INFORME DE EXTRACCIÓN DEL DNA POR MEDIO DEL KIT Pure Link Genomic DNA

Mini Kit INVITROGEN

Imagen tomada de: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K182001

La extracción de los glóbulos blancos en el DNA se hizo con la ayuda del KIT Pure Link
Genomic DNA Mini kit INVITROGEN, el cual permite un alto rendimiento, una alta
purificación y además permite la extracción del DNA puro para un amplio tipo de muestras
(bacterias, sangre, células tejidos). Este se utilizó con el objetivo de derogar el uso de otro
métodos de extracción (Salting out).

Para llegar al producto final de los glóbulos blancos, la muestra de sangre anticoagulada debe
procesarse.
Inicialmente, se centrifuga la muestra para que se formen las respectivas capas (plasma,
leucocitos, eritrocitos). Se tomaron 200µL de leucocitos y se introdujeron en un tubo de
microcentrífuga estéril, el cual contiene el KIT Pure Link Genomic DNA Mini Kit
INVITROGEN que ayuda a obtener una mejor purificación. Luego se utilizaron 20µL tanto
deproteinasa K ( elimina a las proteínas) como de RNasa A (elimina todos los tipos de RNA) y
se mezcló con vortex conseguir una mezcla homogénea. A continuación, se agregó 200µL de
buffer Lisis/Binding, las muestras son lisadas en este buffer, el cual potencia la acción de la
proteinasa K a su vez que elimina la contaminación por proteínas y sales; se homogenizó de
nuevo y en este orden se incubó a 56 °C por 10 minutos para promover la digestión de las
proteínas. Posteriormente, se mezcló por 5 segundos 200µL de etanol 100%, el cual
deshidrata al DNA, para quitarle las moléculas de agua que lo rodean, aumentando su pureza,
a su vez que lo precipita. Después, se ubicó el lisado en una columna de un tubo de contención
(solo deja pasar el DNA, y el resto quedará en el tubo de contención) y se centrifugó a 10000
rpm a temperatura ambiente por 1 minuto; se descartó el tubo de colección y se ubicó en uno
limpio. Luego, se le 400 µL de buffer de lavado 1 (diluye las sustancias y células presentes aún
en la mezcla), para llevar a centrifugación a 10000 rpm por 1 minuto a temperatura ambiente;
se descartó el tubo de colección y se le agregó un buffer de lavado 2 que se centrifugó a máxima
velocidad por tres minutos. Para finalizar se colocó un tubo de colección nuevo y se adicionó 25
µL de buffer de elución (mantiene el pH de la solución), se incubó a temperatura ambiente por
un minuto y también se centrifugó por uno minuto para recuperar el DNA y almacenar a 20
°C .
La gráfica obtenida por el software (el cual blanquea, es decir al valor total le va a restar
cualquier otro tipo de absorbancia que emita la muestra que no sea la del DNA) que mide la
cantidad de DNA obtenida, indicó que la relación estaba muy por debajo de la relación estándar
entre el DNA y otras sustancias (tanto para 260/230 como para 260/280 un promedio de 2,00).
Puesto que los resultados ( señalados en azul) se muestran en la imagen UN NUMERO.

Imagen tomada: Software de blanqueamiento DNA, del Laboratorio de Biología Molecular,

Universidad Industrial de Santander.

Para la relación 260/280 se obtuvo una proporción 1,55 y para la relación 260/230 1.16, lo cual
nos indica que hubo alguna equivocación durante el proceso de extracción, debido a que como
se mencionó, el valor promedio para ambas relaciones es 2,00.

Imagen tomada: Software de blanqueamiento DNA, del Laboratorio de Biología Molecular,

Universidad Industrial de Santander.

Al consultar al docente y reflexionar con los compañeros de mesón, llegamos a la conclusión de

que al momento de tomar la muestra concentramos una mayor cantidad ya sea de hematíes o
plasma que de glóbulos blancos, por ende, el resultado obtenido fue menor al esperado.
Imagen tomada de scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1130-
05582012000100002

Las posibles causas de la mala toma se deben a que, como pueden visualizar en la imagen
superior, la capa de Leucocitos que se forma después de la centrifugación es de menor tamaño
que la del plasma y la de los eritrocitos, por consiguiente, se tiende a tomar una fracción de
estas capas, dependiendo de hasta donde introducimos la micropipeta, obteniendo así, una
relación más baja de la esperada.