UNIVERSIDAD DEL VALLE NORMA: VERSIÓN:

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

FECHA DE REVISIÓN: 28-3-2016

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS II

ELABORADO POR: REVISADO POR: CAGV APROBADO POR:

Departamento de Química

1. OBJETIVOS

 En virtud del nivel formativo que el estudiante de química deberá tener a estas
alturas y cuando no se especifiquen, los objetivos deberán ser inferidos por el
estudiante a partir de la lectura de la presente guía.

2. INTRODUCCIÓN

Los aminoácidos (recuerde, aquí hablamos de los L-alfa proteinogénicos) se clasifican

habitualmente según las propiedades de su cadena lateral (R).

 Neutros polares o hidrófilos: Serina (Ser), treonina (Thr), cisteína (Cys),

asparagina (Asn), tirosina (Tyr) y glutamina (Gln).

 Neutros apolares o hidrófobos: Glicina (Gly), alanina (Ala), valina (Val), leucina
(Leu), isoleucina (Ile), metionina (Met), prolina (Pro), fenilalanina (Phe) y
triptófano (Trp).

 Aniónicos o ácidos: ácido aspártico (Asp) y ácido glutámico (Glu).

 Catiónicos o básicos: lisina (Lys), arginina (Arg) e histidina (His).

De acuerdo a esta variedad de grupos, es posible realizar la separación de una mezcla

de aminoácidos, por medio de separaciones analíticas como; cromatografía de gas-
liquido (CGL), cromatografía de gas-solido (CGS), cromatografía de capa fina (TLC),
cromatografía liquida de alta resolución, cromatografía de papel y
electrocromatografía.

El principio básico de la cromatografía, es la separación de varios compuestos

presentes en una muestra por medio de la interacción diferencial que presenta cada
uno de estos con las dos fases: una estacionaria y otra móvil que fluye sobre ella.
En esta práctica, se aplicarán algunos de los conceptos de las técnicas de separación
comentadas previamente en la cromatografía ascendente sobre papel. La fase
estacionaria es un papel de celulosa y la móvil una mezcla de 2-propanol: NH3
(acuoso). Según la solubilidad que tengan los componentes de la muestra respecto de
las dos fases así será su movilidad. En cromatografía, el parámetro que mide la
separación de componentes es el 𝑅𝑓 (Factor de retención), ver ejemplo 1.

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑒𝑙 𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑝𝑙𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛

𝑅𝑓 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑒𝑙 𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑝𝑙𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛

Como se ha visto en clase, los aminoácidos tienen propiedades ácido-base, gracias a

grupos ionizables dentro de su estructura. Un 𝛼 -aminoácido sencillo, mono amino y
monocarboxílico, por ejemplo la alanina, es considerado como un ácido dibásico
cuando se halla en su forma totalmente protonada; puede ceder dos protones durante
una valoración completa con una base, esta valoración puede ser monitoreada de
acuerdo al pH de la solución y de esta manera, encontrar los puntos de equivalencia
del aminoácido y por ende sus pKa y pI que en principio son diferentes a los de los
demás aminoácidos.

Ejemplo 1 para cálculo de Rf. Se

realiza una separación de leucina, ácido
aspártico y lisina por una cromatografía
dada. Para esto se deja correr cada
componente como referencia y la
mezcla de los tres.

Si el solvente, tiene un desplazamiento

de 5,2 cm, el Rf para la leucina es:

2 𝑐𝑚
𝑅𝑓 = = 0.38
5,2 𝑐𝑚
3. MATERIAL (A reservar por los grupos) Y REACTIVOS

Material Pinza para bureta (2)

Vaso de precipitados de 600 mL (2)
Vaso de precipitados de 100 mL (4) Reactivos
Vaso de precipitados de 50 mL (2) Leucina
Agitador magnético (2) Prolina
Gotero (2) Histidina
Jeringa (2) Glicina
Escobillón (1) Aspartame
Frasco lavador (1) Ácido glutámico
Papel filtro cuantitativo (2) NaOH
Magneto pequeño (2) Ninhidrina
Bureta de 25 mL (2) 2-propanol
Pipeta volumétrica de 10 mL (2) NH4OH
pH-metro, electrodo y soporte (2) Biftalato de potasio
Capilares (6) HCl concentrado
Varilla de agitación (1)
Probeta de 10 mL (1)

La concentración y composición de cada una de las soluciones empleadas en esta

práctica se encuentra descrita en el Anexo 3.

4. PROCEDIMIENTO

Nota: durante toda la práctica utilice guantes, tapabocas y gafas, use bata de manga
larga. TRAIGA REGLA, CÁMARA DE ~5MPX, UN CAUCHO y DOS DEPILADORES POR
GRUPO.
- Manipule los papeles de cromatografía con guantes y/o depiladores para no
contaminarlos.
- Cuando tenga que utilizar las balanzas analíticas, ingrese al cuarto por el
laboratorio 3007 para no interferir con las actividades que se estén realizando.
- Mantenga las balanzas limpias.

A) Cromatografía en papel: En una tira de papel filtro, trace muy suavemente con
un lápiz la línea punteda del origen del cromatograma, dejando ~1,5 a 2 cm
entre la parte superior e inferior. Con una lápiz, dibuje tenuemente las guías de
separación de las soluciones de aminoácidos de modo semejante a como se ve
en la gráfica 1 (lado izquierdo).

Procure dejar espacio de ~2 cm entre cada marca realizada para las soluciones de los
aminoácidos (40mM) y la mezcla. Siembre las muestras con un capilar muy cerca de
las marcas hechas pero no encima de ellas (¿por qué considera que hay que evitarlo?).
Deje secar.
 La zona de siembra
debe estar por
encima del nivel de
la fase móvil.

Leucina
Marca tenue en lápiz como guía
de separación entre muestras

Gráfica 1. Ejemplo del montaje para realizar el experimento; en la práctica

trabajaremos con ácido glutámico, prolina y leucina (a 40 mM) y la mezcla de los tres.

En un vaso de 600 ml (gráfica 1, lado derecho) adicione la fase móvil necesaria para
que quede a una altura de 0,2 cm. Tápelo herméticamente con papel aluminio por 10
minutos. Después coloque el papel filtro ya con las muestras sembradas y secas, de
manera que la parte inferior del papel se impregne de la solución de fase móvil. No
perturbe el nivel del líquido mientras lo hace.

En seguida vuelva a tapar el vaso con papel aluminio para que la atmósfera del
recipiente se sature del vapor de la fase móvil y deje desarrollar el cromatograma
hasta que la fase móvil esté próxima a llegar al extremo superior. No debe perturbar el
nivel del líquido mientras lo hace.

Realice toda esta parte en una campana de extracción: saque el papel del vaso
con cuidado antes que el disolvente pase la línea superior y marque con una línea
hasta donde llegó la fase movil (idealmente es una línea horizontal pero puede
curvarse), luego extienda el papel, tratando de no tocarlo directamente con las manos,
deje que se seque. Rocíelo con Ninhidrina, deje secar de nuevo y para completar el
revelado, someta su papel a secado a 80 ºC en el horno por 2 min.

Las manchas color púrpura que aparecen sobre la superficie del papel tras el revelado
corresponden a los aminoácidos, después proceda a marcar la ubicación de cada
mancha suavemente con un lápiz.

B) Determinación de pKa de alfa amino, alfa carboxilo y pI o pKR de cadena

lateral.

Tome una alícuota de 10 mL de disolución de aminoácido asignado (100mM) (pipeta

volumétrica) y adiciónelo en un vaso de 50 mL, verifique que el pH esté entre 1,6-1,7
en un pH-metro previamente calibrado.
Mida el pH de la solución y asuma este como su primer dato. Con agitación constante
(tenga cuidado de no tocar con el magneto el electrodo del pH-metro, solicite
magnetos pequeños) empiece la titulación de la disolución de aminoácido con NaOH
(100 mM), adicionando volúmenes de 0,2 mL a 0,4mL o de acuerdo con su criterio, en
la medida que se acerque a algún pH clave en la titulación, después de cada adición de
NaOH, debe anotar el pH de la solución.

En general cuando observe un cambio brusco de pH deberá disminuir el volumen de

titulante a 0,1 mL para observar bien los puntos de equivalencia, cuando el pH varíe
poco puede continuar la titulación adicionando volúmenes superiores. La titulación se
termina cuando el pH de la solución llegua a ~11,5 unidades.

5. TRATAMIENTO DE DESECHOS

Al final del curso el profesor indicará el protocolo respectivo para llevar a cabo el
tratamiento de cada uno de los desechos generados en la presente práctica. Sin
embargo, esto no exonera al estudiante de hacer la respectiva búsqueda bibliográfica
que deberá ser consignada en sus preinformes.

6. CÁLCULOS Y RESULTADOS

Registre los resultados hallados en la actividad “Cromatografía en papel” y

“Determinación de pKa de alfa amino, alfa carboxilo y pI o pKR de cadena lateral” en
las tablas que encontrará en la sección de anexos.

Recuerde:

 En el experimento Cromatografía en papel” debe medir la distancia de cada

mancha y revisar el dato de la marca de la fase móvil. En base a estos valores,
debe calcular el Rf para cada aminoácido.

 Realizar las curvas de titulación pH vs equivalentes de NaOH, hallar los pKn, el

pI del aminoácido o péptido y compararlos de forma estadística con los valores
que se encuentran en la sección de anexos de esta guía.

7. PREGUNTAS

Preguntas a resolver en el preinforme

I. Como debe ser SIEMPRE, no olvide incluir OBJETIVOS, bibliografía, las respectivas
medidas de seguridad y fichas para esta práctica en la respectiva carpeta.
II. Dibuje las estructuras de c/u de las biomoléculas a usar en ésta práctica
recordando clasificarlas de acuerdo a lo mostrado en la introducción. Incluya los
valores de pK1, pK2, pI, pKR para cada aminoácido de la práctica de modo que
estos valores guíen su titulación.
 III. Diferencie claramente c/u de estos conceptos: punto isoeléctrico, pK, fase móvil,
fase estacionaria, fase reversa, fase normal y constantes de reparto dentro del
contexto de la cromatografía.
IV. En el contexto de esta práctica específica, indique cuál es el mecanismo de
reparto usado aclarando fase estacionaria (sus características superficiales) y
fase móvil.
V. SIEMPRE haga diagramas de flujo sobre los procedimientos indicados aquí.

Preguntas a resolver en el informe

I. Calcule los Rf para los aminoácidos en la cromatografía en papel.

II. ¿Podría usted separar los 20 aminoácidos de una mezcla por cromatografía en
papel? ¿Habría un modo de hacerla además cuantitativa? Explique su respuesta.
III. ¿Cómo podría aplicar esta técnica cromatográfica para evaluar la calidad de un
péptido como por ejemplo el aspartame?
IV. ¿A qué se debe el reparto de los diferentes aminoácidos sobre el papel?
Relacionado con la pregunta IV del preinforme.
V. Investigue y comente sobre la electroforesis en Gel y electroforesis capilar y sus
usos más recientes.
VI. Aparte de las gráficas de pH vs Equivalente de [OH-] investigue qué herramientas
existen (gráficas o matemáticas) para hallar los cambios de pendiente en éste
tipo de curvas. Aplique una de ellas a los resultados para hallar los distintos pKas.
VII. Compare los distintos valores de pK que halló durante la titulación de los Aas con
los de los demás compañeros y los reportados en literatura (ver sección de
anexos). ¿Le parece fiable esta técnica para identificar un aminoácido en una
mezcla? Explique su respuesta.

8. BIBLIOGRAFÍA

1. Lehninger. Principios de Bioquímica. 5ta. Edición. 2006. Skoog. D; West. D; Holler,

D; Crouch. S. 75-107
2. Fundamentos de química analítica. 8 ed. México: THOMSON. 2001. pp. 962 – 963.
3. Boyer’s Modern Experimental Biochemistry, 3rd ed. (2000). pp. 227-240.
 ANEXOS

ANEXO 1. TABLAS DE DATOS.

Cromatografía en papel

Distancia Distancia
Solución Rf
mayor menor
Aspartame
Leucina
Prolina
Ácido Glutámico
Mezcla

Determinación de pKa1, pKa2 y pKR

NaOH NaOH NaOH NaOH

pH pH pH pH
(mL) (mL) (mL) (mL)
ANEXO 2. PROPIEDADES QUÍMICAS DE LOS L-AMINOÁCIDOS en
condiciones estándar

Valores Abundancia
Aminoácido Abreviatura de pKa pI en proteínas
𝒑𝑲𝟏 (𝑪𝑶𝑶𝑯) 𝒑𝑲𝟐 (𝑵𝑯+𝟑 ) 𝒑𝑲𝑹 (𝑮𝒓𝒖𝒑𝒐 𝑹) (%)
Apolares con grupos R
alifáticos
Glicina Gly 2.34 9.60 5.97 7.2
Alanina Ala 2.35 9.69 6.01 7.8
Prolina Pro 1.99 10.96 6.48 5.2
Valina Val 2.32 9.62 5.97 6.6
Leucina Leu 2.36 9.60 5.98 9.1
Isoleucina Ile 2.36 9.68 6.02 5.3
Metionina Met 2.28 9.21 5.74 2.3
Apolares con grupos R
aromáticos
Fenilalanina Phe 1.83 9.13 5.48 3.9
Tirosina Tyr 2.20 9.11 10.07 5.66 3.2
Triptofano Trp 2.38 9.39 5.89 1.4
Polares con grupos R
no cargados
Serina Ser 2.21 9.15 5.68 6.8
Treonina Thr 2.11 9.62 5.87 5.9
Cisteina Cys 1.96 10.28 8.18 5.07 1.9
Asparagina Asn 2.02 8.80 5.41 4.3
Glutamina Gln 2.17 9.13 5.65 4.2
Grupos R cargados
positivamente
Lisina Lys 2.18 8.95 10.53 9.74 5.9
Histidina His 1.82 9.17 6.00 7.59 2.3
Arginina Arg 2.17 9.04 12.48 10.76 5.1
Grupos R cargados
negativamente
Aspartato Asp 1.88 9.60 3.65 2.77 5.3
Glutamato Glu 2.19 9.67 4.25 3.22 6.3

ANEXO 3. SOLUCIONES DE TRABAJO

Fase móvil: (80% agua con hidróxido de amonio al 2%: 20% 2-propanol)

SOLUCIÓN CONCENTRACIÓN
Glicina 100 mM
Ácido glutámico 100 mM
Leucina 40mM
Prolina 40mM
Ácido glutámico 40mM
Histidina 100 mM
Lisina 100 mM
Ninhidrina 2 %/Etanol
NaOH 100 mM
HCl 100 mM