(12) SOLICITUD INTERNACIONAL PUBLICADA EN VIRTUD DEL TRATADO DE COOPERACION EN MATERIA

DE PATENTES (PCT)
(19) Organización Mundial de la
Propiedad Intelectual
Oficina internacional
(10) Número de Publicación Internacional
(43) Fecha de publicación internacional WO 2015/088306 Al
18 de junio de 2015 (18.06.2015) W P CT
(51) Clasificación Internacional de Patentes: (72) Inventores: GOMEZ ALDAPA, Carlos Alberto; Calle
A23L 3/3472 (2006.01) A23L 3/358 (2006.01) Dr. Víctor Manuel Ballesteros García, MZ H Lote 2, No.
A23L 3/3508 (2006.01) 110, Fraccionamiento José María Sánchez Ramírez,
Mineral de la Reforma, Hidalgo 42186 (MX). CASTRO
(21) Número de la solicitud internacional:
ROSAS, Javier; Boulevard San Cristóbal No. 232,
PCT/MX20 14/000 195
Fraccionamiento San Cristóbal, Col. La Providencia,
(22) Fecha de presentación internacional: Mineral de la Reforma, Hidalgo 42180 (MX).
9 de diciembre de 2014 (09. 12.2014)
(74) Mandatario: CABALLERO MARTINEZ, Jorge Efrain;
(25) Idioma de presentación: español Paseo de la Reforma No. 250 piso 8 suite 800 sip-
innovation, Col. Juárez, Del. Cuauhtémoc, Distrito Federal
(26) Idioma de publicación: español 06600 (MX).
(30) Datos relativos a la prioridad: (81) Estados designados (a menos que se indique otra cosa,
MX/a/2013014629 para toda clase de protección nacional admisible): AE,
11 de diciembre de 2013 ( 1 1. 12.2013) MX AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BN,
(71) Solicitante: UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ,
ESTADO DE HIDALGO [MX/MX]; Mariano Abasólo DE, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE,
No. 600, Col. Centro, Pachucá de Soto, Hidalgo 42000, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IR, IS, JP, KE,
(MX). KG, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LU, LY, MA,
MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG,
NI, NO, NZ, OM, PA, PE, PG, PH, PL, PT, QA, RO, RS,
RU, RW, SA, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY,
TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN,
ZA, ZM, ZW.
(84) Estados designados (a menos que se indique otra cosa,
para toda clase de protección regional admisible):

[Continúa en la página siguiente]

(54) Title: SOLUTIONS BASED ON PLANT EXTRACTS FOR DISINFECTING CORIANDER (CORIANDRUM SATIVUM)
(54) Título : SOLUCIONES A BASE DE EXTRACTOS DE PLANTAS PARA DESINFECTAR CILANTRO (CORIANDRUM
SATIVUM)

o FIGURA 1

(57) Abstract: The invention relates to compositions or formulations for the effective disinfection and/or preservation of fruit and
oo vegetables contaminated with pathogenic and deteriorating micro-organisms. The formulations described contain compounds with
r an anti-microbial effect derived from plants, which can act independently or combined with other disinfecting agents, such as
organic acids and compounds of chlorine, and surfactants such as polysorbate 80. The compositions of the invention can elimínate or
inactivate microbial contamination, including that of pathogenic micro-organisms, of fruit and vegetables, especially coriander,
without altering the nutritious and/or alimentary and or sensory properties thereof.
(57) Resumen:
[Continúa en la página siguiente]
 w o 2015/088306 Λ i llll I I I I 11III II I III I I III II II III II I II
ARIPO (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW, MZ, NA, RW, Publicada:
SD, SL, ST, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), euro-asiática (AM,
— con informe de búsqueda internacional (Art. 21(3))
AZ, BY, KG, KZ, RU, TJ, TM), europea (AL, AT, BE,
BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, — antes de la expiración del plazo para modificar las
HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, reivindicaciones y para ser republicada si se reciben
PT, RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR), OAPI (BF, BJ, CF, modificaciones (Regla 48.2(h))
CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, KM, ML, MR, NE, SN,
TD, TG).

La presente invención describe composiciones o formulaciones para la desinfección y/o preservación efectiva de frutas y verduras
contaminadas con microorganismos patógenos y deterioradores. Las formulaciones descritas contienen compuestos con efecto
antimicrobiano derivados de plantas, los cuales pueden actuar por si solos o en combinación con otros agentes desinfectantes,
como por ejemplo ácidos orgánicos y compuestos del cloro, y tensoactivos, como el polisorbato 80. Las composiciones de la
invención son capaces de eliminar o inactivar la contaminación microbiana, incluyendo la de microorganismos patógenos, de
frutas y verduras, en especial de cilantro sin alterar sus propiedades nutritivas y/o alimenticias y/o sensoriales.
 SOLUCIONES A BASE DE EXTRACTOS DE PLANTAS PARA DESINFECTAR
CILANTRO ICoriandrum sativum)

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al desarrollo de formulaciones que contienen

compuestos con actividad antimicrobiana presentes en plantas y que son utilizados
como desinfectantes y conservadores para alimentos, por ejemplo de origen vegetal y
animal; más particularmente a formulaciones acuosas a base de extractos de cálices
de Jamaica {Hibiscus sabdariffa), el método mediante el cual se obtiene y sus usos
como formulación efectiva para eliminar bacterias patógenas de alimentos de origen
vegetal, como frutas y hortalizas, pero con la más alta efectividad para cilantro
(Coriandrum sativum).

ESTADO DE LA TÉCNICA

El cilantro (Coriandrum sativum) es un producto agrícola ampliamente

consumido en todo el mundo. En México se cuenta con un poco más de 6 mil
hectáreas dedicadas a su siembra (Sagarpa, 2013). El cilantro es una hierba anual de
la familia de las apiáceas (antes llamadas umbelíferas). Es la única especie del género
Coriandrum, que es también el único miembro de la tribu Coriandreae. Todas las partes
de la planta son comestibles, sin embargo, son las hojas frescas y las semillas secas
las de uso culinario más frecuente. Las hojas frescas son ingrediente esencial de la
salsa verde y el guacamole mexicanos. Las hojas picadas también se usan como
adorno, añadidas al final del cocimiento o justo antes de servir, sobre sopas y otros
platos. El cilantro fresco nunca se cocina porque el calor destruye totalmente su aroma
y sabor. Debe conservarse en el frigorífico dentro de envases herméticos, procurando
consumirlo en pocos días, ya que se marchita rápidamente. No debe secarse ni
congelarse porque pierde el aroma.
En México su uso es muy extenso, se utiliza en la preparación de diversas
salsas y moles, como saborizante en sopas y caldos, y fresco y picado como aderezo
de diferentes tipos de tacos y antojitos. El cilantro es conocido también como perejil
chino o perejil árabe, en castellano se identifica además por los siguientes nombres:
cilantro silvestre u hortense, ceandro, celandria, cilandro, coantrillo, coendro, coentro,
coentro das hortas, colentro, coriandro, cuantrillo, culantro, jilantro, salandria y xendro.

Se han reportado solo 3 variedades del cilantro de las cuales se desprenden los
cultivares tipos de cilantro existentes en todo el mundo: sativum, microcarpum y
vulgare Alef.

No obstante, a la par con e l incremento e n el consumo de cilantro en todo e l

mundo, se han presentado brotes de enfermedad por bacterias patógenas y parásitos
debido al consumo de cilantro crudo (Campbell et al., 2001; CDC, 2013). Por ejemplo,
recientemente (noviembre, 2013) ocurrió un brote multi-estatal (es decir que afecto
varios estados) e n la unión americana e n donde e l vehículo implicado fue el cilantro y el
microorganismo que estaba en el cilantro fue Ciclospora (CDC, 2005). Desde 1970
hasta e l momento se han reportado un poco más 30 brotes de enfermedad de etiología
microbiana en los Estados Unidos de Norte América (USA, por sus siglas en ingles) y
e n diferentes partes del mundo debido al consumo de cilantro crudo. Este tipo de
brotes ha provocado una regulación estricta dentro y fuera de USA para todos los
productores de cilantro, y por supuesto, también para todos los productores de cilantro
que exportan a USA o a otras partes del mundo como México. Todo esto ha significado
que con frecuencia se retengan embarques de cilantro en las fronteras, cierre parcial o
total de la exportación de este producto a los países y pérdidas económicas por parte
de los productores al no cumplir con los estándares microbiológicos. No obstante, para
el caso de México, la mayor producción de cilantro se consume en e l país.

Cabe señalar que aunque en México no existen reportes de brotes de

enfermedad de etiología microbiana asociados al consumo de cilantro, debido a las
malas prácticas de higiene que generalmente ocurren durante el cultivo, cosecha,
transporte y comercialización del cilantro, es de esperar la participación del cilantro e n
brotes de enfermedad y como vehículo de bacterias patógenas. Un hecho que sustenta
esta observación, es la frecuencia con la que se ha aislado recientemente cepas de
Salmonella a partir de cilantro (Quiroz-Santiago et al., 2009), así como Salmonella,
grupos patógenos de Escheríchia cotí, y otras bacterias patógenas, a partir de
diferentes productos crudos en México (Castañeda-Ramírez et al., 20 ; Castro-Rosas
et al., 2012).

Los recientes brotes de enfermedades alimentaria asociadas con cilantro

crearon la necesidad de determinar las fuentes de contaminación del cilantro y
comprender la sobrevivencia y/o crecimiento de microorganismos patógenos en el;
estos han conducido al desarrollo de tecnologías innovadoras de control. En general,
los agentes patógenos en el cilantro se podrían controlar mediante la prevención de la
contaminación durante el cultivo y la cosecha de los productos, también mediante el
uso de desinfectantes con poder antimicrobiano en el producto cosechado, y por el
almacenamiento del cilantro a baja temperatura. No obstante, se ha identificado a la
desinfección como la etapa de mayor importancia para la inocuidad microbiana del
cilantro crudo.

Por lo general el cilantro no se consume directamente como se cosecha.

Después de la cosecha ya sea en el campo o en la industria (y aún en el hogar) reciben
tratamientos diversos que tienden a favorecer su conservación y/o inocuidad. La
aplicación de lavado y desinfección del cilantro mejora su imagen microbiana. No
obstante, es difícil lograr de manera segura la inactivación o remoción de
microorganismos patógenos aún en condiciones extremas de tratamientos que no
dañen sénsorialmente al cilantro.

La prevención de la contaminación del cilantro es también una estrategia de

control porque para varios microorganismos patógenos no se requiere el crecimiento de
los patógenos para causar enfermedad. Por lo tanto, las medidas de control adicionales
pueden ser de valor. Cabe señalar que el comportamiento de los microorganismos
patógenos en el cilantro se ve afectado por la ubicación del patógeno en el producto, la
calidad del producto, la temperatura de almacenamiento, tipo de embalaje, y la
humedad relativa. La superficie del cilantro suele tener escasos nutrientes, lo que limita
el crecimiento de patógenos durante el almacenamiento a temperatura ambiente o de
refrigeración.
 No obstante, cabe destacar que los microorganismos patógenos como
Salmonella son capaces de sobrevivir por tiempo prolongado en la superficie de cilantro
tanto en refrigeración como a temperatura ambiente (BrandI y Mandrell, 1998). Además
una vez sobre el cilantro, patógenos como Salmonella podría producir polímeros
extracelulares sobre el cilantro lo que lleva a la formación de una biopelícula (BrandI y
Mandrell, 1998) que los podría proteger contra los desinfectantes; este comportamiento
de los microorganismos patógenos se ha observado en diferentes vegetales como por
ejemplo en tomates (Iturriaga et al., 2007). Un hecho a destacar es que los
microorganismos patógenos como Salmonella, por ejemplo, son capaces de
multiplicarse en cilantro picado incrementando de forma muy significativa su
concentración y haciendo mucho más peligroso al alimento (BrandI y Mandrell, 1998).

Los microorganismos patógenos en la superficie del cilantro pueden contaminar

los tejidos internos e infiltrase (BrandI y Mandrell, 1998) y posteriormente durante el
cortado del cilantro podrían contaminar el producto picado y crecer en el. Varios
hallazgos de la investigación indican que los patógenos bacterianos pueden infiltran en
los productos vegetales, como el cilantro cuando hay un diferencial de temperatura
entre el producto vegetal y el agua de lavado (BrandI y Mandrell, 1998; Kroupitski et al.,
2009; Bartz, 1982; Guo et al., 2002; Ibarra-Sanchez et al., 2004; Zhuang y Beuchat
1995) y por la presión hidrostática cuando los vegetales se sumergen en el tanque de
recepción (Bartz, 1982; Bartz y Showalter, 1981).

La infiltración bacteriana aumenta en los vegetales crudos en presencia de

heridas y pinchazos. Los patógenos infiltrados no se eliminan por las prácticas
normales de lavado. El principal beneficio de la adición de productos químicos
antimicrobianos (como los desinfectantes químicos a base de hipoclorito o a base de
ácidos orgánicos) al agua de lavado del cilantro es el control de la propagación de
agentes patógenos, su inactivación y/o evitar su infiltración a las hojas y tallo. No
obstante, los desinfectantes químicos actualmente disponibles tienen beneficios
limitados sobre los productos vegetales, como el cilantro. Se ha estudiado el efecto
antimicrobiano de soluciones de hipoclorito, peróxido de hidrógeno, ácido peracético y
el agua electrolizada en su capacidad para reducir los agentes patógenos en productos
vegetales durante el proceso de lavado. No obstante, se ha concluido que estos
tratamientos tienen un efecto limitado sobre los microorganismos patógenos,
presumiblemente porque los agentes activos no tienen suficiente contacto con los
microorganismos patógenos sobre los productos vegetales crudos.

El proceso de desinfección se refiere a la destrucción física de los

microorganismos cuya actividad compromete la inocuidad o las características
sensoriales de un alimento. El efecto puede lograrse a través de medios físicos o
químicos, estando su eficacia en función de los microorganismos (tipo y número), el
substrato sobre el cual se encuentran (presencia de materia orgánica), la estructura del
material (que permita el acceso directo del germicida a los microorganismos) y el
germicida (concentración, temperatura y tiempo de contacto) (Fernández, 2000). En el
proceso de desinfección, la sustancia germicida participa en reacciones químicas, de
manera que mientras mayor es el número de microorganismos mayor demanda del
agente para lograr una inactivación total de la población. La susceptibilidad a un
germicida específico varía entre los microorganismos; algunos se inactivan desde el
primer momento de contacto, mientras que en el otro extremo pueden existir
sobrevivientes. Finalmente hay que tener presente que entre los microorganismos es
posible la selección de cepas con resistencia creciente al efecto de una agente
germicida específico. En consecuencia, con el tiempo, llegan a requerirse
concentraciones muy superiores del desinfectante a las iniciales para alcanzar el
mismo nivel de inactivación (Fernández, 2000).

Diferentes estudios demuestran que los tratamientos de desinfección de

productos agrícolas crudos con frecuencia tienen un efecto débil ó limitado. Por
ejemplo el lavado y desinfección con 200 mg/L de cloro activo (hipoclorito), de yodo
(yodóforo), de bióxido de cloro o de 100 mg/L de un producto comercial a base de
extracto de semilla de toronja (citricidal) redujeron el contenido de germinado de alfalfa
en sólo 1-2 logi 0; la disminución de S. typhi o de V. cholerae 0 1 inoculados en el
laboratorio no fue mayor a 1.5 og UFC/g (Castro-Rosas y Escartín, 1999).

La industria de alimentos cuenta con una diversidad de agentes germicidas. Sus

virtudes y limitaciones obligan a seleccionar cuidadosamente aquellos que mejor se
ajusten a cada necesidad particular (Fernández, 2000). La inactivación de las bacterias
patógenas en las plantas procesadores de alimentos es un requisito básico para
controlarlas e impedir su acceso al producto terminado (Álvarez, 1998).

Lo común es que un germicida se considere efectivo cuando demuestra

capacidad para inactivar al menos 3 Log de una suspensión de microorganismos en
30s (Fernández, 2000).

Las soluciones a base de cloro son un desinfectante barato y disponible como

hipoclorito o en sus formas de liberación lenta (cloraminas, por ejemplo) (Lelieveld et
al., 2013). Los hipocloritos tienen un amplio espectro de actividad antibacteriana,
aunque son menos efectivos contra esporas que contra bacterias no formadoras de
esporas y tienen bajo efecto contra micobacterias (Russell et al., 2004). Las soluciones
de cloro como hipoclorito de sodio ó bióxido de cloro, son ampliamente utilizadas por la
industria de alimentos como desinfectante. Los dos son oxidantes fuertes que actúan a
nivel de las membranas y otros constituyentes celulares (Harmon et al., 1987). No
obstante, el primero presenta la desventaja de reaccionar fácilmente con la materia
orgánica, por lo que se inactiva más rápido. En el segundo la interferencia es mínima
(Castro-Rosas y Escartin, 1999). La principal desventaja del hipoclorito de sodio es que
la humedad, el calor, la luz y sobre todo la presencia de materia orgánica, incrementan
la tasa de pérdida de cloro libre. La actividad germicida del cloro generalmente ha sido
atribuida al ácido hipocloroso (HOCI), el cual es generado en soluciones acuosas de
hipoclorito de sodio y otros compuestos que contengan cloro.

Los desinfectantes se pueden incorporar al agua de lavado y de esta forma

contribuir a la reducción de la carga microbiana. La efectividad del hipoclorito no
solamente es afectada por el tiempo de exposición y la concentración del cloro libre, si
no por otros factores como temperatura, pH, tipo de cepa, así como presencia y tipo de
materia orgánica (Álvarez, 1998). No obstante, algunos autores señalan que la
eficiencia del hipoclorito en la reducción de microorganismos patógenos presentes en
verduras es limitada (Adams et al., 1997).

Compuestos químicos derivados del cloro, yodo y plata han sido típicamente
usados como desinfectantes de verduras, como el cilantro. Sin embargo, recientemente
diversos estudios muestran que los tratamientos de desinfección con estos compuestos
resultan ineficientes en la eliminación o reducción de los niveles de patógenos
microbianos. Por tal motivo, muchos países han abandonado el uso de hipoclorito o
soluciones de yodo para la desinfección de verduras crudas.

Los ácidos orgánicos han sido utilizados tradicionalmente como conservadores

de alimentos o en soluciones para desinfectar verduras crudas. Su efecto
antimicrobiano se ejerce a través de la forma no disociada causando una baja del pH.

El ácido acético es una sustancia inocua; no existen limites oficiales para la

ingesta diaria en el hombre. Cuando se incorpora ácido acético a un alimento se
expresan dos efectos, uno acidulante y otro preservativo. A concentración de 1-2%
inhibe casi toda la flora total dentro de límites razonablemente elevados de carga
inicial. Al 0.1% actúa sobre la mayoría de los patógenos y esporulados; al 0.5% tiene
efecto sobre los hongos toxigénicos. Se ha evaluado la eficacia del ácido acético contra
algunos patógenos específicos utilizando como medio algunos alimentos. Los informes
publicados a menudo son difíciles de comparar por que las concentraciones de ácido
han sido variables expresadas como porcentaje, molaridad o pH final del medio de
ensayo acidificado. La actividad antimicrobiana depende del tiempo de exposición,
temperatura, tipo de ácido, concentración del ácido, nivel de disociación y pH (Harmon
et al., 1987). No obstante, los resultados generales demuestran que la eficacia del
ácido acético aumenta a medida que aumenta la concentración, disminuye el pH, la
temperatura aumenta y la carga microbiana disminuye (Harmon et al., 1987). Entre las
bacterias, las Gram positivas suelen ser más resistentes que las bacterias Gra
negativas (Rameshkumar et al., 2007). Las esporas bacterianas y los virus son más
resistentes que las células vegetativas. Sin embargo, los ácidos orgánicos han
mostrado también poca efectividad para desinfectar verduras crudas (Fernández,
2000).

La investigación reciente indica que los productos químicos antimicrobianos en

la fase de vapor pueden reducir significativamente las poblaciones de patógenos en la
superficie de vegetales. El uso de 5 mg / litro de gas dióxido de cloro durante 1 h fue
significativamente más eficaz contra la Salmonella en la cicatriz del pedúnculo de
tomates que eran soluciones acuosas de 200 ppm de hipoclorito de sodio (2 min de
exposición) y 1200 ppm de hipoclorito de sodio acidificado (2 min de exposición) (Yuk
et al., 2005). El uso de 10 g / litro de ozono inactiva por completo 7 log UFC de
Salmonella enterítidis de la superficie de tomates cherry después de 15 min, sin
embargo, se afecta el color de los tomates (Das et al., 2003).

Debido a que los agentes antimicrobianos en fase vapor pueden ser eficaces
contra bacterias adheridas a ubicaciones de los productos agrícolas crudos no
alcanzadas por los agentes activos en solución acuosa, su uso en los productos
envasados (en bolsas de plástico) o durante el procesamiento de productos (en la
empresa) podría proporcionar un beneficio extra en el control de patógenos. Sin
embargo, este tipo de tratamientos con vapor no sería un tratamiento opcional ni
practico para los productores primarios de cilantro en campo ya que por lo general los
productores venden su producto empacado en cajas de cartón o madera entre otras
cosas por la facilidad y para evitar acumulación e humedad lo que ocurriría si se usaran
bolsas de plástico. Además, este tampoco sería un tratamiento práctico para aplicarlo
en los restaurantes o en los hogares.

El uso de sustancias químicas como desinfectantes de verduras crudas para

mejorar o preservar su inocuidad, es un procedimiento umversalmente utilizado por los
productores. Sin embargo, algunos de estos antimicrobianos pueden resultar tóxicos
para los consumidores; es el caso de las soluciones de hipoclorito. Reportes recientes
señalan que el hipoclorito en solución puede formar precursores de cáncer. Además,
muchos de los desinfectantes químicos, como las soluciones a base de yodo o plata
coloidal, muestran limitado o variado efecto antimicrobiano en productos como las
verduras crudas; una situación similar ocurre con los conservadores para alimentos.

Debido a ello, los desinfectantes y conservadores obtenidos a partir de plantas

recientemente han surgido como una alternativa viable, ya que estos podrían tener
igual o mayor potencial antimicrobiano y con un mínimo riesgo para los consumidores.

La aplicación de extractos de ajo en fruta fresca contra enfermedades

poscosecha han obtenido el control completo de la putrefacción marrón de los
melocotones causados por el Monilinia fructicola (Roller, 2003). Yucel y Karapinar
(2005) evaluaron la reducción de S. typhimuríum en cebollas mediante la aplicación de
jugo de limón, vinagre y sus mezclas, observando una reducción respectiva de 0.87-
2.93, 0.66-2.92 y 0.86-3.24 Log UFC/g.

Los aceites esenciales provenientes de plantas son capaces de inactivar los

patógenos de interés en productos frescos. De 96 diferentes tipos de aceites
esenciales examinados, sólo 3 resultaron eficaces contra E . coli 0157:H7 y Salmonella
entérica los cuales fueron de orégano, tomillo, y canela. En otro estudio se ensayaron
16 compuestos individuales de los aceites más eficaces contra E . coli 0157:H7 y
Salmonella y se encontró que los compuestos más eficaces fueron timol,
cinamaldehído, y carvacrol (Friedman et al., 2002). Esta información se obtuvo usando
el aceite en la fase líquida. Existe limitada información disponible sobre la eficacia de
los aceites esenciales en forma de vapor. En otro estudio, Muñoz (2003) evaluó el
efecto de dos concentraciones de carvacrol y el desinfectante comercial Boradantix©
(EVESA, Extractos Vegetales S.A.) en la sobrevivencia de L . monocytogenes, P.
fluorescens, E . coli, Erwinia caratovora y S. typhimuríum en jugo de Manzana y
zanahoria. Todos los microorganismos de estudio fueron inhibidos en ambas
concentraciones del carvacrol. Las bacterias estudiadas mostraron mayor sensibilidad
hacia el carvacrol que al Boradantix©. Lin et al., (2000) evaluaron el efecto del alil y
metil isocianato (AITC/MITC) (componentes clave de mostaza verde) sobre L
monocytogenes, E . coli 0157:H7 y S. montevideo, inoculadas sobre la superficie de
tomate. AITC fue más efectivo contra Salmonella y E . coli, lográndose 8 Log de
reducción con un tratamiento de vapor generado de 400 µ Ι de AITC después de 4 y 2
días, respectivamente sobre manzana. También se alcanzaron 8 Log de reducción de
S. Montevideo sobre cutícula de tomate con 500 µ Ι de AITC.

Han sido relativamente pocos los estudios de la acción antimicrobiana de los

aceites esenciales en sistemas modelo de alimentos y en alimentos verdaderos. Sin
embargo, la eficacia de aceites esenciales in vitro es a menudo mucho mejor que in
vivo o in situ, es decir en alimentos. Generalmente al aplicar un antimicrobiano de
plantas a un alimento o in vitro se necesitan de 10 a 100 veces más concentración de
antimicrobiano que lo observado in vivo. Por ejemplo, el aceite esencial de la menta
(Mentha piperita) ha demostrado inhibir e l crecimiento de Salmonella enteritidis y L.
monocytogenes e n medios de cultivo por 2 días a 30°C. Sin embargo, el efecto del
aceite esencial de la menta e n e l aperitivos griegos tzatziki (pH 4.5) y el taramasalata
(pH 5.0) y en paté (pH 6.8) a 4°C y 10°C fue variable (Roller, 2003). Salmonella
enteritidis fue eliminada en aperitivos bajo todas las condiciones examinadas pero no
cuando fue inoculado e n paté y mantenido a 10°C. En éste mismo estudio, L
monocytogenes se comportó de forma semejante, ya que la cuenta microbiana
disminuyó e n los aperitivos pero aumentó en e l paté (Roller, 2003). E l crecimiento de £ .
coli, Salmonella sp., L. monocytogenes y Staphylococcus aureus fueron inhibidos por e l

aceite esencial del orégano en caldos de cultivo. Sin embargo, cuando estos aceites se
probaron e n alimentos tales como berenjena, taramasalata ó mayonesa se observaron
reacciones tales como incremento del pH, incremento de temperatura y para el caso de
las emulsiones separación del aceite usado (Roller, 2003). En otro estudio .

monocytogenes S. typhimurium fueron inhibidos e n carne tratada con aceite esencial

de clavo y orégano, respectivamente. Una reducción marcada de Aeromonas
hydrophila ha sido también reportada en carne de cerdo cocinada que fue tratada con
aceites del clavo o cilantro, empaquetada a vacío o con aire y almacenada a 2°C y
10°C. (Roller, 2003).

Las diferencias que se observan entre los estudios de efecto antimicrobiano

cuando se aplican directamente los aceites extraídos de plantas sobre los

microorganismos (microorganismos en suspensión acuosa) y aquellos en los que existe

un alimento o materia orgánica de por medio, es posible que ocurra por la interferencia
con los componentes del alimento o de la materia orgánica (proteínas, grasas,
azúcares, sales). Por lo tanto, es muy posible que solamente una proporción del aceite
esencial adicionado al alimento tenga actividad antibacteriana. Por otra parte, la
distribución espacial de las diferentes fases (sólido/líquido) e n un alimento y la carencia
de homogeneidad de factores como el pH, a entre otros, pueden jugar un papel en la
eficacia. Debido a todo lo anterior, e n diversas partes del mundo se encuentran e n
curso estudios encaminados a la búsqueda de antimicrobianos alternativos (Jongen,
2005). Entre las nuevas alternativas de desinfectantes se ha optado por compuestos
naturales con amplia capacidad antimicrobiana.
 Cabe destacar que los extractos obtenidos de algunas plantas han mostrado
efecto antimicrobiano contra cepas de patógenos multiresistentes a antibióticos, lo cual,
abre todo un campo nuevo para el desarrollo de nuevos antimicrobianos para su uso en
humanos y animales.

Como antecedente de la presente solicitud, se ha evaluado el efecto

antimicrobiano de alrededor de 60 diferentes plantas usadas en la herbolaria (Cruz-
Gálvez et al., 2013); donde algunas de éstas han mostrado un elevado poder
antimicrobiano contra diferentes microorganismos patógenos, tales como Salmonella o
Escheríchia coli 0157:H7, entre otros, así como contra microorganismos deterioradores
de alimentos (Pseudomonas aeruginosas, por ejemplo), y la planta que mayor efecto
antimicrobiano ha mostrado han sido los cálices de la flor de jamaica, siendo en
algunos casos mayor el efecto antimicrobiano que el de desinfectantes comerciales a
base de hipoclorito, yodo, plata coloidal.

Los extractos de los cálices de jamaica los hemos separado mediante

cromatografía en columna para obtener fracciones con mayor poder antimicrobiano;
con fracciones seleccionadas se han elaborado soluciones que han sido evaluadas
para determinar su potencial antimicrobiano.

Diferentes investigadores ha reportado también que los cálices de la flor de

Jamaica (Hibiscus sabdaríffa L) poseen sustancias con elevado poder antimicrobiano
(Aziz et al., 1998; Fernández et al., 1996; Kang et al., 2007). En los cálices de la flor de
Jamaica se han detectado una gama de compuestos fitoquímicos que podrían ser los
responsables del efecto antimicrobiano observado, tales como por ejemplo los
polifenoles (Tajkarimi er al., 2010), entre ellos algunos ácidos fenólicos (Tajkarimi et al.,
2010), así como flavonoides, catequinas y epicatequinas (Friedman et al. 2002). No
obstante, no existen estudios puntuales que muestren cuales son efectivamente
las moléculas o compuestos químicos responsable del efecto antimicrobiano
observado en los cálices de Jamaica. Diferentes investigadores coinciden en que es
necesario realizar mayores estudios para identificar las moléculas específicas y
responsables del efecto antimicrobiano provocado por los cálices de Jamaica en
solución.
 Escasos son los documentos de patente que describen extractos de los cálices
de la flor de Jamaica (Hibiscus sabdariffa ) y su uso como material con propiedades
antimicrobianas.

Por ejemplo, la solicitud de patente JP20021 28602 describe su uso en una

composición agroquímica para proteger plantas en campos de sembradíos, mientras
que la solicitud US201 00323048 describe el empleo de un extracto crudo de los cálices
de Jamaica para producir un medicamento para tratar infecciones urinarias causadas
por Escherichia coliy Candida albicans.

En la solicitud de patente KR20080092186 se describe un extracto de Jamaica

que es empleado para mejorar la calidad de la carne de res, puerco y pollo y para
incrementar su estabilidad de almacenaje. El extracto es preparado mediante
extracción con etanol y sometido a un proceso de secado en frío. La concentración del
extracto en la composición es de 500 mg/ml y se trata la carne con una preparación del
0.5-al 3.0 % (por peso).

Por otro lado, en la solicitud US201 2001 5062 se describen composiciones que
comprenden extracto de la planta Agapanthus africanus y composiciones que
comprenden este extracto mas otros extractos de otras plantas diferentes, como por
ejemplo plantas de la familia Rosa o de alfalfa para usarse como agentes en la
protección biológica de otras plantas incluyendo sus semillas. A pesar de que en este
documento de solicitud de patente se hace referencia al artículo publicado por
Leksomboon et al. (Kasetsart, Journal Natural Science 35: 392-396, 2001.) en donde se
menciona que extractos obtenidos de diversas plantas (Hibiscus sabdariffa, Psidium
guctjava, Púnica granatum, Spondias pinnata and Tamarindus indica) tienen una
función antimicrobiana, dicho documento no aporta ninguna evidencia experimental que
involucre los extractos de Hibiscus sabdariffa para el mismo uso que se le da a los
extractos de Agapanthus africanus.

Por lo anterior, es necesario contar con composiciones antimicrobianas

protectoras efectivas para evitar y/o combatir la contaminación microbiana de los
alimentos, principalmente de aquellos que se consumen crudos, como por ejemplo el
cilantro, con la finalidad de preservarlos y consumirlos sin el riesgo de adquirir
enfermedades causadas por su contaminación con microorganismos patógenos.

Hasta antes de la presente invención, no había sido posible desarrollar

composiciones efectivas para desinfectar eficientemente y sin daño al producto como
las descritas aquí, y que al mismo tiempo permitieran conservar las propiedades
nutritivas de frutas y verduras y no afectar, por ejemplo la calidad del cilantro, con lo
cual es posible con la presente invención obtener cilantro crudo inocuo desde el punto
de vista microbiano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Se muestra el espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) de

PROTÓN ( H) del extracto metanólico seco obtenido de los cálices de
jamaica que se utilizó en la presente invención.
Figura 2. Se muestra el espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) de
PROTÓN ( H) de la colección de fracciones denominada como III que fue
obtenida a partir de un extracto acetónico de los cálices de Jamaica y que
fue la colección que se utilizó en la presente invención.
Figura 3. Se muestra el espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) de
PROTÓN ( H) de la colección de fracciones denominada como IV que fue
obtenida a partir de un extracto acetónico de los cálices de Jamaica y que
fue la colección que se utilizó en la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con los problemas mencionados anteriormente, existe la necesidad

de proveer una formulación de mayor eficacia para inactivar o remover
microorganismos patógenos del cilantro (Coríandrum sativum) aún en condiciones
extremas de tratamiento, pero que no dañen sensorialmente el alimento.

La presente invención se refiere a composiciones que contienen fitoquímicos

presentes en extractos de plantas que son utilizados como desinfectantes de alimentos
de origen vegetal y animal, por ejemplo dirigidos a la desinfección y preservación de
frutas y hortalizas, particularmente a la desinfección y/o preservación del cilantro
(Coriandrum sativum).

Una modalidad de la presente invención se refiere a la obtención de un

preparado vegetal que comprende un extracto metanólico de los cálices de la flor de
Jamaica (Hibiscus sabdariffa) ó fracciones cromatográficas especificas obtenidas de!
extracto acetónico y metanólico de los cálices de Jamaica, los cuales son útiles para
eliminar agentes patógenos presentes en los alimentos (efecto desinfectante) y para
retrasar el deterioro de los alimentos o preservar su inocuidad (efecto conservador).

Otra modalidad de la presente invención se refiere a la obtención de extractos

derivados de plantas que son utilizados como desinfectantes contra microorganismos
patógenos presentes en los alimentos y para retrasar el deterioro de los alimentos y/o
preservar su inocuidad, es decir, como conservadores para alimentos, los que
constituyen una alternativa al uso de desinfectantes tradicionales que pueden llegar a
ser tóxicos al ser humano, a los animales o al medio ambiente.

Otra modalidad de la presente invención se refiere a la elaboración de

composiciones que contengan el extracto de los cálices de Jamaica (Hibiscus
sabdariffa L ) que tengan una función desinfectante y conservadora de alimentos
conjuntamente con otros compuestos que tengan propiedades desinfectantes por
ejemplo ácido acético, hipoclorito, etc.

Otra modalidad de la presente invención se refiere a la obtención de extractos

obtenidos a partir de cálices de jamaica que tienen un efecto desinfectante o
conservador cuando son aplicados a alimentos. Un aspecto de esta modalidad se
refiere a la aplicación de extractos obtenidos a partir de cálices de la planta de Jamaica
{Hibiscus sabdariffa L.) que tienen un efecto desinfectante o conservador cuando son
aplicados a alimentos de origen vegetal, preferentemente cilantro.
 Otra modalidad de la presente invención es el desarrollo de un método para la
obtención del extracto metanólicos a partir de cálices de Jamaica, extracto que resulta
ser útil como desinfectante y conservador de alimentos.

Otra modalidad de la presente invención se refiere al método para obtener

fracciones cromatográficas especificas y con efecto antimicrobiano obtenidas del
extracto acetónico o metanólico de los cálices de jamaica, los cuales son útiles para
eliminar agentes patógenos presentes en los alimentos (efecto desinfectante) y para
retrasar el deterioro de los alimentos o preservar su inocuidad (efecto conservador).

Otra modalidad de la presente invención es un método de tratamiento y/o

conservación de alimentos de origen animal y/o vegetal mediante la aplicación de
composiciones que contienen extractos de cálices de Jamaica que permiten la
desinfección y su conservación de los mismos.

El uso de los extractos de cálices de Jamaica como desinfectante y/o

conservador de alimentos, es otra modalidad que se describe en la presente invención.

Los compuestos provenientes de los cálices de Jamaica pueden ser de utilidad

en la elaboración de un desinfectante eficiente para eliminar a las bacterias patógenas
presentes en las verduras crudas, tal como el cilantro. En la presente invención se
describe un extracto de cálices de Jamaica y fracciones especificas i por
cromatografía en columna a partir de un extracto acetónico y/o metanólico de los
cálices de Jamaica, que comprende fitoquímicos, el cual puede ser utilizado como
desinfectante y/o conservador de alimentos debido a su eficiencia en la eliminación d
bacterias patógenas de verduras crudas tales como cilantro.

A diferencia de otras composiciones conocidas hasta ahora para el mismo fin,

las composiciones de la presente invención son capaces de eliminar a las bacterias
patógenas presente en verduras crudas, como por ejemplo cilantro per se, sin alterar
sus propiedades alimenticias así como las características de calidad del producto. En
consecuencia, la aplicación de las composiciones de la presente invención en verduras
crudas, permite su conservación, así como su desinfección efectiva, lo que los
convierte en alimentos seguros para su consumo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Las composiciones de la presente invención comprenden extractos de plantas

con conocida actividad antimicrobiana, como por ejemplo extractos metanólicos de
Jamaica y fracciones cromatográficas especificas obtenidas del extracto acetónico y
metanólicos de los cálices de Jamaica, ya sean solos o en combinación con otros
componentes con probada actividad desinfectante, tales como por ejemplo ácidos
orgánicos que incluyen ácido acético y compuestos de cloro que incluyen hipoclorito de
sodio. Para el caso de la desinfección de verduras crudas tales como por ejemplo
cilantro, las composiciones de la invención que incluyen una mezcla del extracto
metanólicos de plantas con actividad antimicrobiana así como ácido acético e
hipoclorito de sodio y polisorbato, y una mezcla de fracciones cromatográficas
especificas obtenidas del extracto acetónico y/o metanólico de los cálices de Jamaica
así como ácido acético e hipoclorito de sodio y polisorbato 80, suelen ser muy efectivas
para eliminar los microorganismos residentes en el vegetal, logrando al mismo tiempo
que sus propiedades organolépticas y/o nutricionales no se vean afectadas y sin que se
altere, por ejemplo la calidad comercial del cilantro.

Para efectos de la presente invención, las composiciones descritas aquí,

comprenden:
a) Extractos derivados de plantas, los cuales exhiban propiedades antimicrobianas,
como por ejemplo extractos derivados de cálices de jamaica (Hibiscus
sabdariffa),
b) Fracciones cromatográfica obtenidas de extractos acetónicos y metanólicos
derivados de plantas, las cuales exhiban propiedades antimicrobianas, como por
ejemplo fracciones cromatográfica obtenidas de cálices de Jamaica {Hibiscus
sabdariffa),
c) Un acido orgánico con actividad desinfectante, como por ejemplo ácido acético,
ácido láctico, acido cítrico, ácido peracético, ácido octanoico, ácido
peroxietanoico y ácido 1-hidroxietiliden-1,1-difosfónico, y mezclas de los
 mismos, en una concentración p/p de 0.01% a 10%, preferentemente de 0.1% a
1%,

d) Un compuesto de cloro con actividad desinfectante, como por ejemplo hipoclorito

de sodio, hipoclorito de calcio, bióxido de cloro y mezclas de los mismos en una
concentración p/p de 0.001% a 10%, preferentemente de 0.001% a 0.1%, y
e) Un tensoactivo con actividad emulsificante de las grasas o ceras naturales que
se encuentran en la superficie de! cilantro como por ejemplo, polisorbatos,
Polisorbato 80, Polisorbato 20, alquil C12-C18 dimetil betaína (cocobetaína,
alquil C10-C16 dimetilbetaína (laurilbetaína), Sulfobetaína acil (C10-C14 graso)
amidopropilen(hidroxipropilen), sulfobetaína, Ciclodextrinas, B-ciclodextrinas y β-
Cyclodextrin y mezclas de los mismos en una concentración p/p de 0.1% a 5%,
preferentemente de 0.5% a 1%.

Para efectos de la invención, las composiciones se agregan a los alimentos a

desinfectar y/o preservar a través de métodos conocidos en el arte, tales como
aplicación directa, a través de aerosoles, la inmersión completa de la planta en las
soluciones desinfectantes o bien mediante dispositivos que permitan su adecuada
dispersión en los alimentos a tratar. Las composiciones de la invención pueden
adicionarse o ponerse en contacto con los alimentos en una cantidad de 0.1 mL por
1000g de alimento, preferentemente de 0.1 a 1mL por 100g de alimento, o bien
adicionarse en volúmenes mayores conforme a las necesidades que se tengan de
desinfección del alimento. Después de aplicadas, las composiciones pueden
permanecer el tiempo necesario hasta obtener el efecto desinfectante y/o de
preservación deseado en las frutas y verduras. Previo a su consumo, las frutas y
verduras tratadas con las composiciones descritas aquí simplemente se lavan con agua
potable para eliminar dichas composiciones.

Las composiciones descritas aquí, pueden ser obtenidas mediante la mezcla de

sus componentes en las concentraciones deseadas, para posteriormente almacenarlas
a temperatura ambiente, con lo que se encuentran listas para aplicarse a los alimentos
cuando se considere necesario.
 Para efectos de la invención, las composiciones descritas aquí pueden contener
solamente extractos vegetales con actividad antimicrobiana, como por ejemplo
extractos derivados de cálices de Jamaica, o bien fracciones cromatográficas obtenidas
a partir de los extractos acetónicos y/o metanólicos de los cálices de Jamaica, los
cuales se ponen en contacto con los alimentos, por ejemplo alimentos de origen
vegetal crudos como el cilantro, con la finalidad de desinfectarlos y/o preservarlos. En
la presente invención, se describe la actividad desinfectante de extractos derivados de
Jamaica y de fracciones cromatográficas especificas obtenidas a partir de los extractos
de los cálices de Jamaica, en la desinfección y/o preservación de alimentos, por
ejemplo frutas y verduras crudas, por lo que pueden usarse directamente o bien
formando parte de composiciones que las contengan. En este sentido, los extractos o
fracciones cromatográficas derivados de los cálices de Jamaica, pueden adicionarse o
ponerse e n contacto con los alimentos a desinfectar y/o preservar e n una
concentración p/p de 0.001% a 10%, preferentemente de 0.1% a 1%.

La efectividad desinfectante y/o de preservación e n los alimentos de las

composiciones descritas aquí es tai, que inactiva o elimina a las bacterias patógenas al
humano o deterioradoras de alimentos que puedan estar presentes en ellos, mientras
que al mismo tiempo no afecta las propiedades organolépticas y/o nutritivas del
alimento. En e l caso de alimentos frescos como por ejemplo cilantro, las composiciones
de la invención desinfectan adecuadamente el alimento sin afectar sus propiedades
alimenticias, mientras que al mismo tiempo no afectan las propiedades organolépticas
o de calidad.

Los extractos vegetales de la presente invención y las fracciones

cromatográficas puede ser obtenidos mediante el método siguiente:

a) Colocar la planta seca e n un recipiente en condiciones asépticas, añadir solvente

proporción1:9; preferentemente se colocan 100 g de la planta seca en un recipiente
(matraz) en condiciones asépticas, se añaden 900 mi de solvente y se deja reposar

durante 7 días;
b) Retirar los cálices y recuperar el extracto-solvente; preferentemente el extracto
resultante se recupera previa presión de la planta en las paredes del matraz para
retirar el exceso de líquido;
c) Pasar el extracto por un tamiz y recuperar el extracto filtrado; preferentemente el
extracto se pasa por un tamiz No. 200;
d) Retirar por completo el solvente del extracto mediante rota-evaporación a una
temperatura de 40°C, una rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar;
e) Recuperar el extracto seco; preferentemente en un contener previamente estéril;
f) Obtener fracciones de los extractos mediante cromatografía en columna empleando
como eluyentes solventes de diferente polaridad;
g) Eliminar el solvente de las fracciones obtenidas mediante rota-evaporación a una
temperatura de 40°C, una rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar; y
h) Recuperar las fracciones secas; preferentemente en un contenedor.

Obtenidos los extractos y las fracciones, éstas se almacenan a temperatura

ambiente hasta su uso. Una vez obtenidos los extractos y las fracciones
cromatográficas, éstas puede utilizarse solas, o bien en combinación con otros
desinfectantes para obtener las composiciones de la invención, las cuales pueden ser
obtenidas mediante métodos conocidos en el arte donde implique la combinación de
los diversos elementos que las conforman para formar soluciones y/o suspensiones
capaces de ser aplicadas posteriormente a los alimentos a desinfectar y/o preservar,
mediante métodos conocidos en el arte.

La presente invención constituye el primer reporte de la utilización y efectividad

de composiciones que contienen extractos vegetales con actividad microbiana, ya sea
solos o en combinación con otros desinfectantes, para la desinfección y/o preservación
de alimentos, particularmente de frutas y hortalizas, como por ejemplo cilantro. Como
podrá observarse más adelante, las composiciones de la invención son capaces de
desinfectar y/o eliminar microorganismos presentes en cilantro de forma muy eficiente,
con lo que es posible contar con cilantro inocuos microbiológicamente y seguros para
su consumo.
 A continuación se incluyen los siguientes ejemplos con la única finalidad de
ilustrar la presente invención, sin que ello implique limitación alguna a su alcance.

Ejemplo 1. Materiales y métodos.

1.1. Material vegetal.

Se usaron cálices secos de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) de la variedad criolla
de Oaxaca, mientras que en el caso del cilantro (Coriandrum sativum), éste se obtuvo
de un productor local. Se trabajo con las hojas; se seleccionaron hojas de un tamaño
aproximado de 3 cm2 ; se emplearon hojas de un tamaño uniforme y sin daño visible.

1.2. Cepas bacterianas.

Se utilizaron cepas de E . coli 0157:H7 (P1C6, aislada de un brote de
enfermedad), E . coli enteroinvasiva (4VC81-5, aislada de caso clínico) E . coli
enterotoxigénica (1620 TL, aislada de caso clínico), E. coli enteropatógena (52 GM 291,
aislada de caso clínico), Salmonella typhimuríum (ATCC 14028), Salmonella
choleraesuis (ATCC 10708), Listería monocytogenes (ATCC 19115), Listeria
monocytogenes Scott A , Staphylococcus epidermis (ATCC 12228), Staphylococcus
aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Bordetella (ATCC
12741) Sri/ge//a sonnei (ATCC 25931) y Shigella flexnerí (ATCC 12022), V. cholerae
(87151, serotipo Inaba aislada del ambiente) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC
27853). Las cepas de £ . coli 0157:H7 y la de V. cholerae 0 1 fueron donadas por el Dr.
Fernández Escartin de la Universidad Autónoma de Querétaro. Todas las cepas fueron
marcadas con resistencia al antibiótico rifampicina (R+) para eliminar la interferencia de
la flora microbiana nativa del extracto (Castro-Rosas y Escartin, 2000). Ésta resistencia
al antibiótico se mantuvo en el transcurso durante todo el estudio. Las cepas se
mantuvieron a 4 - 7°C en agar base sangre (ABS, Merck®, Alemania) con
transferencias quincenales, activándose en caldo soya tripticaseína (CST, Bioxon®,
México) con incubación a 35°C/24h.

1.3. Obtención de extracto acuoso a partir de los cálices de Jamaica.

Bajo condiciones asépticas 100 g de cálices de Jamaica fueron colocados en un
matraz Erlenmeyer, a los cuales se les adicionó 900 mL de agua destilada, llevando a
ebullición la mezcla durante 20 minutos. Una vez finalizado el tratamiento se dejó
enfriar a temperatura ambiente. Los cálices fueron retirados del extracto (previa presión
en las paredes del matraz para retirar el exceso de líquido de ello) y posteriormente el
extracto se pasó por un tamiz No. 200 (MONTIMAX) para eliminar partículas.
Finalmente se retiró toda el agua del extracto por rota evaporación empleado un rota
evaporador (Buchi R-205) empleando las condiciones siguientes: temperatura de 40°C
de la tina, rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 bar. El extracto seco se
recuperó en un frasco estéril y se almacenó a temperatura ambiente hasta su uso.

1.4. Obtención de extracto metanólico y acetónico a partir de la Jamaica.

Bajo condiciones asépticas 100 g de cálices de Jamaica fueron colocados en un
matraz, a los cuales se les adicionó 900 mL de metanol o acetona y se almacenaron
durante 7 días a temperatura ambiente. Una vez finalizado el tratamiento los cálices
fueron retirados del extracto (previa presión en las paredes del matraz para retirar el
exceso de líquido de ello) y posteriormente el extracto se pasó por un tamiz No. 200
(MONTIMAX) para eliminar partículas. Finalmente se retiró todo el metanol o acetona
del extracto por rota evaporación empleado un rota evaporador (Buchi R-205)
empleando las condiciones siguientes: temperatura de 40°C de la tina, rotación de 80
rpm y una presión a vacío de 72 mbar. Los extractos secos (metanólico o acetónico) se
recuperaron por separado en frasco estéril y se almacenó a temperatura ambiente
hasta su uso.

1.5. Obtención de fracciones a partir del extracto metanólico mediante cromatografía en

columna
Una vez que se ha obtenido el extracto seco (libre de solventes), éste se mezcló
con silica (con el fin de hacer manejable el extracto, ya que este aun tenía humedad),
este se agregó a la columna empaquetada. Se colocó algodón en el fondo de la
columna con ayuda de una varilla para evitar que se desprendiera el gel de sílice
cuando se abría la llave, se sujetó la columna con dos pinzas y se aseguró de tal
manera que estuviera recta. Se mezcló el gel sílice con hexano aproximadamente
8:1g. (gel sílice: extracto), esta cantidad se mezcló con hexano hasta obtener una pasta
fluida, se vertió la pasta en la columna, la cantidad de hexano agregada debió ser la
suficiente para evitar que la silica se secará o ingresará aire a la pasta. El extracto se
agregó poco a poco, se le agregó una pequeña capa de sulfato de sodio (este sirve
como secante), encima de este se le puso una capa de algodón para amortiguar la
caída del disolvente al ser agregado y así evitar la dispersión del sulfato de calcio y el
extracto, después de este procedimiento se llenó la columna con el disolvente (hexano)
y se abrió la llave para comenzar a bajar las fracciones con las diferentes mezclas de
solventes, recuperándolas en cantidades de 50 mi cada una, que posteriormente se
evaporaron con ayuda del rotaevaporador, y estas fueron colocadas en viales,
considerando cada una de estas como una fracción.

Tabla 1. Solventes y mezclas utilizados para la obtención de fracciones a partir del

extracto metanólico

Para cambiar la mezcla de solventes se realizó cromatografía en placa fina, y al

encontrar diferencias claramente visibles (por la aparición de bandas distintas en
tamaño y forma) entre fracciones la mezcla se cambiaron de menor a mayor polaridad
(hexano, acetato de etilo y metanol) en la tabla 1 se muestran las mezclas de solvente
utilizadas y con las que se eluyó.
 De un total de 28.5 g de extracto metanólico se obtuvieron 93 fracciones de las
cuales después de determinar la semejanza de las fracciones mediante cromatografía
en capa fina se obtuvieron 7 colecciones de fracciones (Tabla 2).

Tabla 2 . Número de fracciones reunidas en cada colección obtenidas a partir del

extracto metanólico

.6. Obtención de fracciones a partir del extracto acetónico mediante cromatografía en

columna.
Una vez que se ha obtenido el extracto seco (libre de solventes), éste se mezcló
con silica (con el fin de hacer manejable el extracto, ya que este aun tenía humedad),
este se agregó a la columna empaquetada. Se colocó algodón en el fondo de la
columna con ayuda de una varilla para evitar que se desprendiera el gel de sílice
cuando se abría llave, se sujetó la columna con dos pinzas y se aseguró de tal manera
que estuviera recta. Se mezcló el gel sílice con cloroformo aproximadamente 8:1g. (gel
sílice: extracto), esta cantidad se mezcló con cloroformo hasta obtener una pasta fluida,
se vertió la pasta en la columna, la cantidad de cloroformo agregada debió ser la
suficiente para evitar que la silica se secará o ingresará aire a la pasta, posteriormente
se agregó poco a poco el extracto, se le agregó una pequeña capa de sulfato de sodio
(este sirve como secante), encima de este se le puso una capa de algodón para
amortiguar la caída del disolvente al ser agregado y así evitar la dispersión del sulfato
de calcio y el extracto, después de este procedimiento se llenó la columna con el
disolvente (cloroformo) y se abrió la llave para comenzar a bajar las fracciones con las
diferentes mezclas de solventes, recuperándolas en cantidades de 50 mi cada una, que
posteriormente se evaporaron con ayuda del rotaevaporador, y estas fueron colocadas
en viales, considerando cada una de estas como una fracción. Para cambiar la mezcla
de solventes se realizó cromatografía en placa fina, y al encontrar diferencias entre
fracciones la mezcla se cambiaron de menor a mayor polaridad (cloroformo-acetona)
en la tabla 3 se muestran las mezclas de solvente utilizadas y con las que se eluyó.

Tabla 3 . Disolventes y mezclas utilizadas para la obtención de fracciones a partir del

extracto acetónico

De un total de 20.5 g de extracto acetónico se obtuvieron 7 fracciones de las

cuales después de determinar la semejanza de las fracciones mediante cromatografía
en capa fina se obtuvieron 7 colecciones de fracciones (Tabla 4).

Tabla 4 . Numero de fracciones reunidas en cada colección obtenidas a partir del

extracto acetónico

1.7. Determinación de la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos, metanólico

y acetónico, del acido acético, hipoclorito y de las fracciones correspondientes
provenientes de los cálices de Jamaica en medio de cultivo (estudios in vitro).

1. 7. 1. Preparación del inóculo de las cepas.

 Tubos de ensayo con cultivos de 24 h e n CST de cada cepa R+, fueron
centrifugados a 3500 rpm por 20 min. Posteriormente se desechó el sobrenadante; e l
paquete celular se resuspendió agregando 3 mL de solución salina isotónica estéril y se
agitó e n vortex por 10 s. El procedimiento anterior se repitió dos veces más.
Posteriormente, la concentración de cada cepa fue de aproximadamente 1x 0 9 UFC
/mL. Finalmente cada cepa se diluyó decimalmente en solución salina isotónica una
sola ocasión.

1. 7.2. Preparación de las soluciones de los extractos o de las fracciones.

A partir de los extractos secos o fracciones (colecciones) secas se prepararon
soluciones acuosas empleando agua destilada estéril o una solución de Polisorbato 80:
agua e n una proporción 20:80. Los extractos acuosos y metanólico y fracciones
acetónicas (fracción III) y metanólicas (fracción IV) y se solubilizaron en agua destilada
mientras que los extractos acetónicos y fracciones no polares o de polaridad baja
fueron solubilizados e n la solución de Polisorbato 80:agua. A el agua o a e l polisorbato
80:agua se les agregaron los extractos secos o fracciones en una proporción 1:10 y
1:100 (agua:extracto ó agua:fracción) por separado y se depositarán e n frascos
estériles.

1.7.3 Efecto antimicrobiano de los extractos y las fracciones en medio de cultivo.

Por separado, 100 de la primera dilución de los cultivos de los patógenos
fueron inoculados sobre cajas de AST suplementarias con 10 mg/L de e l antibiótico
rifampicina, el inoculo se distribuyó e n toda la superficie del agar mediante la técnica ¾te
extensión por superficie. Sobre las cajas inoculadas, por separado; se cotocaron
alícuotas de 10 i de la solución de los extractos (acuoso, metanólico o acetónico), o
de las fracciones cromatográficas. Se realizaron cuatro repeticiones para cada
tratamiento. Después de que e l extracto o fracciones fueron absorbidos por e l agar, las
cajas de cultivo se incubaron a 35 ± 1°C, por 24 h . Finalmente se midió e l diámetro de
cada uno de los halos de inhibición formados e n la superficie del medio inoculado.

1.8. Evaluación del efecto antimicrobiano de los extractos acuoso, metanólico,

acetónico, fracciones cromatográficas y formulaciones específicas en la reducción de
Salmonella y E . coli 0157. Ή 7 en cilantro contaminado.
1.8. 1. Preparación de las soluciones desinfectantes.

Las soluciones de extractos de cálices de Jamaica, mezclas a base de extractos

y fracciones cromatográficas así como las mezclas conteniendo acido acético,
hipoclorito y/o polisorbato 80 % fueron preparadas a las concentraciones, proporciones
o mezclas que se describen en la Tabla 5 . Por ejemplo, para preparar 100 mi de una
solución conteniendo extracto metanólico de cálices Jamaica al 1 % , acido acético al
0.1 % y 100 mg/L de hipoclorito: a 100 mL de agua destilada se le agregó 1 g de
extracto metanólico seco de cálices de Jamaica, además 1 mi de una solución de acido
acético al 10 % y 0.2 mi de una solución de hipoclorito al 5 % .

1.8.2. Cepas.
Para éstos estudios se trabajó con 7 serotipos de Salmonella: (3 typhimurium
[ATCC 14028, uno aislado de tomate, J1, y otro de semilla de alfalfa, GA1], Salmonella
choleraesuis [ATCC 10708], typhi, gaminara, y montes/ideo) y 3 de £ . co// 0157:H7 (dos
aisladas e n nuestro laboratorio a partir de carne cruda molida de res [P1C6 y M5C8] y
otra aislada de un brote provocado por consumo de carne en los Estados Unidos de
Norteamérica [E09]), esta cepa fue donada por el Dr. Eduardo Fernández Escartin de la
Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo. A partir de las cepas nativas se
obtuvieron cepas mutantes resistencia al antibiótico rifampicina (R+), esto para ser
usadas en los estudios. A l incorporar e l antibiótico al medio de cultivo para monitorear
el comportamiento de las cepas mutantes se eliminaría la interferencia de la flora
microbiana nativa de los extracto, fracciones y material vegetal de estudio (Castro-
Rosas y Escartin, 2000).

1.8.3. Preparación del inóculo de las cepas.

Tubos de ensayo con cultivos de 24 h e n CST de cada cepa R+, fueron
centrifugados a 3500 rpm por 20 min. Posteriormente se desechó e l sobrenadante; e l
paquete celular se resuspendió agregando 3 mL de solución salina isotónica estéril y se
agitó e n vortex por 10 s. E l procedimiento anterior se repitió dos veces más. La
concentración resultante de cada cepa fue de aproximadamente 1x1 0 9 UFC /mL. Un
mililitro de cada cepa de Salmonella fue mezclado e n un tubo de ensaye vacío para

tener una mezcla de las 7 cepas de Salmonella examinadas. Lo mismo se realizó con
las cepas de E . coli 0157:H7, para tener una mezcla de las tres cepas de E . coli
0157:H7.

1.8.4. Inoculación del cilantro

Se utilizaron hojas de cilantro de un tamaño uniforme o semejante (aprox 3 cm2)

y que no presentaron daños visibles. Por separado, se inocularon hojas individuales
colocando en la parte central de cada hoja 5 gotas o alícuotas de 10 L de una
suspensión de cada tipo de mezcla de bacteria patógena (Salmonella ó E. coli
0157:H7) conteniendo aproximadamente 1 x 10 7 UFC, los 5 inóculos estuvieron
cercanos sin llegar a confluir las hojas inoculadas se colocaron en una charolas y se
introdujeron en una campana bioclimática por dos horas a una humedad relativa de
90±1% y 26.5±1 °C. La finalidad de este tratamiento fue la de provocar la adherencia o
infiltración de las células de las bacterias patógenas de estudio para simular las
condiciones naturales, en otras palabras, la de tener un modelo que se asemejase err
lo posible a lo que ocurre cuando el cilantro se contaminan por las fuentes de
contaminación naturales o comunes con las bacterias patógenas.

1.8.5. Tratamiento de desinfección de las hojas de cilantro.

Después de las dos horas en la cámara bioclimática, cada hoja a por
separado para eliminar los microorganismos que no se adhirieron, el lavado consistió
en sumergir y agitar cada hoja de cilantro inoculada en agua destilada por 10 s, se dejó
escurrir la parte lavada a temperatura ambiente hasta sequedad y posteriormente
por separado las hojas se sumergieron por 0 min en Jas diferentes soluciones
desinfectantes señaladas en la Tabla 5 . Un tratamiento solo con agua destilada sirvió
como control positivo.

1.8.6. Recuento de microorganismos sobrevivientes a los tr0amientos

Después del tratamiento, las hojas de cilantro se retiraron de la solución
desinfectante y para eliminar el desinfectante remanente se sumergió la parte
inoculada en agua destilada por 10 s, posteriormente se corto la parte inoculada (un
cuadro de aproximadamente 2 x 2 cm y con una profundidad de aprox. 2 cm) con
ayuda de un bisturí estéril, cada porción se colocó de manera independiente en una
bolsas de plástico y se adicionaron 0 m de diluyente de peptona. Posteriormente, los
materiales se agitaron manualmente presionando y frotando con fuerza la parte
inoculada y toda la hoja de cilantro desde la parte exterior de la bolsa por un minuto.
Después de este tiempo se realizó el recuento de cada bolsa mediante la técnica de
vertido en placa empleando agar para métodos estándar (Bioxon, México) adicionado
de 100 mg/L de Rifampicina (Sigma, México), las cajas se incubaron a 35°C/24-48 h.
Este procedimiento se realizó por duplicado para cada replica. Cada tratamiento se
efectuó por quintuplicado.

Tabla 5 . Tratamientos a los que fueron sometidas por separado hojas de cilantro
contaminadas con las mezclas de las cepas de Salmonella o E . coli 0157:H7

No Tratamientos
1 Sin tratamiento (control)
2 EA 1%
3 EAc 1%
4 EM 1%
5 Fac 1%
6 Fm 1%
7 HS 100 ppm
8 Acá 0.1 %
9 Acá 0.5 %
10 EA 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm
11 EA 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm
12 EAc 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm
13 EAc 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm
14 EM 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm
15 EM 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm
16 Fac 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm
17 Fac 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm
18 Fm 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm
19 Fm 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm
20 EA 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm + Po80 2%
21 EA 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm + Po80 2%
22 EAc 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm + Po80 2 %
23 EAc 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm + Po80 2%
24 EM 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm + Po80 2 %
25 EM 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm + Po80 2%
26 Fac 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm + Po80 2%
27 Fac 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm + Po80 2%
28 Fm 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm + Po80 2 %
29 Fm 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm + Po80 2%
30 EM 1% + Fac 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm + Po80 2%
31 EM 1% + Fac 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm + Po80 2%
32 EM 1% + Fm 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm + Po80 2%
33 EM 1% + Fm 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm + Po80 2%
Para la elaboración de las soluciones se empleo como base:
A) el extracto seco de los cálices de Jamaica en la sección anterior, B) Solución de hipoclorito de sodio con
el 5 % de hipoclonto libre, C) Acido acético glacial al 10 %, d) Monooleato de Polioxietileno Sorbitan o
polisorbato 80 (Polisorbato 80), d) Agua destilada estéril a pH 6

1.8.7. Análisis estadístico

Los resultados obtenidos se analizaron estadísticamente con un análisis de

varianza de una sola vía (ANOVA) comparando las medias con la prueba de Tukey,
con un nivel de significancia del 0.05.

1.9. Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de los extractos y de la colecciones.

Se determinó el espectro de RMN del protón ( H) del extracto metanólico seco
obtenido de los cálices de Jamaica y también de las colecciones de fracciones
obtenidas del extracto acetónico (colección III) y del extracto metanólico (colección IV).
Estos extractos y colecciones de fracciones analizadas con RMN fueron las que se
utilizaron en las formulaciones.

El extractos secos y las colección se solubilizaron en agua deuterada. Los

espectros de RMN se obtuvieron utilizando un espectrómetro de resonancia magnética
nuclear (Varían NMR, 400 MHz).

La espectroscopia de RMN estudia los núcleos atómicos. Esta técnica

espectroscópica puede utilizarse sólo para estudiar núcleos atómicos con un número
impar de protones o neutrones (o de ambos), para determinar las estructuras de los
compuestos orgánicos. Esta situación se da en los átomos de 1H , 3 C, 1 Fy P. Este
tipo de núcleos son magnéticamente activos, es decir poseen espín, igual que los
electrones, ya que los núcleos poseen carga positiva y poseen un movimiento de
rotación sobre un eje que hace que se comporten como si fueran pequeños imanes. El
espectrómetro de RMN detecta estas señales y las registra como una gráfica de
frecuencias frente a intensidad, que es el llamado espectro de RMN

Ejemplo 2. Efecto antimicrobiano de los extractos de los cálices de Jamaica.

Los tres tipos de extractos (acuoso, metanólico y acetónico) mostraron un
acentuado efecto antimicrobiano (Tabla 6). Todos los microorganismos ensayados
fueron inhibidos desde los primeros instantes de contacto. El efecto inhibitorio
observado sugiere la presencia de substancias antimicrobianas en los extractos. Este
efecto puede provocar un daño letal a la célula o solo causar un efecto subletal ó estrés
celular (Busta, 1976). Distintos componentes del vegetal podrían ser los responsables
de éste efecto antimicrobiano.

Con la finalidad de separar, aislar y/o concentrar las sustancias antimicrobianas

presentes en los extractos de los cálices de -Jamaica, los extractos se separaron en
diferentes compuestos o grupos de compuestos con base en su polaridad; para esto se
recurrió a la separación de los compuestos por cromatografía en columna, de esta
manera se obtuvieron diferentes grupos de compuestos o grupos de fracciones
(colecciones de fracciones, ver metodología). Posteriormente se probó el efecto
antimicrobiano de las colecciones de fracciones obtenidas. Debido a que el extracto
acetónico y el metanólico tuvieron mayor efecto antimicrobiano que el extracto acuoso,
no se separaron por cromatografía los componentes del extracto acuoso.

Tabla 6 . Efecto antimicrobiano del extracto acuoso de Jamaica diluido 1:10 y el de una
solución de penicilina (control) sobre diferentes microorganismos

Diámetro de Diámetro de Diámetro de Diámetro de

Tipo de inhibición inhibición inhibición inhibición
microorganismo Extracto Extracto Extracto Penicilina
acuoso acetónico metanólico (control)

E. coli 11* 13* 14 25

£ co// 0157:H7 11 14 14 22

E . coli enteroinvasiva 11 11 13 25
E. coli 11 20
10 12
enteropatóqena
E. coli 11 12 12 20
enterotoxiqénica
S. aureus 11 13 14 26

V. choteras OI 11 14 14 22

S. Typhimurium 12 14 14 24

S. Choleraesuis 11 12 12 20

P. aeruginosas 11 13 14 21

S. flexneri 10 12 14 22

S. sonnei 12 14 13 24

L monocytogenes 10 13 14 23
* (mm)
Ejemplo 3. Efecto antimicrobiano de diferentes fracciones cromatográficas.
En las Tabla 7 se muestra el efecto inhibitorio expresado en longitud del halo de
inhibición en milímetros (mm), que se observó en cajas de petri sembradas con
diferentes microorganismos, por el efecto de diferentes colecciones de fracciones
cromatográficas agrupadas por polaridad obtenidas a partir del extracto acetónico de
los cálices de Jamaica. Se observa que sólo las colecciones II y III provenientes de
extracto acetónico muestran efecto antimicrobiano o inhibitorio. La colección III es la
que mostró el mayor efecto antimicrobiano (Tabla 7). Esta fracción III se utilizó para
realizar las mezclas o formulaciones que se utilizaron en los experimentos de
desinfección del cilantro.

En las Tabla 8 se muestra el efecto inhibitorio en mm de diferentes colecciones

de fracciones cromatográficas agrupadas por polaridad obtenidas a partir del extracto
metanóiico de los cálices de Jamaica. Se observa que todas las colecciones
provocaron halos de inhibición lo cual se interpreta como efecto antimicrobiano de las
colecciones. No obstante, la colección IV es la que mostró el mayor efecto
antimicrobiano (Tabla 8). Esta fracción IV se utilizó para realizar las mezclas o
formulaciones que se utilizaron en los experimentos de desinfección del cilantro.

Tabla 7 . Efecto antimicrobiano de colecciones acetónica

Colección Colección Colección Colección Colección Colección Colección

Tipo de bacteria
I II III IV V VI VII

S. Choleraesuis 0 0 14 0 0 0 0

. co/( 0 57:H7 0 9* 18 0 0 0 0

S. flexneri 0 19 25 0 0 0 0

S. aureus 0 13 12 0 0 0 0

S. Typhimurium 0 22 18 0 0 0 0

L. monocytogenes 0 18 22 0 0 0 0

S. epidermis 0 13 21 0 0 0 0

P. aeruginosas 0 14 19 0 0 0 0

Bordetella 0 0 12 0 0 0 0

0 11 18 0 0 0 0
S. sonnei

* Halo de inhibición expresado en milímetros (mm); e l Cero (0) significa que no se observo efecto inhibitorio.
Tabla 8 . Efecto antimicrobiano de colecciones metanólicas

Tipo de Colecció Colecció Colección Colección Colecció Colección Colección

bacteria n n ll III IV nV VI VII

L
6 10 15 24 12 11 15
monocytogenes

S. sonnei 8 11 10 30 10 12 6

P. aeruginosas 6 10 11 22 8 8 7

S. Choleraesuis 10 12 13 36 9 13 6

S. fíexneri 7 14 13 29 10 12 8

S. Typhimurium 7 11 10 32 12 10 10

Bordetella 8 10 8 23 9 13 6

E. C ' O157:H7 6 17 20 26 14 11 6

S. aureus 13 22 17 30 11 10 7

S. epidérmicas 6 15 12 28 10 12 6

* Halo de inhibición expresado e n milímetros (mm); el Cero (0) significa que no se observo efecto inhibitorio

Ejemplo 4. Potencial desinfectante de los extractos y fracciones solos o en

mezclas con ácido acético, hipoclorito de sodio y/ó Polisorbato 80.

Se encontró que todos los tratamientos tuvieron efecto antimicrobiano con

respecto al control. Los datos de este estudio se encuentran reportados en la tabla 9 .
Se observa que aunque todos los tratamientos muestran efecto antimicrobiano sólo 4
combinaciones lograron eliminar a niveles no detectables la concentración de las
mezclas de cada patógeno: los tratamientos 30, 31, 32 y 33 redujeron 5 og la
concentración de ambos patógenos (Tabla 9).

En la presente invención, con 4 combinaciones específicas de tres

antimicrobianos y un tensoactivo (polisorbato) se logró la eliminación total de los
microorganismos patógenos inoculados en el cilantro; esto es un ejemplo de lo que
actualmente se conoce como tratamiento de barreras múltiples. Las barreras múltiples
son la combinación de tratamientos antimicrobianos que potencian el efecto
antimicrobiano global, lo que da como resultado alimentos estables, seguros e inocuos.
 Cabe señalar el posible papel potenciador del polisorbato 80 en el efecto
antimicrobiano observado, ya que al ser un tensoactivo es posible que haya favorecido
la emulsificación de la cera natural del cilantro lo cual pudo incrementar el efecto de la
solución desinfectante al eliminar o disminuir el efecto protector que la cera estaría
proporcionando a los microorganismos inoculados sobre el cilantro.

Por lo anterior, !as 4 composiciones de la presente invención son una

excelente alternativa para la desinfección y/o preservación de alimentos, por ejemplo
alimentos frescos, sin que alteren sus propiedades nutritivas. En este sentido, las
composiciones descritas aquí, permiten la desinfección efectiva de microorganismos
patógenos de frutas y hortalizas, preferentemente cilantro permitiendo el consumo
seguro de tales productos.

Tabla 9 :
 Tabla 9 . Concentración de £ coli 0157:H7 y S.Typhimurium en Cilantro al inicio y después de diferentes tratamientos
co// 0157:H7 Salmonella
Tratamiento
Número Número Número Número
Inicial Final Inicial Final
1 Sin tratamiento (control) 5.00 ± 0.30'* 4.80 ± 0.30 4.90 ± 0.30 4.70 ± 0.30
2 EA 1% 5.00 ± 0.20 3.80 ± 0.30 4.90 ± 0.30 3.70 ± 0.20
3 EAc 1% 5.00 ± 0.20 3.50 ± 0.30 4.90 ± 0.30 3.50 ± 0.30
4 E 1% 5.00 ± 0.20 3.60 ± 0.30 4.90 ± 0.30 3.70 ± 0.40
5 Fac 1% 5.00 ± 0.20 3.30 ± 0.40 4.90 ± 0.30 3.60 ± 0.20
6 Fm 1% 5.00 ± 0.20 3.40 ± 0.30 4.90 ± 0.30 3.50 ± 0.30
7 HS 100 ppm 5.00 ± 0.20 3.90 ± 0.40 4.90 ± 0.30 3.70 ± 0.20
8 Acá 0.1 % 5.00 ± 0.20 4.10 ± 0.30 4.90 ± 0.30 3.90 ± 0.30
9 Acá 0.5 % 5.00 ± 0.20 4.10 ± 0.30 4.90 ± 0.30 3.70 ± 0.30
10 EA 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm 5.00 ± 0.20 3.10 ± 0.20 4.90 ± 0.30 3.40 ± 0.30
11 EA 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm 5.00 ± 0.20 2.70 ± 0.20 4.90 ± 0.30 3.10 ± 0.30
12 EAc 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm 5.00 ± 0.20 2.60 ± 0.30 4.90 ± 0.30 2.80 ± 0.30
13 EAc 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm 5.00 ± 0.20 2.30 ± 0.30 4.90 ± 0.30 2.60 ± 0.30
14 EM 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm 5.00 ± 0.20 2.80 ± 0.30 4.90 ± 0.30 2.80 ± 0.40
15 EM 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm 5.00 ± 0.20 2.50 ± 0.30 4.90 ± 0.30 2.50 ± 0.40
16 Fac 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm 5.00 ± 0.20 2.10 ± 0.20 4.90 ± 0.30 2.60 ± 0.30
17 Fac 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm 5.00 ± 0.20 1.80 ± 0.30 4.90 ± 0.30 2.10 ± 0.30
18 Fm 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm 5.00 ± 0.20 2.50 ± 0.20 4.90 ± 0.30 2.60 ± 0.30
19 Fm 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm 5.00 ± 0.20 2.20 ± 0.20 4.90 ± 0.30 2.50 ± 0.30
20 EA 1% + Acá 0.1 % + HS 100 ppm + Po80 2% 5.00 ± 0.20 2.00 ± 0.20 4.90 ± 0.30 2.40 ± 0.20
21 EA 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm + Po80 2% 5.00 ± 0.20 1.90 ± 0.30 4.90 ± 0.30 2.30 ± 0.20
22 EAc 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm + Po80 2% 5.00 ± 0.20 1.90 ± 0.20 4.90 ± 0.30 2.10 ± 0.30
23 EAc 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm + Po80 2% 5.00 ± 0.20 1.60 ± 0.20 4.90 ± 0.30 1.90 ± 0.20
24 EM 1% + Acá 0.1 % + HS 100 ppm + Po80 2% 5.00 ± 0.20 1.80 ± 0.20 4.90 ± 0.30 2.00 ± 0.30
25 EM 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm + Po80 2% 5.00 ± 0.20 1.60 ± 0.20 4.90 ± 0.30 1 .70 ± 0.30
26 Fac 1% + Acá 0 . 1% + HS 100 ppm + Po80 2% 5.00 ± 0.20 1.60 ± 0.30 4.90 ± 0.30 1.90 ± 0.30
27 Fac 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm + Po80 2% 5.00 ± 0.20 1.40 ± 0.30 4.90 ± 0.30 1.10 ± 0.30
28 Fm 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm + Po80 2% 5.00 ± 0.20 1.70 ± 0.30 4.90 ± 0.30 1.80 ± 0.30
29 Fm 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm + Po80 2% 5.00 ± 0.20 1.40 ± 0.30 4.90 ± 0.30 1.60 ± 0.30
30 , EM 1% + Fac 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm + Po80 2% 5.00 0.20 0.00 4.90 1 0.30 0.00
31 EM 1% + Fac 1% + Acá 0.5% HS 100 ppm + Po80 2% 5.00 0.20 0.00 4.90 0.30 0.00
32 EM 1% + Fm 1% + Acá 0.1% + HS 100 ppm + Po80 2% 5.00 0.20 0.00 4.90 0.30 0.00
33 EM 1% + Fm 1% + Acá 0.5% + HS 100 ppm + Po80 2% 5.00 i 0.20 0.00 4.90 0.30 0.00

Extracto acetónico, EM: Extracto metanólico, Fac: Fracción acetónica, Fm: Fracción metanólica, Acá: Ácido acético, HS: Hipoclorito de Sodio, Po80: Polisorbato 80
Ejemplo 5. Espectro de RMN obtenido del extracto matanólico seco.

El espectro de RMN obtenido del extracto metanólico seco de los cálices de

Jamaica se presenta e n la Figura 1. En e l espectro se observan varios picos

característicos del extracto que utilizamos e n las formulaciones. Este espectro

caracteriza e l extracto acetónico usado e n las formulaciones de la tabla 9 .

Ejemplo 6. Espectro de RMN obtenido de la colección cromatográfica III

proveniente del extracto acetónico.

De la colección cromatográfica III obtenida a partir del extracto acetónico, se

obtuvo e l espectro de RMN Figura 2 . Se observan varios y diferentes picos
característicos de la colección cromatográfica que utilizamos e n las formulaciones. Este
espectro caracteriza a la colección cromatográfica III usada e n las formulaciones
antimicrobianas de la tabla 9 .

Ejemplo 7. Espectro de RMN obtenido de la colección cromatográfica IV

proveniente del extracto metanólico.

De la colección cromatográfica IV obtenida a partir del extracto metanólico, se

obtuvo e l espectro de RMN Figura 3 . Se observan varios y diferentes picos
característicos de la colección cromatográfica que utilizamos e n las formulaciones. Este
espectro caracteriza a la colección cromatográfica IV usada e n las formulaciones
antimicrobianas de la tabla 9 .

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Microbiol. 61:2127-2131.
 REIVINDICACIONES

Habiendo descrito suficientemente mi invención, considero como una novedad y por lo

tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes
cláusulas:

1. Una solución con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar cilantro
(Coriandrum sativum), caracterizada porque comprende:

a) Extracto metanólico de cálices de Jamaica {Hibiscus sabdariffa);

b) Una colección de fracciones cromatográficas ó ai a de un extracto acetónico
de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa);
c) Ácido acético;
d) Hipoclorito de Sodio;
e) Monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80 (Polisorbato 80)

2. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1 ,

caracterizada porque el a) extracto meta ti e cálices de Jamaica (Hibiscus
sabdariffa) está presente en una concentración entre 0 al 10%.

3. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad co a peivfrKlicación 1,

caracterizada porque la b) colección de fracciones cromatográficas obtenida de un
extracto acetónico de cálices de Jamaica (Hibiscus. sabdariffa) está presente en
una concentración entre 0.01% al 10%.

4. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad * la reivindicación 1,

caracterizado porque el c) ácido acético está presente entina concentración entre
0.01 a 10%.

5. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1,

caracterizado porque el d) hipoclorito de sodio está presente en una concentración
entre 10 a 1000 ppm.
6. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1,
caracterizado porque el e) monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80
está presente en una concentración entre 0.1 a 10 % .

7. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1,

caracterizada porque el f) extracto metanólico de cálices de Jamaica {Hibiscus
sabdariffa) presenta un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) como se
observa en la Figura 1.

8. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación i ,

caracterizada porque la g) colección de fracción cromatográfica obtenida de un
extracto acetónico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) presenta un
espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) como se observa en la Figura 2.

9. La solución de la reivindicación 1, caracterizada porque tiene una presentación

como formulación acuosa.

10. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizada porque donde una o varias partes de Jamaica (Hibiscus
sabdariffa) pueden ser usadas para la obtención del extracto metanólico.

11. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizada porque donde una o varias partes de Jamaica (Hibiscus
sabdariffa) pueden ser usadas para la obtención de las colecciones de fracciones
cromatográficas de un extracto acetónico

12. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, donde la parte de la planta de Jamaica que se emplea para obtener los
extractos y las colecciones de fracciones son los cálices.

13. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizada por un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN)
 del extracto metanólico obtenido de los cálices de la Jamaica (Hibiscus sabdariffa)
(Figura 1).

14. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizada por un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN)
de la colección de fracciones cromatográficas obtenida de un extracto acetónico
de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) (Figura 2).

15. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizada porque es útil como desinfectante y conservador de
alimentos de origen vegetal y animal.

16. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizada porque la formulación acuosa es útil como desinfectante y
conservador de frutas y verduras, especialmente cilantro.

17. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizada porque las principales variedades de cilantro (Coríandrum
sativum) sobre las que actúa como desinfectante se seleccionan de sativum,
microcarpum y vulgare Alef.

18. Un método para la desinfección y/o preservación de cilantro (Coríandrum sativum),

caracterizado porque comprende aplicar al cilantro la solución definida en las

reivindicaciones anteriores.

19. Un extracto vegetal con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar
cilantro (Coríandrum sativum), caracterizado porque es obtenido mediante las
siguientes etapas:

a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir metanol

y almacenar a 22° ± 2 o C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar el metanol del extracto, y
c) Recuperar el extracto metanólico seco.
20. El extracto de la reivindicación 19, caracterizado porque se obtiene con metanol.

21. El extracto de conformidad con la reivindicación 19, porque donde una o varias
partes de la planta pueden ser usadas para la obtención del extracto.

22. El extracto de la reivindicación 19, caracterizado porque la planta e s la planta de

Jamaica (Hibiscus sabdariffa).

23. El extracto de la reivindicación 19 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizado porque el extracto e s obtenido de los cálices de la
Jamaica.

24. El extracto de la reivindicación 19 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizado por que presenta un espectro de resonancia magnética
nuclear (RMN) como se observa e n la Figura .

25. El extracto de la reivindicación 19 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizado porque e s útil como desinfectante y conservador de
alimentos de origen animal y vegetal.

26. E l extracto de la reivindicación 19 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizado porque es útil como desinfectante y conservador de frutas
y verduras, preferentemente cilantro.

27. El extracto de la reivindicación 19 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizado porque las principales variedades de cilantro {Coriandrum
sativum) sobre las que actúa como desinfectante se seleccionan de sativum,
microcarpum y vulgare Alef.

28. Un método para la desinfección y/o preservación de cilantro (Coriandrum sativum),

caracterizado porque comprende aplicar al cilantro e l extracto definido e n las

reivindicaciones de la 19 a la 27.
29. Un método para obtener un extracto vegetal con actividad antimicrobiana para
desinfectar y/o preservar cilantro (Coríandrum sativum), caracterizado porque
comprende las siguiente etapas:

a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir

metanol y almacenar a 22° ± 2o C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar el metanol del extracto, y
c) Recuperar el extracto seco.

30. El método para obtener el extracto vegetal de la reivindicación 29, caracterizado

porque el extracto puede tener una presentación sólida o liquida.

31. Una colección de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana para

desinfectar y/o preservar cilantro (Coríandrum sativum), caracterizada porque es

obtenido mediante las siguientes etapas:

a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir

acetona y almacenar a 22° ± 2o C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar la acetona del extracto,
c) Recuperar el extracto seco,
d) Efectuar cromatografía para separar el extracto acetónico seco en fracciones
cromatográficas utilizando solventes y mezclas de solventes de diferentes
polaridades,
e) Recuperar en recipientes fracciones cromatográficas de diferentes polaridades,
f) Retirar el solvente de las fracciones,
g) Agrupar o reunir en recipientes las fracciones para formar grupos (colecciones)
de polaridades iguales o semejantes,
h) Efectuar ensayos microbiológicos con las colecciones,
i) Recuperar las colecciones de fracciones con actividad antimicrobiana
32. La colección de fracciones cromatográficas de conformidad con la reivindicación

31, porque donde una o varias partes de la planta pueden ser usadas para la
obtención de la colección de fracciones cromatográficas.

33. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 3 1 de conformidad

con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la planta es la Jamaica
{Hibiscus sabdariffa).

34. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 3 1 de conformidad

con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las fracciones son
obtenidas de los cálices de la Jamaica.

35. La colección de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana de la

reivindicación 3 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada
porque la colección de fracciones presenta un espectro de resonancia magnética
nuclear (R N) como se observa en la Figura 2.

36. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 3 1 de conformidad

con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es útil como desinfectante

y conservador de alimentos de origen animal y vegetal.

37. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 3 1 de conformidad

con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es útil como desinfectante

y conservador de frutas y verduras, preferentemente cilantro.

38. La colección de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana de

conformidad con la reivindicación 3 1 de conformidad con las reivindicaciones
anteriores, caracterizada porque las principales variedades de cilantro (Coríandrum
sativum) sobre las que actúa como desinfectante se seleccionan de sativum,
microcarpum y vulgare Alef.

39. El método para desinfectar y/o conservar frutas y verduras, preferentemente

cilantro con la colección de fracciones cromatográficas con actividad
 antimicrobiana del extracto de los cálices de Jamaica definida en las reivindicación
de la 3 1 a la 38.

40. Un método para obtener colecciones de fracciones cromatográficas con actividad

antimicrobiana a partir de un extracto vegetal para desinfectar y/o preservar cilantro
(Coriandrum sativum), caracterizado porque comprende las siguiente etapas:

a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir

acetona y almacenar a 22° ± 2o C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar la acetona del extracto,
c) Recuperar el extracto seco,
d) Efectuar cromatografía para separar el extracto acetónico seco en fracciones
cromatográficas utilizando solventes y mezclas de solventes de diferentes
polaridades,
e) Recuperar en recipientes fracciones cromatográficas de diferentes polaridades,
f) Retirar el solvente de las fracciones,
g) Agrupar o reunir en recipientes las fracciones para formar grupos (colecciones)
de polaridades iguales o semejantes,
h) Efectuar ensayos microbiológicos con las colecciones,
i) Recuperar las colecciones de fracciones con actividad antimicrobiana.

41. El método conforme a la reivindicación 40, caracterizado porque las colecciones de

fracciones puede tener una presentación sólida o liquida.

42. Un método para la preparación de una solución con actividad antimicrobíana para
desinfectar y/o preservar cilantro {Coriandrum sativum), caracterizado por
comprender los pasos de:

a) Colocar la planta de Jamaica seca en un recipiente en condiciones asépticas,

añadir metanol y almacenar a 22° ± 2o C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar el del extracto y,
c) Recuperar el extracto metanólico seco,
 ) Colocar planta de Jamaica seca en un recipiente en condiciones asépticas,
añadir acetona y almacenar a 22° ± 2 o C por 7 días,
e) Pasar el extracto por un tamiz y retirar la acetona del extracto,
f) Recuperar el extracto acetónico seco,
g) Efectuar cromatografía para separar el extracto acetónico seco en fracciones
cromatográficas utilizando solventes y mezclas de solventes de diferentes
polaridades,
h) Recuperar en recipientes fracciones cromatográficas de diferentes polaridades,
i) Retirar el solvente de las fracciones,
j) Agrupar o reunir en recipientes las fracciones para formar grupos (colecciones)
de polaridades iguales o semejantes,
k) Efectuar ensayos microbiológicos con las colecciones,
I) Recuperar las colecciones de fracciones con actividad antimicrobiana,
) Preparar la solución acuosa en un recipiente conteniendo: agua, extracto
metanólico seco de Jamaica, una colecciones de fracciones cromatográficas con
actividad antimicrobiana proveniente del extracto acetónico seco de Jamaica,
ácido acético, hipoclorito de sodio y monooleato de Polioxietileno Sorbitan o
polisorbato 80.

43. El método conforme a la reivindicación 44, donde la parte de la planta de Jamaica

que se emplea son los cálices.

44. Una solución con actividad antimiofeobiana para desinfectar y/o preservar cilantro
(Coriandrum sativum), caracterizada porque comprende-

a) Extracto metanólico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa);

b) Una colección de fracciones cromatográficas obtenida de un extracto metanólico
de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa);
c) Ácido acético;
d) Hipoclorito de Sodio;
e) Monooleato de Polioxietileno Sorbitart, o polisorbato 80 (Polisorbato 80)
45. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 44,
caracterizada porque el a) extracto metanólico de cálices de Jamaica (Hibiscus
sabdariffa) está presente en una concentración entre 0.01% al 10%.

46. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 44,

caracterizada porque la b) colección de fracciones cromatográficas obtenida de un
extracto metanólico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) está presente en
una concentración entre 0.01% al 10%.

47. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 44,

caracterizado porque el c) ácido acético está presente en una concentración entre
0.01 a 10%.

48. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 44,

caracterizado porque el d) hipoclorito de sodio está presente en una concentración
entre 10 a 1000 ppm.

49. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 44,

caracterizado porque el e) monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80
está presente en una concentración entre 0.1 a 10 % .

50. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 44,

caracterizada porque el f) extracto metanólico de cálices de Jamaica (Hibiscus

sabdariffa) presenta un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) como se
observa en la Figura 1.

51. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 44,

caracterizada porque la g) colección de fracción cromatográfica obtenida de un
extracto metanólico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) presenta un
espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) como se observa en la Figura 3 .

52. La solución de la reivindicación 44, caracterizada porque tiene una presentación

como formulación acuosa.

53. La solución de la reivindicación 44 de conformidad con las reivindicaciones
anteriores, caracterizada porque donde una o varias partes de Jamaica (Hibiscus
sabdariffá) pueden ser usadas para la obtención del extracto metanólico.

54. La solución de la reivindicación 44 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizada porque donde una o varias partes de Jamaica (Hibiscus
sabdariffá) pueden ser usadas para la obtención de las colecciones de fracciones
cromatográficas de un extracto metanólico.

55. La solución de la reivindicación 44 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, donde la parte de la planta de Jamaica que se emplea para obtener los
extractos y las colecciones de fracciones son los cálices.

56. La solución de la reivindicación 44 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizada por un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN)
del extracto metanólico obtenido de los cálices de la Jamaica (Hibiscus sabdariffá)
(Figura 1).

57. La solución de la reivindicación 44 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizada por un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN)
de la colección de fracciones cromatográficas obtenida de urrextractcr metanólico
de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffá) (Figura 3);

58. La solución de la reivindicación 44 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizada porque es útil como desinfectante y co tó to
alimentos de origen vegetal y animal.

59. La solución de la reivindicación 44 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizada porque la formulación acuosa es útil como desinfectante y

conservador de frutas y verduras, especialmente cilantro.

60. La solución de la reivindicación 44 de conformidad con las reivindicaciones

anteriores, caracterizada porque las principales variedades de cilantro (Coriandrum
 sativum) sobre las que actúa como desinfectante se seleccionan de sativum,
microcarpum y vulgare Alef.

61. Un método para la desinfección y/o preservación de cilantro (Coriandrum sativum),

caracterizado porque comprende aplicar al cilantro la solución definida e n las
reivindicaciones de la 44 a la 60.

62. Un extracto vegetal con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar
cilantro (Coriandrum sativum), caracterizado por las reivindicaciones de la 19 a la
30.

63. Una colección de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana para

desinfectar y/o preservar cilantro (Coriandrum sativum), caracterizada porque es
obtenido mediante las siguientes etapas:

a) Colocar la planta seca e n un recipiente en condiciones asépticas, añadir

metanol y almacenar a 22° ± 2 o C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar la acetona del extracto,
c) Recuperar el extracto seco,
d) Efectuar cromatografía para separar e l extracto acetóníco seco en fracciones
cromatográficas utilizando solventes-- y - mezclas de solventes de diferentes
polaridades,
e) Recuperar e n recipientes fracciones cromatográficas de diferentes polaridades,
f) Retirar el solvente de las fra ne s,
g) Agrupar o reunir en recipienteSssías fracciones para formar grupos (colecciones)
de polaridades iguales o semejantes,
h) Efectuar ensayos microbiológicos^eafrlas colecciones,
i) Recuperar las colecciones de fracciones con actividad antimicrobiana

64. La colección de fracciones cromatográficas de conformidad con la reivindicación

63, porque donde una o varias partes de la planta pueden ser usadas para la
obtención de la colección de fracciones cromatográficas.
65. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 63 de conformidad

con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la planta es la Jamaica

(Hibiscus sabdariffa).

66. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 63 de conformidad

con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las fracciones son
obtenidas de los cálices de la Jamaica.

67. La colección de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana de la

reivindicación 63 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada
porque la colección de fracciones presenta un espectro de resonancia magnética
nuclear (RMN) como se observa en la Figura 3 .

68. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 63 de conformidad

con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es útil como desinfectante
y conservador de alimentos de origen animal y vegetal.

69. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 63 de conformidad

con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es útil como desinfectante

y conservador de frutas y verduras, preferentemente cilantro.

70. La colección de fracciones cromatográficas con actividad arifimicrobiana de

conformidad con la reivindicación 63 de conformidad con las reivindicaciones
anteriores, caracterizada porque las principales variedades de cilantro (Coriandrum
sativum) sobre las que actúa como desinfectante se seleccionan de sativum,
microcarpum y vulgare Alef.

71. El método para desinfectar y/o conservar frutas y verduras, preferentemente

cilantro con la colección de fracciones cromatográficas con actividad
antimicrobiana del extracto de los cálices de Jamaica definida en las reivindicación
de la 63 a la 70.
72. Un método para obtener colecciones de fracciones cromatográficas con actividad
antimicrobiana a partir de un extracto vegetal para desinfectar y/o preservar cilantro
(Coriandrum sativum), caracterizado porque comprende las siguiente etapas:

a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir

acetona y almacenar a 22° ± 2 o C por 7 días,
b) Pasar e l extracto por un tamiz y retirar la acetona del extracto,
c) Recuperar el extracto seco,
d) Efectuar cromatografía para separar e l extracto acetónico seco en fracciones
cromatográficas utilizando solventes y mezclas de solventes de diferentes
polaridades,
e) Recuperar en recipientes fracciones cromatográficas de diferentes polaridades,
f) Retirar el solvente de las fracciones,
g) Agrupar o reunir en recipientes las fracciones para formar grupos (colecciones)
de polaridades iguales o semejantes,
h) Efectuar ensayos microbiológicos con las colecciones,
i) Recuperar las colecciones de fracciones con actividad antimicrobiana.

73. El método conforme a la reivindicación 72, caracterizado porque las colecciones de

fracciones puede tener una presentación sólida o liquida.

74. Un método para la preparación de una solución con actividad antimicrobiana para
desinfectar y/o preservar cilantro (Coriandrum sativum), caracterizado por
comprender los pasos de:

a) Colocar la planta de Jamaica {Hibiscus sabdariffa) seca en un recipiente en

condiciones asépticas, añadir metanol y almacenar a 22° ± 2 o C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar el metanol del extracto, y
c) Recuperar e l extracto metanólico seco.
d) Colocar planta de Jamaica seca en un recipiente en condiciones asépticas,
añadir acetona y almacenar a 22° ± 2° C por 7 días,
e) Pasar el extracto por un tamiz y retirar la acetona del extracto,
f) Recuperar el extracto acetónico seco,
g) Efectuar cromatografía para separar e l extracto acetónico seco en fracciones
cromatográficas utilizando solventes y mezclas de solventes de diferentes
polaridades,
h) Recuperar e n recipientes fracciones cromatográficas de diferentes polaridades,
i) Retirar e l solvente de las fracciones,
j) Agrupar o reunir en recipientes las fracciones para formar grupos (colecciones)
de polaridades iguales o semejantes,
k) Efectuar ensayos microbiológicos con las colecciones,
I) Recuperar las colecciones de fracciones con actividad antimicrobiana,
m) Preparar la solución acuosa en un recipiente conteniendo: agua, extracto
metanóüco seco de Jamaica, una colecciones de fracciones cromatográficas
con actividad antimicrobiana proveniente del extracto acetónico seco de
Jamaica, ácido acético, hipoclorito de sodio y monooleato de Polioxietileno
Sorbitan o polisorbato 80.

El método conforme a la reivindicación 74, donde la parte de la planta de Jamaica

que se emplea son los cálices.

A . CLASSIFICATION OF SUBJECT MATTER

See extra sheet

According to International Patent Classification (IPC) or to both national classification and IPC
B . FIELDS SEARCHED

Mínimum documentation searched (classification system followed by classification symbols)

A23L

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EPODOC, INVENES, WPI, X-FULL, NPL, CAPLUS, FSTA, AGRICOLA, CABA, SCISEARCH
C . DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT

Category* Citation of document, wi h indication, where appropriate, of the relevant passages Relevant to claim No.

A US 2010323046 Al (ROLLAND, Y., DUVAL, C.) 1-5, 10-12, 15, 16,

23.12.2010, page 1, [0003]; page 2, [0040], [0041]; 22-26, 34, 44-46,
page 3, Examples 1) c). 52, 62, 65, 66

A KANG P S, SEOK J H, KIM Y H, EUN J S, OH S H . 1-5, 10-12, 15, 16,

Antimicrobial and antioxidativa effects of Roselle 22-26, 34, 44-46,
(Hibiscus sabdariffa L.) flower extract and its fractions 52, 62, 65, 66
on skin microorganisms and oxidation. Food Science and
Biotechnology, 2007; Vol. 16, n° 3, pages 409-414.
ISSN 1226-7708

IFurfher documents are listed in the continuation of Box C . patent family annex.

* Special categories of cited documents:
"A" document defining the general state of the art which is not
considered to be of particular relevance.
"E" earlier document but published on or after the international
filing date
"L" document which may fhrow doubts on priority claim(s) or
which is cited to establish the publication date of another
citation or other special reason (as specified)
"O" document referring to an oral disclosure use, exhibition, or
other means.
"P" document published prior to the international filing date but
later than the priority date claimed
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9 April 2015 (09.04.2015)
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later document published after the international filing date or
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to understand the principie or fheory underlying the
invention
document of particular relevance; the claimed invention
cannot be considered novel or cannot be considered to
involve an inventive step when the document is taken alone
document of particular relevance; the claimed invention
cannot be considered to involve an inventive step when the
document is combined with one or more other documents ,
such combination being obvious to a person skilled in the art
document member of the same patent family
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(10/04/2015)
Authorized officer
A . Sukhwani
Telephone No. 9 1 3495473
C (continuation). DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Category Citation of documents, with indication, where appropriate, of the relevant passages Relevant to claim No.

Y MORALES-CABRERA M, HERNANDEZ-MORALES J, 22 - 26, 62

LEYVA-RUELAS G, SALINAS-MORENO Y,
SOTO-ROJAS L, CASTRO-ROSAS J . Influence of variety
and extraction solvent on antibacterial activity of roselle
{Hibiscus sabdariffa L.) calyxes. Journal of Medicinal
Plants Research, August 2013, Vol. 7, n° 31, pages 2319-2322.
ISSN: 1996-0875. Doi: 10.5897/JMPRI2.1242.
Available on the Internet: <URL:
http://www.academicjournals.org/JMPR/abstracts/abstracts/
abstracts2013/17Aug/Morales-Cabrera%20et%20al.htm

Y FULLERTON M, KHATIWADA J, JOHNSON J . U, DAVIS 22 - 26, 62

S ; WILLIAMS L . L . Determination of antimicrobial
activity of sorrel (Hibiscus sabdariffa) on Escherichia coli
0157:H7 isolated from food, veterinary, and clinical samples.
Journal of Medicinal Food, 2011, Vol. 14, n° 9, pages 950-956.
ISSN: 1096-620X. Doi: 10.1089/jmf.20 10.0200

A OLALEYE, M . T. Cytotoxicity and antibacterial activity of 22 - 24, 62

Methanolic extract of Hibiscus sabdariffa. Journal of Medicinal
Plants Research, 2007; Vol. 1, n° 1, pages 009-013.
ISSN 1996-0875. Retrieved from the Internet: <URL:
http://academicjournals.org/article/articlel380372687_Olaleye.pdf

A JP H0646812 A (NISHIYAMA HITOSHI; YAMAMOTO 1, 4, 5, 44, 47, 48

KAZUFUMI) 22.02.1994, Abstract; [0006], [0007],
[0016]-[0018]; claim 1

Form PCT/ISA/210 (continuation of second sheet) (July 2009)

 n erna ona app ca on
PCT/MX2014/000195

Box No. II Observations where certain claims were found iinsearchable ( C ontinuation of item 2 of flrst sheet)

This intemational search report has not been established in respect of certain claims under Article 17(2 )(a) for the folio wing reasons:

Claims Nos.:
because tliey relate to subject matter not required to be searched by this Authority, naniely :

Claims Nos.: 19-21 , 29-32, 40, 4 1 , 63, 64, 72, 73

because they relate to parís of the intemational application that do not comply with the prescribed requirements to such an
extent that no meaningful intemational search can be carried out, specifically:
Claims 19-21 , 29-32, 40, 4 1 , 63, 64, 72 and 73 lack clarity (PCT Article 6) because they
relate to a plant extract or solution with antimicrobial activity or to a method for
obtaining an extract, which in all three cases are not defined or characterised
technically, for which reason it is not possible to carry out a meaningful search.
Claims Nos.:
because they are dependent claims and are not drafted in accordance with the second and third sentences of Rule 6.4(a).

Boi No. III Observations where un t of invention is lacking ( o ti atio of item 3 of first sheet)

This Intemational Searching Authority found múltiple inventions in this intemational application, as follows:

The patent application lacks unity of invention because it comprises 2 inventions:

Invention 1: Solution with antimicrobial activity comprising a methanolic extract and a
collection of acetonic extract fractions of calyxes of Hibiscus sabdariffa (claims 1-18,
22-28, 33-39, 42 and 43).
Invention 2 : Solution with antimicrobial activity comprising a methanolic extract and a
collection of methanolic extract fractions of calyxes of Hibiscus sabdariffa (claims 44-62,
65-71 , 74 and 75).

As all required additional search fees were timely paid by the applicant, this mternational search report covers all searchable
claims.

As all searchable claims could be searched without efíbrt justifying additional fees, this Authority did not invite payment of
additional fees.

As only some of the required additional search fees were timely paid by the applicant, this intemational search report covers
only those claims for which fees were paid, specifically claims Nos.:

No required additional search fees were timely paid by the applicant. Consequently, this intemational search report is
restricted to the invention first mentioned in the claims; it is covered by claims Nos. :

The additional search fees were accompanied by the applicant' s protest and, where applicable, the
payment of a protest fee.
The additional search fees were accompanied by the applicant' s protest but the applicable protest
fee was not paid within the time limit specified in the invitation.
No protest accompanied the payment of additional search fees.

Form PCT/ISA/210 (continuation of first sheet (2)) (January 2015)

 Information on patent family members

Patent document cited Publication Patent family Publication

in he search report date member(s) date

US20 10323046 Al 23.12.2010 JP2010526125 A 29.07.2010

EP2144619 Al 20.01.2010
WO2008 148995 Al 11.12.2008
FR2915899 Al 14.11.2008
FR2915899 B 1 21.09.2012

JPH0646812 A 22.02.1994 NONE

Form PCT/ISA/210 (patent family annex) (July 2009)

 .

PCT/MX2014/000195

CLASSIFICATION OF SUBJECT MATTER

A23L3/3472 (2006.01)
A23L3/3508 (2006.01)
A23L3/358 (2006.01)

Form PCT/ISA/210 (extra sheet) (July 2009)

A . CLASIFICACIÓN DEL OBJETO DE LA SOLICITUD
Ver Hoja Adicional

De acuerdo con la Clasificación Internacional de Patentes (CIP) o según la clasificación nacional y CIP.
B . SECTORES COMPRENDIDOS POR LA BÚSQUEDA

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

A23L

Otra documentación consultada, además de la documentación mínima, en la medida en que tales documentos formen parte de los sectores
comprendidos por la búsqueda

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda internacional (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de
búsqueda utilizados)
EPODOC, INVENES, WPI, X-FULL, NPL, CAPLUS, FSTA, AGRICOLA, CABA, SCISEARCH
C . DOCUMENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES
Relevante para las
Categoría* Documentos citados, con indicación, si procede, de las partes relevantes reivindicaciones n°

A US 2010323046 Al (ROLLAND, Y., DUVAL, C.) 23.12.2010, 1-5, 10-12, 15, 16,
página 1, [0003]; página 2, [0040], [0041]; 22-26, 34, 44-46,
página 3, Ejemplos 1) c). 52, 62, 65, 66

A KANG P S, SEOK J H, KIM Y H, EUN J S, OH S H . 1-5, 10-12, 15, 16,

Antimicrobial and antioxidativa effects of Roselle 22-26, 34, 44-46,
(Hibiscus sabdariffa L.) flower extract and its fractions 52, 62, 65, 66
on skin microorganisms and oxidation.
Food Science and Biotechnology, 2007; Vol. 16, n° 3,
páginas 409-414. ISSN 1226-7708

IHI En la continuación del recuadro C se relacionan otros documentos IHI Los documentos de familias de patentes se indican en el

* Categorías especiales de documentos citados: "T"
"A" documento que define el estado general de la técnica no
considerado como particularmente relevante.
"E" solicitud de patente o patente anterior pero publicada en la
fecha de presentación internacional o en fecha posterior.
"L" documento que puede plantear dudas sobre una reivindicación
de prioridad o que se cita para determinar la fecha de
publicación de otra cita o por una razón especial (como la
indicada).
"O" documento que se refiere a una divulgación oral, a una Ύ "
utilización, a una exposición o a cualquier otro medio.
"P" documento publicado antes de la fecha de presentación
internacional pero con posterioridad a la fecha de prioridad
reivindicada.
"¿fe"
Fecha en que se ha concluido efectivamente la búsqueda internacional.
9 Abril 2015 (09.04.2015)
Nombre y dirección postal de la Administración encargada de la
búsqueda internacional
OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS
Paseo de la Castellana, 75 - 28071 Madrid (España)
N° de fax: 9 1 349 53 04
Formulario PCT/ISA/210 (segunda hoja) (Julio 2009)
documento ulterior publicado con posterioridad a la fecha de
presentación internacional o de prioridad que no pertenece al
estado de la técnica pertinente pero que se cita por permitir
la comprensión del principio o teoría que constituye la base
de la invención.
documento particularmente relevante; la invención
reivindicada no puede considerarse nueva o que implique
una actividad inventiva por referencia al documento
aisladamente considerado.
documento particularmente relevante; la invención
reivindicada no puede considerarse que implique una
actividad inventiva cuando el documento se asocia a otro u
otros documentos de la misma naturaleza, cuya combinación
resulta evidente para un experto en la materia
documento que forma parte de la misma familia de patentes.
Fecha de expedición del informe de búsqueda internacional.
10-ABRIL-2015 (10/04/2015)
Funcionario autorizado
A . Sukhwani
N° de teléfono 9 1 3495473
C (Continuación). DOCUMENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES
Categoría Relevante para las
* Documentos citados, con indicación, si procede, de las partes relevantes
reivindicaciones n°

Y MORALES-CABRERA M, HERNANDEZ-MORALES J, 22 - 26, 62

LEYVA-RUELAS G, SALINAS-MORENO Y,
SOTO-ROJAS L, CASTRO-ROSAS J .
Influence of variety and extraction solvent on antibacterial
activity of roselle {Hibiscus sabdariffa L.) calyxes.
Journal of Medicinal Plants Research, Agosto 2013,
Vol. 7, n° 31, páginas 2319-2322. ISSN: 1996-0875.
Doi: 10.5897/JMPRI2.1242. Disponible en Internet: <URL:
http://www.academicjournals.org/JMPR/abstracts/abstracts/
abstracts2013/17Aug/Morales-Cabrera%20et%20al.htm

Y FULLERTON M, KHATIWADA J, JOHNSON J . U, DAVIS 22 - 26, 62

S ; WILLIAMS L . L . Determination of antimicrobial
activity of sorrel (Hibiscus sabdariffa) on Escherichia coli
0157:H7 isolated from food, veterinary, and clinical samples.
Journal of Medicinal Food, 201 1, Vol. 14, n° 9, páginas
950-956. ISSN: 1096-620X. Doi: 10.1089/jmf.2010.0200

A OLALEYE, M . T. Cytotoxicity and antibacterial activity of 22 - 24, 62

Methanolic extract of Hibiscus sabdariffa. Journal of Medicinal
Plants Research, 2007; Vol. 1, n° 1, páginas 009-013.
ISSN 1996-0875. Recuperado de Internet: <URL:
http://academicjournals.org/article/articlel380372687_Olaleye.pdf

A JP H0646812 A (NISHIYAMA HITOSHI; YAMAMOTO 1, 4, 5, 44, 47, 48

KAZUFUMI) 22.02.1994, resumen; [0006], [0007],
[0016]-[0018]; reivindicación 1

Formulario PCT/ISA/210 (continuación de la segunda hoja) (Julio 2009)

Recuadro II Observaciones cuando se estime que algunas reivindicaciones no pueden ser objeto de búsqueda (continuación
del punto 2 de la primera hoja)

Este informe de búsqueda internacional no se ha realizado en relación a ciertas reivindicaciones según el artículo 17.2.a) por los siguientes
motivos:

1. Las reivindicaciones n s :
se refieren a un objeto con respecto al cual esta Administración no está obligada a proceder a la búsqueda, a saber:

2 . I I Las reivindicaciones n s : 9-21 , 29-32, 40, 4 1 , 63, 64, 72, 73

se refieren a elementos de la solicitud internacional que no cumplen con los requisitos establecidos, de tal modo que no pueda
efectuarse una búsqueda provechosa, concretamente:

Las reivindicaciones 19-21 , 29-32, 40, 4 1 , 63, 64, 72, 73 presentan falta de claridad (artículo 6 del PCT)
puesto que se refieren a un extracto vegetal o a una solución con actividad antimicrobiana o a un método para
obtener un extracto, en los tres casos no definidos n i caracterizados técnicamente por lo que no puede
efectuarse una búsqueda provechosa.

3. Las reivindicaciones n s :
son reivindicaciones dependientes y no están redactadas de conformidad con los párrafos segundo y tercero de la regla 6.4(a).

Recuadro III Observaciones cuando falta unidad de invención (continuación del punto 3 de la primera hoja)
La Administración encargada de la Búsqueda Internacional ha detectado varias invenciones en la presente solicitud internacional, a saber:

La solicitud de patente no tiene Unidad de Invención ya que comprende 2 invenciones:

1 invención : Solución con actividad antimicrobiana que comprende extracto metanólico y colección de
fracciones de extracto acetónico de cálices de Hibiscus sabdariffa (reivindicaciones 1- 1 8, 22-28, 33-39, 42,
43).
2a invención : Solución con actividad antimicrobiana que comprende extracto metanólico y colección de
fracciones de extracto metanólico de cálices de Hibiscus sabdariffa (reivindicaciones 44-62, 65-71 , 74, 75).

1. Dado que todas las tasas adicionales requeridas han sido satisfechas por el solicitante dentro del plazo, el presente informe de
búsqueda de tipo internacional comprende todas las reivindicaciones que pueden ser objeto de búsqueda.

2 . IHI Dado que todas las reivindicaciones que pueden ser objeto de búsqueda podrían serlo sin realizar un esfuerzo que justifique tasas
adicionales, esta Administración no requirió el pago de tasas adicionales.

3. Dado que tan sólo una parte de las tasas adicionales requeridas ha sido satisfecha dentro del plazo por el solicitante, el presente
informe de búsqueda de tipo internacional comprende solamente aquellas reivindicaciones respecto de las cuales han sido
satisfechas las tasas, concretamente las reivindicaciones n s :

4. □ Ninguna de las tasas adicionales requeridas ha sido satisfecha por el solicitante dentro de plazo. En consecuencia, el presente
informe de búsqueda de tipo internacional se limita a la invención mencionada en primer término en las reivindicaciones, cubierta
por las reivindicaciones n s :

Indicación en cuanto a la protesta Se acompañó a las tasas adicionales la protesta del solicitante y, en su caso,
el pago de una tasa de protesta.
Se acompañó a las tasas adicionales la protesta del solicitante, pero la tasa de protesta
aplicable no se pagó en el plazo establecido para ello.
El pago de las tasas adicionales no ha sido acompañado de ninguna protesta.
Formulario PCT/ISA/210 (continuación de la primera hoja (2)) (Julio 2009)
 Informaciones relativas a los miembros de familias de patentes

Documento de patente citado Fecha de Miembro(s) de la Fecha de

en el informe de búsqueda Publicación familia de patentes Publicación

US20 10323046 Al 23.12.2010 JP2010526125 A 29.07.2010

EP2144619 Al 20.01.2010
WO2008 148995 Al 11.12.2008
FR2915899 Al 14.11.2008
FR2915899 B 1 21.09.2012

JPH0646812 A 22.02.1994 NINGUNO

PCT/ISA/210 (Anexo - familias de patentes) (Julio 2009)

 CLASIFICACIONES DE INVENCIÓN
A23L3/3472 (2006.01)
A23L3/3508 (2006.01)
A23L3/358 (2006.01)

Formulario PCT/ISA/210 (hoja adicional) (Julio 2009)