SIGNIFICADO CLÍNICO
A bilirrubina é o produto final da degradação da
hemoglobina. Como esse processo ocorre nas células
hepáticas, níveis alterados de bilirrubina indicam
alterações hepatocelulares, obstrução biliar ou icterícia
hemolítica.
A hiperbilirrubinemia ocorre nas seguintes condições:
no recém nascido, podendo atingir 12mg/dL, na icterícia
obstrutiva, na icterícia hepatocelular (parenquinatosa),
nas hepatites por vírus e na necrose hepática aguda,
havendo predominância da bilirrubina direta (BD).
As icterícias por hemólise são secundárias à anemia
hemolítica, hemoglobinúria paroxística, policitemia,
malária, transfusão de sangue incompatível e anemia
hemolítica do recém nascido (eritroblastose fetal).
Nessas situações a BD está pouco elevada, havendo
nítida predominância da bilirrubina indireta (BI).
A determinação da bilirrubina no líquido amniótico é
de importância fundamental no diagnóstico pré natal
da enfermidade hemolítica. Valores menores que 0,1
mg/dL são considerados normais, enquanto que valores
entre 0,1 e 0,27mg/dL são encontrados somente em
presença de eritroblastose fetal.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
Foram realizados 44 testes em amostras cujo teor de
bilirrubina se situava no intervalo de 0,45 a 23mg/dL.
Esses ensaios foram realizados em paralelo com uma
metodologia de referência. A comparação do kit de
Bilirrubina Doles (Y) com a metodologia mencionada
(X) deu origem à seguinte equação de regressão linear:
Y= 0,30 + 1,01X, sendo o coeficiente de correlação
0,99.
Testes de recuperação mostraram índice de
recuperação equivalente a 97 ± 3,5%.
O erro da média foi de 1,96%.
Repetitividade: foram realizadas 20 dosagens
sucessivas, com 2 amostras, obtendo-se os seguintes
resultados:
Amostra 1 Amostra 2
Concentração (mg/dL) 1,21 16,00
Desvio padrão 0,06 0,32
Coeficiente de variação (%) 4,96 2,00
Reprodutibilidade: foram realizadas 20 dosagens,
durante 20 dias consecutivos, obtendo-se os seguintes
resultados:
Amostra 1 Amostra 2
Concentração (mg/dL) 1,21 17,90
Desvio padrão 0,06 0,54
Coeficiente de variação (%) 4,96 3,01
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Especificidade: A metodologia de Sims-Horn é
específica para determinação de bilirrubina, sendo a
mesma detectada em baixas concentrações.
Sensibilidade: a absorvância encontrada, de 0,005,
corresponde a 0,125mg/dL de bilirrubina direta e a
absorvância encontrada, de 0,010, corresponde a
0,25mg/dL de bilirrubina total, quando realizados os
testes em espectrofotômetro, a 530nm. A sensibilidade
do sistema está diretamente relacionada com a do
aparelho utilizado no laboratório.
Diluição da matriz: estudos sucessivos de diluição
da matriz mostraram que não há interferência na
sensibilidade diagnóstica da presente metodologia de
Sims-Horn.
Substâncias interferentes: a dosagem de bilirrubina
total em plasma contendo EDTA apresenta resultados
elevados. O EDTA existente no plasma reage com
Benzoato de Sódio, com formação de Ácido Benzóico.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
• Jendrassik, L., e Grof, P.: Biochem. Z.297,81, 1938.
• Sims, F.H., Horn, C.: Am.J. Clin. Path.29: 412, 1958.
• Malloy, H.T. e Evelyn, K.A., J.: Biol. Chem. 119, 481,
1973.
• Tibúrcio, H.M.: Controle Interno da Qualidade
Analítica, 1aed. março/1995.
• Henry, J.B.: Clinical Diagnosis and Management by
Laboratory Methods, 19a ed, 258-260, 1996.
• BURTIS, Carla., ASHWOOD, Edward R. Tiez Textbook
of Clinical Chemistriz. 3a ed. Philadelphia: Saunder,
1999.p.1133-1136.
• Doles: dados de arquivo.
TERMOS E CONDIÇÕES DE GARANTIA DA
QUALIDADE DO PRODUTO
As garantias do fabricante ao consumidor seguem
estritamente as relacionadas na Lei no 8.078, de 11 de
setembro de 1.990 - Código de Defesa do Consumidor.
Os reagentes que compõem este sistema para
diagnóstico são garantidos na sua performance,
reprodutibilidade e qualidade até a data de vencimento.
Os produtos que apresentarem problemas
técnicos comprovados serão substituídos, sem
ônus para o consumidor.
Doles Reag. Equip. para Laboratórios Ltda.
CNPJ: 01.085.513/0001-05
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Revisão: 19 (11/2018)
BILIRRUBINA BIOQUÍMICA CLÍNICA
FINALIDADE • Pipetas semiautomáticas 50µL ou 200µL.
Sistema colorimétrico para determinação das • Ponteiras descartáveis.
bilirrubinas no soro ou plasma. • Água destilada ou deionizada.
Somente para uso diagnóstico in vitro. • Cronômetro.
PRINCÍPIO
A bilirrubina presente no soro é constituida por 4 ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE DOS
frações: REAGENTES DE USO
Bilirrubina livre não conjugada - α bilirrubina; Solução aceleradora: armazenar à temperatura de
Bilirrubina monoconjugada - β bilirrubina;
Bilirrubina diconjugada - γ bilirrubina; 20-30oC. Estável até a data de vencimento indicada
Bilirrubina ligada covalentemente à albumina - no rótulo do frasco, obedecidas as condições de
δ bilirrubina. armazenamento.
As frações β, γ e δ são hidrossolúveis e reagem
Reagente sulfanílico: armazenar à temperatura de
diretamente com o diazo reagente e são chamadas no
20-30oC. Estável até a data de vencimento indicada
conjunto de bilirrubina direta.
no rótulo do frasco, obedecidas as condições de
A fração α da bilirrubina é insolúvel na água. Sua
solubilidade é alcançada com aditivos (cafeina, álcool,armazenamento.
cetrimide, etc) chamados de aceleradores e representa Nitrito de Sódio: armazenar à temperatura de 20-
o que se chama de bilirrubina indireta. 30oC. Estável até a data de vencimento indicada
A bilirrubina dosada na presença de solução aceleradora
é chamada de bilirrubina total pois representa a soma no rótulo do frasco, obedecidas as condições de
das bilirrubinas direta e indireta. armazenamento.
Solução padrão: na forma liofilizada, armazenar
PARTICULARIDADES DO SISTEMA à temperatura de 20-30oC. Estável até a data de
Bilirrubina Doles é uma modificação da técnica de
vencimento indicada no rótulo do frasco.
Sims-Horn permitindo a determinação da bilirrubina
total e frações em apenas 3 minutos. Os reagentes são
todos estáveis à temperatura ambiente. A simplicidade CUIDADOS E PRECAUÇÕES COM O USO DOS
da técnica permite que o diazo-reagente seja preparado REAGENTES
dentro do próprio tubo de reação, através de um Todos os reagentes são somente para uso diagnóstico
sistema de conta gotas.
in vitro. Seu manuseio deve ser cuidadoso, evitando-
METODOLOGIA se o contato com pele e mucosas. Em caso de
Sims-Horn contaminação acidental, lavar a área afetada em água
corrente. O descarte do material utilizado deverá ser
REAGENTES
Solução aceleradora: solução de Benzoato de Cafeína feito obedecendo-se aos critérios de biossegurança
tamponada. Contém por litro: Benzoato de Sódio 0,13M estabelecidos pelo laboratório, de acordo com as
e Cafeína 0,13M. normas locais, estaduais ou federais.
Reagente sulfanílico: solução de Ácido Sulfanílico
0,04M em Ácido Clorídrico 0,45M. Observar ainda a simbologia
Nitrito de Sódio: cada frasco contém 0,45mmol de
constante nos rótulos do produto:
Nitrito de Sódio. Corrosivo Irritante
Solução padrão: cada lote contém concentrações
variáveis de cloreto de Naftiletilenodiamino em meio AMOSTRA
a substâncias inertes. Uma solução 0,789mmol de Soro ou plasma (colhido com heparina), isento de
Naftiletilenodiamino frente ao diazo-reagente gera
uma coloração equivalente à aquela desenvolvida por hemólise e lipemia. Até a realização do teste, o soro
solução de bilirrubina 10mg/dL em meio proteico, deve ser mantido refrigerado e ao abrigo da luz.
segundo Sims-Horn. A concentração do padrão Se protegida da luz, a bilirrubina permanece estável por
varia de lote a lote entre 8 e 12mg/dL. (Vide rótulo 3 dias, entre 2-8oC, e por 3 meses a 10oC negativos.
do frasco).
Todas as amostras biológicas devem ser
APRESENTAÇÃO consideradas como sendo potencialmente
Solução aceleradora 1 x 210mL infectantes.
Reagente sulfanílico 2 x 32mL
Nitrito de Sódio 1 x 21mL
Solução padrão (após reconstituição) 1 x 5mL PROCEDIMENTO TÉCNICO
Solução padrão: reconstituir a solução pela adição
NÚMERO DE TESTES de 5mL de água destilada e agitar. Após 10 minutos,
Técnica Macro - 104 testes
a solução está pronta para uso. Estável por 8 dias, se
Técnica Micro - 208 testes
armazenada entre 2-8oC.
EQUIPAMENTOS E MATERIAIS NECESSÁRIOS
NÃO FORNECIDOS DETERMINAÇÃO DO FATOR (F)
• Espectrofotômetro ou fotocolorímetro capaz de medir Como a diluição do soro é diferente nas técnicas
a absorvância em 530nm ou filtro verde.
macro e micro, faz-se necessária a determinação
• Tubos de ensaio.
• Pipetas graduadas. de um fator para cada modalidade.
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TÉCNICA MACRO Obtendo-se valores mais elevados, dilui-se a amostra • A ordem de adição dos reagentes é de fundamental A literatura relata que a bilirrubina α possui uma
Rotular 3 tubos de ensaio de P (padrão) e adicionar com solução fisiológica e procede-se à nova dosagem. importância para a obtenção de resultados estrutura conformacional chamada trans. Na
a cada um: Multiplicar o valor encontrado pelo fator de diluição. satisfatórios. A alteração da adição dos reagentes presença de luz a conformação desta molécula
• O kit de Bilirrubina Doles possui padrão no compromete a formação do diazo-reagente muda de trans para cis (posição que torna a
Nitrito de Sódio 2 gotas intervalo de linearidade da metodologia de tendo como consequência resultados falsamente bilirrubina hidrossolúvel). Nestas condições, porções
Sims-Horn. O laboratório deve realizar o ensaio diminuídos. de bilirrubina indireta, solubilizadas, reagem de
Reagente sulfanílico 4 gotas com o padrão que acompanha o kit e calcular • No gotejamento dos reagentes nitrito de sódio e maneira idêntica à bilirrubina direta.
seu fator de calibração (F), de acordo com o sulfanílico, o frasco deve ser mantido na posição Em pacientes anictéricos pode haver um aumento
Água destilada 4 mL exemplo acima. vertical, afim de se evitar que a gota caia pelas artificial da bilirrubina direta, tendo resultados finais
• A concentração do padrão é variável de lote paredes do tubo, o que levará ao comprometimento de bilirrubina direta próxima ou até superior a total.
Solução Padrão 200µL a lote. O fator deve ser refeito a cada lote do da formação do diazo-reagente. • Amostras com teor de Triglicérides maior de 200mg/
produto. dL produzem resultados falsamente diminuidos.
Misturar, deixar repousar por 3 minutos e ler os tubos Identificar 3 tubos de ensaio com B (branco), BD • Amostras com teor de Hemoglobina acima de 30
P, zerando o aparelho com água destilada, em DETERMINAÇÃO DA AMOSTRA (bilirrubina direta), BT (bilirrubina total). mg/dL produzem resultados falsamente elevados
530nm ou filtro verde. na Bilirrubina total e falsamente diminuidos na
TÉCNICA MACRO Proceder como segue: determinação da Bilirrubina direta.
TÉCNICA MICRO Antes de iniciar as dosagens, ler atentamente os • Avaliação da concentração de Hemoglobina em
Rotular 3 tubos de ensaio de P (padrão) e adicionar itens a seguir: B BD BT uma amostra hemolisada (estimativa):
a cada um: • A ordem de adição dos reagentes é de fundamental 1- Adicionar 50µL da amostra em 2,0mL de
importância para a obtenção de resultados Nitrito de Sódio - 1 gota 1 gota solução fisiológica.
satisfatórios. A alteração da adição dos reagentes 2-Ler a absorvância em 405nm. Zerar o aparelho
Nitrito de Sódio 1 gota compromete a formação do diazo-reagente tendo com água.
Reagente sulfanílico 2 gotas 2 gotas 2 gotas
como consequência resultados falsamente diminuídos.
Reagente sulfanílico 2 gotas • No gotejamento dos reagentes nitrito de sódio e Hb (mg/dL) Absorvância x 601
Água destilada 2 mL 2 mL - 405
sulfanílico, o frasco deve ser mantido na posição
Água destilada 2 mL vertical, afim de se evitar que a gota caia pelas Solução aceleradora - - 2 mL • A bilirrubina é extremamente fotossensível,
paredes do tubo, o que levará ao comprometimento devendo o soro ser mantido ao abrigo da luz e
Solução Padrão 50µL
da formação do diazo-reagente. Amostra 50µL 50µL 50µL refrigerado.
• O uso de plasma cujo sangue foi colhido com
Misturar, deixar repousar por 3 minutos e ler os tubos Identificar 3 tubos de ensaio com B (branco), BD anticoagulante à base de EDTA é contra-indicado.
P, zerando o aparelho com água destilada, em (bilirrubina direta), BT (bilirrubina total). Misturar por agitação o conteúdo dos 3 tubos e deixar O sal EDTA reage com Benzoato de Sódio
530nm ou filtro verde. repousar por 3 minutos (20-30oC). Ler as absorvâncias formando-se Ácido Benzóico. Este, insolúvel,
Proceder como segue: de BD e BT, ajustando o zero do aparelho com o precipita-se e turva a solução. À leitura,
CÁLCULO DO FATOR respectivo branco em 530nm ou filtro verde. A cor no espectrofotômetro, teremos resultados
B BD BT final permanece estável por 30 minutos, à temperatura falsamente elevados.
concentração P de 20-30oC.
Fator (F) = Nitrito de Sódio - 2 gotas 2 gotas CONTROLE DA QUALIDADE DO SISTEMA
absorvância P CÁLCULO DA AMOSTRA
1. A limpeza e a secagem adequada do material a
Reagente sulfanílico 4 gotas 4 gotas 4 gotas ser utilizado são de fundamental importância para a
EXEMPLO: Bilirrubina total (mg/dL) = absorvância BT x F
estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados
Absorvância Padrão (P): 0,396; 0,394; 0,395 Água destilada 4 mL 4 mL - Bilirrubina direta (mg/dL) = absorvância BD x F
corretos. Resquícios de produtos de limpeza nos
Média aritmética: 0,395 Bilirrubina indireta (mg/dL) = BT - BD
tubos de ensaio podem ocasionar resultados
Solução aceleradora - - 4 mL falsamente elevados.
Concentração do Padrão (P): 9,4mg/dL Exemplo:
2. A água utilizada na limpeza do material, no preparo
Amostra 200µL 200µL 200µL dos reagentes e na dosagem, deve ser de boa qualidade.
9,4 BD: 0,010 BT:0,040
F= = 23,80 Bilirrubina total (mg/dL) = 0,040 x 25,31 = 1,01
3. Colunas deionizadoras saturadas liberam íons
Misturar por agitação o conteúdo dos 3 tubos e deixar diversos, aminas e agentes oxidantes, que deterioram
0,395 Bilirrubina direta (mg/dL) = 0,010 x 25,31 = 0,25
repousar por 3 minutos (20-30oC). Ler as absorvâncias os reagentes.
Bilirrubina indireta (mg/dL)= 1,01 - 0,25 = 0,76
de BD e BT, em espectrofotômetro ou fotocolorímetro, 4. As pipetagens devem ser precisas.
CURVA DE CALIBRAÇÃO
ajustando o zero do aparelho com o respectivo branco 5. O uso de soro controle de referência deve ser uma
Padrão Absorvância
Conc.
em 530nm ou filtro verde. A cor final permanece LIMITAÇÕES DO SISTEMA
(gm/dL) • Para se obter ótimo desempenho do sistema, prática rotineira do laboratório. Recomenda-se utilizar
estável por 30 minutos, à temperatura de 20-30oC. um soro controle com valor na faixa de normalidade
1 0.000 0 A sensibilidade do sistema está diretamente é necessário que o procedimento técnico seja
2 0.078 2 rigorosamente seguido conforme instruções de uso. (soro controle N - Doles) e outro soro controle de
relacionado com a sensibilidade do equipamento valor elevado (soro controle P - Doles).
3 0.198 5
de leitura. Qualquer alteração poderá levar a resultados errôneos.
4 0.395 10 • A bilirrubina indireta não é hidrossolúvel e para reagir 6. A sensibilidade do sistema está diretamente relacio-
5 0.590 15 com o diazo-reagente é necessário a adição de um nada com a sensibilidade do equipamento de leitura.
TÉCNICA MICRO
6 0.800 20 componente que a torne hidrossolúvel. A solução
Antes de iniciar as dosagens ler atentamente os
7 0.910 25
aceleradora torna a fração indireta hidrossolúvel, VALORES DE REFERÊNCIA
itens a seguir:
possibilitando a reação com o diazo-reagente. Além É recomendado que cada laboratório estabeleça sua
• Utilizar a técnica micro somente para dosagens
• A curva de calibração demonstra a linearidade da reação em amostras com bilirrubinas elevadas (amostras da aceleradora fatores interferentes podem torná-la própria faixa de valores de referência na população
até uma determinada concentração, na qual pode ser ictéricas). hidrossolúvel antes mesmo de proceder a reação, atendida.
determinado um fator de calibração (F),de acordo com a Lei Atenção! A técnica micro é inadequada para dosagem o que levaria neste caso uma BD alterada não por Como orientação sugerimos os seguintes valores:
de Beer. de bilirrubinas em amostras de soro com aspecto motivos biológicos. Os interferentes mais conhecidos Bilirrubina direta até 0,4mg/dL
• A reação é linear entre 0 e 20mg/dL (ver curva acima). físico normal. são luz e temperatura. Bilirrubina total até 1,2mg/dL

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