Cuestionario de Biología celular

Tema: Citoesqueleto

1. ¿En cuál de los siguientes tipos de células se espera una alta densidad de
filamentos intermedios citoplasmáticos? Explique su respuesta.

a. Célula muscular lisa en el tracto digestivo de un vertebrado

b. Célula nerviosa en la médula espinal de un ratón
c. Espermatozoide humano
d. Célula vegetal
e. Amoeba proteus (ameba de vida libre)
f. Célula epitelial de la piel humana

Los filamentos intermedios citoplasmáticos son componentes importantes del

citoesqueleto compuesto por proteínas lo que permite dar soporte y forma a la célula.
Las células que esperan una alta densidad de los filamentos intermedios son los de
la célula epitelial de la piel humana, ya que encuentran conformadas por un tipo de
filamentos intermedios llamado queratina, la cual es la que contiene la mayor cantidad
y diversidad de monómeros; y estos filamentos son lo que le dan resistencia mecánica
a la piel. Si no hubiera una alta densidad de estos, se ocasionarían enfermedades
con respecto a los filamentos intermedios como el Parkinson.
El citoesqueleto actúa como una pista sobre la cual las células pueden mover
organelas, cromosomas y otras cosas. Algunos ejemplos son:
- Movimiento de vesículas entre organelas y la superficie celular, frecuentemente
estudiado en el axón del calamar.
- Flujos citoplasmáticos.
- Movimiento de vesículas de pigmento para coloración protectora.
- Descarga del contenido de vesículas para regulación del agua en los protozoos.
- División celular (citocinesis).
- Movimiento de cromosomas durante la mitosis y la meiosis.

2. Indique la estructura del centrosoma.

 Los centrosomas están compuestos por dos
centriolos (un par, también llamados
diplosomas) rodeados por la matriz
pericentriolar.
Los centriolos poseen forma de cilindros y
recuerdan a un barril. En vertebrados, miden
0,2 µm de ancho y de 0,3 a 0,5 de largo µm.
A su vez, estas estructuras cilíndricas están
organizadas en nueve tripletes de microtúbulos
en forma de anillo. Esta ordenación suele
denotarse como 9 + 0.
El número 9 indica los nueve microtúbulos y el
cero hace referencia a la ausencia de los
mismos en la parte central. Los microtúbulos
funcionan como una especie de sistemas de
vigas que resisten la compresión del
citoesqueleto.
En los centrosomas existen tres tipos de
microtúbulos, cada uno con una función y distribución definida:
 Los microtúbulos astrales, las cuales anclan al centrosoma con la membrana
celular por medio de prolongaciones cortas.
 Los microtúbulos del cinetocoro (el cinetocoro es una estructura del cromosoma
localizada en los centrómeros de los mismos), que acoplan al cinetocoro asociado
al cromosoma con los centrosomas.
 Por último, los microtúbulos polares, ubicados en ambos polos del huso.
Además, los centriolos dan origen a los cuerpos basales. Ambos elementos son
inter-convertibles. Estas son las estructuras de las que provienen los cilios y los
flagelos, elementos que permiten la locomoción en ciertos organismos.
Matriz pericentriolar
La matriz o material pericentriolar es una zona del citoplasma granulosa y bastante
densa. Está constituida por una conjunto de proteínas variada.
Las proteínas principales de esta matriz amorfa son la tubulina y la pericentrina.
Ambas tienen la capacidad de interaccionar con los microtúbulos para la unión de
los cromosomas.
Específicamente, son los anillos de ɣ tubulina los que sirven como zonas de
nucleación para el desarrollo de los microtúbulos que luego irradian fuera del
centrosoma.

3. Investigue sobre los motores celulares. ¿Cómo es la estructura? ¿Cómo

funcionan? Señale ejemplos.

Motores celulares

Las células tienen motores de proteínas que ligan dos moléculas, y usando ATP como energía,
causan que una molécula cambie en relación a la otra. Dos tipos de estos motores de proteína son la
miosina y la actina, y dineina o kinesina y microtúbulos. Estas familias de proteínas tienen un
extremo motor, pero pueden tener varias clases de diferentes estructuras moleculares en el
extremo ligante. Cuando estas proteínas se ligan pueden causar que se muevan diferentes
moléculas, organelas etc.

Ejemplo de diferentes motores ligantes encontrados en motores celulares de la familia de las

kinesinas. Fuente: El Proyecto Biológico, The University of Arizona

Cuando se conecta a otros microtúbulos, los motores de proteína pueden causar movimiento si los
extremos están fijos o extender la longitud de los paquetes de fibras si los extremos están libres.

Fuente: El proyecto Biológico, The University of Arizona

 Fuente: Dreamsite.com Author: Kateryn Akon

Transporte intracelular, proteínas del motor de kinesina (naranja), moleculas del tranporte que se mueven a
través de los microtúbulos. Fuente: Dreamsite.com Author: Kateryn Akon

A partir de las actividades observadas de las proteínas motoras podemos inferir tres propiedades
generales que ellas poseen:

 La capacidad para transformar una fuente de energía ya sea ATP o un gradiente de iones, en
un movimiento lineal o rotatorio.
 La capacidad para unirse y trasladarse a lo largo de los filamentos del citoesqueleto, de las
hebras de DNA o de complejos proteicos.

 El movimiento neto en una dirección dada.

 Motores rotos

En individuos saludables, la proteína distrofina es parte de la conexión entre el citoesqueleto celular

y las proteínas adhesivas en la parte de afuera de la célula. En la Distrofia Muscular de Duchenne, sin
embargo, el gen que codifica la distrofína es defectuoso, resultando en degeneración muscular y
finalmente la muerte. La enfermedad es recesiva ligada al cromosoma X y ocurre en 1 de cada 3,500
varones.

4. ¿Qué molécula, cuándo se une a G-actina, promueve la polimerización?

Se une con la molécula de ATP; cuando la G actina está unida a ATP es cuando se favorece
su incorporación al filamento. Por medio de los monómeros de actina que presenta una
hendidura hacia el centro de la molécula se une el ATP. Los monómeros unidos al ATP se
incorporan al extremo positivo del filamento, mientras que en el extremo opuesto o
extremo negativo, los monómeros hidrolizan el ATP a ADP + Pi.
 Formación del microfilamento de actina
Fuente: https://en.wikiversity.org/wiki/WikiJournal_of_Medicine

Los filamentos de actina están formados por moléculas de una proteína globular
denominada G-actina , que en presencia de ATP se polimeriza formando un filamento
doble helicoidal , también llamado actina filamentosa o F actina.

La actina viene a ser una proteína monomérica (G – actina) que regula la motilidad y
la estructura celular. La fuerza en la motilidad ha estado regulada por la actividad de
la ATPasa de la miosina, que es una enzima que hidroliza trifosfato de adenosina o
por la maduración de la propia polimerización y despolimerización de los filamentos
de actina (F – actina).
La profilina es una proteína multifuncional de unión a la actina involucrada en el
equilibrio de G – actina/ F – actina. Incrementa el intercambio de ADP por ATP unido
a la actina, lo cual promueve la polimerización de la F – actina. El cambio de G- actina
controlado por la profilina inhibe la polimerización de la F - actina
TEMA: APOPTOSIS

1. Explique los términos apoptosis y necrosis. Indique diferencias y semejanzas de los

2 procesos.

Apoptosis: Tipo de muerte celular en la que una serie de procesos moleculares en la célula
conducen a su muerte. Este es un método que el cuerpo usa para deshacerse de células
innecesarias o anormales.

Necrosis: Es la muerte de tejido corporal que ocurre cuando muy poca sangre fluye al
tejido. Esto puede suceder por lesión, radiación o sustancias químicas. ... Cuando zonas
grandes de tejido mueren debido a la falta de riego sanguíneo, la afección a la que se
puede llegar se denomina gangrena.

DIFERENCIAS
NECROSIS
Pérdida de la integridad de
membrana
Floculación de la cromatina
Dilatación de la célula y lísis
No hay formación de vesículas.
lisis completa
Desintegración de orgánulos
Pérdida de la regulación de la
homeostasis iónica
APOPTOSIS
Deformación de la membrana, sin
pérdida de integridad
Agregación de la cromatina en la
membrana nuclear interna
Reducción celular
Formación de vesículas limitadas por
membrana (cuerpos apoptóticos)
Fagocitosis
No hay desintegración de orgánulos y
permanecen intactos
Proceso muy regulado, que Implica
activación de enzimas

No requiere energía (proceso Requiere energía (ATP) (proceso

 pasivo, también sucede a 4ºC) activo, no sucede a 4ºC)
Digestión del DNA al azar Fragmentación del DNA no al azar
Fragmentación postlítica del DNA Fragmentación prelítica del DNA
(último evento de muerte celular) (primer evento de muerte celular)

2. Describa los eventos que se producen durante la destrucción autofágica de

organelas y moléculas intracelulares

La autofagia es un proceso en el cual citoplasma y organelos son secuestrados en

vesículas con membrana celular duplicada, liberando su contenido dentro de lisosomas,
para su posterior degradación y reciclaje de macromoléculas.

La autofagia sirve como respuesta al estrés producido por la falta de alimentos y es uno de
sus principales roles en los organismos unicelulares. Cuando una célula tiene una parte
dañada, la célula inicia la autofagia para comerse a los organelos o las partes que han
dejado de funcionar para así mantenerse sana. A nivel de membrana, existen moléculas
que actúan como sensores del medio extracelular, activando vías regulatorias
intracelulares.

3. Indague sobre la necroptosis. ¿En qué consiste? ¿Cuáles serian sus funciones?

La necroptosis es una forma de muerte celular programada que comparte aspectos

de la apoptosis y la necrosis.

Se desencadena a partir de la activación de diversos receptores de membrana entre

los que se encuentra el TNFR1. Paralelamente se produce la activación de la vía
apoptótica que induce la cascada de caspasas incluidas en un complejo
 multiproteico del que la caspasa 8 es parte. Cuando las caspasas correspondientes
a la apoptosis no se activan, estas cinasas continúan el proceso de necroptosis que
culmina con una muerte celular a la cual llegan mediante eventos de destrucción
celular similares a los que ocurren en la necrosis, como la permeabilización de las
membranas lisosómicas, generación de especies reactivas del oxígeno, afectación
mitocondrial y una reducción de los niveles de ATP.

Hoy en día la necroptosis es muy usada para tratar ciertas patologias como el
Alzheimer, enfermedad de Huntington, Parkinson y hasta el tratamiento para el
cáncer ya que las células cancerígenas resisten a menudo muerte celular evitando
apoptosis. por lo tanto si la necroptosis se podría activar específicamente en células
cancerígenas, esta resistencia podría ser superada.

4. ¿Qué son las caspasas iniciadoras y las caspasas ejecutoras y cuáles son sus
targets?
Las caspasas iniciadoras, incluyen caspasa-8 y caspasa-9. Procesan las formas inactivas
de las caspasas efectoras como las caspasas-3 y -7, activándolas.
Las caspasas existen como proenzimas inactivas, o zimógenos, y deben sufrir una escisión
activadora para que se inicie la apoptosis. Las caspasas tienen sus propios sitios de
escisión que pueden hidrolizarse no sólamente por otras caspasas sino también
autocatalíticamente.
Las caspasas ejecutoras, incluyen las caspasa-3 y caspasa-7. Actúan sobre muchos
componentes celulares. Escinden el citoesqueleto y las proteínas de la matriz nuclear y, de
esta manera, rompen el primero y dan lugar a la fragmentación del núcleo. En el núcleo,
las dianas de la activación de caspasas incluyen proteínas implicadas en la transcripción,
replicación y reparación del DNA.

TEMA: ELECTROFORESIS

1. ¿Qué otras macromoléculas pueden ser separadas por electroforesis en gel? ¿Cuál
es el polímero más utilizado para cada una de esas macromoléculas?
Las otras moléculas pueden ser:
a. Aminoácidos
b. Péptidos
c. Proteínas
d. Nucleótidos
e. Ácidos nucleicos
El polímero más utilizado es la Poliacrilamida, es el resultado de la polimerización química
de una mezcla de acrimida y bisacrilamida. Regulando las concentraciones de ambas y su
proporción que consiguen distintas porosidades.
2. Mencione tres tipos de agarosa disponibles comercialmente y sus características.
Agarosa LM Sieve:
La baja temperatura de fusión de estas agarosas permite la recuperación de ácidos
nucleicos no dañados a una temperatura más baja que su temperatura desnaturalizada.
- Agarosa de bajo punto de fusión/gelificacion y la más alta capacidad de resolución
para fragmentos pequeños.
- Rango de separación 200-800pb.
D1 Baja EEO GQT (Genética Quality Tested):
Agarosa estándar, útil en la recuperación de fragmentos de ADN antes de procesos
enzimáticos o clonación.
D-5:
Agarosa de alta fuerza de gel, no solo específicamente recomendada para ácidos
nucleicos de gran peso molecular, incluido cromosomas, sino también para partículas de
gran tamaño como virus y ribosomas.
Muy recomendable para PFGE, por su alta fuerza de gel y movilidad, mayor que la de las
agarosas estándar.
3. ¿Además del azul de bromo fenol, que otro colorante se utiliza en los buffers de carga?
Azul de Coomassie
El nombre completo es azul brillante de Coomassie R-250. Se trata de un compuesto
coloreado que se une a todo tipo de proteínas. Es poco soluble en agua, por lo que
habitualmente se disuelve en una mezcla de agua, ácido acético y metanol o isopropanol.
Tras realizar la electroforesis, el gel se "tiñe" sumergiéndolo durante unos 30 minutos en la
disolución de Coomassie para que éste penetre y se fije a las proteínas. Dado que todo el
gel se impregna del colorante, es preciso después realizar una distinción, lavando varias
veces con disolvente libre del colorante.
Azul de bromofenol
Se trata de un compuesto coloreado y con carga, utilizado para comprobar el progreso de
la electroforesis.
En la electroforesis, por su menor tamaño, se mueve más rápido que las proteínas o que la
mayoría de moléculas de DNA (aquéllas superiores a 300 pb), es decir, marca el "frente de
avance". Puesto que su color azul-violeta es bien visible, permite detener la electroforesis
con la confianza de que las moléculas de proteína o DNA no se hayan salido del gel.

Xileno-cianol y verde cianol

Se trata de compuestos coloreados y con carga, utilizados para comprobar el progreso de
la electroforesis.
En la electroforesis el xileno-cianol se mueve aproximadamente como las moléculas de
DNA de 3500 a 5000 pb (depende del tampón y el % de agarosa en el gel). Ambos tienen
un color azul turquesa que permite detener la electroforesis con la confianza de que las
moléculas grandes de DNA no se hayan salido del gel.
4. En la electroforesis SDS-PAGE ¿A qué concentración de poliacrilamida se encuentra el
gel separador? ¿y el gel concentrador? ¿Cuál es la función de ambos?
En la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, la separación de proteínas se hace
en función de la masa molecular. Tanto es así que la representación del logaritmo de la
masa molecular frente a la distancia migrada obedece a una línea recta para gran número
de proteínas. Su utilidad es el SDS u detergente aniónico (-), dota a todas las proteínas de
carga (-) todas migrarán hacia el ánodo (+), separándose sólo por tamaño y Azul de
bromofenol, colorante con carga negativa y con una movilidad electroforética que
equivaldría a pequeños polipéptidos.
Esta electroforesis es discontinua pues utiliza dos geles:
Un gel concentrador con bajo grado de reticulación y pH 6,8 (gel acumulador o “stacking
gel”).
También llamado sistema discontinuo o de Laemmli que se llevará a cabo en la presente
práctica. Consta de dos tipos de geles: un gel, llamado concentrador con un tamaño de
poro no restrictivo (grande) que se forma sobre un segundo gel llamado separador. En este
sistema cada uno de los geles se prepara con tampones de diferente pH y fuerza iónica, y
el tampón de electroforesis es un tercer tipo de tampón.
Un gel separador con grado de reticulación mayor con valores entre 6% y 15%,
pudiéndose también utilizar gradientes de concentración de acrilamida (gel separador).
También llamado, sistema continúo de Weber y Osborn. En este sistema existe un único
gel separador que emplea
 TEMA: PCR

1. Mencione la función de cada uno de los componentes de mezcla de reacción de PCR

Para que la PCR tenga éxito es fundamental la utilización de los componentes que se
mencionaran a continuación:
ADN diana: En principio puede efectuarse la amplificación por PCR si está presente al
menos un ejemplar intacto del gen diana. La cantidad total de ADN utilizada normalmente
para la PCR está entre 0,05 y 1,0 µg, lo que permite la detección de ejemplares solos de la
secuencia diana.
Cebadores: Generalmente se utilizan cebadores de 16 a 30 nucleótidos de longitud, lo que
permite que la temperatura de anillamiento sea razonablemente elevada. Los cebadores no
deben tener tramos de secuencias con una polibase ni motivos repetidos, ya que podrían
hibridarse de forma inadecuada con el ADN molde. La distancia entre cebadores debe ser
inferior a 10 kb en longitud. La concentración usual de oligonucleótidos para la PCR es de 1
µM. Esto resulta suficiente para al menos 30 ciclos de amplificación. La presencia de
oligonucleótidos a una concentración superior puede provocar la amplificación no deseada
de secuencias distintas de la diana. Por el contrario, la PCR no es eficaz si la concentración
del cebador es limitante.
ADN polimerasa:
El uso de una ADN polimerasa termorresistente ha facilitado el proceso porque ha dejado
de ser necesario añadir enzimas tras cada fase de desnaturalización. En principio, las ADN
polimerasas solo pueden incorporar nucleótidos al extremo 3’ de un polinucleótido. La
primera ADN polimerasa termoestable utilizada fue la ADN polimerasa Taq, aislada de la
bacteria Thermus aquaticus (Saiki et al., 1988). Aunque esta enzima es probablemente la
más utilizada a efectos de la PCR, en el comercio pueden encontrarse algunas otras ADN
polimerasas.
(Información adicional): Commented [S1]: No entrea en el examen

ADN polimerasa Taq/AmpliTaq:

La ADN polimerasa AmpliTaq es un enzima modificada genéticamente expresada por E. coli. Como
AmpliTaq es recombinante, su pureza y reproducibilidad son superiores a las del tipo silvestre. Sin
embargo, es posible que durante la amplificación del ADN se produzca contaminación con algunas
secuencias homólogas de E. coli. En tal caso, se recomienda el uso de una ADN polimerasa que no
se haya expresado con E. coli como organismo hospedador. Tanto la ADN polimerasa Taq como la
AmpliTaq poseen actividad exonucleásica de 5’ a 3’, con lo que eliminan nucleótidos por delante de la
cadena en crecimiento.

ADN polimerasas Vent, DeepVent, Pfu y UITma:

Estas enzimas tienen actividad exonucleásica de 3’ a 5’, que les permite eliminar los residuos mal
apareados hasta que se forme un extremo con bases correctamente unidas.

ADN polimerasa AmpliTaqGold:

Esta enzima consiste en una ADN polimerasa AmpliTaq, inactiva a temperatura ambiente, y que solo
puede activarse durante un periodo de incubación a 94 ºC. En este caso, el programa del termociclador
debe incluir un tiempo de pre-incubación a la temperatura de 92 – 95 ºC. En caso de PCR con liberación
gradual es posible suprimir el tiempo de pre-incubación, pero deben efectuarse al menos 10 ciclos más
que con la PCR clásica.
Tampones de reacción y MgCl2 en las PCR:
En la PCR es fundamental la presencia de cationes divalentes. La concentración de MgCl2
en la mezcla final de reacción suele estar entre 0,5 y 5,0 mM, y la concentración óptima se
determina empíricamente (Innis y Gelfand, 1990). Los iones Mg2+:
 forman un complejo soluble con los dNTP, lo cual es fundamental para la incorporación
de estos;
  estimulan la actividad polimerásica;
 aumentan la Tf de la interacción cebador / ADN molde (con lo que estabilizan la
interacción entre las dos cadenas).

Desoxirribonucleósido-trifosfatos:

Para la síntesis de ADN hacen falta desoxirribonucleósido-trifosfatos libre (dNTP). La

concentración de cada uno de los dNTP para la PCR debe estar entre 20 y 200 µM, y los
cuatro dNTP deben utilizarse a concentraciones equivalentes para minimizar los errores de
incorporación.

En síntesis:

 ADN molde: Secuencias de ADN, provenientes del material biológico de nuestro interés y que se desea
generar muchas copias.
 ADN polimerasa: Tipo de enzima que duplica el ADN molde
 Cebadores o Primers: Sirve como punto de partida para la replicación del ADN.
 Nucleótidos libres: las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena complementaria a la cadena
molde mediante la incorporación de nucleótidos al extremo 3’ libre del cebador que se ha unido a la
cadena molde. Los nucleótidos se añaden en forma de desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs).

2. ¿A qué se debe el nombre de Taq de la ADN polimerasa utilizada?

La polimerasa Taq es un tipo de ADN polimerasa termoestable, nombrada de esta forma
debido a que es producida por la bacteria Thermus aquaticus (T-aq) y a partir de la cual fue
aislada en el año 1968 por Thomas D. Brock. A menudo suele abreviarse como "Taq Pol" (o
simplemente como "Taq"), y es frecuentemente utilizada en las técnicas de PCR, un método
que se utiliza para amplificar secuencias cortas de ADN.
T. aquaticus es una bacteria que vive en manantiales calientes y fuentes hidrotermales, y la
polimerasa Taq que de ella se extrae ha sido caracterizada como una extremoenzima capaz
de soportar las condiciones de alta temperatura requeridas durante el proceso de PCR sin
desnaturalizarse.
3. ¿Por qué es necesario tener un primer a cada extremo del segmento del ADN a
amplificar?
 Porque el primer o cebador es una cadena de ácido nucleico o de una molécula relacionada
que sirve como punto de partida para la replicación del ADN y es necesario para que se
amplifique el mismo fragmento por ambos lados y producir la amplificación de la molécula de
ADN.

4. ¿Por qué la longitud precisa de la secuencia de ADN molde no llega a ser amplificada
hasta el tercer ciclo? Realiza un dibujo que explique tu respuesta.
Para poder entender esto, primero debemos recordar lo siguiente:

En el primer ciclo, con estas tres temperaturas (95°, 55°-65° y 75°), se sintetizarán los
primeros fragmentos a partir del ADN genómico. Estos primeros fragmentos no tendrán el
tamaño esperado, serán un poco más grandes ya que la taq copiará hasta donde le sea
posible, pero se obtendrán en cantidades tan pequeñas que al final no podremos detectarlos.
Después se repiten una vez más las tres temperaturas, pero en este segundo ciclo, los
oligonucleótidos, además de unirse al ADN que pusimos al inicio, también se unirán a los
fragmentos recién sintetizados del primer ciclo (ver segundo ciclo de la figura 1), por lo tanto
en este segundo paso la polimerasa sintetizará 2 fragmentos largos copiados directamente
del ADN y 2 fragmentos del tamaño esperado, que es el tamaño que hay entre los dos
oligonucleótidos que hemos usado. De esta forma con cada ciclo aumentará el número de
fragmentos del tamaño que queremos. Cabe mencionar que antes y después de estos ciclos
se programan dos pasos, uno de 95ºC durante varios minutos para iniciar con
desnaturalización, y en el tercer ciclo, un paso último de extensión a 72ºC para permitir que
la taq termine de sintetizar todos los fragmentos que pueden haber quedado incompletos.
Ya que 72ºC es la temperatura en la cual la polimerasa alcanza su máxima actividad, y
continúa la síntesis de los fragmentos de ADN a partir de los oligonucleótidos que ya se
habían alineado.

Esquema:
 Este ciclo se repite numerosas veces, entre 30 y 40 ciclos. No se suele hacer más de
40, ya que ahí ya tendremos productos no específicos de amplificación.
Al final tenemos como producto mayoritario el DNA de la secuencia comprendida
entre los dos primers. Partimos de DNA genómico en muy poca concentración, y luego
vamos aumentando la concentración del producto que está acotado entre los dos
primers.