9 Determinacion de Carbohidratos Por Colorimetria PDF

CÓDIGO: FO-DOC-112
UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS

VERSIÓN: 01 PÁGINA: 1 de 6
PROCESO GESTION DE APOYO A LA ACADEMIA FECHA: 02/09/2016
FORMATO GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO VIGENCIA: 2016
LABORATORIO DE QUIMICA
UNIDAD ACADEMICA: Medicina Veterinaria y Zootecnia

CURSO: Bioquímica I
PRACTICA Nº : 9 DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS POR COLORIMETRÍA
1. OBJETIVOS
 Conocer las bases de la colorimetría o espectroscopia visible.
 Aplicar la técnica a la determinación de la glucosa en una muestra problema.
 Adquirir destreza en la aplicación de la espectroscopia.
 Medir la concentración de la glucosa en la muestra problema.
2. CONSULTA PREVIA
Consultar y explicar de la forma más completa posible cada una de las palabras subrayadas que aparecen
en el fundamento teórico.
Describir cada uno de los principales componentes de un espectrómetro (fig. 3)
Cuáles son las longitudes de onda de los diferentes colores que componen la luz visible y que son los
colores complementarios. Para una mejor respuesta puede ayudarse con la elaboración de una tabla.
3. FUNDAMENTO TEORICO
La espectrofotometría: es uno de los métodos de análisis más usados siendo fundamental en los
laboratorios clínicos, tanto para identificar las muestras desconocidos como cuantificar su concentración.
Se basa en la relación que existe en la absorción de luz por parte de un compuesto y su concentración.
Cuando se hace incidir luz monocromática (de una sola longitud de onda) sobre una solución homogénea,
una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como consecuencia de la
intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a P (fig. 1), siendo Po la intensidad de la luz incidente (o
emitida por la fuente) y P la intensidad del rayo de luz transmitido (o que no fue absorbido por la solución).
Dependiendo del compuesto y el tipo de absorción a medir, la muestra puede estar en fase liquida, solida o
gaseosa. La luz empleada puede ir dese la región visible y ultravioleta del espectro electromagnético.
IMAGEN
Cada sustancia tiene su propio espectro de absorción, el cual es una curva que muestra la cantidad de
energía radiante absorbida, Absorbancia, por la sustancia en cada longitud de onda del espectro
electromagnético, es decir, a una determinada longitud de onda de la energía radiante, cada sustancia
absorbe una cantidad de radiación que es distinta a la que absorbe otro compuesto (fig. 2)
La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente la

concentración de la sustancian absorbente, cuando este haz pasa a través de un medio homogéneo. Esto
es la ley de Beer. Dicha ley es aprovechada en los laboratorios para implementación de técnicas que
permiten la cuantificación de muestras con la utilización de diferentes tipos de espectrofotómetros (fig. 3 y
fig. 4).
ELABORADO POR: Cesar CARGO: Docente Fecha: 25-09-2017

Turriago Hernández
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Fig. 2: Espectro de absorción en el ultravioleta del parabeno (bacteriana y fungicida)
Fig. 3: Esquema general de los principales componentes de un espectrofotómetro.
Fig. 4: Imagen de un espectrofotómetro típico de laboratorio.
Considérese un haz de luz de energía radiante con una intensidad inicial incidiendo sobre una celda
pasando a través de ella. La celda contiene una solución homogénea de un compuesto que absorbe
energía radiante a una longitud de onda determinada (fig. 1). La intensidad de la energía transmitida, (P),
será menor que la energía radiante absorbida por la pared de la celda, solvente y otra parte será reflejada
por la superficie de la celda. Estos factores deben ser eliminados si se desea considerar solo la absorción
del compuesto de interés. Esto se hace por medio del uso del tubo con la solución blanco que contiene toso
menos el compuesto a medir.
La transmitancia del compuesto en solución se define como la fracción de luz incidente que es transmitida:

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Transmitancia = T = P/Po
Habitualmente esta razón se describe como porcentaje de transmitancia.
Porcentaje de T= %T = P/Po x 100
El concepto de transmitancia es importante por cuanto es solamente la luz transmitida la que se puede
medir.
Cuando la concentración de un compuesto en solución aumenta, más luz es absorbida por la solución y
menos transmitida. El descenso del porcentaje de transmitancia varía inversa y logarítmicamente con la
concentración. Sin embargo, es más conveniente utilizar la absorbancia, A, la cual es directamente
proporcional a la concentración. Por tanto:
A = -log P/Po = - log T = log 1/T
Es importante reconocer que la absorbancia (A) no es una medición directa, sino que se obtiene
matemáticamente a partir de los datos de la transmitancia.
Ley de Beer y Lambert
Esta ley establece que la concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de
energía radiante absorbida o inversamente proporcional al logaritmo de la energía radiante transmitida. Si la
concentración de una solución es constante y la longitud del camino que la luz debe atravesar en la solución
se duplica, el efecto es el mismo que duplicando la concentración, ya que habrá ahora dos veces más de
moléculas absorbentes en el camino de la radiación. Por ende, la absorbancia es también directamente
proporcional a la longitud del camino de la energía radiante a través de la celda.
La relación matemática entre la absorción de energía radiante, concentración de la solución y longitud del
camino óptico se demuestra por la ley de Beer-lambert:
A = abc
A es la absorción; a, es la absortividad de la sustancia; b, es la longitud del camino óptico; c, la

concentración de la sustancia de interés.
Esta ecuación constituye lavase del análisis cuantitativo por fotometría de absorción o espectroscopia de
absorción. Los valores de la absorbancia no tienen unidades. La absorbancia es una constante de
proporcionalidad relacionada con la naturaleza química del soluto.
4. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS
Equipos Materiales Reactivos y/o sustancias

Espectrofotómetro Tubos de ensayo 814) Agua destilada
Pipeta de 1ml (1) Orto- toluidina
Pipeta de 5 ml (1) Glucosa al 0.2%
Gradilla (1) Muestra problema
5 PROCEDIMIENTO
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El método que se utilizara para la determinación de la glucosa colorimétricamente está basado en la

reacción de loa glucosa con la orto- toluidina en la cual la amina aromática (o-toluidina) en un medio acido
reacciona en el grupo aldehído de la glucosa para formar glucosamina coloreada que se determina
cuantitativamente por colorimetría.
Preparación de los patrones y de la muestra problema
Seis tubos de ensayo colocar los siguientes reactivos en su orden:
Tubos Glucosa 0.2% (mL) M. Problema (mL) H2O Destilada (mL) Vol. Total (mL)
B (Blanco) 0.0 0.0 5.0 5.0
1 0.1 0.0 4.9 5.0
2 0.2 0.0 4.8 5.0
3 0.3 0.0 4.7 5.0
4 0.4 0.0 4.6 5.0
5 0.5 0.0 4.5 5.0
M 0.0 0.3 4.7 5.0
Tomar nuevamente siete tubos de ensayo, rotularlos como B’, 1’, 2’, 3’, 4’, 5’ y M’. En los seis primeros
colocar un mL de cada una de las soluciones anteriores en su orden, en el B’ un ml. Del B, en el 1 un mL
del1, en el 2’ un mL del 2 y así sucesivamente. En el tubo M’ colocar un mL del M (muestra). Luego agregar
en cada uno de los tubos desde el B’ hasta el M’ cuatro mL del reactivo o-toluidina, para desarrollo el color.
Calentar en baño de agua hirviendo durante 30 minutos, colocar en la boca de los tubos unas bolas de
cristal para evitar pérdidas por evaporación, con el calentamiento deberá aparecer una coloración verde
Elaboración de la curva espectral o espectro de absorción
Tome dos celdas del espectrofotómetro y en una de ellas coloque el blanco y en la otra el contenido del
tubo 3’ (después de usarlos no los bote, los necesitará para la curva de calibración). Con la solución B’
ajuste el espectrofotómetro a 0 de absorbancia. Saque esta celda y coloque la celda con solución del tubo 3’
y lea la absorbancia a 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670, 690 y 710 nm, anote y reporte estos datos en su
informe. En cada lectura se debe colocar el blanco y ajustar el aparato al 100% de la transmitancia.
Curva de calibración
Cuadre el espectrofotómetro en la longitud de onda que arrojo la mayor absorción y determine la

absorbancia para todas las soluciones patrón preparadas (patrones 1’, 2’, 3’, 4’, 5’) al igual para que la
muestra (M’). Anote y reporte de los resultados obtenidos
6. RESULTADOS
a. Con la absorbancia a cada longitud de onda complete el siguiente cuadro calculando la transmitancia y el
porcentaje de transmitancia y resalte la longitud de onda que presenta la mayor absorbancia.
Longitud de onda (nm) %T T A
550
570

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590
610
625
630
635
650
670
690
710
b. Complete la siguiente tabla, calculando las concentraciones resultantes de glucosa en cada uno de los
tubos:
Concentración Concentración glucosa

Tubo Tubo
glucosa (mg/ml) (mg/ml)
B B’
1 1’
2 2’
3 3’
4 4’
5 5’
c. Consigne en la siguiente tabla los resultados de la concentración y absorbancia para los tubos prima:
Concentración
Tubo Absorbancia
glucosa (mg/ml)
B’
1’
2’
3’
4’
5’
M’
d. Con estos datos elabore la curva de dispersión de datos en papel milimetrado y en Excel, calculando el
“r” y la ecuación.
e. De la ecuación despeje X y determine la concentración de la glucosa con la ayuda de la Absorbancia

obtenida en el tubo M’. Y a su vez determine la concentración inicial de la muestra problema.
7. BIBLIOGRAFIA
 Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica. Silvia Quesada Mora. Editorial universidad
estatal a distancia. ISBN: 978-9968-31-616-3.

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La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente la

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Fig. 2: Espectro de absorción en el ultravioleta del parabeno (bacteriana y fungicida)

Fig. 3: Esquema general de los principales componentes de un espectrofotómetro.

Fig. 4: Imagen de un espectrofotómetro típico de laboratorio.

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Habitualmente esta razón se describe como porcentaje de transmitancia.

Porcentaje de T= %T = P/Po x 100

A = -log P/Po = - log T = log 1/T

Ley de Beer y Lambert

A es la absorción; a, es la absortividad de la sustancia; b, es la longitud del camino óptico; c, la

4. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

Equipos Materiales Reactivos y/o sustancias

El método que se utilizara para la determinación de la glucosa colorimétricamente está basado en la

Preparación de los patrones y de la muestra problema

Seis tubos de ensayo colocar los siguientes reactivos en su orden:

Elaboración de la curva espectral o espectro de absorción

Cuadre el espectrofotómetro en la longitud de onda que arrojo la mayor absorción y determine la

Longitud de onda (nm) %T T A

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Concentración Concentración glucosa

e. De la ecuación despeje X y determine la concentración de la glucosa con la ayuda de la Absorbancia

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