LABORATORIO DE QUÍMICA ANALÍTICA E INSTRUMENTAL 502503

GUIA No 7 Principios de cromatografía

Cromatografía en capa delgada y en Columna (clásica) y HPLC

I. EL PROBLEMA.

Separar los pigmentos de una muestra vegetal, por medio de técnicas cromatográficas.
Cuantificar la cantidad de etanol presente en una muestra de licor , usando HPLC

II. FUNDAMENTO TEORICO.

La historia de la cromatografía moderna se remonta a los estudios del botánico ruso Mikhail Tswett, quien
utilizó una columna rellena de carbonato de calcio (fase estacionaria) para separar pigmentos coloreados de
extractos vegetales. La muestra se colocaba en la parte superior de la columna y se hacia pasar a través del
carbonato de calcio usando éter de petróleo (fase móvil). A medida que el solvente se desplazaba, los
pigmentos se empezaban a separar en bandas coloreadas, luego se sacaba de la columna el carbonato, se
cortaba y cada pigmento se extraía por separado. Tswett denominó esta técnica cromatografía, por la
combinación de las palabras griegas que significaban “color” y “escribir”. Después de 1931 esta técnica
analítica tomo interés para las separaciones bioquímicas gracias a los trabajos de Martín y Synge (1941), y
por los cuales fueron merecedores del premio Nobel de Química en 1952.

En resumen, la cromatografía es una técnica en la que se separan solutos debido a la distribución diferencial
de estos, entre la fase móvil y la estacionaria.

Las separaciones se pueden clasificar en tres formas:

- según el estado físico de la fase móvil y de la estacionaria
- según el método de contacto entre las fases
- según los mecanismos físicos o químicos responsables de la separación

La fase móvil suele ser un líquido o un gas (cromatografía líquida o cromatografía de gases) y la fase
estacionaria es un sólido o una película líquida que reviste una superficie sólida. Para poner en contacto la
fase móvil y la estacionaria se usan dos métodos, la cromatografía de columna (CC) donde la fase estacionaria
se empaca en una columna estrecha por la cual pasa la fase móvil, por efecto de la gravedad o de una presión
aplicada. La cromatografía de capa delgada (CCD), la fase sólida cubre una lámina plana de vidrio, metal o
plástico, que se coloca en contacto con la fase móvil y esta se desplaza por capilaridad.

El mecanismo por el que los solutos se separan se pueden catalogar en cromatografía de adsorción y
cromatografía de reparto; en la primera los solutos se separan según la capacidad para adsorberse sobre una
fase estacionaria sólida, y en la segunda, la separación se debe a la diferencia del equilibrio de reparto
(solubilidades) entre la fase móvil líquida y la fase estacionaria (película líquida). También la separación se
puede deber a las interacciones electrostáticas entre la fase estacionaria y los solutos (cromatografía de
intercambio iónico); por la interacción entre los solutos con las cavidades porosas de un gel (cromatografía de
exclusión por tamaño), y por la formación de enlaces específicos entre la fase estacionaria y los solutos
(cromatografía de afinidad).
 III. MATERIALES Y REACTIVOS.

Cada grupo debe tener:

- Un mortero con mano

- Un vidrio de reloj
- Una espátula
- Dos Pipetas graduadas de 10 mL
- Dos erlenmeyer de 50,0mL
- Cuatro vasos de precipitados de 50 mL
- Un embudo de vidrio mediano
- Una pipeta Pasteur con chupa
- Una pipeta Pasteur sin chupa
- Un agitador de vidrio
- Una nuez
- Una pinza para refrigerante pequeña
- Dos goteros plásticos limpios y secos
- Un triangulo de porcelana
- Dos cortes de gasa
- Dos capilares
- Un tapón de caucho con hueco (para que se coloque la pipeta Pasteur)
- 1 Micriopipeta de 10 a 100µL
- 1 Micriopipeta de 100 a 1000µL

Material y reactivos de uso general:

- Etanol al 96%
- n-Hexano
- Eter de petróleo
- Tolueno:metanol (9:1)
- Acetona:metanol (9:1)
- Acetona:cloroformo:metanol (7:2:1)
- Etanol al 96%:agua (1:1)
- Etanol al 96%:agua (1:2)
- Placas de celulosa
- Placas de sílica gel
- Sílica gel en polvo
- Alúmina en polvo
- Lana de vidrio
- Parafilm
- Algodón
- Dos planchas de calentamiento
- Varilla metálica delgada (para empujar la lana de vidrio o el algodón al fondo de la pipeta Pasteur)
- Papel aluminio
- 5 vasos de precipitados de 250 mL. o 5 envases en vidrio transparente altos, con tapa.

Las muestras vegetales que se pueden utilizar son: Remolacha, mora, achiote.
Seco en la estufa de aire durante la noche a 50oC
IV. PROCEDIMIENTO

1. Preparación de la muestra-Extracción etanólica:

Pique el material vegetal seco en pequeños trozos y pese aproximadamente 10g de este, coloque la
muestra en el mortero, adicione 10,0 mL de etanol al 96% y haga la extracción. Filtre sobre gasa y recoja
el filtrado en un erlenmeyer de 50 mL, devuelva el residuo al mortero y repita la extracción dos veces
más. Concentre el extracto etanólico en una plancha de calentamiento a temperatura moderada y en
la campana de extracción hasta un volumen aproximado de 5 mL, tape con parafilm y guarde para la
cromatografía. No deje secar el extracto. (Cuidado con calcinar el extracto).

El residuo sólido se utilizará para la extracción con solventes orgánicos.

2. Preparación de la muestra-Extracción con solvente orgánico:

El residuo sólido obtenido del punto anterior colóquelo nuevamente en el mortero seco y adicione 10,0
mL de n-hexano o de éter de petróleo y haga la extracción. Filtre sobre gasa y recoja el filtrado en un
erlenemyer de 50,0 mL. realice la extracción dos veces más. Concentre el extracto orgánico en la
plancha de calentamiento al baño maría, en la campana de extracción. Concentre hasta un volumen
aproximado de 5 mL, tape y guarde para la cromatografía.

Puede desecha el residuo sólido.

3. Cromatografía en columna (CC): Para el extracto con solvente orgánico

En un vaso de precipitados de 50,0 mL adicione entre 3 y 5 gramos de la fase estacionaria que va a

utilizar y luego adicione 10 mL del solvente o mezcla de solventes que usará como fase móvil. Agite
suavemente.

Coloque en forma adecuada la pipeta Pasteur en una pinza para refrigerante, introduzca una pequeña
porción de lana de vidrio al interior para hacer un tapón no muy compacto ni muy alto al fondo de la
pipeta. Adicione lentamente la suspensión de la fase estacionaria en el solvente de estudio con un
gotero de vidrio y cuide que no se formen burbujas al interior de la columna; recoja en solvente que
sale de la columna en un vaso de precipitados, parcialmente tapado con papel alumnio. Llene la
columna con la fase estacionaria HASTA 0,5cm por debajo del nivel superior. No deje que la columna
se seque, manténgala húmeda con el solvente que usará como fase móvil.

Coloque 2 a 5 gotas del extracto con el solvente orgánico en un vidrio de reloj y déjelo secar al medio
ambiente o en baño maría, luego adicione 5 gotas de la fase móvil, disuelva los pigmentos y coloque
las cinco gotas en la parte superior de la columna sobre la fase estacionaria previamente despejada de
fase móvil. Deje que los pigmentos se introduzcan en la columna y luego elúyalos adicionando más fase
móvil a la columna hasta que se observe separación o un pigmento coloreados llegue al final de la fase
estacionaria. No deje que los pigmentos se salgan de la columna, tapando la parte superior e inferior
con Parafilm. Observe.

4. Cromatografía en capa delgada (CCD):

Trace una línea con lápiz, a 1 cm de altura, en la lámina con la fase estacionaria adecuada; divida la
línea en dos y en la primera porción adicione con un capilar dos gotas del extracto correspondiente
(ver tabla 1) y en la segunda porción 6 gotas del extracto, deje secar al aire. Coloque la placa en la
 cámara de revelado en donde está la fase móvil, y debe sumergirse por debajo del punto de siembra
del extracto; la mezcla de solventes correrá sobre la lámina por capilaridad y se retirará la placa cuando
la fase móvil esté a 1cm de llegar al nivel superior. Deje secar a la atmósfera y con un lápiz indique la
posición de los pigmentos sobre la placa. Observe.

Tabla No 1.

EXTRACTO VEGETAL PLACA SILICAGEL PLACA CELULOSA

SOLVENTE ORGANICO SI NO
ETANOLICO NO SI

V. TABLA DE DATOS

En la tabla de datos debe tener en cuenta el sistema de solventes que utilizó para cada una de las
cromatografías y la descripción de la separación de los pigmentos, si esta se llevó o no acabo.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

SISTEMA DE SOLVENTES SILICA GEL ALUMINA

Tolueno:Metanol
(9:1)
Acetona:metanol
(9:1)
Acetona:cloroforme:metanol
(7:2:1)

CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA

SISTEMA DE SOLVENTES SILICA GEL CELULOSA

Tolueno:Metanol
X
(9:1)
Acetona:Metanol
X
(9:1)
Acetona:cloroformo:metanol
X
(7:2:1)
Etanol al 96%:Agua
X
(1:1)
Etanol al 96%:agua
X
(1:2)

5. CROMATOGRAFIA HPLC

Atienda las explicaciones del monitor encargado del cuidado de equipo. El método utilizado es una
separación por HPC en un equipo Hitachi.,el solvente es ( H2SO4 5Mm) que varía en composisicón desde 0%
hasta 100% de mezcla de 0 a 28 minutos, el con flujo del solvente es de 0.5mL/min. La detección de los
compuestos alcohólicos se realiza a 270 nm con un detector LaChrom L- 7400 de Merk- Hitachi
Cantidad de muestra para el análisis son 60 µL.
La curva de calibración está preparada entre 0 y 6% de etanol, tome los datos de altura de pico, para hacer
los cálculos.
La muestra problema puede ser una bebida alcohólica, prepare por dilución un 1 mL de muestra que contenga
aproximadamente entre 2 y 4 % de alcohol.
Si la bebida seleccionada tiene entre 2 y 4% de etanol no es necesaria la dilución
Inyecte la muestra y espere 28 minutos hasta obtener el cromatograma. (Para este método el tiempo de
retención del etanol esta entre 25.6 y 25.75 min)
Columna de intercambio ioníco Aminex HPX87H. tamaño de poro 300mm X 7.8mm
Registre el número de señales de muestra, los tiempos de retención, compare con la curva de calibración y
determine la concentración del etanol presente en la muestra.

VI. BIBLIOGRAFÍA.

- Harvey, D. Química analítica moderna. 2002. McGraw Hill, primera edición, España.
- Ramírez, I.B; Gaviria, L.E; Young, S.T y Morales, A.L. Química analítica instrumental. 1989. Editorial
Hispanoamericana, Universidad abierta y a distancia, UNISUR. Bogotá.
 PREINFORME E INFORME

GUIA No .7 Principios de cromatografía

Cromatografía en capa delgada y en Columna (clásica) y HPLC

Nombre __________________________Fecha __________________Grupo___

CUESTIONARIO PARA EL PREINFORME.

En una hoja responda las siguientes preguntas

- Indique la composición o estructura de la Silica Gel, alumina y celulosa.

- Indique que tipo de fase estacionaria (sílica gel, alumnina y celulosa) es más adecuada para separar
sustancias no-polares y sustancias polares.
- Qué tipos de pigmentos coloreados se encuentran en los vegetales que usara en la práctica?
- ¿ Estos pigmentos son polares o no polares?
- ¿ Que otro tipo de sustancias polares se pueden encontrar en los vegtales?
- ¿ Que otro tipo de sustancias no-polares se pueden encontrar en los vegetales?

1. Extracción de la muestra
Hipótesis
_____________________________________________________________________________________
_______________________________________________

Diagrama de flujo

2. Cromatografía en columna (CC): Para el extracto con solvente orgánico

Hipotesis_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
Diagrama de flujo
 3. Cromatografía en capa delgada (CCD)
Hipótesis: _____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
Diagrama de flujo

4. Cromatografía HPLC
Hiptesis:_________________________________________________________________-
_________________________________________________________________________

Fichas técnicas. Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio.

Peligrosi Primeros auxilios y Forma de

Nombre Fórmula Aspecto
dad* medidas de higiene eliminación
*
Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable (F),
extremadamente inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o
peligroso para el medio ambiente (N). Pictogramas SGA

PARA EL ANÁLISIS DE LA PRÁCTICA

¿Qué tipos de pigmentos coloreados encontró en los vegetales?

Cuál es la estructura química propuesta para los pigmentos encontrados
Cuando hubo separación, ¿cuántos pigmentos se observan?
Explique la razón por la cual en un tipo de fase móvil y de fase estacionaria hubo separación y porque
en otra no.
Explicación detallada de los procesos de adsorción en las separaciones por cromatografía realizadas
en el laboratorio
Explicación detallada de los procesos de reparto en las separaciones por cromatografía, realizadas en
el laboratorio.
En la cromatografía de capa delgada, calcular la eficiencia de la separación por medio de los valores
Rf.
Calcular la concentración de etanol en la muestra problema, discuta el proceso de separación y la
evaluación cuantitativa de este compuesto en la muestra analizada.