio de cultivo y
seguida verter las placas. Para evitar que precipite el agar durante el vertido en placas es
recomendable colocar placas durante la fase de solidificación sobre un fondo fresco. Las placas
del medio de cultivo son opalescentes y rosa claro. La estabilidad de las placas en refrigeración sin
protección es 3 semanas, en bolsas plásticos o con cinta adhesiva 3 meses.
Empleo: Enriquecer el material de muestra en el correspondiente caldo selectivo para Salmonella.

Luego inocular el cultivo con un asa de incubación sobre ¼ de una placa de agar. Para obtener
colonias individuales bien reconocibles se continúa la inoculación con la misma asa sobre las
restantes ¾ de la placa. Incubación 24 a 48 horas aeróbicamente a 35 a 37ºC.
2.2.7.- AGAR BISMUTO-SULFITO
Agar selectivo para aislamiento y diferenciación de Salmonella typhi y otras Salmonella.
Forma de Acción: El verde brillante y el bismuto inhiben considerablemente a los gérmenes de

acompañamiento. Las colonias de Salmonella sulfuro de hidrogeno positivas presentan
ennegrecimiento debido al sulfuro de hierro. La reducción de los iones de bismuto a bismuto
metálico produce brillo metálico.
Empleo e Interpretación: Sembrar finamente en la superficie de las placas, por estrías en

superficie procedente de un cultivo de enriquecimiento.
42
Incubación: 48 horas a 37ºC, se reconoce por el ennegrecimiento de las colonias de Salmonella,

pero todavía sin ningún brillo metálico, dicho brillo metálico aparece a después de este tiempo.
2.2.8.- AGAR TSI- AGAR HIERRO TRES AZUCARES
Para la identificación de Enterobacterias. Este medio de cultivo corresponde a las

recomendaciones dadas por la International Organization for Standarization (ISO) (1975).
a.-Forma de Acción: La degradación del azúcar con formación de acido se manifiesta por un cambio
de color del indicador rojo de fenol que vira de un anaranjado-rojizo a amarillo, o por un viraje a
rojo intenso en caso de alcalinización. El tiosulfato es reducido por algunos gérmenes a acido
sulfhídrico, el cual reacciona con la sal férrica produciendo sulfuro de hierro de color negro.
b.- Empleo de Interpretación: Se siembra el cultivo puro sometido a investigación tanto por estría
en la superficie inclinado como en la columna vertical, mediante estría central. Incubación 48
horas a 37 ºC.
2.2.9.- MEDIO DE CULTIVO SIM
Medio de cultivo de ensayo para comprobar la formación de sulfuro, la formación de Indol y la

motilidad.
Empleo e Interpretación: El cultivo es sometido a siembra por picadura en la capa superior del
medio de cultivo
Incubación: 18 a 24 horas a 37ºC. La motilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del
medio de cultivo alrededor del canal de la picadura. La formación del indol se debe a la coloración
rojo-púrpura de la capa de reactivo.
Cuadro 8. Características bioquímicas de Salmonella sp.

Microorganismo H2S Indol Motilidad
Escherichia - + +/-
Enterobacter - - +
Citrobacter + - +
Shiguella - +/- -
Salmonella + - +
Proteus vulgaris + + +
2.2.10.- AGAR LISINA-HIERRO
43
Agar de ensayo para la demostración simultanea de lisina descarboxilasa (LD) y de la

formación de acido sulfhídrico (H2S) para la identificación de Enterobacterias sobre todo de
Salmonella y Arizona.
Se produce el viraje al violeta del indicador de pH púrpura de bromocresol, es necesario que

se produzca la acidificación del medio de cultivo por fermentación de la glucosa.
Salmonella no produce viraje del medio, pero si puede producir el sulfuro de hidrogeno.
2.2.11.- CALDO UREA
El caldo distribuido es claro y de color amarillento rojo. Medio de cultivo de diferenciación

para la demostración de microorganismo que utiliza urea.
Ha sido recomendada por ferguson y Hook (1943) para la diferenciación de Salmonella y

Proteus. Los gérmenes que utilizan urea producen un viraje del indicador hacia el rojo y
produce eventualmente turbidez del medio.
Empleo e Interpretación: Sembrar masivamente el cultivo puro. Incubar por 48 horas a

37ºC. Salmonella es urea negativa o débilmente negativa.
2.2.12.- AGAR MIO
Es un medio utilizado para la identificación de Enterobacterias en base a la motilidad. La

motilidad es demostrada por la difusión del crecimiento en el tubo depuse de la incubación.
La reacción de la ornitina se inicia por el color púrpura en el medio. La producción del
indol se demuestra por la presencia de un anillo rojo-cereza al agregar el reactivo de
Kovacs.
Empleo e Interpretación: Los tubos con el medio MIO son inoculados por punción
profunda, después de incubados por 18 a 24 horas a 35ºC. La motilidad y la reacción de
descarboxilación de la ornitina se colorean de rojo después de la adición del indol.
2.2.13.- AGAR CITRATO DE SIMMONS
Se basa en la utilización o no del citrato como única fuente de carbono. E. coli no crece en
el medio, mientras que la mayoría de los otros organismos lo hacen. El género Salmonella
utiliza el citrato produciendo la coloración azul característica
44
Empleo e Interpretación: El medio puede utilizarse en agar inclinado en tubos de ensayo o

bien en placas Petri. En ambos casos se inocula ligeramente la superficie del medio en estrías o
también se inocula el fondo del medio por picadura.
3.1 MATERIALES
 Muestra: carne molida, huevos, carne de pollo, mayonesa

 Balanza eléctrica de 2,000 g de capacidad
 Instrumentos para la preparación de la muestra: cuchillos, pinzas, tenedores, tijeras,
cucharas, espátulas, etc.
 Incubadora a 35ºC a 37º C
 Baño maría a 48 ºC a 50º
 Recipientes con tapa para el medio de enriquecimiento
 Pipetas bacteriológicas
 Mechero bunsen
Medios de cultivo
 Agar SS
 Agar triple azúcar hierro (TSI)
 Agar citrato de Simmons
 Caldo Rappaport – Vassiliadis
 Agar hierro lisina (LIA)
 Peptona tamponada.
Reactivos y colorantes
 Cristales de fosfato de cretina
 Solución hidróxido de potasio al 40%
 Solución de hidróxido de sodio 1N
 Indicador de rojo de metilo
 Agua destilada estéril
45
3.2 METODOS
Procedimiento Día 1 y 2
 Pesar asépticamente 25 g de muestra en un frasco tapa rosca estéril que contengo 225 ml
de agua peptonada tamponada estéril y agitar por 5 minutos.
 Pasado este periodo de tiempo transferir asépticamente 0.1 ml de la suspensión a un tubo
de 10 ml del caldo Rappaport – Vassiliadis e incubar a 41.5°C por 24 h ± 3 h junto con los
controles positivo y negativos.
Procedimiento Día 3 y 4
Sembrar de los tubos a los medios selectivos agar SS, por estrías. Incubar a 37 °C por 24 a
48 horas.
Seleccionar las colonias características o sospechosas (colonias incoloras o transparentes

con o sin centro negro) y sembrar en agar nutritivo incubando por 24h ± 3 h a 37°C.
Realizar la confirmación bioquímica en los medios de cultivo: agar TSI, agar urea, agar
LIA, Reactivo voges proskauer, indol, detección de B- Descarboxilasa. Reporte los
resultados. Finalmente realice la confirmación serológica
Procedimiento Día 4
 Seleccionar 2 ó más colonias típicas o sospechosas de Salmonella e inocular en agar TSI y

agar LIA.
 Tocar suavemente el centro de la colonia con una aguja de siembra estéril e inocular en le
TSI sembrando en estrías cultivo inclinado y picando la columna del medio.
 Sin flamear, inocular en el agar lisina hierro (LIA) picando la columna del medio 3 veces y
luego sembrando en estrías.
 Incubar a 35 ºC por 24 horas. Tapar los tubos sin ajustar demasiado para mantener las
condiciones aeróbicas.
 Sembrar en agar citrato de Simmons, sembrando en estrías cultivo inclinado y picando la
columna del medio, Incubar a 35 ºC por 24 horas.
 Sembrar en el medio de cultivo SIM, sembrando en estrías cultivo inclinado y picando la
columna del medio, Incubar a 35 ºC por 24 horas
46
Evaluación bioquímica
 Salmonella en agar TSI, produce típicamente en la parte inclinada una reacción alcalina
(roja) y en la columna del medio una reacción acida (amarillo) con o sin producción del
H2S (pigmentación negra).
 En el agar LIA, Salmonella produce típicamente una reacción alcalina (color púrpura) en la
columna del medio en el tubo. Considerar una reacción acida negativa cuando la columna
presenta un color amarillo. La mayoría de cultivos de Salmonella produce H2S en agar
LIA.
 En agar citrato de Simmons se da una coloración azul para el género Salmonella.
 En el agar Sulfuro de hidrogeno-indol –motilidad, se coloca 1 gota de reactivo de indol y
se observa un halo de color púrpura.
 Cuando los resultados de la prueba bioquímica concuerdan con el patrón indicado se
confirma que el aislamiento es de Salmonella sp.
 Las colonias identificadas bioquímicamentje como Salmonella son enfrentadas a diversos
sueros para su confirmación serológica.
VII. RESULTADOS
Prepare sus resultados mediante cuadros, gráficos sobre las características de las colonias:
forma, aspecto, color y tamaño de las colonias de Salmonella sp. Reporte sus resultados de la
prueba bioquímica para la identificación de SalmoneIla sp.
V. DISCUSIONES
Explica ampliamente cada uno de tus resultados con sustento bibliográfico.
VI. CONCLUSIONES
En función de los resultados obtenidos y considerando los objetivos de la práctica, responder a

los objetivos planteados.
47
PRACTICA Nº 8
CONTROL DE ESTERILIDAD DE CONSERVAS
I. OBJETIVOS
 Disponer un método para aislar e investigar esporas de Clostridium botulinum en alimentos

envasados.
 Evaluar la presencia de microorganismos termófilos y mesófilos aerobios y anaerobios.
Los alimentos enlatados o envasados normalmente son preservados mediante tratamiento

térmico asegurándose así mediante la esterilización comercial. Los alimentos que ofrecen
mayor riesgo son los denominados de baja acidez, con Aw superior a 0.85 y un pH mayor a
4.6. Ofrecen riesgos potenciales de proliferación de bacterias patógenas, como el Clostridium
botulinum, razón por el cual medidas extremas de seguridad deben ser adoptadas en su
procesamiento.
De acuerdo con los Métodos Normalizados o métodos descritos por organizaciones con
credibilidad internacional tales como la Asociación Oficial de Químicos Analíticos (AOAC), o
Asociación Americana de Salud Pública (APHA) sobre Prueba de Esterilidad Comercial,
considerando la temperatura, tiempo de incubación e indicadores microbiológicos del
mencionado método, los cuales deben especificarse en el informe del ensayo.
La prueba de esterilización comercial se realiza en envases que no presenten ningún defecto

visual. Si luego de la incubación el producto presenta alteración en el olor, color, apariencia,
pH, el producto se considerará “No estéril comercialmente”.
Si tras la inspección sanitaria resulta necesario tomar muestras de las unidades defectuosas
para determinar las causas, se procederá por el método de análisis microbiológico para
determinar las causas microbiológicas del deterioro según métodos establecidos en el Codex
alimentarius, Manual de Bacteriología Analítica (BAM) de la Administración de Alimentos y
Drogas (FDA) o Asociación Americana de Salud pública (APHA).
La alteración se debe a los microorganismos que sobreviven al tratamiento térmico o pueden

llegan al interior de las latas a través de las suturas. Si se conoce el tipo de alimento se puede
48
predecir qué tipo de microorganismo es el responsable, en las alteraciones por fugas es

imposible predecir el tipo de contaminación.
El resultado se debe reportar de la siguiente manera:
Aceptación: “Estéril comercialmente”
Rechazo: “No estéril comercialmente”
2.1 FACTORES DE ALTERACIÓN MICROBIANA
 Cargas especificas de microorganismos resistentes al tratamiento térmico.

 Temperatura de crecimiento de los m.o. sobrevivientes.
 Temperatura de almacenamiento del producto envasado.
 Características del alimento envasado, pH, contenido de aditivos.
 Presencia de oxígeno.
2.2 LOS MÉTODOS MODERNOS DE PRESERVACIÓN DE ALIMENTOS
 Manipulación aséptica
 Tratamiento térmico
 Temperaturas bajas
 Deshidratación
 Presión osmótica
 Productos químicos
 Radiaciones
Estos procedimientos de preservación tienen por fundamento algunos de los principios siguientes:
 Prevención o eliminación de la contaminación

 Inhibición del crecimiento y metabolismo bacteriano
 Destrucción de los microorganismos
La temperatura elevada es uno de los métodos más seguros y dignos de confianza para la
preservación de alimentos. La acción de calor se aplica para destruir los microorganismos de los
productos alimenticios envasados en cajas o envases de hojalata que impiden la entrada de
49
microorganismos después de cerradas. El calor a presión en autoclave es el medio más eficaz para
la destrucción de las formas vegetativas y esporuladas.
La preservación de los alimentos por el calor requiere el conocimiento de la resistencia térmica de
los microorganismos, especialmente las esporas. Axial mismo hay que tener en cuenta la velocidad
de penetración del calor a través de productos de consistencia diferentes, así como el tamaño de los
envases.
El microorganismo más importante que hay que destruir en esta clase de conservas es el anaerobio
Clostridium botulinum, el cual produce una toxina muy activa, muchas veces de acción mortal.
Debido a su resistencia térmica, las bacterias que forman esporas como especies del género
Clostridium y Bacillus, constituyen el grupo de microorganismos más importantes para la industria
conservera.
2.3 TIPOS PREDOMINANTES DE ALTERACIÓN DE LOS PRODUCTOS

COMERCIALES
1.- Agriado ligero

2.- Alteración por anaerobios termófilos
3.- Putrefacción y los microorganismos que causan intoxicaciones alimentarías.
El microorganismo más importante que hay que destruir en alimento tipo conservas es el anaerobio
Clostridium botulinum. Este microorganismo vive como saprofito en el intestino de los animales
herbívoros, los cuales lo distribuyen extensamente por todo el suelo.
Las esporas de Clostridium botulinum son muy resistentes a la acción del calor y en los productos
alimenticios deficientemente elaborados pueden conservar su vitalidad y germinar mas tarde. La
forma vegetativa crece entonces en condiciones anaerobias en los productos envasados y producen
la toxina que da lugar a una grave toxemia cuando se ingiere con los alimentos. Las conservas de
hortalizas de fabricación casera son las causas más frecuentes de intoxicación, pero también los
encurtidos y las carnes enlatadas constituyen un buen medio para el crecimiento de esta bacteria y
la producción de esta toxina.
2.4 PERÍODO DE INCUBACIÓN
El tiempo de incubación es variable, depende de la dosis ingerida, puede ser desde unas cuantas
horas hasta varios días, con promedio de 2 a 36 horas.
50
Síntomas: Dolores gastrointestinales, cefalea, postración, estreñimiento, dificultad respiratoria y

algunas veces asfixia. Por lo general se presentan también manifestaciones nerviosas, como
fotofobia y visión borrosa.
El diagnostico se confirma por el aislamiento de la bacteria y demostración de las toxinas en el

alimento sospechoso.
3.2 MATERIALES
 Licuadora
 Balanza de 2000 g de capacidad, sensibilidad 0.1 g
 Incubadora de 35ºC
 Baño maria de 46ºC
 Estufa
 Contador de colonias
 Mechero Bunsen
 Jarras anaeróbicas con sobre generadores de hidrogeno, anhídrido carbónico y catalizadores
 Pipetas de 1 ml
 Pipetas de 10 ml
 Placas petri
 Tubos de prueba
 Espátula de extensión
 Asa de siembra
 Cucharas estériles
 Todos los materiales a utilizarse en los análisis microbiológicos deben ser estériles y
manipulados con la debida asepsia.
Medios de cultivo
 Agar plate count
 Agar tripstosa-sulfito- Cicloserina (TSC)
 Emulsión de yema de huevo
 Caldo de hígado picado o Medio de carne cocida
51
 Caldo cerebro corazón

 Medio de Tioglicolato (fluido)
 Medio lactosa gelatina
 Medio de Nitrato –Motilidad
 Reactivos para tinción Gram
 Almidón soluble al 0.1%
 Clorhidrato de cisteina
 Solución de glicerina
 Reactivo para la detección de Nitrito
3.2 METODOS
DIA 1
Tomar nota de las prescripciones externas del envase, numero de lote, dimensiones de la lata, peso,
retirar la etiqueta para pegar en el cuaderno de historial de las muestras. Realizar el examen visual del
recipiente para detectar presencia de defectos mecánicos, integridad de las suturas, perforaciones,
corrosiones, abolladuras u otras anormalidades.
a.- Numero de envases: Se toma una muestra mínima de 10 latas, desinfectar cada uno de los
envases. Colocar las latas sobre papel filtro sobre una placa de petri limpio para observar la pérdida de
líquido durante la incubación.
b.- Incubación preliminar: Incubar algunas latas por 10 días a 55ºC para detectar microorganismos
termófilos y el otro grupo de latas a 35ºC por 21 días para la detección de microorganismos mesófilos.
Durante la pre-incubación se agitan las latas cada 2 días y se separan aquellas que muestren
hinchamiento y pérdida de material, los cuales deben ser examinados para determinar los defectos en la
hermeticidad del cierre.
DIA 10 Y 21
a.- Examen externo del envase después de la incubación
52
 Para abrir los envases para el control de esterilidad se debe tomar una serie de precauciones
como:
 Abrir los envases de preferencia dentro de una cámara de flujo laminar con aire estéril
circulante.
 Lavar cuidadosamente con algodón y alcohol de 70º, echar un poco de alcohol sobre la tapa y
dejar actuar por unos minutos, eliminar el alcohol y flamear en forma rápida. No flamear los
envases abombados.
 El analista debe asegurarse bien las manos y desinfectar con alcohol si usa guantes
 No hablar durante el procesamiento.
 Abrir con un abrelatas estéril en una línea alejada de las suturas, evitando tocar la muestra con
las manos.
 Examinar visualmente el aspecto del producto, tomando nota de las posibles alteraciones.
Tapar con una placa estéril.
b.- Análisis de envases abombados
 Se debe tener ciertas precauciones para que no se contamine el analista y el ambiente del
laboratorio.
 Limpiar y desinfectar el envase, no flamear.
 Colocar la lata sobre un desinfectante (tegol al 5%)
 Colocar sobre la lata un embudo invertido con un estilete de metal y realizar un orificio en la
lata para eliminar los gases.
 Abrir con un abrelatas estéril en una línea alejada de las suturas, evitando tocar con las manos
la muestra. Examinar visualmente el aspecto del producto, tomando en cuenta las posibles
alteraciones.
c.- Medida del pH
La medida del pH se realiza después del análisis microbiológico con un pH-metro, directamente
sobre el producto si es homogéneo
d.- Control de Esterilidad
 Para comprobar la esterilidad del producto es necesario colocar las muestras en medios de
cultivo muy nutritivos que permitan el crecimiento de bacterias revivificables.
53
 Una vez abierta la lata con un abridor estéril se siembra una serie de 3 tubos para aerobios
y otra serie de 3 tubos para anaerobios.
 Según el tipo de muestra utilizar pipetas para líquidos, pinzas, bisturís para sólidos. La
siembra en medios específicos se realiza asépticamente y de distintos lugares.
e.- Detección de Aerobios
Transferir con una pipeta estéril 3 ml o g de la muestra en cada uno de los frascos conteniendo
27 ml de caldo cerebro corazón adicionado de almidón.
f.- Detección de Anaerobios
Transferir con una pipeta estéril 3 ml o g de la muestra en cada uno de los tubos conteniendo
27 ml de caldo cerebro corazón adicionado de cisterna y almidón. Luego se coloca en una jarra
de anaerobiosis. Si no se cuenta con la jarra adicionar a cada tubo o frasco una capa de 12 ml
de parafina estéril.
Se incuba la serie de 3 tubos a 55ºC por 72 horas para detectar microorganismos termófilos y
los otros 3 tubos a 35ºC/72 horas para la detección de microorganismos mesófilos.
´Procedimiento para la investigación de bacterias
a.- Aerobios
Se inocula por duplicado 1 ml o 1 g de muestra en placas petri estériles, se le adiciona de 15 a

20 ml de agar plate count, fundido a temperatura de 45ºC, se mezcla con movimientos de
vaiven y movimientos circulares, dejas solidificar y se recubre con aproximadamente 5 ml de
medio estéril. Dejar solidificar e incubar las placas a 35ºC/72 horas para mesófilos y a 55ºC/72
horas para termófilos.
b.- Anaerobios
Se inocula por duplicado 1 ml de la muestra en placas petri estériles, se le adiciona 15 a 20 ml

de agar BHI adicionado cisterna y almidón, fundido temperado a 55 ºC Mezclar con
movimientos de vaiven y circulares, dejar solidificar y colocar en jarras de anaerobiosis e
incubar a 35ºC/72 horas para mesófilos y 55ºC/72 horas para termófilos.
54
DIA 24
Lectura de Resultados
 Compruebe de presencia de colonias en medios sólidos y realizar un recuento.

 En los medios líquidos, es necesario realizar subcultivos en medios sólidos. Algunos
medios de cultivo líquidos que contienen indicadores viran de color por la presencia de
microorganismos.
 Preparar la coloración Gram y examinar la presencia de bastoncillos Gram-positivos
grandes. Se interpreta de acuerdo al crecimiento obtenido en los distintos medios de
cultivo usado para aerobios y anaerobios.
III. RESULTADOS
Describirlo con tablas, ilustraciones y/o gráficos. Reportar la presencia de

mesófilos, termófilos, aerobios y anaerobios en un cuadro.
IV. DISCUSIONES
Interpreta y explica los resultados sobre la presencia y factores determinantes de la

presencia de estos microorganismos en conservas en forma amplia con sustento
bibliográfico y antecedentes referidos al ensayo.
V. CONCLUSIONES
En función de los resultados obtenidos y considerando los objetivos de la práctica,

responder a los objetivos planteados.
55
PRACTICA N° 9
NUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y COLIFORMES TERMOTOLERANTES (E.

coli) POR EL MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE DE TUBOS MÚLTIPLES NMP/ml
og
I. OBJETIVOS
 Determinar la numeración de E. coli por el método del Numero Más probable.

 Determinar la numeración de Coliformes totales por el método del Numero Más probable
2.1 COLIFORMES FECALES- Escherichia coli
Escherichia coli es un coliforme fecal. Los coliformes fecales son un grupo de microorganismos
seleccionados por incubación de los inóculos procedentes de un caldo de enriquecimiento a
temperaturas superiores a las normales (45 +/-0,5º C) y son muy indicativos de una posible
contaminación de origen fecal del alimento. Se definen por la producción de ácido y de gas en
caldo EC a 45º C de temperatura.
Los criterios de identificación utilizados son la producción de gas a partir de la glucosa (y otros
azucares) y la fermentación de la lactosa dentro de 48 horas a 45 ºC.
E. coli es causante de la diarrea frecuente en los niños y turistas. Existen varios grupos que pueden
producir cuadros entéricos leves y severos. La presencia de E. coli, indica generalmente una
contaminación fecal. Por ejemplo, la contaminación fecal del agua, moluscos, productos lácteos y
en otros alimentos.
Existen varios grupos que pueden producir cuadros entéricos leves a severos, entre ellos tenemos:
o E. coli enterotoxigénica (ETEC), gastroenteritis, diarrea del viajero

o E. coli enteropatógeno (EPEC), diarrea infantil
o E. coli enterohemorrágico (EHEC), colitis hemorrágica
o E. coli enteroinvasivo (EIEC), disentería bacilar
56
Su distribución es universal, principalmente en países en vías de desarrollo.
Cifras sustanciales de E. coli en alimentos, sugiere una falta general de limpieza en el manejo del
mismo y un almacenamiento inadecuado.
El término de coliformes fecales ha sido como un intento de encontrar métodos rápidos y fiables
para establecer la presencia de E. coli.
Los coliformes fecales comprenden un grupo de microorganismos seleccionados por incubación

de los inóculos procedentes de un caldo de enriquecimiento de coliformes a temperaturas
superiores a las normales (45ºC).
2.2 COLIFORMES TOTALES
No todos los coliformes son de origen fecal, por lo que se hizo necesario desarrollar pruebas para
diferenciarlos a efectos de emplearlos como indicadores de contaminación. Se distinguen, por lo
tanto, los coliformes totales que comprende la totalidad del grupo los coliformes fecales aquellos
de origen intestinal.
En conjunto los coliformes están representados por cuatro géneros de la familia

Enterobacteriaceae: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, y Klebsiella. Todos ellos son
fermentadores de la lactosa en 48 horas.
Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, y también en el suelo, las plantas, etc.
No son muy buenos como indicadores, pero se utilizan como indicadores de contaminación fecal
y son buenos indicadores de un proceso o de un estado sanitario poco satisfactorio.
Desde el punto de vista de la salud pública esta diferenciación es importante puesto que permite
asegurar con alto grado de certeza que la contaminación que presenta el agua es de origen fecal.
2.3 DETERMINACION DE Escherichia coli POR EL MÉTODO DE LOS TUBOS

MÚLTIPLES
1.- Prueba presuntiva: Caldo Lauril Sulfato Triptosa
El medio de cultivo contemplado por la ISO es el Caldo Lauril Sulfato Triptosa, aunque se
puede emplear alternativamente otros medios como para esta prueba (Caldo Lauril Sulfato,
57
Caldo Lauril Triptosa, caldo lactosado), se puede usar cualquiera de ellos, pero con preferencia
el primero. Incubar 35ºC/3 horas pasar a baño María a 44.5 ºC/24 horas
Debido a su elevada calidad nutritiva y al tampón de fosfatos que contiene este medio de
cultivo se garantiza el crecimiento y la intensa producción de gas. La producción de gas puede
evaluarse con tubitos de fermentación. El contenido de Lauril Sulfato inhibe notablemente el
crecimiento de la flora indeseable de otras bacterias.
A partir de los tubos gas positivo en caldo lauril sulfato en la prueba presuntiva, se inoculará
tubos que contengan caldo EC. Incubar a 44.5 ºC por 24 horas en baño maría con tapa para
mantener una temperatura homogénea y estable.
Cualquier inoculación directa de las diluciones de la muestra en caldo EC, sin previo
enriquecimiento en caldo lauril sulfato o triptosa es inadecuada.
Luego del periodo de incubación, los tubos son retirados del baño maría, se agita subvente y se
observa la producción de gas. La presencia de gas en cualquier cantidad es una prueba positiva.
Se calcula el numero más probable (NMP), basándose en las combinaciones de tubos positivos
y negativos.
2.- Prueba confirmativa: caldo EC.
El caldo EC, es un medio contemplado por la ISO: 7251; 1993, este medio favorece el
crecimiento de las bacterias lactosa-positivas, especialmente coliformes y E. coli. Los
gérmenes lactosa positivos consumen lactosa con producción de gas, las sales biliares inhiben
notablemente el crecimiento de gérmenes gram positivos o de microorganismos no adaptadas
al medio ambiente intestinal.
Un segundo método es utilizando el caldo lactosado verde brillante bilis con MUG incubado a
37ºC por 24 horas, los tubos que dan fluorescencia azul claro la luz UV corresponden a E. coli.
3.- Pruebas complementarias
Agar EMB según LEVINE (agar-eosina-azul de metileno-lactosa –sacarosa)
Los colorantes contenidos en su formula inhiben a muchos gérmenes gram positivos de

acompañamiento.
58
A partir de los tubos positivos con un asa de siembra pasar al agar EMB e incubar a 37ºC/24
horas, las colonias típicas son de color rosado oscuras con núcleo central con o sin brillo
metálico.
2.4 DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES POR EL MÉTODO DE LOS

TUBOS MÚLTIPLES NMP
1.- Prueba Presuntiva
Esta técnica es aplicada en exámenes de rutina de muestras obviamente contaminadas. Se

deben prestar especial atención a la interpretación a los resultados porque pueden obtenerse
falsos positivos, ocasionados por ciertas especies de bacterias que no son coliformes.
El caldo lactosado es el medio recomendado para la prueba presuntiva, asegurando una

recuperación equivalente de coliformes. Todas las muestras deben ser agitadas vigorosamente
al igual que las diluciones antes de inocular en la serie de tubos múltiples.
Al cabo de las 24 horas de incubación los tubos deben ser examinados, si no se ha producido
gas se vuelve a examinar a las 48 horas.
Si se forma gas como resultado de la fermentación se enturbiará simultáneamente el caldo y

agitando simultáneamente se puede demostrar una fermentación activa por la aparición
continua de pequeñas burbujas de gas en el medio, fuera del tubo de fermentación.
Se debe homogenizar el tubo con fermentación sacudiéndolo suavemente y por movimientos

de rotación antes de efectuar la transferencia a la prueba confirmativa.
Para la transferencia se debe utilizar un asa de siembra con alambre de micrón cromo o platino
Nº 22 ó 24 en forma de asa o anillo con 4 mm de diámetro.
2.- Prueba Confirmativa. Caldo lactosado verde brillante
La bilis y el colorante verde brillante inhiben notablemente el desarrollo de la flora indeseable

presente en las muestras incluso clostridios degradadores de lactosa (Clostridium perfringens).
La fermentación de la lactosa con formación de gas que es indicativo de la presencia de de
coliformes, se demuestra mediante los tubitos Durham.
Todos los tubos de gas positivo en la prueba presuntiva deben ser sometidos a procedimientos
confirmativos.
59
Para esta prueba se utiliza tubos que contienen caldo lactosado verde brillante bilis (caldo
brilla) o también puede ser utilizados palcas de agar eosina azul de metileno (Agar EMB). A
partir de los tubos positivos de caldo Lauril Sulfato inocular de inmediato a tubos que
contienen caldo lactosado verde brillante bilis (caldo brilla), incubar a 37ºC por 24 y 48 horas.
Se considera como prueba confirmativa positiva la formación de gas (menor o mayor) en el

interior del tubo invertido en cualquier periodo de tiempo dentro de las 48 horas. Se calcula el
numero más probable (NMP), basándose en las combinaciones de tubos positivos y negativos.
3.- Prueba Complementaria
A partir de los tubos positivos de caldo lactosado verde brillante bilis, utilizando un asa de
micrón cromo se siembra en las placas de Agar EMB y llevar a incubar por 24 horas a 35 ºC.
A las 24 horas las colonias positivas son las colonias típicas (colonias rosado oscuras, con un
núcleo central, con o sin brillo metálico) o las colonias atípicas (colonias rosadas mucoides,
opacas sin núcleo), las colonias negativas son transparentes.
2.5 CALCULO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)
El cálculo de la densidad probable de bacterias coliformes fecales en una muestra está basado
en la combinación de los resultados positivos y negativos obtenidos en cada dilución. La
densidad de bacterias coliformes se expresa como NMP de coliformes es por 100 ml.
El NMP se obtiene a través de tablas en las que se presentan el límite de confianza de 95% para
cada valor.
Tres diluciones son necesarias para la obtención del código del NMP. Si tenemos sembrados 3
porciones de las diluciones 10-2, 3 de 10-3 y 3 de 10-4 y se tiene como resultado positivo 3 de 10 -
2
, 2 de 10-3 y ninguno de 10-4. El código resultante para la obtención del NMP será de 3 – 2 –
0.
3.1 Materiales
 Incubadora a 35ºC±1 ºC
 Estufa
 Baño maría a 44.5ºC
60
 Autoclave
 Balanza con capacidad de 2kg
 Lámpara UV
 Pipetas graduadas a 1ml y 10 ml
 Frascos para dilución 500 ml
 Placas de petri
 Utensilios estériles para manejar muestras (bolsas plásticas, cucharas, cuchillos, tenedores)
 Vasos de precipitado
Medios de cultivo
 Caldo Lauril Sulfato o Caldo Lauril Triptosa,
 Caldo EC
 Caldo verde brillante bilis lactosa
 Caldo peptonado al 0.1%
 Indol
 TSI
 Medio para movilidad
 Agar citrato de Simmons
 Reactivo rojo de metilo
 Reactivo de kovacs
 Reactivos para coloración Gram.
3.2 METODO
Procedimiento
 Pesar 10 g ó ml de la muestra y agregar 90 ml de agua peptonada al 0.1% (se tiene dilución 10 -

1
). Agitar
 Preparar diluciones decimales con 9 ml de agua peptonada de 10 -2 y 10-3.
61
 Transferir 10 ml a 3 tubos de caldo Lauril Sulfato de la dilución 10 -1 y de esta misma dilución

transferir 1 ml a 3 tubos de caldo lauril sulfato; así sucesivamente transferir 1 ml de la dilución
10-2 y 10-3 a 3 tubos da caldo lauril sulfato.
 Incubar a 37°C por 24 a 48 horas.
 Para la prueba confirmativa igualmente transferir con un asa de siembra de los tubos gas
positivo y turbio a tripletes de tubos con caldo EC. Incubar 44.5 C/24 a 48 h.
 Hacer la lectura como prueba confirmativa positiva la formación de gas (menor o mayor) en el
interior del tubo invertido en cualquier periodo de tiempo dentro de las 24 horas.
 Adicionar 2 a 5 gotas de Reactivo de Kovacs, aparición de un anillo rojo en la superficie del
medio es Indol positivo
 Calcular el número más probable (NMP), basándose en las combinaciones de tubos positivos y
negativos.
Nota: ver diagrama de procesamiento para E. coli y coliformes totales en anexo.
IV. RESULTADOS
Describirlo con tablas, ilustraciones y/o gráficos. Reportar la presencia de Coliformes Totales
y E. coli..
V. DISCUSIONES
Interpreta y explica los resultados sobre la presencia y factores determinantes de la presencia

de estos microorganismos en conservas en forma amplia con sustento bibliográfico y
antecedentes referidos al ensayo.
VI. CONCLUSIONES
En función de los resultados obtenidos y considerando los objetivos de la práctica, responder a

los objetivos planteados.
62
PRACTICA Nº 10
NUMERACION DE MOHOS Y LEVADURAS
I. OBJETIVOS
 Describir los procedimientos para el aislamiento de mohos y levaduras.

 Disponer de un método para realizar el recuento de mohos y levaduras en alimentos.
 Comparar dos medios de cultivo especifico para mohos y levaduras.
Muchos mohos transmitidos por alimentos y posiblemente levaduras pueden ser peligrosos para
la salud humana y animal debido a su capacidad para producir metabolitos tóxicos conocidos
como micotoxinas. La mayoría de micotoxinas son compuestos estables que no pueden ser
destruidos durante el procesamiento de alimentos o cocción domestica donde la toxina
preformada aun puede estar presente. Ciertos mohos y levaduras transmitidas por alimentos
también pueden producir reacciones alérgicas o pueden producir infecciones principalmente en
grupos de personas vulnerables como ancianos, personas débiles o inmunodeprimidos.
Los mohos son un grupo grande que incluye varios cientos de especies. La capacidad de estos
organismos para atacar a muchos alimentos se debe en gran parte a sus requerimientos
ambientales de relativa versatilidad. A pesar de que todos los mohos y levaduras son aerobios
obligatorios, su requerimiento de acido alcalino para cocer es bastante amplio; fluctuando de pH
2 a 9. Su rango de temperatura varía de 10 ºC a 35ºC.
Los requerimientos de humedad de mohos transmitidos por alimentos son relativamente bajos; la
mayoría de especies crecen en una actividad de agua (aw) de 0.85 o menos, aunque la levadura
requiere una mayor actividad de agua.
Las levaduras y mohos causan varios grados de deterioro y descomposición de alimentos.

Pueden invadir y crecer en cualquier tipo de alimento, pueden invadir campos de cosecha, tales
63
como granos pequeños, nueces, frijoles, tomates y manzanas en el campo antes de la cosecha y
durante el almacenamiento. También crecen en los alimentos procesados y en mezclas
alimenticias.
En los alimentos pueden ser detectados por presentar colores ligeramente manchados, fuertemente
manchados o complemente descompuesto manifestado por la formaron de manchas de diferentes
colores, micelio blanco, negro, rojo, verde, etc. también pueden producir sabores y olores
anormales.
La contaminación del alimento por mohos y levaduras también puede tener como resultados
pérdidas económicas para el productor, procesador y consumidor.
El método de siembra directa en placa es más eficiente que el método de siembra por diluciones en
placa para detectar especies individuales de moho, incluyendo la mayoría de productores de toxina.
3.1 Medios de cultivo para hongos
Para el cultivo, aislamiento y determinación del número de levaduras y mohos, a partir de alimentos
y otros materiales.
El medio de cultivo Agar papa Glucosa corresponde a las recomendaciones de la American Public
Health Association para el análisis de alimentos y de productos lácteos.
Forma de Acción: Los hidratos de carbono y la infusión de patata, favorecen el crecimiento de

levaduras y mohos, en tanto que debido a al bajo valor de pH la flora bacteriana de
acompañamiento queda parcialmente inhibida en su desarrollo. Para la numeración de mohos y
levaduras se recomienda bajar aun más el pH, haciendo descender hasta aproximadamente 3.5.
Las características morfológicas típicas de los hongos se desarrollan bien en este medio de cultivo.
Composición g/L
Infusión de patata preparada a partir de 200 g de papa …………..…. 4 ml
D-glucosa …………………………………. 20 g
Agar ……………………………. 15 g
Preparación
 Disolver 39g/ litro y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121ºC
64
 Para ajustar el pH a aproximadamente a 3.5, incorporar al medio de cultivo a 45 – 50 ºC una

solución estéril de acido tartárico al 10% a razón de 14 ml /litro
Empleo e Interpretación
Este medio de cultivo se siembra por estrías en superficie o mediante el procedimiento de

incorporación. Incubación hasta 5 días a temperatura ambiente.
Agar oxitetraciclina glucosa extracto de levadura
3.1 Materiales
Harina de trigo, cereales u otros granos
Equipos y Materiales
 Estomacher u homogenizador
 Equipo de filtración
 Incubadora de 22 a 25 ºC
 Placas petri de 100 x 15 mm
 Pipetas serológicas de 10 ml
 Pipetas serológicas de 1 ml
 Pinzas para papel filtro
Medios de cultivo
 Agua peptonada al 0.1%
 Agar ogy con oxitetraclina
 Agar papa dextrosa
 Oxitetraciclina
 Gentamicina
 Kit de colorantes para la coloración gram
65
 Azul de lactofenol
3.2 METODO
Método de Recuento en placa
DIA 1
 Pesar 10 gramos ó 10 ml de muestra, colocar en una bolsa de stomacher y agregar 90 ml de agua

peptonada al 0.1% y licuar por 30 segundos.
 Pipetear por duplicado en placas de Petri, alícuotas de 1 ml de las diluciones de 10 -1, 10-2 y 10-3. Se
deben sembrar 3 diluciones distintas.
 Verter en la placa 10 a 15 ml de agar plate count y temperado a 44ºC-46ºC. El periodo de tiempo
transcurrido entre a realización de las diluciones y el vertido del medio no debe superar los 20
minutos y si es preferible que sea menor a 10 minutos.
 Acto seguido mezclar el inoculo fundido, inclinando y girando las placas con movimientos de
vaivén, en sentido de las agujas de un reloj, en sentido antihorario.
 Con el fin de controlar la esterilidad preparar una o varias placas conteniendo el medio y el
diluyente sin inocular.
 Inocular 0.1 ml de las diluciones 10-2, 10-3 y 10-4 sobre el medio sólido de agar papa dextrosa y con
la ayuda de una espátula de drigalski sembrar en toda la superficie del medio. Dejar secar e invertir
la placa.
 Una vez solidificado al agar invertir e incubar a 22 – 24 ºC durante 3 a 5 días.
 Con la ayuda del contador de colonias y del dispositivo de recuento contar las colonias en aquellas
placas que contengan entre 30 a 300. Llevando a cabo un examen microscópico cuando sea
necesario para identificar las colonias de levaduras.
DIA 3 y 5
Informe de Resultados
Calcular el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo o ml de muestra,

multiplicando el número de colonias de las placas por el factor de dilución.
66
PRÁCTICA Nº 11
AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y CULTIVO DE HONGOS COMESTIBLES Y

MEDICINALES
I. OBJETIVOS
 Elaborar diferentes medios de cultivo para el aislamiento de pseudotejidos de hongos

comestibles y medicinales
 Producir micelio puro a partir de cuerpo fructíferos de diferentes Basidiomicetos.
 Determinar el medio de cultivo más adecuado en placas petri para el desarrollo del
micelio de los hongos comestible y medicinal.
2.1 Características de los hongos comestibles y medicinales

Los hongos comestibles son ampliamente consumidos en el mundo por su excelente sabor, aroma
y textura. Sin embargo, es poco conocido su gran potencial como alimento funcional sus
propiedades nutricionales y medicinales. Estas propiedades son únicas y diferentes a los aportados
por otros alimentos ampliamente consumidos (Chang, 1996 y Miles, 2004).
A nivel mundial, se han reportado más de 1,200 especies de hongos comestibles y medicinales
consumidos en 85 países (Boa, 2004).
Actualmente, se cultivan comercialmente más de 15 especies de hongos comestibles, a través de

procesos biotecnológicos eficientes. Se ha estimado que la producción mundial supera los 6.2
millones de toneladas de hongos frescos por año, cuyo valor económico es superior a los 30
billones de dólares (Chang y Miles, 2004).
Vedder (1986) indica, que el valor nutricional de las setas es notable, ya que constituyen una
magnífica fuente de proteínas por contener hasta 35% en base seca, Este dato es significativo si se
compara con el 13.2% del trigo y 25.2% de la leche. Además, contienen vitaminas: B1, B2, B12,
C, D, Niacina y Ácido pantoténico, así como ácidos grasos insaturados y un bajo contenido
calórico.
67
2.2. Requerimientos nutricionales de los hongos
Los Basidiomicetos que descompone la madera proliferan sobre los árboles muertos de castaño,
haya, roble, aliso japonés o morera, entre otras especies de madera dura. En su hábitat natural, se
encuentra en áreas húmedas y boscosas con sombra. Los hongos se producen en el otoño,
temprano invierno y primavera cuando los cambios de temperatura y la humedad inducen el ciclo
reproductivo. Las esporas son blancos y los bordes de las branquias son dentados. Esta especie es
originaria de Japón, China, la península de Corea, y otras regiones en Asia oriental. (Quaicoe, C.,
& Obodai, 2014 p.45).
Como hongo saprófito de la pudrición blanca, el shiitake produce micelio durante su fase de
crecimiento vegetativo vigoroso. El micelio puede absorber pequeñas moléculas de nutrientes en
forma directa. Sin embargo, es necesario previamente romper las moléculas de nutrientes
complejos a través de la secreción de enzimas para descomponer estas sustancias lignocelulósicas
complejas que sirven como la mayor fuente de carbono para el shiitake.
2.3. Metabolismo del hongo shiitake
El carbono es el nutriente más importante requerido por el shiitake, es el elemento base para la
construcción de las proteínas, los ácidos nucleicos y los azucares de las células vivientes; también
es el mayor componente para la obtención de la energía usada para la oxidación en el
metabolismo. El carbono normalmente proviene de los compuestos orgánicos como azucares,
ácidos orgánicos, alcoholes, almidones, celulosa, hemicelulosa y lignina. El nitrógeno es un
elemento indispensable para la estructura protoplasmática y los elementos celulares estructurales
del shiitake (Chen, 2005 p.6).
El agua es vital para el crecimiento y la produccion de shiitake, los nutrientes necesitan ser
disueltos en agua para ser absorbidos por el micelio. Es importante proporcionar y mantener el
volumen de humedad optimo en el substrato para el cultivo del shiitake que debe ser de 55% de
humedad. Shiitake es un hongo aerobio, durante el proceso metabolico, dependiendo de la
disponibilidad de oxigeno, los componente organicos se oxidan a traves de la respiracion, de este
modo la energia liberada se almacena en forma de ATP par luego ser utiliza en el crecimiento del
micelio y la fructificacion. Las diferentes fases de produccion del shiitake requiere cantidades
diferentes de oxigeno. Se requiere mas oxigeno durante la fase reproductiva que durante la fase de
crecimiento vegetativo del micelio. (Donoghue, J., 1995 p.239).
68
3.1 Materiales  Agar extracto de malta

 Placas petri Equipos:
 Tubos de ensayo  Autoclave
 Balanza
 Frascos de vidrio  Refrigeradora
 Estufa
Medios de cultivo:
 Agar a base de cerveza Reactivos y desinfectantes:
 Agar a base de cerveza malta  Hipoclorito de sodio al 5%
 Agar infusión papa
 Alcohol 96°
3.2. Métodos
3.2.1 Elaboración de medios de cultivo

Con el objetivo de seleccionar la cepa madre (micelio puro) con mejores características de
crecimiento y reducir los costos de los medios de cultivo se elaboraron medios de cultivo en
placas petri de la siguiente forma:
a) Agar modificado a base de cerveza blanca
Todos los insumos mencionados en la formulación en base a 1 litro se colocan en frascos de

vidrio de 1 litro de volumen y se esterilizan en autoclave a 121°C/15 Lb/15 min. Posterior a
la esterilización se retiran los frascos y se dejan enfriar hasta 45 a 50°C de temperatura y
para luego dispensarse los medios de cultivo en placas petri estériles.
La formulación del medio a base de cerveza blanca es:
Agua destilada : 750 ml
Cerveza blanca : 250 ml
Agar : 15 g
pH : 6.0
b) Agar modificado a base de cerveza malta:
Se colocan todos los insumos mencionados en la formulación en base a 1 litro en frascos de

vidrio y esterilizar en autoclave a 121 °C/15 Lb/15 min, dejándose enfriar hasta 45 a 50°C
el medio de cultivo estéril y para luego dispensarse en placas petri estériles.
La formulación del medio de cultivo a base cerveza alta es:
Agua destilada : 750 ml
Cerveza malta : 250 ml
Agar : 15 g
pH : 6.0
c) Agar papa y glucosa:
69
Se colocan todos los insumos mencionados en la formulación en base a 1 litro en frascos de

vidrio y esterilizar en autoclave a 121 °C/15 Lb/15, luego dejar enfriar hasta 45 a 50°C el
medio de cultivo estéril y para luego dispensarse en placas petri estériles.
La formulación del medio de cultivo a base de infusión de papa es:

Infusión de papa : 1000 ml
Agua destilada : volumen requerido
Agar : 15 g
glucosa : 5g
pH : 6.0
Modo de preparación:
Este medio de cultivo se prepara hirviendo 100 g de papa cortado en rodajas sin pelar en
1000 ml de agua destilada durante
CUERPO 10 minutos y luego se decanta y filtra, la infusión se
FRUCTIFERO
DEL HONGO SHIITAKE
formula en base a 1 litro, añadiéndose agar 15 g, glucosa 5g. Se esteriliza en autoclave a 15
libras de presión y 121ºC durante 15 minutos. En condiciones de asepsia el medio de
cultivo se deja enfriar hasta aproximadamente 45 °C y proceder a colocar en placas petri
AISLAMIENTO DEL En condiciones asépticas
estériles dejándose solidificar antes
TEJIDO de su empleo.
A PARTIR DEL
CARPOFORO O ESTIPETE
3.2.2. Aislamiento y purificación del micelio
En un ambiente de absoluta asepsia, incluyendo los materiales esterilizados, se seleccionan los

SIEBRA EN EL MEDIO DE Agar a base de cerveza
cuerpos fructíferos del hongoCULTIVO
shiitakeMODIFICADO
(producidos en el laboratorio
blanca, malta yde
agarMicrobiología
papa de la
glucosa
UNAMBA) y con la ayuda de EN
un PLACA
bisturí y pinza estéril se procede a realizar cortes longitudinales,
aislándose pequeñas porciones de tejido y procediéndose a colocar en el punto medio de placas
Temperatura ambiente
conteniendo los medios de cultivo citados anteriormente.
INCUBACIÓN
Condiciones de oscuridad
3.2.3. Incubación del micelio en medios de cultivo
Una vez sembrado los tejidos del hongo en los medios de cultivo a base de cerveza blanca, a base
de cerveza malta y medio a base de infusión
EVALUACIÓN de papa yPara
A LOS descartar se deja en incubación a
sacarosa;
48 Y 72 HORAS contaminación
temperatura ambiente (17 °C), evaluándose a diario el radio de desarrollo del micelio en los medios
de cultivo.
COLONIZACIÓN T= 12 a 14 días
3.2.4. Selección y evaluación del micelio
COMPLETA EN PLACA
En esta etapa se evalúa el radio de desarrollo en cm/día; haciendo uso de una regla
milimetrada se efectúa a medir el crecimiento radial del micelio a diario.
CEPA MADRE DE
SHIITAKE
REPIQUE PARA Conservación:

CEPARIO EN TUBOS 70
T= -5 ºC 3
T= 3 meses
Figura 1. Flujo de operaciones para el aislamiento de micelio a partir de pseudo tejido del Lentinula
edodes Berk
IV. RESULTADOS
Los resultados deben ser presentados en orden de las etapas planteadas y deben estar
relacionadas con los objetivos planteados, deben ser redactados en forma clara, precisa y
concisa de los hallazgos significativos de las variables estudiadas. Deben ser presentadas en
tablas, ilustraciones y/o gráfico, estos serán citados y comentados dentro del texto y explicados
de acuerdo a los resultados expresados.
71
V. DISCUSIONES
Las discusiones que enuncian los resultados deben ser explicados de manera clara, con sustento
bibliográfico, deben ser comparados con resultados de otros autores como antecedentes.
VI. CONCLUSIONES
Las conclusiones serán obtenidas a partir de los resultados y discusiones, se deben presentar en
un párrafo separado, deben ser redactados en forma clara, precisa y concisa. Deben reflejar el
cumplimiento de los objetivos planteados como una respuesta puntual a los objetivos.
PRACTICA Nº 12
AISLAMIENTO Y PRODUCCIÓN DE INOCULANTES A PARTIR DE Rhizobium sp.
I. CONCLUSIONES
72
BIBLIOGRAFIA
1. Freeman Bob A. 1998. Fundamentos de Microbiología. Editorial Acribia. Edición 15ª.

2. Jawets, Melnick y Adelberg. Microbiologia Medical. Editorial El Manual Moreno S.A.
Edición 17ª 2002.
3. Manual de Análisis Microbiológico de Alimentos. Dirección General de Salud Ambiental.
DIGESA 2001.
4. Mendo Rubio, Manuel. Medios de Cultivo en Microbiología. Ediciones Laborales SRL,
Quinta Edición, 2003.
5. Michael P. Doyle, Larry R. Beuchat. 1997, Microbiología de los Alimentos, Ediciones
Acribia S.A.
6. Puig-Duran Fresco, J. 1999. “Ingeniería, Autocontrol y Auditoria de la Higiene en la

Industria Alimentaría”. Ed. Mundi-Prensa- Coedición A. Madrid Vicente. España.
7. Wildbrett, G. 2000. “Limpieza y Desinfección en la Industria Alimentaría”. Editorial

ACRIBIA, S. A. Zaragoza. España.
ANEXOS
73
ANEXO 1. DETERMINACION DE AEROBIOS MESOFILOS VIABLES EN ALIMENTOS
ANEXO 2. DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN MUESTRAS SÓLIDAS O ALIMENTOS

ANEXO 3. DETERMINACIÓN DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS
ANEXO 4. DETERMINACIÓN DE Salmonella spp. EN ALIMENTOS
ANEXO 5. DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS
ANEXO 5. DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS

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E.A.P.

Ingeniería Agroindustrial UNAMBA 2019-I

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA

DOCENTE: ING. SAUL MOREANO CARRASCO

 Bioseguridad: La seguridad biológica o bioseguridad, es la aplicación del conocimiento, de

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

 Derrame de material biológico sobre el cuerpo: Remover la ropa inmediatamente. Lavar

 Salpicaduras en los ojos con materiales biopeligrosos: Lavar inmediatamente el globo

El éxito de estas normas depende de la sinceridad, la constancia,

PRACTICA N° 1 Principios básicos para el análisis microbiológico de alimentos.

PRACTICA N° 2 Métodos de muestreo para el examen microbiológico de alimentos.

PRACTICA N° 3 Evaluación microbiológica de superficies vivas e inertes

PRACTICA N° 5 Investigación y numeración de Bacillus cereus en productos de panificación.

PRACTICA N° 6 Investigación y numeración de Staphylococcus aureus coagulasa positivo.

PRACTICA N° 7 Investigación de Salmonella sp. en alimentos (ovoproductos).

PRÁCTICA Nº 8 Control de esterilidad de conservas.

PRACTICA N° 9 Numeración de coliformes totales y coliformes termotolerantes (E. coli) por el

PRACTICA Nº 10 Numeración de mohos y levaduras en cereales.

PRÁCTICA Nº 11 Aislamiento, purificación y cultivo de hongos comestibles y medicinales.

PRACTICA N° 12 Aislamiento y producción de inoculantes a partir de Rhizobium sp.

PRINCIPIOS BÁSICOS PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

 Conocer los principios básicos sobre la preparación de materiales para el examen

II. FUNDAMENTO TEORICO

2.2 RE SUSPENSIÓN Y HOMOGENIZACIÓN DEL ALIMENTO

Los métodos de aislamiento y numeración de microorganismos presentes en las muestras de alimentos,

Otro factor de gran importancia en la numeración de microorganismos en los alimentos la naturaleza

2.3 MÉTODOS DIRECTO DE RECUENTO DE MICROORGANISMOS

Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento. Se considera como

Se han desarrollado técnicas que hacen posible la automatización del proceso.

a.- Recuento en Placa

b.- Filtros de membrana

c.- Contaje de microcolonias al microscopio

Se añade un pequeño volumen de agar-cultivo a un portaobjeto y se incuba para seguir la formación de

d.- Films secos (Petrifilm)

2.4 MÉTODO INDIRECTO PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS

a.- Número Más Probable (NMP/g o ml)

b.- Métodos basados en la reducción de colorantes

2.5 COMPUTO DEL RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA

2.6.- CRITERIOS MICROBIOLÓGICOS

Los criterios microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad se sujetan de acuerdo a lo expresado en

MÉTODOS DE MUESTREO PARA EL EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

 Preparar los materiales necesarios para la toma de muestras.

II. FUNDAMENTO TEORICO

Un alimento de riesgo en salud pública es aquel que, en razón a sus características de

En el control de calidad de alimentos es necesario tomar en cuenta ciertas normas. El inspector

Lote: Cantidad determinada de unidades de características similares fabricadas bajo

Muestra representativa: Es aquella que es tomada conforme las normas de muestreo

Criterios microbiológicos: Define la aceptabilidad de un producto o un lote de un alimento

Agentes microbianos: Son los microorganismos de vida útil, indicadores y patógenos

2.2 PLANES DE MUESTREO

n: número de unidades de muestra seleccionada al azar de un lote, que se analizan para

c: número máximo permitido de unidades de muestra rechazables en un plan de muestreo de 2

m: valor umbral o limite microbiológico que separa la calidad aceptable de la rechazable. En

M: Los valores de recuentos microbianos superiores a “M” son inaceptables, el alimento

El programa de muestreo se aplica a: Registro Sanitario y Certificación Sanitaria Oficial de

Cuadro 1. Planes de muestreo para combinaciones de diferentes grados de riesgo para la

SEVERIDAD, TIPO DE CONDICIONES NORMALES DE MANIPULACIÓN Y

Moderado, directo , Categoría 7 Categoría 8 Categoría 9

2.3 EXCEPCIONES EN QUE “n” ES DIFERENTE DE 5

a) Número de unidades de muestra para registro sanitario de alimentos y bebidas

En número de unidades de muestra de alimentos y bebidas (n) para la inscripción en el registro

b) Número de unidades de muestra para la verificación del plan HACCP

c) Número de unidades de muestra para la vigilancia sanitaria de alimentos preparados

Para el caso de la vigilancia sanitaria de alimentos y bebidas preparados provenientes de