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instrumentos analíticos y microbiológicos combinados para estudiar el efecto sobre la Aspergilo

Florida Avus de aceite esencial de canela contenida en el envasado de alimentos

S. Manso una , F. Cacho-Nerin segundo , R. Becerril una , C. Nerín una , *

una Departamento de Química Analítica, Instituto de Investigación en Ingeniería de Aragón (I3A), Universidad de Zaragoza, María de Luna 3, E-50018 Zaragoza, España 1
segundo Instituto de Biofísica y nanosistemas Investigación de la Academia de Ciencias de Austria, Schmiedlstrasse 6, 8042 Graz, Austria

información del artículo resumen

Historia del artículo: Aceite esencial de canela se ha utilizado durante siglos para proteger los alimentos de infección frommicrobiological, y en los últimos diez años aceite
Recibido el 6 de febrero de 2012, esencial de canela también se incorpora en materiales de envasado de alimentos como agente antimicrobiano. Sin embargo, se sabe muy poco sobre
recibidos en forma revisada 4 de julio de
el efecto real que tiene en las células de los microorganismos. Este estudio combina instrumentos analíticos y microbiológicos para dilucidar el daño
2012
celular producido en Aspergilo Florida Avus. En primer lugar, la actividad antifúngica de aceite esencial de canela se evaluó a 10 3, 10 4, 10 5 y 10 6 UFC /
Aceptado 14 de julio de 2012

ml. Concentración inhibitoria mínima (MIC) y Concentración mínima fungicida (MFC) se determinaron por macrodilución en contacto directo con
Palabras clave: Aspergillus Florida
el molde. Se obtuvo una actividad fuerte, con una MIC de
Avus
0.05 mi 0,1 mg / ml, y un MFC de 0,05 mi 0,2 mg / ml, ambos rangos dependiendo de las suspensiones de hongos iniciales. Tereftalato de
actividad antifúngica de
envasado activo aceite esencial polietileno fi LMS que contienen aceite esencial de canela se ensayaron en fase de vapor, sin contacto directo con el molde. Activo PET
de canela SEM FTIR comenzó a mostrar actividad a carga CIN EO 2% y produjo una inhibición total al 4% EO CIN. SEM y FTIR se utilizaron para estudiar el daño
celular en el molde expuesto al aceite esencial de canela. daño evidente y una fuerte disminución en la esporulación fueron encontrados por
SEM, mientras que los cambios bioquímicos en conidios podrían ser sugeridas a partir del análisis espectros FTIR. Dos técnicas de deposición
se utilizaron para preparar las muestras para FTIR. Los resultados obtenidos se muestran y discuten.

2012 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

1. Introducción
En los últimos diez años se han publicado muchos estudios sobre el desarrollo de materiales de
envasado activo, la mayoría de ellos se centraron en aplicaciones alimentarias ( Becerril, Gómez-Lus,
Goni, López, y Nerín, 2007; Goni et al., 2009; López, Sánchez, Batlle, y Nerín, 2005; López,
Sánchez, Batlle, y Nerín, 2007a; Nielsen y Ríos, 2000 ). Esta es un área de gran interés para la
industria y el mundo académico, como la introducción de agentes de protección en los materiales de
embalaje se puede utilizar para proteger los alimentos sin la adición directa de nuevos productos
químicos. La tendencia actual de los productos alimenticios naturales y producidos ecológicamente
havingmore, mientras que requiere al mismo tiempo la vida útil más larga, es un desafío a la industria
alimentaria tiene que hacer frente. Un punto clave en esta investigación es la selección de los
agentes activos, es decir, las sustancias de protección para ser incorporados en los materiales de
embalaje ( Coma, 2008 ). Los extractos naturales, tales como aceites esenciales (EO) y sus
componentes, se clasifican como Florida avorings en Europa (Decisión 2002/113 / CE del 23 de enero
del 2002, notificada fi ed bajo
el número C (2002) 88). Además, los aceites esenciales y sus componentes se clasifican como
GRAS (generalmente reconocidos como seguros) por la Administración de Alimentos y Fármacos de
Estados Unidos. Por esta razón, se han propuesto a menudo aceites esenciales (EOS) y se utiliza
como antimicrobiano, antifúngico y agentes antioxidantes, en general, con buenos resultados ( Gutiérrez,
Batlle, Sánchez, y Nerín, 2010; Gutiérrez, Escudero, Batlle, y Nerín, 2009; Gutiérrez, Sánchez, Batlle,
y Nerín, 2009; Rodríguez, Batlle, y Nerín, 2007; RodriguezLafuente, Nerín de la Puerta, y Batlle 2009 ).
Entre ellos, EO canela ha demostrado una fuerte actividad antimicrobiana, althoughmost de los
estudios muestran el comportamiento frente a bacterias y sólo unos pocos informes están dedicados
a los moldes. No es posible comparar actividad antifúngica y antibacteriana ( Ghannoum & Rice, 1999 ).
Además, la actividad antifúngica se estudia y se reportó el uso de metodología muy variable, ya que
no existen protocolos estándar para probar EO en hongos ( Holley y Patel, 2005; Tullio et al., 2007 ).
Los moldes se dif fi culto para inhibir debido a su estructura compleja. Se reproducen por medio de
esporas, fromwhich que crecen en forma de multicelular fi lamentos llamados hifas. La red
interconectada de hifas forma el micelio, y apoya la conidiophore fértil que contiene las esporas que
pueden ser propagados. Hay miles de especies conocidas de moldes, algunos de los cuales son

* Autor correspondiente. Tel .: þ 34 976 762388; fax: þ 34 976 761 873.

Dirección de correo electrónico: cnerin@unizar.es (C. Nerín).
1 http://i3a.unizar.es/grupo/guia-17 .

0956-7135 / $ mi see front matter 2012 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2012.07.018
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patógenos oportunistas que pueden provocar enfermedades graves, incluso con efectos letales ( Fischer
& Dott, 2003; Samson, Hoekstra, y Frisvad, 2004; Samson, Houbraken, Thrane, Frisvad, y Andersen,
2010 ).
Uno de los géneros más comunes es el molde Aspergilo, que es un patógeno para las plantas, los
animales y los seres humanos que produce una Florida aflatoxina, un potente carcinógeno ( Fischer &
Dott, 2003 ) Que también pueden causar intoxicación aguda o crónica después de la ingestión de
alimentos contaminados ( Riba et al., 2010 ). Esto pone de relieve la importancia de la inhibición de este
molde particular en los productos alimenticios.
Se acepta generalmente que la liberación de la sustancia activa depende de la substrato
subyacente (plástico fi lm, papel, cartón.), ashappens inmostof la caseswithbacteria. Sin embargo, el
metabolismo de los moldes es muy diferente y el de Florida influencia del sustrato y la formulación en
la cinética de liberación debe ser estudiado.
inhibición Mold está mediada por la interacción bioquímica entre la sustancia antifúngica y el
microorganismo. Sin embargo, esta interacción no se ha estudiado en profundidad, sin embargo, y
sólo se han descrito efectos macroscópicos. Por lo tanto, no está claro si el micelio o las esporas se
ven afectados, y si este efecto se concentra en la membrana o en el interior de la célula.
Para el propósito de diseño de material de envasado activo, no sólo es necesaria para
demostrar la actividad antifúngica, sino también para establecer que compuestos son responsables
de estas propiedades, y lo que la concentración óptima es obtener la máxima inhibición. Por otra
parte, con el fin de estudiar el mecanismo de acción del aceite esencial, algunas técnicas analíticas
pueden aplicarse como la mayoría de ellos son destructivos para las células. En la última década,
FTIR (HR-FTIR) de alta resolución se ha convertido en una poderosa técnica para identificar la
composición bioquímica celular ( Jilkine, Gough, Julian, y Kaminskyj de 2008 ). Aunque la resolución
espacial está limitada, el carácter no destructivo y la selectividad de la especificación fi bandas C
asociados con grupos funcionales seleccionados, permiten estudiar los cambios producidos por la
exposición del microorganismo a los materiales de envasado activo. cambios celulares también
pueden ser estudiadas con alta resolución espacial por microscopía electrónica de barrido (SEM).
Aunque esta técnica no proporciona la selectividad química clave necesaria para detectar cambios
sutiles en la muestra, que es un poderoso complemento para observar claramente la pérdida de
integridad de la pared celular.
Los dos objetivos principales de este trabajo son: i) analizar la in Florida influencia del sustrato
sobre la actividad antifúngica frente Aspergilo Florida Avus de varios materiales de embalaje que
contienen EO canela como agente activo y ii) para proporcionar datos para dilucidar el mecanismo de
acción de esta sustancia. rendimiento microbiológico de themold se analiza en presencia del agente
activo en forma pura y, como se presenta fromthe packagingmaterials (papel PETand). El daño
celular se evalúa en presencia de EO canela liberado de los materiales de envasado activo.
2. Materiales y métodos
2.1. medios de microorganismos y cultura
cepa de A. Florida Avus CECT 2949 (Colección Española de Cultivos Tipo) fue proporcionada
por el Departamento de Microbiología de la Universidad de Valencia (España). Para los medios de
cultivo, Czapek (CZP) medios de comunicación como sólidos y extracto de levadura Broth (YEB)
como se emplearon medios líquidos, todos suministrados por Scharlau (España). Como diluyentes,
agua destilada con 0,1% de Tween 80 y solución fisiológica (NaCl 0,9%) se utilizaron, ambos
proporcionados por Panreac (España).
2.2. reactivos
Aceite esencial de canela (CIN EO) de la corteza, Forti fi ed con cinamaldehído ( zeylanicum
canela, CAS 8015-91-6) y con
371
una fi concentración final de cinamaldehyde de 900 mg / g fue suministrado por Argolide (España).
Canela EO de las hojas por lo general contiene eugenol como componente principal y poca cantidad
de cinamaldehyde. el EF fi deficiencia de este último EO como agente antimicrobiano ha demostrado
ser mucho más bajo que el procedente de la corteza. El Forti CIN EOwas fi cado por la empresa
Argólida, que CERTI fi es la
fi concentración final de cinamaldehído. componentes menores, tales como b-cariofileno, linalool y
safrol también estaban presentes, pero su en Florida influencia era muy baja, de acuerdo con los
estudios previos mencionados anteriormente. El etanol sin estabilizante, de grado HPLC, fue
suministrado por Scharlau (España). diluciones apropiadas de los puros CIN EO en etanol se
utilizaron para algunos experimentos. El glutaraldehído, cacodilate de sodio y sacarosa, todos
proporcionados por Panreac (España) se utilizaron como reactivos de deshidratación.
2.3. PET activa
PET activo que contiene CIN EO fue proporcionado por Artibal (Sabiñánigo, España), y consistió
en un 25 metro m gruesa capa de PET recubierta con una formulación de base de disolvente
orgánico que contiene el aceite esencial. El gramaje del recubrimiento fue de entre 2,0 y 2,5 g / m 2. Se
ensayaron capas de PET activas con 2, 4, 6 y 8% cantidades CIN EO, donde cada punto porcentual
asciende a 0,0355 g / m 2.
2.4. Concentración inhibitoria mínima (MIC) y Concentración mínima fungicida (MFC)
A. Florida Avus inóculos de 10 3, 10 4, 10 5 y 10 6 CFU / ml se prepararon en NaCl 0,9% y con fi confirmada
por recuento en placa. valores de MIC se obtuvieron por macrodilución en tubos de ensayo de caldo
(YEB) de levadura extracto ( Manso, Nerín, y Gómez-Lus de 2010 ). metodología similar se ha
empleado por otros autores en la determinación antifúngica de la EOS ( Mitchell, de Stamford, de
Souza, Lima, y ​Carmo, 2010; Rasooli y Owlia, 2005; Rasooli, Rezaei, y Allameh de 2006 ) Las
muestras se prepararon como sigue: fi primera, diluciones en serie de CIN EO en etanol se
prepararon en el intervalo de 160 mg / ml a 2,5 mg / mL. Tubos que contienen 1,78 ml de YEB se
inocularon con 200 metro L de la suspensión fúngica y 20 metro L de la dilución CIN EO, de manera
que la fi concentración EO nal en los tubos de muestra se diluyó por un factor de 100. Los controles
con 20 metro L de etanol se añadieron a la prueba. Se empleó el mismo procedimiento para las 4
concentraciones de hongos. Las muestras se incubaron durante 48 h a 25 C bajo agitación continua,
excepto aquellos con la concentración fúngica más bajo, que se incubaron durante 72 h para
asegurar el crecimiento completemold. Para asegurar que no haya cambios en función del tiempo y
en contra fi rm fi concentraciones de MIC Nal, tubos de ensayo se mantuvieron en la incubadora a
25ºC durante un total de 5 días.
Después de la incubación, la concentración de EO más bajo con la no-crecimiento fue nombrado
el MIC. evidente desarrollo de un myceliummass se observó en los tubos de vidrio en el caso de la
no inhibición. Por debajo de la MIC, concentración subinhibitorias se determinó como que con un
crecimiento reducido en comparación con el control.
Para determinar la concentración fungicida mínima, 100 metro L de las suspensiones no de
crecimiento se sembraron con una Spatel Drigalsky estéril en placas de Petri que contenían 15 ml de
CZP. Después de 5 días de incubación a 25 C, la MFC se determinó como la concentración más baja,
donde se había desarrollado ninguna colonia.
El MIC y el MFC se determinan ambas tres veces por duplicado.
2.5. caracterización antifúngica de PET activo
A. Florida Avus se incubó en CZP durante 7 días a 25 C. Suspensiones
de 10 4, 10 5 y 10 6 CFU / ml se prepararon como en el ensayo anterior, y 100 metro L de cada
populationwere sembró con una Spatel Drigalsky estéril en placas de Petri CZP. MASCOTA fi LMS se
evaluaron en vapor
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fase, es decir, sin ningún contacto con el microorganismo, colocándolos sobre la parte superior de las
placas de Petri en lugar de la tapa ( López et al, 2007a.; Rodríguez et al., 2007; Rodríguez, Nerín, y
Batlle, 2008 ) .El material activo se selló a la placa de Petri utilizando un lazo de cable de nylon. La
distancia entre el plástico fi lm y el medio de cultivo en la placa de Petri fue de entre 0,8 y 1,0 cm.
Como un fi primer experimento a corto plazo, la incubación se llevó a cabo durante 12 días a 25 C
con el agar en la parte inferior, siguiendo el desarrollo del molde con el tiempo para las diferentes
cargas CIN EO.
Después de esta prueba, el rendimiento antifúngico a largo plazo del material se estudió con dos
experimentos paralelos:
- durabilidad de la actividad antifúngica
- estabilidad de las propiedades antifúngicas
Con el fin de evaluar la durabilidad, las placas de Petri se incubaron durante dos meses a 25 C,
para comprobar posibles cambios en el crecimiento de hongos.
La estabilidad de las propiedades antifúngicas se estudió por newactivematerials almacenar al 4 C
para dos meses, y luego usarlos para llevar a cabo el mismo experimento a corto plazo como
anteriormente.
Por último, el fungistático o fungicida del carácter fi LMS que causaron la inhibición total se
determinó de dos maneras diferentes. La mitad de las muestras de los experimentos anteriores
fueron liberados de la exposición CIN EO reemplazando el PET activo fi lm con una nueva tapa de
cubierta, que se había esterilizado previamente por exposición a la luz UV durante 20 min. La otra
mitad de las muestras werewashed con 9 ml de agua destilada que contiene 0,1% de Tween 80,
sembradas sobre nuevos platos CZP de Petri y se incubaron durante 7 días a 25 carga EO C. El CIN
de la fi lm continuación, se determinó que era fungicida si el molde no se desarrolló, y fungistática lo
contrario.
El ensayo de rendimiento antifúngico conjunto se realizó dos veces por triplicado.
2.6. Microscopía electrónica de barrido
Los cambios morfológicos en el molde resultante de la exposición a vapor de CIN EO se
estudiaron mediante SEM. Las muestras se prepararon como sigue. platos de Petri CZP se
sembraron con 100 metro L de 10 6 suspensión CFU / mL utilizando un Spatel Drigalsky estéril.
discos Whatman de 9 mm de papel que contienen 10, 20 y 30 metro L de EO canela se coloca sobre
la parte superior de la placa de Petri. Todas las muestras fueron closedwith párrafo fi LMTO simular
fugas natural de compuestos volátiles, y se incubaron a 25 Cwith el agar en la parte inferior. Después
de 6 días de incubación, una 1mm 2
trozo de agar cerca de la inhibición areawas cortado, separado y colocado en un tubo de ensayo que
contenía 2,5% de glutaraldehído en tampón cacodilate de sodio con sacarosa, dejándolo durante la
noche a temperatura ambiente durante
fi fijación. El día siguiente, el tampón de cacodilate se retiró de cada tubo y la muestra se lavó con 1
ml de agua destilada estéril durante 20 min. Las muestras se deshidrataron luego siguiendo el mismo
procedimiento descrito anteriormente y se mantiene a 4 C en la última etapa de deshidratación (100%
de etanol) para aweek hasta su uso ( Sharma y Tripathi, 2008 ). En el momento del estudio, trozos de
agar deshidratado se colocaron en una pequeña tapa deslizante y pulverización catódica con oro.
imágenes de SEM fueron adquiridas con una Inspeccionar microscopio electrónico de barrido F
(FEI), trabajando en 5 mi 30 kV y llegar a una resolución de 1,5 nm.
2.7. microspectroscopy y análisis de datos FTIR
cambios bioquímicos en las esporas resultantes de la exposición a CIN EO fueron estudiados
por FTIR microspectroscopy. Los moldes se cultivaron como sigue. placas de Petri conteniendo 15
ml de CZP se inocularon con 100 metro L de un 10 6 suspensión fúngica CFU / ml y se sembraron
con un bucle Drigalsky estéril. discos 9mmpaper Whatman que contienen 10 metro L de CIN EOwere
coloca sobre la parte superior de la placa de Petri, con el fin de
inducir una zona de inhibición en la fase de vapor culturemediumby inoculado. Las placas de Petri se
cerraron con el párrafo fi lm y se cultivaron a 25 C con el agar en la parte inferior. Las muestras de
control se prepararon de la misma manera, pero sin la adición de EO CIN al disco de papel.
Las esporas se recogieron entonces y se prepararon siguiendo dos procedimientos diferentes.
En el fi primero uno, esporas de alrededor de la zona de inhibición se cosecharon con un asa estéril,
se colocaron en un microtubo que contiene 1 ml de agua destilada esterilizada, y se sometió a dos
etapas de centrifugación de 7 min a 9892 g. Posteriormente, 600 metro L de la fi pellet final se
deposita sobre IR soportes (discos de ZnSe de espesor 4 mm con un diámetro de 40 mm). FTIR Los
espectros se recogieron en geometría de transmisión en un espectrómetro Bruker Vertex 70
interferómetro acoplada a un espectrómetro Bruker Hyperion microscopio Vis-IR 2000, el montaje de
un detector MCT. espectros de absorbancia se obtuvieron de al menos 20 puntos diferentes de cada
muestra por la co-adición de 256 barridos entre 4000 y 850 cm 1 a una resolución espectral de 4 cm 1. este
experimento fue repetido tres veces.
En el segundo procedimiento, dos regiones diferentes se consideraron por separado ( Figura 1 ),
La banda estrecha de crecimiento pobre (zona 1), y la región de crecimiento normal lejos de la zona
de inhibición (zona 2). Las esporas y sus controles fueron cosechadas después de 6, 11 y 24 días de
cultivo y se colocaron en un microtubo que contiene 1 ml de 2,5% de glutaraldehído en tampón
cacodilate de sodio con sacarosa. Después de un 2 h
fi jación período, las muestras se deshidrataron en una solución de etanol graduado (30, 50, 70, 90 y
100%) repetir cada paso 20 minutos dos veces. Antes de los análisis, los sedimentos se recogieron
con una pipeta Pasteur, depositados sobre células infrarrojos y secaron al aire, tratando de obtener
una capa uniforme. FTIR Los espectros se recogieron en un espectrómetro Bruker Vertex 70
interferómetro acoplada a un espectrómetro Bruker Hyperion 3000 microscopio Vis-IR, el montaje de
un detector de matriz de plano focal con 64
64
elementos (Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Alemania). Los espectros de absorbancia se recogieron
en geometría de transmisión entre 4000 y 850 cm 1 a una resolución espectral de 4 cm 1 con 128
barridos coadded en 2 2 el modo de binning, resultando en 32
32 simul-
espectros simul- en una única adquisición, cada uno cubriendo un área de muestra de 5,3 5.3 metro metro
2. Varias adquisiciones weremade para cada muestra, en lugares escogidos con la ayuda del
microscopio óptico.
procesamiento de datos primarios de todos los datos se realizó utilizando el software OPUS (v.
6.5, Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Alemania). Después de corregir los espectros para artefactos
atmosféricos, fi -Primer orden espectros derivados se calcularon utilizando el algoritmo de
Savitzky-Golay con 9 puntos de suavizado. análisis de datos posteriores se realizó usando
procedimientos personalizados dentro de Igor Pro (v. 6, Wavemetrics, Portland, OR, EE.UU.).
3. Resultados y discusión
3.1. MIC y MFC
tabla 1 resume los resultados para las concentraciones inhibidoras y fungicidas mínimas de
aceite esencial de canela en directo
Figura 1. zonas de crecimiento en la placa de Petri utilizada para el análisis FTIR.
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contactar con A. Florida Avus. Después de 48 (72) h de incubación bajo agitación continua, de no Tabla 2
escala de crecimiento utilizada para describir la actividad antimicrobiana.
crecimiento fue encontrado en 0,1 mg / mL. Este MIC era ligeramente dependiente de la
concentración de la suspensión fúngica, con un valor inferior para el 10 4 CFU / ml y 10 3 inóculos CFU Nivel Descripción

/ mL. Una tendencia similar se encontró para el MFC, donde era necesario una dosis EO superior 0 Sin crecimiento

para matar el hongo en 10 6 y 10 5 CFU / mL. Esta dependencia de la actividad de la concentración 1 A partir crecimiento observado, unsually el borde de la placa de Petri

inicial de hongos ha sido señalado por otros autores también ( Rasooli et al., 2006 ). 2 evidente crecimiento, alcanzando el medio de la placa de Petri (50% de la
superficie de ensayo)
3 Fuerte crecimiento desarrollado (75% de la superficie de ensayo)

4 Crecimiento sobre la superficie completa (100%)

En un trabajo previo en nuestro laboratorio, se realizó la prueba sameMIC / MFC para evaluar la
actividad antifúngica de CIN EO ( Cinnamomum zeylanicum), orégano EO ( Origanum vulgare) y éster
Además de la actividad antifúngica de corto plazo de la PET fi LMS, se estudiaron tres aspectos,
de lauramida Arginate de etilo (LAE) ( Manso et al., 2010 ). Entre ellos, CIN EO dio los valores más
la largo termdurability y la estabilidad del efecto, y su fuerza. En cuanto a la durabilidad del efecto
bajos en contra de la misma cepa A. Florida Avus A las 10 6 UFC /
antifúngico, inhibición total se mantuvo después de extender el período de incubación de dos meses
a 25 C. Esto demuestra la liberación progresiva de las sustancias activas, que está controlado por la
ml. Rasooli et al. estudiado la actividad antifúngica de dos variedades de tomillo EO contra Aspergillus
formulación de revestimiento.
niger y Aspergillus parasiticus
( Rasooli y Owlia, 2005; Rasooli et al., 2006 ). En el fi primer caso, una MIC de 0,125 mi 0.250 mg / mL
(125 mi 250 ppm) se encontró dependiendo de la variedad de tomillo, con valores de MFC de 250 mi 500
La identificación de los compuestos responsables del efecto antifúngico y cuantificación de ellos
ppm. Nuestros resultados muestran que la canela es un agente ligeramente más fuerte que la
en la atmósfera alrededor del molde puede llevarse a cabo por GC mi SRA. Por lo tanto, es posible
determinar los componentes de mayor y menor de una EO dado, y para identificar las sinergias entre
Matricaria chamomilla Florida ower EO probado por Tolouee et al. (2010) y muchmore activo que el O.
los compuestos. En trabajos previos de nuestro laboratorio que analizan la misma EO empleada en
vulgare EO evaluó byMitchell et al. A las 10 6 sp / ml ( Mitchell et al., 2010 ), Que produjo una MIC de
este trabajo ( Goni et al., 2009; López et al, 2005, 2007a.; López, Sánchez, Batlle, y Nerín, 2007b ), Se
0,6 mg / ml y un MFC de 1,25 mg / mL. Como resultado, este trabajo demuestra que EO canela es un
encontró que cinamaldehído es la principal A. Florida Avus inhibidor, y que la concentración de
agente antifúngico fuerte en comparación con otras sustancias.
eugenol (otro antimicrobiano bien conocido) también es relevante. La relación entre estos
compuestos depende del origen de la EO, por ejemplo, a partir de la corteza o de las hojas de la
planta. También se encontró efecto sinérgico de cinamaldehído frente A. Florida Avus, donde la
fortificación de la EO natural con este signi compuesto fi cativamente aumentó la actividad
3.2. rendimiento antifúngica de materiales activos antimicrobiana.

A diferencia de las bacterias, que crecen rápidamente, el crecimiento de moho es relativamente

lento, con controles de A. Florida Avus pueda 4 días para cubrir la superficie de la placa de Petri
completamente. Con el fin de describir el crecimiento de moho y la actividad de los materiales de La estabilidad del material activo se comprobó llevando a cabo el mismo experimento reportado
embalaje, se utilizó la superficie de la placa de Petri para construir una escala cualitativa ( Tabla 2 ). en Figura 2 en las mismas condiciones, pero utilizando material que había sido almacenado a 4ºC
En esta escala, un bajo índice indica una fuerte actividad antimicrobiana, es decir, crecimiento durante dos meses. Los resultados de estos experimentos fueron los mismos que aquellos con
deteriorado ( Wallstrom, Stromberg, y Karlsson, 2005 ). El desarrollo de A. Florida Avus expuesto a sustratos frescos, lo que demuestra la estabilidad de la fi LMS.
PET activa a carga CIN EO 2% se informa en Figura 2 . el 10 4 suspensión CFU / mL fue totalmente
inhibida por el 2% fi LMS, y un mayor contenido de aceite esencial (de 4% a 8% CIN EO fi LMS) Finalmente, se evaluó la resistencia a largo plazo de la actividad a través del personaje
causada inhibición total para todas las suspensiones en estudio (10 4, 10 5 y 10 6 CFU / ml). Esos datos fungistático o fungicida de la inhibición. La mitad de las muestras que exhibieron inhibición total
no se incluyen en el Figura 2 . fueron liberados de la presencia del aceite esencial mediante la sustitución de la fi lmwith una tapa de
cubierta estéril, mientras que el otro medio se cosecharon, re-sembraron en nuevas placas de Petri y
se cultivaron como anteriormente. No se observó crecimiento en todo caso, con fi confirmando el
efecto fungicida a largo plazo de la PET activo fi LMS.
Como se ha mencionado anteriormente para el MIC y MFC, la concentración inicial del inóculo
juega un papel esencial en el grado de inhibición. Las suspensiones más diluidas (10 4 CFU / ml) se
inhibió completamente incluso con el más bajo exposición CIN EO, mientras que las suspensiones
intermedios (10 5 CFU / ml) se deteriora parcialmente, sin crecimiento hasta el tercer día y sólo
desarrollo medio después de 12 días de observación. El inóculo más concentrada (10 6 UFC / ml) fue
ligeramente retrasado, alcanzando su pleno desarrollo un día después que el control. Este
comportamiento sugiere que los compuestos activos liberados por el envase activo afectan el
desarrollo inicial de los moldes, produciendo un retraso en el crecimiento que puede atribuirse a un
efecto fungistático a aquellas concentraciones.

tabla 1
Concentración inhibitoria mínima (MIC) y la concentración fungicida mínima (MFC) para CIN EO en Aspergilo Florida Avus.

CFU / mL MIC (mg / ml) Dakota del Sur MFC (mg / ml) Dakota del Sur

10 6 0.1 0.05 0.2 0.01

Figura 2. Desarrollo de A. Florida Avus bajo el efecto de 2% CIN EO liberado de PET activo, durante 12 días. La escala
10 5 0.1 0.01 0.1 0.01
del eje vertical se describe en Tabla 2 . Crecimiento de las de alta y media suspensiones fúngicas (10 6 y 10 5 CFU / ml,
10 4 0.05 0.01 0.1 0.05
respectivamente) era retrasado en relación con muestras de control. leyenda de símbolos: el control;
10 3 0.05 0.01 0.05 0.01
PET 2% (10 6 CFU / ml); - PET 2%
Resultados expresados ​como mg / mL desviación estándar. (10 5 CFU / ml).
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Fig. 3. Las imágenes SEM de las muestras de control. A, B: Vista general, mostrando un crecimiento normal de la no expuesta A. Florida Avus. Muchos hifas son vistos cubriendo toda la superficie. C, D, E: Detalles de un hifas y conidióforos. Las hifas
cuentan con una forma tubular y tener conidióforos esféricas, completamente formados en la punta. F: Detalle de conidios que cubren toda la superficie de la conidiophore y con espículas característicos en la superficie.

3.3. Comparación de materiales
La combinación de los resultados aquí con el trabajo previo de nuestro laboratorio ( Gutiérrez,
Sánchez, et al., 2009; López et al, 2007a, 2007b.; Montero et al., 2009; Montero-Prado,
Rodríguez-Lafuente, y Nerín, 2011; Rodríguez et al, 2007., 2008; Rodríguez-Lafuente, Nerín, y Batlle,
2010 ), Tratar con otros polímeros y papel como envases activos, varias características interesantes
pueden ser destacados. El fondo común es que todos los materiales contenidos CIN EO como
agente activo incorporado con tecnología de revestimiento, pero usando una fórmula diferente
dependiendo del sustrato.
Para concentraciones muy bajas de Rhizopus stolonifer ( 10 2 CFU / ml), papel activo cargado con
0,15 mi 0,9 g / m 2 de CIN EO fueron evaluados utilizando metodología similar a la aquí ( Rodríguez et
al., 2008 ). En ese experimento, la actividad se inició a 0,3 g / m 2, y la inhibición total se encuentra en
0,9 g / m 2. En esta concentración, actividad antifúngica disminuyó fuertemente, con themold que
cubre el 64% y 16% del área de placa de Petri para 0,6 y 0,3 g / m 2 de carga, respectivamente
(resultados se han recalculado a partir de los informes originales de diámetro, con el fin de ser
consistentes con el presente trabajo). Hemos obtenido resultados similares para concentraciones de
inóculo más altas (datos no publicados).
La misma tendencia con respecto a la carga CIN EO y la concentración inicial de inóculo se
encontró para otros sustratos poliméricos ( López et al, 2007a.; Montero-Prado et al., 2011 ), Que
conduce a la conclusión general de que cuanto mayor sea el contenido de EO nominal en el
revestimiento activo, más fuerte es la actividad antifúngica ( Rodríguez et al., 2008 ), Y más alta la
suspensión fúngica inicial, mayor es el contenido de EO necesaria para obtener una inhibición total.
Un análisis más detallado de los datos revela que el plástico fi LMS (PET, PP y PE / EVOH)
muestran características similares, lo que indica que la liberación del aceite esencial de canela a
partir del polímero para el microorganismo se produce de la misma manera, sin una fuerte
dependencia del sustrato. Esto demuestra que los compuestos activos están integrados en la
formulación de revestimiento, y que la interacción con la superficie del polímero (absorción,
degradación) es insignificante.
Por otro lado, se necesitaba una carga CIN EO mayor para el papel activo. Esto puede
explicarse (a) por la porosidad y mayor grosor del papel, lo que ralentiza la liberación EO a la
atmósfera, (b) por una liberación más lenta de la fromparaf aceite esencial fi n recubrimiento que del
revestimiento de plástico, o (c) por una combinación de ambos efectos.
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Fig. 4. Las imágenes SEM de las muestras tratadas. A, B: Efecto de la 10 metro L CIN de hifas ( UNA) y conidióforos ( SEGUNDO). C, D: a 20 metro L CIN, aumento de los daños de las hifas ( DO) e interrumpido conidios ( RE) son apreciados. E, F: A 30 metro L CIN,
hifas individuales son indistinguibles y el crecimiento conidial se inhibe completamente.
3.4. Microscopía electrónica de barrido
El disco de papel activo crea un área de inhibición sobre la placa de Petri, donde se inhibe el
crecimiento, y se observa una zona clara alrededor de donde sólo micelio blanco está presente y una
fuerte disminución en la esporulación. Este anillo se considera como expuestos a subinhibitorias
concentración de aceite esencial, y los cambios morfológicos evidentes pueden ser apreciados
debido a la exposición a la fase de vapor CIN EO. SEM permite la observación directa de estos
cambios físicos en la célula con alta resolución espacial.
Como se informó en Fig. 3 , Micelios ordenados individuales pueden ser claramente
distinguido en las muestras control, y una gran cantidad de conidióforos bien formada crecen al final
de sus puntas (3a, 3b). Las hifas son fi filamentosa, con una forma tubular y una estructura regular
(3c). Todos los conidióforos son globular, formando cabezas esféricas que contienen conidios
inflamado dentro (3d, 3e). Como se muestra en detalle en (3f), la ultraestructura típico de conidios
cuenta con espículas que cubren toda la superficie.
Por otro lado, las imágenes de las muestras expuestas a 10, 20 y 30 metro L de CIN EO
mostrar daño evidente y una inhibición característica de la esporulación ( Fig. 4 ). A las 10
EO canela (4a, 4b), los compuestos volátiles causan la interrupción de las hifas, que aparecerá
mezclado
375
y pegados entre sí, formando una masa celular irregular. Pocas conidióforos se encontraron en esta
concentración de OE, y ofrecieron un gran número de conidios incompleta. con 20 metro L de canela
(4c, 4d), se encontró que sólo las esporas individuales, y el típico aspecto regular e hinchado del
conidio se había perdido. También se encontró que las hifas fueron más adherido, formando una
masa cada vez más homogénea. A las concentraciones más altas CIN EO, hifas individuales eran se
observó una inhibición indistinguibles y total de la esporulación ( Fig. 4 e y f).
Dos razones podrían explicar este efecto. Una hipótesis es que el retraso del crecimiento
causado por el CIN EO induce la formación incompleta de los conidios, lo que resulta en el
crecimiento frustrado, lo que podría ser consistente, así como con los resultados del estudio FTIR.
Alternativamente, también es posible que el aceite esencial de causa daño a los conidios después de
la conidiophore se ha formado, lo que resulta en un cabezal de vesículas no estructurada.
Estas observaciones son consistentes con los de otros autores, que informó de las anomalías en
la estructura de la pared celular, se rompen e hifas agregada, la pérdida de citoplasma, una fuerte
disminución en el número de conidios y conidióforos con desarrollo anómalo ( Helal, Sarhan, Abu
metro L de Shahla, y Abou El-Khair, 2006; LopezMalo, Alzamora, y Palou, 2002; Tolouee et al., 2010 ).
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Fig. 5. espectro típico FTIR de A. Florida Avus ( superior) y fi derivado primera para una muestra y su control (3 mediciones cada una) después de 24 días de exposición al vapor de canela EO.

3.5. El análisis FTIR

El objetivo de este análisis fue solamente las esporas, dada su función reproductiva y el hecho
de que producen micotoxinas. Además, las esporas se pueden cosechar a partir de la placa de Petri
sin contaminación ( Fischer, Braun, Thissen, y Dott, 2006 ). Sin embargo, es bien sabido que las
células pueden sufrir cambios cuando son retirados de su medio original. Por esta razón, son
rutinariamente fi fijos con el fin de evitar fuerzas de tensión entre el intracelular Florida uid y el aire
externo, garantizando así la calidad de los espectros de IR ( Gazi et al., 2005 ). Sin embargo, las
células también pueden deshidratarse por centrifugación, se minimiza el efecto negativo del proceso
de secado al aire, evitando la posible interferencia de los disolventes con el espectro IR de la
muestra.

El disco de papel con el aceite esencial produce una zona de inhibición sobre la superficie del
plato Petri, donde se altera el crecimiento ( Figura 1 ). Alrededor de esta zona, se observa una clara
zona donde está presente sólo micelio blanco y una fuerte disminución de la esporulación se nota.
Lejos de la zona de inhibición de la formación de mohos es aparentemente normal.

Fig. 5 muestra espectros de absorción FTIR típica de A. Florida Avus en el intervalo de número
de onda entre 1900 y 900 cm 1. Los espectros se han normalizado con el fin de permitir la
comparación entre las curvas, y las bandas de error representan la variabilidad de la señal como la
Fig. 6. micrografía típica de una región de la muestra en estudio. Cada cuadrado representa un elemento del detector
desviación estándar. La banda a 1725 cm 1 corresponde a C] O (sólo los que se consideran para contener la muestra se han dibujado). Nota cómo el fi ltrado criterio descarta regiones
con solamente hifas o demasiado pequeña muestra.
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Fig. 7. Posición de la banda Amida I en las muestras estudiadas. Las barras de error son desviaciones estándar. Las estadísticas pobres para las muestras de 11 días se deben a la baja recuento de esporas en las muestras, causada por la escasa cobertura de la
compatibilidad con infrarrojos.
estiramiento de los lípidos. los fi región de huella digital entre 900 y 1050 cm 1, característico de
azúcares, es conocido por ser muy variable debido a la contribución de muchas bandas
superpuestas ( Szeghalmi, Kaminskyj, y Gough, 2007 ). Del mismo modo, la región entre 1300 y 1150
cm 1, correspondiente a los ácidos nucleicos, también es muy variable debido a las mutaciones
frecuentes de los moldes.
Con el fin de cubrir el apoyo IR homogéneamente y tienen un suf fi cantidad ciente de la muestra,
la fi procedimiento de preparación primer considerado todas las esporas de la placa de Petri. Como
resultado, sólo un pequeño porcentaje de las células en cada muestra fueron realmente afectada por
el CIN EO. Esto explica la falta de significación fi diferencias signifi entre las muestras expuestas y sus
controles. Aunque el análisis de clúster grupos precisión los espectros correspondientes a cada
muestra, es incapaz de distinguir muestras expuestas de los controles.
El segundo procedimiento de preparación de muestras destinado a mejorar la señal
correspondiente a las esporas afectados por el aprovechamiento de dos zonas distintas. En este
caso, el DIF fi cultades surgieron en el proceso de deposición, ya que la cobertura de soporte IR era
muy escaso. Como consecuencia, el procesamiento de los espectros FTIR se involucró más, ya que
sólo parte del área cubierta por el detector contenía la muestra. Esto se enfrentó con una costumbre fi filtro, mínimas inhibitorias y fungicidas esenciales, el efecto de la diferente carga de EO en el crecimiento
que utiliza la información de espectro de desprenderse de elementos detectores sin suficiente
cobertura de la muestra, como se muestra en Fig. 6 . Las ligeras diferencias entre el marcador y la
muestra, que son más evidentes en la parte superior de la imagen, se deben a la paralaje entre el
detector y la cámara del microscopio.
Los mayores cambios en el espectro IR aparecen en la banda Amida I. Fig. 7 informa de la
posición del pico de amida I en las zonas de la muestra a las 6, 11 y 24 días (barras de error son la
desviación estándar, y las estadísticas pobres para las muestras de 11 días son debido al pequeño
número de esporas en la región analizada). La posición del pico se mantiene sin cambios en 1,630
cm 1 Para el fi primera 11 días, y es el mismo para las muestras expuestas y sus controles. Sin
embargo, a los 24 días de la banda se desplaza hacia w 1637 cm 1 en el caso del control y la zona 2,
mientras que un signi fi el cambio más pequeño cativamente se ve en el caso de la zona 1 ( w 1632 cm 1).
La amida II y III picos siguen esta tendencia, así, aunque el desplazamiento es menor. Tales cambios
en la banda de amida I se han explicado por los cambios conformacionales en las proteínas de la
muestra ( Saulou et al., 2010 ). El trabajo previo en nuestro laboratorio analizó la atmósfera creada por
el envase activo en la placa de Petri ( López et al., 2007b ), Que muestra que la presencia de A. Florida
Avus alterado la composición con signi fi diferencias signifi en las concentraciones de eugenol, una y segundo-
pineno, canfeno y pag- cimeno. Además,
377
la atmósfera de Forti fi ed EO canela, que inhibió completamente el molde, no se vio afectada. Estos
resultados apoyan firmemente nuestra interpretación de que el cambio en la banda Amida I se debe
al efecto de EO en el molde.
Aunque los resultados de FTIR no son concluyentes por sí mismos, apoyan los resultados del
estudio de SEM que el EO canela afecta al proceso de crecimiento de A. Florida Avus, pero no la
supervivencia de la espora, una vez que se desarrolle completamente, es decir, matar themold es dif
muchmore fi culto que evitar su crecimiento.
4. Conclusiones
Además de los obstáculos asociados al trabajo con células vivas, tales como el carácter
destructivo de la mayoría de las técnicas de análisis, que trata de moldes presenta el DIF adicional fi cultades
de mutaciones frecuentes y el crecimiento lento en comparación con las bacterias. Estudiar el efecto
de los agentes antimicrobianos requiere una combinación de métodos tales como el propuesto en
este trabajo. Hemos presentado una profunda visión general de la actuación antifúngica de los
materiales de envasado basados ​en Active canela, incluyendo las concentraciones de aceite
de moho, el daño celular observada por SEM causada por las sustancias activas y los cambios más
significativos en el espectro del infrarrojo medio, proporcionando una nueva visión sobre el modo de
acción del aceite esencial de canela en A. Florida Avus.
Los resultados combinados demuestran la eficacia del aceite esencial de canela como
compuesto antifúngico, independientemente del sustrato de la que se entrega. En general, de
plástico fi LMS requiremuch menos carga EO CIN que el papel activo para inhibir themold, lo que
podría ser explicado por las diferencias en el recubrimiento o por el material en sí (por ejemplo,
porosidad). Sin embargo, ambos sustratos tienen una excelente eficacia y la estabilidad a largo
plazo. Esto abre una amplia gama de aplicaciones industriales, en particular para la fi campo del
envasado de alimentos donde A. Florida Avus contaminación es un problema importante. Hemos
demostrado que es posible elegir entre diferentes sustratos y desarrollar soluciones a medida
adaptadas a la situación particular y el producto alimenticio, sin comprometer la eficacia del aceite
esencial como agente antimicrobiano.
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen a L. y G. Vaccari Birarda de la línea de luz de sincrotrón en el laboratorio
SISSI Elettra por su ayuda con el HR-FTIR
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mediciones, Íñigo Echaniz y Carlos Cuestas del FTIR y los servicios de Microscopía Electrónica,
respectivamente, del Instituto Aragonés de la Nanociencia (INA) de la Universidad de Zaragoza. S.
Manso es apoyado por el número de subvención / contrato BES-2009-
022061. El apoyo financiero fue proporcionado generosamente por el Ministerio de Ciencia e
Innovación español y por los fondos FEDER, con el número de proyectos AGL2008-04363.
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