III- La PCR (polymerase chain reaction) La PCR

Dénaturation
Le mélange réactionel est chauffé
à 90-95°C. Ceci dénature l’ADN
cible (le rend simple brin).

Hybridation
La température est abaissée à 50-
65°C. Les amorces s’associent
avec la séquence de bases
complémentaires de l’ADN cible.
Elongation
La température est remontée à
72°C. Ceci initie la synthèse, par
l’ADN polymérase, des nouveaux
brins d’ADN depuis l’extrémité
3’OH des amorces et utilisant la
cible simple brin comme matrice.

BC
BC 2008
2008 -- 11 -- BC
BC 2006
2006 -- 33 --

La PCR La PCR

, par exemple

etc…
BC
BC 2006
2006 -- 22 -- BC
BC 2006
2006 -- 44 --

1
 Taille Amplicon
A/A A/S S/S
Influence de la température d’hybridation (pb) non digéré

- PCR à gradient de température -

51.9 52.8 54.1 55.7 57.6 59.2 60.3 61.2

603 -
- 500
- 354
310 -
271 -
234 -
194 - - 201
- 153
118 -
- 90
72 -
- 56

BC
BC 2006
2006 -- 55 -- BC
BC 2006
2006 -- 77 --

Mise en évidence d’un polymorphisme de

Analyse RFLP par PCR, ex. drépanocytose
répétition par PCR
Amplification d’un fragment défini d’ADN de 500 pb

Exon 1 IVS I Exon 2 IVS II

MST II MST II MST II

153 nts 201 nts 90 nts 56 nts
Hb Béta A
354 nts 90 nts 56 nts
Hb Béta S

A/A S/S A/S

354nts -
201 nts
153 nts

90 nts
56 nts
+
BC
BC 2006
2006 -- 66 -- BC
BC 2006
2006 -- 88 --

2
 Mise en évidence d’un polymorphisme de VNTR et STRP – analyse par PCR
répétition par PCR 2 kb

Chr. maternel
Individu 1
Chr. paternel

1,8 kb

2,2 kb

Chr. maternel
Individu 2
Chr. paternel

1,7 kb

Individu 1 Individu 2

- 2,2 kb

- 2,0 kb

- 1,8 kb
- 1,7 kb
BC
BC 2006
2006 -- 99 -- BC
BC 2006
2006 -- 11
11 --

BC
BC 2006
2006 -- 10
10 -- BC
BC 2006
2006 -- 12
12 --

3
 HUMvWA HUMF13
RT-PCR
RT-PCR
(16 à 20) (3.2, 5, 6)

BC
BC 2006
2006 -- 13
13 -- BC
BC 2006
2006 -- 15
15 --

Jour 1 4 7 14 21 28
TGFβ1 - + - + - + - + - + - +
COL I
462 pb

OPN
416 pb

PAL
375 pb

OC
293 pb

GAPDH
315 pb

Locus HUMTH01 = Gène de la Tyrosine Hydrogenase humaine Æ séquence répétée de 4 nucléotides dans intron 01
Etude de l’expression de gènes codant pour des protéines de la MEC osseuse en fonction du temps dans les
ostéoblastes en culture primaire. Les cellules ont été mises en culture en présence ou non de TGF-β1 (3ng/ml)
durant une période de 1 à 28 jours. Aux temps 1, 4, 7, 14, 21 et 28 jours les ARN ont été extraits et l’expression des
gènes analysée par RT-PCR. Col I = collagène I ; OPN = ostéopontine ; PAL = phosphatase alcaline ; OC =
ostéocalcine ; GAPDH = glyceraldehyde 3 phosphate deshydrogénase = gène de référence ; pb= paire de bases.

BC
BC 2006
2006 -- 14
14 -- BC
BC 2006
2006 -- 16
16 --

4
 La PCR en temps réel : une PCR quantitative SYBR Green Sybr green

Zone de
détection PCR
excitation émission
conventionnelle
Amorce
3’ 5’

3’ 5’

• Système simple, facile à développer (à partir d’une PCR classique)

• Adapté à n’importe quelle cible
• Nécessité de faire une courbe de T°C de fusion pour vérifier la spécificité
(dimères d’amorces, produits d’amplification non-spécifique)
• Chaque amplicons possède un Tm donné
Ct : threshold cycle = cycle limite de détection des amplicons
BC
BC 2006
2006 -- 17
17 -- BC
BC 2006
2006 -- 19
19 --

Amplification par PCR en temps réel avec du SYBR green

TaqMan : Activité 5’-3’ exonucléasede la Taq

Reporter Quencher

Amorce
3’ 5’

Reporter
Quencher

3’ 5’

Dégradation de la sonde provoque émission de fluo.

Sonde augmente la spécificité

BC
BC 2006
2006 -- 18
18 -- BC
BC 2006
2006 -- 20
20 --

5
 PCR en temps réel : courbes de calibration Expression du gène ABCG2 (BCRP) humain

Obtenues par dilution de l’ARN de cellules HepG2 Obtenu à partir de 50 ng d’ARN

BC
BC 2006
2006 Langmann et al., 2003 -- 21
21 -- BC
BC 2006
2006 Langmann et al., 2003 -- 23
23 --

PCR en temps réel : droites de calibration Expression relative du gène ABCG2

(BCRP) humain dans 20 tissus

Pentes ~ identiques
Coefficient de corrélation optimal

BC
BC 2006
2006 Langmann et al., 2003 -- 22
22 -- BC
BC 2006
2006 Langmann et al., 2003 -- 24
24 --