Universidad de La Sabana

Facultad de Ingeniería
Laboratorio de Biotecnología
Profesora: Gina Pilar López Ramírez
Chía-Cundinamarca

______________________________________________________________________________
Diseño y preparación de medios de cultivo
Laura Catalina Marcelo García 0000043032
______________________________________________________________________________

Objetivo General: Evaluar efecto de macro y micronutrientes en crecimiento de microorganismos

filamentosos y no filamentosos.

Objetivos específicos:
 Adquirir destreza en la preparación de medios de cultivo
 Preparar medios de cultivo químicamente definidos.
 Evaluar cualitativamente crecimiento de microorganismos en diferentes medios de cultivo.
 Evaluar los microorganismos presentes en una muestra biológica.

Introducción sulfato de potasio promueven la formación de

Los sustratos nutritivos preparados en el
laboratorio se denominan medios de cultivos.
En estos medios, microorganismos encuentran
sustancias nutritivas como lo son
carbohidratos, aminoácidos, polialcoholes,
vitaminas, minerales, así como condiciones
óptimas de pH que permiten el crecimiento y
desarrollo de microorganismos [1]. Ya que
todos los microorganismos no requieren los
mismos nutrientes, existen diferentes tipos de
medios de cultivo con características
específicas que permiten el crecimiento de
organismos en especial, los usados en este
laboratorio son químicamente definidos, lo
que permite saber con exactitud los
componentes que cada medio de cultivo tiene,
entre ellos se encuentra:
Cultivo Cetrimide agar: es utilizado para
aislamiento selectivo de Pseudomonas
aeruginosa y otras especies del género. En
este medio las peptonas contenidas aportan
nutrientes para el desarrollo de los
microorganismos. El cloruro de magnesio y el
pigmentos. La cetrimida actúa como un agente
inhibidor de flora acompañante al liberar
nitrógeno y fósforo de. El pH final de este
medio es de 7.2 ± 0.2 [2]
Sabouraud Glucosado Agar: este medio se
utiliza principalmente para el aislamiento y
conservación de hongos patógenos y
saprófitos, así como para el cultivo de
levaduras. Entre los nutrientes de este cultivo
se encuentran la peptona, la tripteína y la
glucosa. Favorece el crecimiento de estos
microorganismos y debido a la presencia de
cloranfenicol y un pH ácido (5.6 ± 0.2)
inhibe el crecimiento de bacterias. [3]
ISP2: este medio contiene dextrosa y
extractos de levadura y malta que aportan
vitaminas, en especial vitamina B, factores de
crecimiento, carbohidratos y aminoácidos [4].
Este medio es óptimo para el crecimiento de
levaduras y actinomicetos, este medio se
puede acidificar con ácido láctico, ácido
clorhídrico, ácido tartárico o ácido cítrico para
incrementar la selectividad. Su pH está entre Es importante aprender a diseñar medios de
6.2 ± 0.2 cultivo ya que esto permitirá el desarrollo y
[5]. crecimiento de microorganismos haciendo
más fácil el estudio e identificación de los
Mac Conkey Agar: se utiliza para aislamientos mismos.
de bacilos Gram negativos o de la familia
Enterobacteriaceae ya que las peptonas con Metodología
las que cuenta aporta nutrientes para el  Preparación de medios de cultivo
crecimiento de estos microorganismos, el
carbohidrato lo aporta la lactosa y las sales
biliares y el cristal violeta inhiben el
crecimiento de microorganismos Gram
positivos. El pH que se maneja en este medio
es de (7.1 ± 0.2) [6].

Agar Bilis Rojo Violeta Glucosa (VRBG):

funciona para la detección de
Enterobacteriaceae ya que incluye bacterias
coliformes fermentadoras de lactosa. El
digerido enzimático provee nitrógeno,
carbono y aminoácidos, el extracto de
levadura suministra vitaminas, el carbohidrato
lo aporta la dextrosa y la inhibición de Gram
positivos se dan por los agentes selectivos
tales como las sales biliares y el cristal violeta
en un pH de (7.4 ± 0.2) [7].

E.M.B Agar: se utiliza para el aislamiento

selectivo de bacilos Gram negativos debido a
la combinación de fórmulas Holt-Harris y
Teague con la de Levine. Las peptonas
presentes favorecen el desarrollo microbiano y
los indicadores eosina y azul de metileno
permite diferenciar organismos que utilizan  Pruebas de pureza
lactosa (crecen con periferia rosada o azulada)
y /o sacarosa (incoloros) en un pH alrededor
de (7.2 ± 0.2). [8]

Si bien no se utilizó en laboratorio es

importante mencionar el cultivo Chromocul
como el recomendado para detección y
enumeración de bacterias coliformes basado
en la enzima b-D-galactosidasa presente en
este tipo de bacterias para separar el sustrato
Salmon-Gal produciendo una coloración rojo
asalmonado. [9]

 Preparación de suspensiones celulares
en solución salina al 0,85%
 Siembra por técnica de aislamiento
Resultados
Observaciones iniciales:
En un principio las colonias utilizadas
fueron de Staphyloccocus aureus, una
bacteria que a simple vista se pudo
observar como puntos muy finos y de
una coloración entre amarilla y
naranja. Debido a que se trataba de
una bacteria se realizó una prueba de
pureza con el objetivo de verificar que
se estuviera trabajando con ese tipo de
organismo, esta prueba constó de hacer
la tinción te Gram que al verla en
microscopio con un objetivo de 100X
(utilizando aceite de inmersión) se
pudo observar unas formas esféricas
de color azul oscuro o violeta, lo que
indica que es una bacteria Gram
positiva (tienen una pared gruesa de
peptidoglicano) como se había
determinado en la práctica pasada.
En cuanto a la levadura asignada se
tenía una colonia de Sacharomyces
cereviceae, esta levadura se observó
como puntos blancos de aspecto
cremoso y opaco de diferentes
tamaños. Para este caso se utilizó azul
de metileno para observarla al
microscopio en un objetivo de 40X
pudiendo observar su forma ovalada y
aglomerada como se observa en la
Figura 1.
 Figura 1. Sacharomyces cereviceae observada
al microscopio (40X).
Figura 3.
En cuanto a la muestra biológica se Colonia de
utilizó un durazno en descomposición
principalmente las partes que
contenían posibles hongos de una
apariencia mohosa y coloración blanca
y verde, así como partes donde la Streptomyces en medio ISP2
coloración de la fruta era café y tenía
una textura más blanda que el resto de Este medio de cultivo presenta una tonalidad
la fruta. La preparación de esta ámbar al secarse, en él se sembró
muestra se realizó como se describió Streptomyces ya que es ideal para el
anteriormente en la metodología crecimiento de actinomicetos, después de
haciendo uso de solución salina al encubar se pudo observar claramente el
0,85% como se observa en la Figura crecimiento de la colonia con aspecto de
2. pelusa blanca.

Figura 2. Preparación muestra de durazno en

descomposición en solución salina de 0,85% Figura 4. Siembra de solución de durazno en
descomposición de concentración 10-4 en
En cuanto a los medios de cultivo una vez medio ISP2
esterilizados se sirvieron en las cajas de Petri
debidamente rotuladas. Se utilizaron 6 medios En este medio después de la incubación no se
diferentes (ISP2, E.M.B, VRBG, Mac pudo observar registro alguno de
Conkey,Sabouraud y Cetrimide) donde se microorganismos procedentes del durazno en
hicieron uso de 3 cajas de cada uno para la descomposición.
siembra de una muestra de colonia
proporcionada, y de la solución de la muestra
biológica (en este caso durazno en
descomposición) en concentraciones de 10-4 y
10-5 cuyos resultados se muestran a
continuación:
 Figura 5. Siembra de solución de durazno en
descomposición de concentración 10-5 en
medio ISP2
Figura 8.
Siembra de
En este medio después de la incubación no se solución de
durazno en
pudo observar registro alguno de
microorganismos procedentes del durazno en
descomposición.
descomposición de concentración 10-5 en
medio VRBG

En este medio después de la incubación no se

pudo observar registro alguno de
microorganismos procedentes del durazno en
descomposición.

En siguiente medio a evaluar fue el Mac

Figura 6. Colonia de Staphylococcus aureus
en medio VRBG
El medio VRBG al secar conserva una
tonalidad magenta proporcionada por el cristal
violeta presente en su composición.
No se pudo apreciar desarrollo de algún
microorganismo en este medio.
Conkey, este medio tiene una coloración roja
o rosada menos intensa que la del VDRG
debido también a la presencia de cristales
violeta en su composición. Como se puede
apreciar en la Figura 9, en este medio se
pudieron observar unos puntos de color
rosado con el borde de un rosado más intenso
y bien definido. Sin embargo el crecimiento
de la bacteria Staphylococcus aureus no se dio
en gran cantidad.

Figura 7. Siembra de solución de durazno en

descomposición de concentración 10-4 en
medio VRBG Figura 9. Colonia de Staphylococcus aureus
en medio Mac Conkey
 Figura 12. Colonia de
Staphylococcus aureus en medio
Cetrimide.

Este medio al solidificarse no conserva un

color tan específico como los mostrados
anteriormente, sin embargo presenta algunas
subtonalidades amarillas. En este medio
tampoco se presentó crecimiento de la
bacteria sembrada como se ve en la Figura 13.

Figura 10. Siembra de solución de durazno en

descomposición de concentración 10-5 en
medio Mac Conkey.
Figura 13. Siembra
de solución de
durazno en
descomposición de
concentración 10-4
en medio
Cetrimide

Figura 11. Siembra de solución de durazno en

descomposición de concentración 10-4 en
medio Mac Conkey.

Como se puede observan en las Figuras 10 y
11 no se pudo apreciar algún tipo de
crecimiento de microorganismos en este
medio correspondientes a la muestra biológica
utilizada.
Figura 14. Siembra de solución de durazno en
descomposición de concentración 10-5 en
medio Cetrimide
Al igual que en los otros medios, en el agar
Cetrimide no se presentó crecimiento ni
desarrollos de ningún microorganismo
proveniente del durazno en descomposición.

Figura 15. Colonia de Sacharomyces
cereviceae en medio Sabouraud.
En el medio Sabouraud se sembró una
levadura (Sacharomyces cereviceae), después
de la incubación se pudo observar un gran
crecimiento de esta colonia en forma de
puntos blancos de aspecto cremoso y opaco
característicos de una levadura (Figura 15).
Adicionalmente este medio se observó con
tonalidades ligeramente amarillas.
Figura
Siembra
solución
durazno
descomposición de concentración 10-5 en
medio Sabouraud.
En esta concentración (Figura 16) no se pudo
observar crecimiento de algún
microorganismo.
Figura
17.
Siembra de solución de durazno en
descomposición de concentración 10-4 en
medio Sabouraud.
A esta concentración se pudo observar que
crecieron microorganismos en la parte inferior
de la caja con el medio Sabouraud (según
Figura 17), su aspecto es suave, de pequeños
hilos delgados que en conjunto se asemejan a
un copo de nieve, tiene una coloración entre
blanca y gris.
Por último está el medio E.M.B el cual
16. presenta una coloración vino tinto. En este
de medio se sembró Staphylococcus aureus, pero
de no se presentó crecimiento ni desarrollo en
en
ninguna de las tres cajas (Figuras 18,19 y 20)
Figura 18. Colonia de Sacharomyces
cereviceae en medio E.M.B

Figura 19. Siembra de solución de durazno en
descomposición de concentración 10-4 en
medio E.M.B
Figura 20. Siembra de solución de durazno en
descomposición de concentración 10-5 en
medio E.M.B
Análisis y discusión
ISP2:
El crecimiento que hubo en este medio por
parte de la colonia Streptomyces fue bastante
bueno, y siendo esta bacteria un actino, se
puede reafirmar que este es un buen medio de
cultivo para cultivar actinomicetos debido a su
gran aporte de vitaminas y fuentes de
carbohidratos proporcionados por el extracto
de malta y levadura que se encuentra en su
composición, adicionalmente se puede afirmar
que este tipo de bacterias se desarrollan en
medios ácidos ( pH óptimo de 6,5), aun
cuando se han encontrado especies que se
pueden desarrollar especies con pH más
ácidos o más básicos hasta de 9 o más [10].
En cuanto a los cultivos que respectan a la
muestra biológica no se pudo identificar
crecimiento de algún microorganismo en
ninguna de las dos concentraciones
manejadas, lo que conlleva a pensar que el
durazno en descomposición utilizado no es
una fuente de buen crecimiento para bacterias
de tipo actinomicetos, esto puede deberse a
que el pH del durazno es de 3.2 ± 0.2 [11]
siendo este un pH más ácido en comparación
con el del medio y muy posible responsable
de que no haya presencia de Streptomices
considerando el pH óptimo en el que esta
especie se desarrolla.
VRBG:
En este medio no se presentó crecimiento ni
en la caja donde se sembró la muestra de la
colonia Staphylococcus aureus, ni en las cajas
con la solución de la muestra biológica. En
primera estancia se vio un patrón en todos los
medios donde se cultivó la muestra de la
colonia S. aureus ya que esta no creció en
ninguno de ellos aun cuando el tiempo de
incubación fue mayor a lo que tarda esta
bacteria en incubarse (1 a 6 horas) [12], lo que
puede indicar que puede que esta colonia no
fue sembrada de manera correcta y los
microorganismos pudieron morir en el
proceso.
Por otra parte, este medio contiene sales
biliares y cristales violeta los cuales son
componentes que inhiben el crecimiento de
bacterias Gram positivas como lo son los
cocos utilizados [7] lo cual respalda que la
bacteria S. aureus no se haya desarrollado. En
las cajas donde se sembró la solución
correspondiente a la muestra biológica
tampoco hubo crecimiento, lo que permite
afirmar que el durazno no es una buena fuente
para que crecimiento de organismos Gram-
negativos que son aquellos para los que este
medio está diseñado.
Mac Conkey:
Al igual que en el medio pasado el Mac
Conke contiene cristales violeta y sales
biliares los cuales inhiben el crecimiento de
gran parte de la flora Gram positiva, sin
embargo, este medio se vio un pequeño
crecimiento de microorganismos esto se pudo
deber a que la bacteria S. aureus es
fermentador de lactosa [13] y este tipo de
microorganismos se pueden observar en el
medio como halo de precipitación biliar [6].
En el caso de las cajas con la solución de la
muestra biológica al no haber crecimiento se
reafirma que el durazno no es na buena fuente
para el crecimiento de microorganismos
Gram-negativos y además de
microorganismos fermentadores de lactosa.
Cetrimide:
Al no observar algún tipo de crecimiento ni de
la colonia utilizada ni de la solución con la
muestra biológica se puede afirmar que la
colonia no era de carácter Pseudomona ni que
el durazno es buena fuente para el crecimiento
de estas, esto también se puede deber a que la
mayoría de Pseudomonas se desarrollan en un
pH mayor a 4,5 [14] y como se mencionó
antes el pH del durazno es mucho menor al de
crecimiento óptimo. Tampoco se pudo
observar ningún tipo de coloración por lo que
se puede afirmar que no hubo crecimiento de
organismos productores de piocianina,
pioverdina o piorrubina [2].
Sabouraud:
Con los resultados presentados se reafirma
que el medio Sabouraud es un medio óptimo
para el crecimiento de levaduras en este caso
de la Sacharomyces cereviceae debido a la
cantidad de peptona, glucosa y tripteína que la
compone y que brinda los nutrientes para el
desarrollo de la misma [3]. En cuanto al
crecimiento en las cajas con la solución de la
muestra biológica el poco crecimiento se pudo
deber a que no se cumplió con el tiempo de
incubación recomendado para el crecimiento
de mohos y hongos que era el microorganismo
que se esperaba encontrar en el durazno en
descomposición que es de 5 a 20 días [3]
mientras que los medios solo se dejaron
incubando durante 2 días.
E.M.B:
El no crecimiento de la S. aureus en este
medio se puede justificar ya que este es un
medio selectivo para microorganismos Gram-
negativos [8] y la bacteria utilizada es Gram-
positiva, la cual se pudo ver inhibida por los
indicadores eosina y azul de metileno. Al no
crecer tampoco en los medios con la solución
del durazno se puede descartar la presencia de
microorganismos Gram-negativos así como
especies de la familia Enterobacteriaceae [8].
Conclusiones
 Se aprendieron a diseñar medios de
cultivo y se adquirió destreza en la
elaboración de estos.
 El trabajar con medios de cultivo
químicamente definidos facilita el
análisis de los microorganismos que
crecen y se desarrollan en estos.
 Se evaluó el crecimiento de
microorganismos en diferentes medios
de cultivo.
 Se analizó los posibles
microrganismos presentes en una
muestra biológica de durazno en
proceso de descomposición mediante
diluciones de la fruta en solución
salina a 0,85%
 La presencia de cristal violeta, sales
biliares, eosina y azul de metileno en
algunos medio impidieron el
crecimiento de organismos Gram-
positivos con los cuales se trabajó.
 El diseño de medios de cultivo permite
evaluar el crecimiento de
microorganismos y su afinidad con los
componentes del mismo.
Recomendaciones
 Hacer buen uso del tiempo mientras
los medios se esterilizan en el
autoclave.
 Marcar las cajas previamente con el
nombre del cultivo y la fecha para
identificar los medios fácilmente y
evitar confusiones. Si es posible
marcarlos en la parte inferior de la caja
para poder observar bien los
microorganismos en la parte superior.
 Utilizar microorganismos afines a los
medios para evaluar el crecimiento en
 ellos y evitar usar microorganismos
que pueden ser inhibidos por algún
componente si no es lo que se desea.
 Realizar las siembras cerca del
mechero para evitar algún tipo de
contaminación en el proceso de
siembra.
 En el caso de trabajar hongos tener en
cuenta el tiempo de incubación que
estos requieren es mayor.
Referencias
[1]Congreso internacional del colegio
nacional de bacteriología. Beneficios de los
Medios de cultivo para Microbiología en
MDM científica . Recuperado el 27 de
Febrero de 2019 en:
https://mdmcientifica.com/beneficios-de-
los-medios-de-cultivo-para-microbiologia-
en-mdm-cientifica/
[2]LABORATORIOS BRITANIA S.A.
(2015). Cetrimida Agar. REF B2311531.
Consultado el 27 de Febrero de 2019 en:
http://www.britanialab.com/back/public/up
load/productos/upl_5a2ed5a58f4ee.pdf
[3] LABORATORIOS BRITANIA S.A.
(2015).Sabouraud Glucosado Agar. REF
B0215005-B02215006. Consultado el 27 de
Febrero de 2019 en:
https://www.britanialab.com/back/public/u
pload/productos/upl_5a2971216486e.pdf
[4]Núñez Reinoso, J.A, Sierra Arias, C.D.
(2018). Identificación de microorganismos de
suelos de la provincia de pichincha, con
capacidad de producir antibióticos de amplio
espectro. Universidad politécnica salesiana
sede Quito. Consultado el 27 de Febrero de
2019 en:
https://dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456
789/15186/1/UPS-QT12347.pdf
[5] HIMEDIA. (20015)Technical Data. Yeast
Malt Agar (YM Agar) (ISP Medium No. 2).
Consultado el 6 de Marzo de 2019 en:
http://himedialabs.com/TD/M424.pdf
[6] LABORATORIOS BRITANIA S.A.
(2015). Mac Conkey Agar. REF B2311431.
Consultado el 27 de Febrero de 2019
https://www.britanialab.com/back/public/u
pload/productos/upl_5a2ed674cf661.pdf
[7]Acumedia. (2015). NEOGEN
CORPORATION. Agar bilis rojo violeta
glucosa. (7425).
Consultado el 27 de Febrero de 2019 en :
https://foodsafety.neogen.com/pdf/acumedi
a_pi/7425_sp_pi.pdf
[8] LABORATORIOS BRITANIA S.A.
(2015). E.M.B Agar (con eosina y Azul de
Metileno). REF B0210105- B0210106.
Consultado el 27 de Febrero de 2019 en :
http://www.britanialab.com/back/public/up
load/productos/upl_5a28240e1c004.pdf
[9]Merck Millipore (2014). Chromocult Agar
para coliformes. Consultado el 27 de Febrero
de 2019 en :
file:///C:/Users/dnb/Favorites/Downloads/D
S4485ES00_Chromocult%20Coliform
%20(6-25)%20(1).pdf
[10] López, B. Streptomyces: características,
taxonomía, morfología, cultivo. Lifeder.com.
Recuperado el 5 de Marzo de 2019 de:
https://www.lifeder.com/streptomyces/
[11]Food- info. (2017). ¿Cuál es el pH de los
alimentos?Consultado el 5 de Marzo de 2019:
http://www.food-info.net/es/qa/qa-fp65.htm
[12]Foodsafety. Staphylococcus. Consultado
el 5 de marzo de 2019 en:
https://espanol.foodsafety.gov/intoxicaci
%C3%B3n/causas/bacteriasvirus/staphyloc
occus/xmd/%C3%ADndice.html
[13]Microbitos, G. (2011). Staphylococcus
aureus, S. epidermis y S. saprophyticus.
Consultado el 7 de Marzo de 2019
en
:http://microbitosblog.com/2011/08/03/stap
hylococcus-aureus-epidermidis- https://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803
saprophyticus/ /2521/LRM_TESIS.pdf

[14]Ruiz Martínez, L. (2007). Pseudomonas

aeruginosa: Aportación al conocimiento de su
estructura y al de los mecanismos que
contribuyen a su resistencia a los
antimicrobianos. Universidad de Barcelona.
Tesis Doctoral. Consultado el 7 de Marzo de
2019 en: