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INFORME DE LABORATORIO Fecha de entrega:16-05-2019

Química Analítica Instrumental Integrantes:
I Acosta Melissa
Alucho Richard
PRÁCTICA N° 7 Carrera Sofía
Quishpe Jenny
UCE – FAC.CCQQ Carrea: Bioquímica Clínica
Grupo #5

1) Tema: Espectrofotometría visible

2) Objetivos:

 Examinar y operar el espectrofotómetro.

 Determinar hierro en una muestra por el método de ortofenantrolina.

 Familiarizarse con los diferentes métodos que existen para el cálculo de la

concentración por espetrofotometría. Ley de Beer.

Resumen

La espectrofotometría es una de las herramientas más utilizadas para la determinación de

sustancias. Es por eso, que esta práctica aplica sus fundamentos para la determinación de hierro
en soluciones estándares y de una muestra problema (agua subterránea). Para esto se realizaron
distintas mediciones de la absorbancia y transmitancia de las soluciones en un
espectrofotómetro y se ejecutó una curva de calibración la cual sirvió posteriormente para
distintos cálculos que permitieron encontrar la concentración de hierro de la muestra problema
que fue de 3,624𝑝𝑝𝑚𝐹𝑒 2+ . Dato que se encuentra muy cercano a lo encontrado para aguas
subterráneas en la bibliografía con un rango de hierro de 0.011-3.56 ppm. Mientras que para
agua potable el hierro máximo permitido es de 3ppm, todo esto avalado por la OMS y el INEN.

Palabras clave: Hierro, transmitancia, espectrofotómetro, absorbancia.

Abstract

Spectrophotometry is one of the most used tools for the determination of substances. That is
why, this practice applies its foundations for the determination of iron in standard solutions and
a sample problem (groundwater). For this, different measurements of the absorbance and
transmittance of the solutions were made in a spectrophotometer and a calibration curve was
executed, which subsequently served for different calculations that allowed finding the iron
concentration of the test sample that was 3,624𝑝𝑝𝑚𝐹𝑒 2+ . Data that is very close to that found
for groundwater in the literature with an iron range of 0.011-3.56 ppm. While for potable water
the maximum allowed iron is 3ppm, all this is endorsed by the OMS and the INEN.

Keywords: Iron, transmittance, spectrophotometer, absorbance.

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3) Introducción el reactivo y el cadmio, mercurio y zinc que forman

complejos solubles incoloros con el reactivo y
La espectrofotometría hace referencia al uso de rebajan la intensidad del color. En ciertas
una fuente de luz para medir las concentraciones condiciones el molibdeno, tungsteno, cobre,
de diversas soluciones, al generarse una fuente de cobalto, níquel y estaño pueden también interferir
luz que capta las longitudes de onda en la cual se (SKOOG, 2002).
genera una absorbancia y una transmitancia que
en su orden se definen como la cantidad de luz o
fotones que absorbe una muestra y la cantidad de 4) Sección Experimental
energía (luz) que atraviesa la muestra (Moreno,
2000). 4.1 Reactivos y Materiales
La determinación de contenido de hierro por Tabla 1.-Materiales y reactivos.
espectrofotometría es una técnica que se basa en
la medida cuantitativa de una imagen-color en MATERIALES REACTIVOS
rangos estrictamente establecidos de longitudes Espectrofotómetro Sal de Mohr
de ondas, para saber la capacidad máxima de
absorbancia y transmitancia que puede tener dicha
sustancia (SKOOG, 2002).
Balones aforados Agua destilada
La ortofenantrolina reacciona con el Fe2+,
originando un complejo de color rojo característico
(ferroína) que absorbe notablemente en las
regiones del espectro visible de alrededor de 505 Pipetas Buffer de pH 4-5
nm. El Fe3+ no presenta absorción a esa longitud de Cubetas limpias Solución de
onda y debe ser reducido a Fe2+ mediante un ácido ascórbico
agente reductor apropiado, como la hidroxilamina, 10%
(en forma de clorato para incrementar su Buretas Solución de
solubilidad) (Thorburn Burns, 2002). ortofenantrolina
La reducción cuantitativa de Fe3+ a Fe2+ ocurre en 0,25%
pocos minutos en un medio ácido (pH 3-4) de Elaborado por: integrantes del grupo
acuerdo a la siguiente ecuación:
4.2Procedimiento

De la sal de Mohr se preparó una solución que

Después de la reducción del Fe 3+ a Fe2+, se da la contenía 1000g Fe/ml y a partir de esta se
formación de un complejo con la adición de
preparó una solución patrón de 10g Fe/ml; de
ortofenantrolina. En un medio acido la
esta última se procedió a preparar los distintos
ortofenantrolina se encuentra en su forma
protonada como ion 1,10-fenantrolin (FenH+). estándares que indica la tabla 2. Luego se
La reacción de complejación puede ser descrita por determinó los valores de transmitancia y
la siguiente ecuación: absorbancia a 510nm de cada estándar y la
muestra en el espectrofotómetro. Por último se
Determinados iones interfieren en el análisis del anotó los resultados para los cálculos posteriores.
hierro, y, por tanto, no interesan que estén
presentes. Estos generalmente comprenden iones
coloreados, la plata y el bismuto que precipitan con
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5)Resultados y Cálculos. 5.2. Concentración de hierro. Cálculo de la

concentración de hierro en los estándares (un solo
Reacción química. cálculo modelo), indicada en la tabla 5.1.

Solución patrón 5.
2+
Tabla 2. Preparación de los estándares de hierro. 10𝑚𝑔𝐹𝑒 10𝑚𝑙 𝑠𝑜𝑙 1
| | | = 6,67𝑚𝑔𝐹𝑒 2+ /𝐿
1000𝑚𝑙 𝑠𝑜𝑙 1 0,015𝐿 𝑠𝑜𝑙
Sol, Ac.
[patrón] Buffer Ortofenan H2O Vol.
St patrón Ascórbico
ppm ml trolina ml ml Final
ml ml.
0 0 12,5
1 0,6 0,400 11,9 5.3. Curva de calibración
2 1,3 0,867 11,2
3 2,5 1,667 0,5 1,0 1,0 10,0 15,0 Ajuste de los datos a una recta del tipo: y= a + b x
4 5 3,333 7,5
5 10 6,667 2,5 Tabla 4. Corrección de los valores de absorbancia
M x
Elaborado por: Integrantes del grupo 𝑚𝑔𝐹𝑒 2+ /𝐿 Absorbancia
St. (Shimadzu)
Tabla 3. Valores de comparación de absorbancia y Experimental Corregido
0 0,000 0,000 0,000
transmitancia a 510nm
1 0,400 0,070 0,080
𝑚𝑔𝐹𝑒 2+ /𝐿 Espectrofotómetro 2 0,867 0,166 0,150
St. 3 1,667 0,258 0,269
Absorbancia Transmitancia
0 4 3,333 0,567 0,518
1 0,400 0,070 85,1 5 6,667 0,991 1,015
2 0,867 0,166 68,3 Elaborado por: Integrantes del grupo
3 1,667 0,258 55,1
4 3,333 0,567 27,1 Regresión lineal.
5 6,667 0,991 10,2
M x 0,561 27,6 R² = 0,9943. r= 0,9971
Elaborado por: Integrantes del grupo
𝐴510,𝐹𝑒2+ = 0,1491𝐶𝐹𝑒2+ + 0,0207

𝐴510,𝐹𝑒2+ = 0,1491 × 0,40 + 0,0207 = 0,080

5.1. Solución patrón. A partir de la sal de Mohr
preparar 100ml una solución que contenga 1000mg 5.4. Coeficiente de absortividad molar y
Fe/L y a partir de esta una solución patrón de 10mg absortividad especifica
Fe/L.
2+
5.4.1. Cálculo del coeficiente ε de cada estándar,
100𝑚𝑔𝐹𝑒 1𝑚𝑚𝑜𝑙𝐹𝑒 2+ 1𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑠𝑎𝑙 392,13𝑚𝑔 𝑠𝑎𝑙 100
| | | | | sacar la media de estos valores además de α y su
1 55,84𝑚𝑔 1𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐹𝑒 2+ 1𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑠𝑎𝑙 99
media.
= 709,33mg ó 0,71g sal de Mohr.
2+
10𝑚𝑔𝐹𝑒
2+
100𝑚𝑙 𝑠𝑜𝑙 1000𝑚𝑙 𝑠𝑜𝑙 𝑂, 400𝑚𝑔𝐹𝑒 1𝑔𝐹𝑒 2+ 1𝑚𝑜𝑙𝐹𝑒 2+
| | | | 2+
| |
1000𝑚𝑙 𝑠𝑜𝑙 1 1000𝑚𝑔 𝐹𝑒 2+ 1𝐿 1000𝑚𝑔𝐹𝑒 55.84𝑔 𝐹𝑒 2+
= 1𝑚𝑙 𝑠𝑜𝑙. 𝑑𝑒 𝑀𝑜ℎ𝑟 = 7,163 × 10−6 𝑀

𝐴 = 𝜀𝑏𝐶
𝐴 0,080
𝜀= = = 11.169 × 103 𝑐𝑚−1 𝑀−1
𝑏𝐶𝐹𝑒 2+ 1 × 7,163 × 10−6
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Tabla 5. Cálculo del coeficiente de Absortividad 𝐴 0,080

𝑝𝑝𝑚𝐹𝑒 2+ = = = 0,400𝑝𝑝𝑚𝐹𝑒 2+
𝑏𝜖 1 × 0,200
molar y Absortividad específica.
𝑚𝑔𝐹𝑒 2+ [𝐹𝑒 2+ ] mol/L Absortividad Absortividad
Tabla 6. Cálculo de las concentraciones a partir de
St. /𝐿 molar específica ε y α.
(mol.L-1.cm-1) (mg.L-1.cm-1)
𝑚𝑔𝐹𝑒 2+ [𝐹𝑒 2+ ] mol/L Absortividad Absortividad
0 0,000 0,000 0,000 0,000
St. 𝐿 molar específica
1 0,400 7,163 × 10−6 11.169 × 103 0,200 teórico
teórico
1,553 × 10−5 (mol.L-1.cm-1) (mg.L-1.cm-1)
2 0,867 9,659 × 103 0,173
2,985 × 10−5 0 0,000 0,000 0,000 0,000
3 1,667 9,012 × 103 0,161
4 3,333 5,969 × 10−5 8,678 × 103 0,155 1 0,400 7,163 × 10−6 11.169 × 103 0,200
5 6,667 1,194 × 10−4 8,501 × 103 0,152 2 0,867 1,553 × 10−5 9,659 × 103 0,173
9,404 × 103 0,168 3 1,671 2,985 × 10−5 9,012 × 103 0,161
4 3,342 5,969 × 10−5 8,678 × 103 0,155
Elaborado por: Integrantes del grupo
5 6,678 1,194 × 10−4 8,501 × 103 0,152
9,404 × 103 0,168
5.5. Cálculo de la cantidad de hierro en la
Elaborado por: Integrantes del grupo
muestra:
Comparación con el estándar uno
5.5.1. Interpolación analítica (Recta ajustada A =
A0 + KsC) 𝑉𝐸𝑋𝑃 − 𝑉𝑇𝑒𝑜𝑟
%Err = × 100
𝑉𝑇𝑒𝑜𝑟
A=F(C)
1.5 0,400 − 0,400
y = 0.1506x + 0.014 %Err = × 100 = 0%𝑝𝑝𝑚𝐹𝑒2+
Absorbancia

1 R² = 0.9996 0,400

0.5 Tabla 7. Cálculo de los valores de Absortividad

específica.
0
0 2 4 6 8 𝑚𝑔𝐹𝑒 2+ [𝐹𝑒 2+ ] mol/L Absortividad Absortividad
concentración, ppm Fe St. /𝐿 molar ε específica α
(mol.L-1.cm-1) (mg.L-1.cm-1)
0 0,000 0,000 0,000 0,000
R² = 0,9996. r= 0,9998 1 0,400 7,163 × 10−6 11.169 × 103 0,200
2 0,867 1,553 × 10−5 9,659 × 103 0,173
Por interpolación gráfica: 2,985 × 10−5
3 1,667 9,012 × 103 0,161
4 3,333 5,969 × 10−5 8,678 × 103 0,155
CFe=3,532ppmFe
5 6,667 1,194 × 10−4 8,501 × 103 0,152
9,404 × 103 0,168
𝐴510,𝐹𝑒2+ = 0,1506𝐶𝐹𝑒2+ + 0,0140
Elaborado por: Integrantes del grupo
𝐴510,𝐹𝑒 2+ − 0,014 0,561 − 0,014
𝐶𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎,𝐹𝑒 2+ = = 5.7. calculo estadístico.
0,1506 0,1506
= 𝟑, 𝟔𝟑𝟐𝒑𝒑𝒎𝑭𝒆𝟐+
Calculo de la sensibilidad y límite de detección para
5.6. Cálculo de las concentraciones utilizando ε y α el método
comparando con el estándar más cercano.
𝐴510,𝐹𝑒2+ = 0,1506𝐶𝐹𝑒2+ + 0,0140
𝐴 = 𝜀𝑏𝐶
𝐴 0,080 Sensibilidad= Ks=0,1506 ppm-1Fe
𝐶𝐹𝑒 2+ = = = 7,163 × 10−6 𝑀𝐹𝑒 2+
𝑏𝜖 1 × 11.169 × 103

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3𝛿𝐵 3 × 1 × 10−4
𝐿𝐷 = = = 1.992𝑥10−3 𝑝𝑝𝑚𝐹𝑒2+
𝐾𝑠 0,1506
Tabla 8. Calculo estadístico
Método %Fe (agua α ε Ks LD
potable)
Especto 3,000 × 10−5 0,168 9,404 × 103 0,151 1.992𝑥10−3
fotómetro
Elaborado por: Integrantes del grupo
6)Discusiones
“La base de la espectrofotometría Visible consiste
en medir la intensidad del color (o de la radiación
absorbida en UV) a una longitud de onda específica
comparándola con otras soluciones de
concentración conocida (soluciones estándar) que
contengan la misma especie absorbente. Para
tener esta relación se emplea la Ley de Beer, que
establece que, para una misma especie absorbente
en una celda de espesor constante, la absorbancia
es directamente proporcional a la concentración.
“Es así que en la experimentación se determinó
tanto la absorbancia como la transmitancia para
cada uno de los estándares preparados a partir de
la sal de Mohr con la finalidad de determinar la
concentración de hierro en la solución desconocida
a 510 nm, como se puede observar en la tabla N°3.
(SKOOG, 1998)
Se ha determinado que la principal diferencia
metodológica entre espectrofotometría visible y
ultravioleta radica principalmente en que el
espectro visible mide la intensidad del color (o de
la radiación absorbida en UV) a una longitud de
onda específica comparándola con otras
soluciones de concentración conocida (soluciones
estándar) que contengan la misma especie
absorbente, mientras que el espectro Ultravioleta
se obtiene generalmente en forma adicional al
espectro infrarrojo de la misma especie
estimulando la molécula completa, causando
cambios vibracionales y rotacionales lo cual
caracteriza la entidad estructural de dicha
molécula. (SKOOG, 1998)
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Entre las principales aplicaciones de la ley de Beer-
Lambert se ha encontrado una particular
importancia en el ámbito de la bioquímica general
y bioquímica de alimentos, ya que si una especie
química (ácido ascórbico, fructuosa, glicerol,
lactosa, galactosa, maltosa, glucosa) presenta
color, es candidato ejemplar para ser analizada por
técnicas colorimétricas, las cuales se fundamentan
en la ley de Beer-Lambert, y permiten determinar
la concentración de los analitos en función de las
absorbancias obtenidas con un espectrofotómetro
y permite construir las curvas de calibración, con
las cuales tomando en cuenta el efecto matriz de la
muestra, se determina la concentración de la
especie de interés. (Bolívar, 2015)
“No existen estudios específicos de calidad de
aguas subterráneas en relación a la presencia de
Fe, sin embargo, mediante el estudio de pozos
localizados en las áreas urbanas se encontraron
invariablemente sujetos a contaminación
microbiológica, provocada por su proximidad a
pozos absorbentes y se presentó un valor
promedio de 0.011-3.56 mg/l. “Tras la
interpolación analítica de la absorbancia en
función de la concentración, se determinó la
concentración de Fe2+ en la muestra, mientras que
gracias a la ecuación de Beer se determinó la
concentración de Fe2+para cada uno de los
estándares, denotando una presencia
característica de hierro en las aguas subterráneas
de 3,632 ppm como se menciona en la teoría. (Piris
da Motta, 2012)
De igual manera se determinó que la
concentración máxima de hierro permitido en el
agua potable es de 0,3 mg/l, por EPA y por debajo
de los parámetros de Acuerdo Ministerial no. 97,
OMS e INEN. Este elemento es muy común en la
corteza terrestre, por lo que se encuentra
naturalmente en el agua, al entrar en contacto con
el oxígeno de la atmósfera, el hierro ferroso se

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oxida a férrico por lo que tiende a manchar las
tuberías, provocando la aparición de bacterias que
lo consumen y forman una biopelícula gelatinosa,
degradando la calidad del agua al momento de la
circulación. (Renato, Baque-Mite; Luis, Simba-
Ochoa, 2016)
En el tratamiento de la muestra se debe reducir al
Fe3+ a Fe2+ mediante la adición de ácido ascórbico,
ya que es el Fe2+ el que al entrar en contacto con la
ortofenantrolina formará el complejo rojo- naranja
que permite la medición espectrofotométrica de la
muestra. Por lo tanto, en la experimentación se
colocó inicialmente 1ml de ác. ascórbico para
obtener Fe2+ (SKOOG, 1998)
“El pH es un factor determinante en la formación
de ciertos complejos o compuestos coloridos.
Cuando el pH influye en la técnica analítica, se
requiere de un control adecuado de este valor para
lo cual se agrega alguna solución buffer, o
estabilizador de pH. “Es así que en la
experimentación se añadió 1ml de Buffer (4,0-5,0)
a cada uno de los estándares para mantener el pH
tras la reducción del Fe3+ y permitir la formación del
complejo de hierro. (SKOOG, 1998)
“La formación del complejo de hierro (3C12H8N2 +
Fe2+= [(C12H8N2) Fe]2+ es un quelato conformado
por 3 moléculas de fenantrolina por cada ion de
hierro para dar un complejo rojo-anaranjado. La
solución coloreada obedece la ley de Beer y la
concentración es determinada
espectrofotométricamente o por comparación
visual. Un pH entre 2,9 y 3,5 asegura un rápido
desarrollo de color en presencia de exceso de
fenantrolina. La adición de fenantrolina en exceso
elimina los errores causados por concentraciones
altas de especies químicas fuertemente oxidantes
y sustituye la que queda acomplejada por metales
interferentes.” Dicho proceso se corroboró en la
experimentación, en primera instancia tras el
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manejo del pH con la solución Buffer y posterior a
ello tras añadir 1ml de ortofenantrolina para
formar el complejo coloreado con el hierro y poder
determinar la respectiva absorbancia y
transmitancia. (Alencastro, 2015)
Existe una serie de factores sistemáticos que
pueden afectar la medición, entre ellos tenemos el
material de trabajo (la vida de uso del
espectrofotómetro, uso de cubetas en mal estado)
y como un factor secundario tenemos el tiempo, ya
que es factible que los complejos o compuestos
formados sean lábiles, esto es que después de un
cierto tiempo se descompongan a otros productos
diferentes, por lo que el tiempo indicado al que
debe hacerse la lectura debe establecerse con base
a la experiencia y los resultados que se tengan. Es
así que en la experimentación tras presentarse
alguno de estos factores se pudo obtener una
concentración aproximada de la muestra de agua,
la cual entra dentro del límite de detección
establecido para dicho proceso
−3 2+
(1.992𝑥10 𝑝𝑝𝑚𝐹𝑒 ) (Morejón, 2014)
7)Conclusiones
Se examinó y opero el espectrofotómetro, en
donde se configura cada haz de luz
monocromática, donde se mide la función de la
longitud de onda en relación a los valores de
absorbancia y transmitancia para cada valor que se
da en la muestra. con ello se le dio correcto
manejo, basándose en un blanco analito (agua
desionizada) para confirmar la confiabilidad de los
datos obtenidos con precauciones incluso en cada
celda manejada.
Se determinó hierro en una muestra por el método
de la ortofenantrolina la cual nos dio un resultado
de 3,624𝑝𝑝𝑚 por regresión lineal.
Se familiarizarse con los diferentes métodos que
existen para el cálculo de la concentración por
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espectrofotometría. En donde deducimos que es concentración de la sustancia, también está

correcto afirmar la proporcionalidad de la ley de aumentando la medida de la absorbancia,
Lambert-Beer, ya que, en los datos obtenidos, obedeciendo la ley química.
vemos que a medida que aumenta la

8)BIBLIOGRAFÍA

Alencastro, O. (2015). DETERMINACIÓN COLORIMÉTRICA DEL HIERRO. Obtenido de

http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/jpn/file/Quimica_Inorganica/1_Determinacion_Col
orimetrica_del_Hierro.pdf

Bolívar, G. (2015). Ley de Beer-Lambert: aplicaciones y ejercicios resueltos. Obtenido de

https://www.lifeder.com/ley-de-beer-lambert/

Morejón, M. (2014). Errores instrumentales en la química. Obtenido de

https://instrumentacionelectronicai.wordpress.com/tag/error-instrumental/

Moreno, R. B. (2000). A instrumental nálisis.

Piris da Motta, M. R. (2012). Hierro y Manganeso en Aguas Superficiales y Subterráneas.
Obtenido de http://www.bvsde.paho.org/bvsaidis/caliagua/peru/argcca011.pdf

Renato, Baque-Mite; Luis, Simba-Ochoa. (2016). Calidad del agua destinada al consumo
humano en un cantón de Ecuador. Revista Ciencia UNEMI, 109-117.

SKOOG, D. L. (1998). PRINCIPIOS DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL (5ta ed). Ed. McGraw-Hill .

SKOOG, A. (2002). Principios-de-Analisis-Instrumental-Skoog-Holler-Nieman-5ta-Edicion.

Sogorb, M. (2004). Técnicas análiticas de contaminantes químicos . Obtenido de Instrumentos
ópticos en medidas de absorbancia:
http://repositorio.innovacionumh.es/Proyectos/P_22CursoMateriales/Miguel_Angel_S
ogorb/Wimba/Espectroscopia_04.htm

Thorburn Burns, D. (2002). Undergraduate instrumental analysis. Journal of Chromatography

9) Anexos

CUESTIONARIO

 Diseño y funcionamiento de un espectrofotómetro de un solo haz y de doble haz.

Instrumentos con un solo haz

Los instrumentos de simple haz son aquellos en los cuales el haz de luz sigue una única
trayectoria entre la fuente y el detector (Figura 4A). La banda de luz atraviesa la muestra que se
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halla contenida en una celda, la luz transmitida por la muestra pasa al detector originándose una
corriente eléctrica que por medio de diferentes circuitos permite observar una señal, ya sea el
movimiento de una aguja o señal digital o un registro gráfico.

Instrumentos de doble haz

En los instrumentos de doble haz la luz proveniente de la fuente es dividida en dos

haces después de salir del monocromador mediante un sistema de espejos divisores (Figura 4B).
Esta división produce dos haces de luz, uno de ellos se dirige a la celda de referencia, que
contiene el blanco, y el otro haz se dirige hacia la celda de muestra. Los dos haces de luz después
de atravesar la celda de referencia y la de muestra llegan a detectores separados para obtener
la señal correspondiente.

Los sistemas de doble haz tienen la ventaja de que cualquier variación en la intensidad de la
fuente, la eficiencia de la red, la reflectividad de los espejos, la fotosensibilidad del detector,
etc., afecta simultáneamente a los dos haces. En consecuencia, la relación de energía de los dos
haces permanece siempre constante. (Sogorb, 2004)