3.

Métodos de cuantificación de proteínas: método de Bradford, Biuret y

Lowry.

Tipo de práctica: Duración: Indicaciones de peligro:

Grupal (2 personas) 4 horas No presenta indicadores de peligro

OBJETIVOS
 Comparar los métodos de cuantificación de proteínas.
 Determinar el rendimiento y pureza de una proteína: Caseína.
 Apreciar el uso de las técnicas espectrofotométricas para la cuantificación de material
biológico.

Conceptos relacionados: Ley de Lambert-Beer, reactivo de Biuret, reactivo de Bradford, curva

de calibración, caseína, reactivo de Lowry.

FUNDAMENTO TEÓRICO
Para el estudio de la estructura de una proteína, de la actividad de una enzima o el contenido
proteínico de un alimento, es necesario conocer cuantitativamente la concentración de las
proteínas.

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se

basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la
formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de formar complejos
colorimétricos.

Entre los métodos que se basan en la formación de complejos colorimétricos entre las proteínas
y reactivos específicos se encuentran:
 Método de Bradford
Está basado en el cambio de color del colorante azul brillante de Coomassie en respuesta a
diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos
(especialmente arginina) y aromáticos. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un
cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este método
se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con
colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la

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proteína. Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-
465nm).

Figura1. Estructura del azul de Coomassie.

 Método de Lowry

Es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un

reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color
proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer.

Este método consta de dos etapas:

a. Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los
átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu 2+-proteína tienen un color
azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la
proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda
etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con
tartrato.
b. La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos
fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el
cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido
fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar
a un complejo de color azul intenso.

 Método de Biuret
La reacción de Biuret es una reacción coloreada (violeta) debida a la formación de un complejo
de Cu, en un medio alcalino, con compuestos que poseen más de un enlace peptídico, como las
proteínas:

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 Figura 2. Reacción de Biuret.
La curva de patrón es un método en química analítica empleado para medir la concentración de
una sustancia en una muestra por comparación con una serie de compuestos de concentración
conocida. Se basa en la existencia de una relación en principio lineal entre un carácter medible
(por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometría) y la variable a determinar
(la concentración). Para ello, se efectúan diluciones de una muestra patrón cuya concentración
es conocida y se registra la lectura del analito presente en cada dilución, estableciendo una
función matemática que relacione las dos variables “concentración vs variable de respuesta”.
Esto se denomina curva de calibración la cual, será útil para determinar la concentración de la
muestra problema.

En la tabla 1 se resumen las características de cada método de cuantificación de proteínas

mencionado previamente.
Tabla 1. Principales métodos para la cuantificación de proteínas y sus rangos de sensibilidad.
Método Rango de sensibilidad (µg) Ventajas Aplicaciones
Bradford 1-15  Limite bajo de  Resultados rápidos
detección  Muestras que contienen
 Compatible con agentes reductores
agentes reductores
 Rapidez
Lowry  25-100 a 500nm  Color estable  Útil para cuantificar
 2-30 a 660 nm  Preciso proteínas de membrana
 1-2 a 750 nm
Biuret  1000-10000  Muy específico para  Determinación de
proteínas. proteínas en cereal.
 Muestra pocas
interferencias
 Es barato

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MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales Reactivos
15 tubos de ensayo Reactivo de Bradford
Micropipetas de 100 y 1000 µL Reactivo de Biuret
Gradilla para tubos de ensayo Reactivo de Lowry
Agitador Vortex Reactivo de Folin-Ciocalteu 1.0 N.
Espectrofotómetro Albúmina sérica bovina (BSA) 10 mg/mL
Agua destilada
NaCl al 1% (p/p)
NaOH 1.0 M
Muestras problema: M1 y M2
PROCEDIMIENTO
1. Método de Bradford
Preparación del reactivo de Bradford
Para 500mL de reactivo de Bradford
 Mida 25mL de etanol al 95% (v/v) en una probeta y protéjalo de la luz con papel aluminio
 Pese 50 mg de azul de Coomassie G-250
 Mida 50 mL de ácido orto fosfórico al 85% (v/v)
 Agregue los 50 mg de azul de Coomassie G-250 al etanol lentamente en agitación constante

Preparación curva de calibración

La curva de calibración debe ir en la misma solución o buffer en el que se encuentran las
muestras. Idealmente medir triplicado cada patrón.

 Preparar una solución inicial del albumina (BSA) de 1mg/mL utilizando agua destilada como
disolvente.
 Prepare los patrones de acuerdo a la tabla 1.
Tabla 1. Especificaciones para la preparación de los patrones de BSA

#Patrón μL de BSA (1mg/mL) μL sln Buffer o H2O Concentración (mg/mL )

1 100 900 0.1

2 200 800 0.2
3 300 700 0.3
4 400 600 0.4
5 500 500 0.5

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 Preparar el blanco: 1mL de Buffer o H2O y 1 mL de reactivo de Bradford
 Pasar el blanco en el espectrofotómetro a 595nm y establecer 0 o línea base
 De cada uno de los patrones preparados agregue 50 µL, 950 µL de agua y mezclar con 1 mL
de Bradford, como se muestra en la tabla 2.

Tabla 2. Especificaciones para la curva de calibración de Bradford.

Concentración
μL de patrón μL sln Buffer o μL reactivo de
Tubo final proteína
de referencia H2O Bradford
(µg/mL )
Blanco - 1000 1000 0.0
Tubo 1 50 950 1000 2.5
Tubo 2 50 950 1000 5.0
Tubo 3 50 950 1000 7.5
Tubo 4 50 950 1000 10.0
Tubo 5 50 950 1000 12.5

 Mezcle por inversión, y deje actuar por 3 minutos.

 Leer la absorbancia a 595nm de cada patrón preparado en la tabla 2.
 Construya la curva de calibración: Y=mX+b, donde los datos de concentración de proteína
son los valores de x y los datos de absorbancia corresponden a los valores de y.
 El docente entregará dos muestras problemas, M1 y M2, para la determinación de la
concentración de proteína. Si la muestra se encuentra fuera del rango de la curva estándar,
el estudiante realizará diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000, de tal manera que se garantice que
la absorbancia de la muestra problema se encuentre dentro del rango de los datos obtenidos
en la curva de calibración.

2. Método de Biuret

Preparación del reactivo de Biuret

Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y 6,7 g NaEDTA en 700 ml de H2O. Mientras se agita, añadir 200
ml de NaOH 5.0 N y luego 1g de KI como estabilizante. Guardar en frasco de plástico.
Preparación curva de calibración

 Preparar una solución inicial del albumina (BSA) de 10 mg/mL.

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 Prepare los patrones de BSA de acuerdo a la tabla 3.

Tabla 3. Especificaciones para la preparación de patrones de BSA para cuantificación método de

Biuret.

#Patrón mL de BSA (10 mg/mL) mL sln Buffer o H2O Concentración (mg/mL )

1 0.2 1.8 1.0

2 0.4 1.6 2.0
3 0.6 1.4 3.0
4 0.8 1.2 4.0
5 1.0 1.0 5.0
6 1.2 0.8 6.0

 De cada uno de los patrones preparados en la tabla 3, mezclar 500 µL con 750 µL del
reactivo de Biuret (ver tabla 4). Prepare el blanco mezclando 500 µL de agua (o buffer) con
750 µL del reactivo de Biuret.

Tabla 4. Especificaciones para la curva de calibración para Biuret

μL sln Buffer o μL reactivo de Concentración final

Tubo μL de patrón de referencia
H2O Biuret proteína (mg/mL )

Blanco - 500 750 0.0

Tubo 1 500 - 750 0.4
Tubo 2 500 - 750 0.8
Tubo 3 500 - 750 1.2
Tubo 4 500 - 750 1.6
Tubo 5 500 - 750 2.0
Tubo 6 500 - 750 2.4

 Mezcle por inversión, y caliente por 5 minutos a 37 °C o deje actuar por 30 minutos.
 Leer la absorbancia a 545 nm del blanco y ajustar a cero.
 Leer la absorbancia de cada patrón a la longitud de onda seleccionada.
 Construya la curva de calibración: Y=mX+b, donde los datos de concentración de proteína
son los valores de x y los datos de absorbancia corresponden a los valores de y.

6
 Determine la concentración de M1 y M2 por este método. Si la muestra se encuentra fuera
del rango de la curva estándar, el estudiante realizará diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000, de
tal manera que se garantice que la absorbancia de la muestra problema se encuentre dentro
del rango de los datos obtenidos en la curva de calibración.

3. Método de Lowry
Preparación del reactivo de Lowry
La preparación del reactivo de Lowry se debe realizar al momento de utilizarse para garantizar
mejores resultados. Para ello, se deben preparar tres soluciones:
Solución A: carbonato sódico al 2% p/v en NaOH 0.1M y guardar a temperatura ambiente.
Solución B: Sulfato cúprico al 1% p/v y guardar a temperatura ambiente.
Solución C: Tartrato de sodio-potásico al 2% p/v y guardar en el refrigerador.

El reactivo de Lowry se prepara mezclando 50 mL de la solución A, 0.5 mL de la solución B y 0.5

mL de la solución C.

Preparación curva de calibración

 Preparar una solución inicial del albumina (BSA) de 1 mg/mL.
 Prepare los patrones de BSA de acuerdo a la tabla 5.

Tabla 5. Especificaciones para la curva de calibración método de Lowry.

Concentración
#Patrón mL de BSA (1 mg/mL) mL sln Buffer o H2O mL reactivo Lowry
(mg/mL )

Blanco - 1.0 5.0 0.000

1 0.2 0.8 5.0 0.033
2 0.3 0.7 5.0 0.050
3 0.4 0.6 5.0 0.066
4 0.6 0.4 5.0 0.100
5 0.8 0.2 5.0 0.133

 Mezclar por inversión cada tubo y dejar reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Cubrir el tubo con papel aluminio o mantener en la oscuridad.
 Agregar a cada tubo 0.5 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu 1.0 N.
 Mezclar por inversión y dejar en reposo durante 30 minutos en la oscuridad.
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 Calibrar el espectrofotómetro a una longitud de onda de 580 nm y ajustar a cero con el
blanco.
 Construya la curva de calibración: Y=mX+b, donde los datos de concentración de proteína
son los valores de x y los datos de absorbancia corresponden a los valores de y.
 Determine la concentración de M1 y M2 por este método. Si la muestra se encuentra por
fuera del rango de la curva estándar, el estudiante realizará diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000,
de tal manera que se garantice que la absorbancia de la muestra problema se encuentre
dentro del rango de los datos obtenidos en la curva de calibración.
 Determine el coeficiente de extinción molar para los tres métodos utilizados.

Reporte sus resultados en la siguiente tabla:

1. Método de Bradford
Patrón Proteína (µg/mL) Absorbancia Factor de dilución Proteína (mg/mL)
1 2.5
2 5.0
3 7.5
4 10.0
5 12.5
M1
M2
2. Método de Biuret
Patrón Proteína (mg/mL) Absorbancia Factor de dilución Proteína (mg/mL)
1 0.4
2 0.8
3 1.2
4 1.6
5 2.0
6 2.4
M1
M2
3. Método de Lowry
Patrón Proteína (mg/mL) Absorbancia Factor de dilución Proteína (mg/mL)
1 0.033
2 0.050
3 0.066
4 0.100
5 0.133
M1
M2

 Disposición de los residuos

Los residuos químicos generados en la práctica de laboratorio deben ser descartados en el

recipiente apropiado, rotulado de acuerdo al tipo de sustancia.
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CUESTIONARIO PREVIO AL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA DE LABORATORIO

1. Defina con sus propias palabras ¿qué es una curva patrón?

2. ¿Qué cuidados se debe tener en la práctica para garantizar la precisión en la cuantificación de
proteínas?
3. ¿Qué es y qué importancia tiene el uso de un blanco en un experimento?
4. Explique por qué en el método de Biuret la absorbancia de una proteína se lee a una longitud
de 545 nm.
5. ¿Cuál método es el más sensible?, y ¿el menos sensible? ¿Por qué?
6. Decide qué método de determinación de proteínas elegirías para la cuantificación de
proteínas en: suero, orina, durante una purificación enzimática, en un extracto bacteriano
concentrado, en preparaciones de membranas plasmáticas solubilizadas con SDS, en
preparaciones de membranas mitocondriales solubilizadas con Tritón X-100. Justifique su
respuesta.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Lehninger A, Nelson DL, Cox M (1997). “Principles of Biochemistry”, Worth Publishers, 2º
edición.
2. D. Voet, JG Voet, CW Pratt. “Fundamentos de Bioquímica”. Editorial Médica Panamericana. 2ª
Ed.Bioquímica, Madrid, 2007.
3. Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-
254.
4. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., and Randall, R. J. (1951) Protein measurement
with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275).
5. Gornall A, Bardawill CJ, David MM (1949). Determination of serum proteins by means of the
biuret reaction. J Biol Chem. 177: 751–766.
6. Determinación de proteínas por el método de Lowry. (Online)
https://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/4.pdf (Consultada el 15 de octubre de 2017).