MODELAMIENTO DEL EFECTO DEL CLORURO DE SODIO SOBRE EL

CRECIMIENTO Y LA PRODUCCIÓN DE NISINA DE Lactococcus lactis.

RESUMEN

Lactococcus lactis es una bacteria ácida láctica que generalmente se encuentra en la leche y

productos lácteos. Se caracteriza por producir nisina el cual tiene efecto antimicrobiano. Su

aislamiento permitirá utilizarlo en la conservación de alimentos que tienen compromiso

con bacterias patógenas responsables de las ETAs. El bjetivo del presente estudio fue

estimar la bondad de ajuste de la curva de crecimiento de L. lactis mediante el uso de

modelo de Gompertz modificado y obtener parámetros cin icos para ser utilizados en

modelos secundarios que estimaron el efecto del cloruro de sodio en concentraciones de 2,

4 y 6% sobre su biocinética de l crecimiento celular y la producción de bacteriocinas. Se

investigaron, en condiciones in vitro, fermentaciones usando el caldo MRS con glucosa 20

g/L. Se midieron el consumo de glucosa, producción de ácido láctico, p cción de

biomasa y nisina, bajo el efecto de las concentraciones creciente de sal. Los resultados

demostraron que el modelo de Gompertz modificado explica el crecimient de L. lactis

obteniendo una velocidad de crecimiento específico de .30 Log UFC/mL/h. Así mismo, el

crecimiento celular y la actividad de bacteriocinas se vieron afectados por los cambios en

la concentración de sal. La concentración de NaCl al 2% no afecta sustancialmen e el

crecimiento y la actividad de la nisina. El efecto neg vo de concentraciones mayores a

2% se traduce en una disminución de la producción específica de nisina (k B) y en

consecuencia en la actividad de la bacteriocina.El efecto inhibitorio del NaCl se debió

principalmente a su papel como agente reductor de a w.

1
I. INTRODUCCION

Actualmente existe una gran variedad de productos quím cos que son utilizados por la

industria en la conservación de los alimentos, pero los esfuerzos por proteger además, sus

propiedades alimenticias y gustativas aumentaron consi erablemente en los últimos años.

Si bien la conservación por adición de sustancias quím cas presenta muchas ventajas, parte

de la población rechaza fuertemente su uso por temor a sus posibles efectos tóxicos. Esto

llevó a las industrias elaboradoras de alimentos a la squeda de alternativas que permitan

suprimir la adición de tales sustancias o reducir las is para satisfacer las exigencias de

los consumidores, con el riesgo de que se puedan afect la estabilidad microbiológica del

producto

En algunos alimentos la adición de ácido acético entre 0,5% y 1,2% es una alternativa para

controlar células vegetativas de microorganismos patógenos. Aunque estas condiciones son

generalmente de carácter bactericida, un limitado grup de microorganismos acidófilos es

capaz de crecer bajo estas condiciones lo que se evidencia por la generación de dióxido de

carbono y aroma indeseable.

Por otro lado, se ha demostrado que los sorbatos retar an el crecimiento de numerosos

microorganismos, este es el antimicrobiano más utilizado en jugos, salsas y aderezos;

siendo su acción inhibitoria generalmente más pronunciada contra hongos y levaduras que

contra bacterias; Así mismo, el antimicrobiano nisina resulta efectivo contra un gran grupo

2
de bacterias Gram (+), por lo que el uso nisina-sorbato podría ser una alternativa para la

reducción de la concentración del preservador químico.

La nisina es ampliamente usada desde 1953, recientemen e recibió la calificación de

GRAS (“Generally Recognized As Safe”, sustancia recono ida generalmente como segura)

por parte de la US FDA (Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos)

para su utilización en alimentos con acidez alta y baj . Debido a las características de que

muchos alimentos procesados por la industria alimentaria, el uso de nisina en los mismos

se vería favorecido.

De todas las sustancias antimicrobianas producidas por las bacterias lácticas, las

bacteriocinas, dentro de las cuales se encuentra la ni ina, aparecen como las más adecuadas

desde un punto de vista tecnológico para ser utilizadas como conservantes de rado

alimentario. En principio, su naturaleza peptídica permite la degradación por los enzimas

digestivos, resultando así presuntivamente inocuas para el consumidor y su microbiota

intestinal de ocupación y, en algunos casos, su espectro de acción incluye a los potenciales

patógenos y alterantes asociados a los alimentos (B. cereus, S. aureus, L. monocytogenes,

Clostridium spp., etc.). Por último, sus propiedades físico-químicas las hacen resistentes a

los tratamientos térmicos y cambios de pH que sufren l alimentos durante su fabricación

y almacenamiento y, además, su pequeño tamaño permite difusión en sistemas

semisólidos, propios de la mayoría de los productos al mentarios.

Adicionalmente, las bacterias lácticas ofrecen la posibilidad de producir as bacteriocinas

in situ durante el proceso de fabricación. De hecho, se ha demostrado que muchos de los

cultivos iniciadores utilizados en sistemas alimentarios producen bacteriocina. Por lo tanto,

3
se podría evitar la adición directa de una preparación pura de la bacteriocina, que

implicaría un mayor gasto económico. La inclusión de c pas bacteriocinogénicas en los

cultivos iniciadores puede realizarse siguiendo dos estrategias diferentes. La primera es

utilizar la cepa productora como cultivo iniciador puro y segundo, como cultivo iniciador

mixto, combinando la cepa productora con una segunda e pecie microbiana resistente a la

bacteriocina y responsable, al menos en parte, de la fermentación.

Actualmente es un problema el no tener una claridad en la medición y estimación de los

valores que expresan los efectos de distintos factores físico-químicos sobre la actividad de

una bacteriocina por lo que no permite inferir su posible aplicación industrial, ya que las

altas temperaturas y las amplias variaciones de pH son, entre otras, algunas de las

condiciones que debe resistir una bacteriocina para se útil como potencial agente inhibidor

de microorganismos no deseados en procesos alimenticio (fermentaciones de leche,

maduración de quesos, curado de encurtidos, etc.).

La producción de bacteriocinas está influenciada por ersos factores, entre los que se

incluyen las fuentes de carbono y nitrógeno, las condi iones de fermentación (pH,

temperatura, agitación, concentración de Cloruro de sodio o actividad de ag etc) y en

general, cualquier variable que afecte el crecimiento bacteriano.

La nisina es una sustancia polipeptídica producida por Lactococcus lactis a partir de una

fermentación en medio lácteo modificado. La molécula exhibe su mayor estabilidad bajo

condiciones ácidas en la que también es más soluble. Sin embargo, la velocidad en que

puede metabolizar mono o disacáridos permitirá la formación de ácidos y de esta manera

generar la producción de nisina, permitiéndole manifestar la propiedad bactericida. Esta

4
correlación metabólica debe ser explorada debido a que son muy variadas las respuestas de

Lactococcus cuando utiliza sustratos diversos en los diferentes alimentos a que puede

llegar, sobre todo cuando se trabaja con cepas nativas aisladas de nuestr s alimentos.

Existen diversos modelos matemáticos que intentan describir el crecimiento de las

bacterias lácticas. Un ejemplo son las ecuaciones logísticas y las de Gompertz que pueden

ser útiles a la hora de predecir el efecto de un único factor ambient l sobre la producción

de bacteriocina y otros parámetros biológicos relevant (biomasa, evolución del pH del

medio de cultivo, etc). La principal desventaja del uso de estas ecuaciones es que han sido

diseñadas para una cepa en concreto, de manera que su xtrapolación a otras cepas, con un

crecimiento muy diferente, da resultados muy imprecisos, por esta razón es necesario

hallar sus parámetros de crecimiento y poder utilizar estos valores cuando se trata de

medir su potencial tecnológico para producir nisina en forma masiva.

Por último, cabe señalar que, aunque la producción de cteriocina sea un proceso

concomitante con el crecimiento, las condiciones óptimas para este último no implican

necesariamente un máximo en la producción de bacteriocina. Por se ha

encontrado una relación bastante lineal entre la veloc dad de bacteriocina y la velocidad de

crecimiento celular para algunas bacteriocinas, pero esta relación no se ha encontrado para

la nisina, cuya biosíntesis es muy compleja y podría depender de factores de cultivo

intrínsecos o metabolitos que se forman en el cultivo pueden alterar dicha

correspondencia entre los parámetros de crecimiento y producción de bacteriocina.

Muchos de los modelos matemáticos han sido estructurad para describir la cinética del

crecimiento celular y la producción de ácido láctico en fermentaciones acidolácticas, sin

5
embargo existen pocos modelos los cuales describen la roducción de bacteriocinas y

especialmente la nisina.

Se hace necesario establecer los parámetros de crecimiento para Lactococcus lactis cuando

es cultivado a temperatura óptima y en sustratos fermentables como la lactosa, la cual

establecería condiciones ideales para que la nisina formada se mantenga estable y con

propiedades antimicrobianas. Este comportamiento del crecimiento (Log UFC/mL) debe

ser ajustado mediante un modelo matemático apropiado como el de Gompertz, para que así

se puedan calcular los parámetros cinéticos del crecimiento en el medio de cultivo de caldo

MRS con glucosa y determinar el comportamiento de los arámetros en procesos

fermentativos en presencia de cantidades variables de uro de sodio.

El objetivo del presente estudio es el modelamiento de datos experimentales del

crecimiento de Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa usando el modelo primario de

Gompertz modificado para cuatro variables y medir el e ecto del cloruro de sodio sobre

dichos parámetros de crecimiento y la producción de nisina, utilizando modelos

secundarios.

1.1. ALCANCES DE LA INVESTIGACION

Las cepas de Lactococcus lactis generalmente son aisladas de productos lácteos o de la

leche, sin embargo no todas las cepas son apropiadas p ra su uso tecnológico, e tal forma

que primero tiene que demostrar su crecimiento en sustratos natural s o medios de cultivo

sintéticos. Su adaptación y crecimiento requiere de mu compuestos químicos que

deben existir en los sustratos o se deben incorporar.

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Por otro lado las condiciones de cultivo intrínsecas también son inconvenientes que se

deben subsanar para que de esta manera su manejo o uso tecnológico en la industria láctea

pueda ser efectiva. Por lo tanto encontrar constantes de su crecimiento bajo los efectos de

dos variables como es la concentración de su fuente limitante de su crecimiento y del

factor osmolaridad (Cloruro de sodio) permitirá que esta bacteria pueda ser accesible por

cualquier productor artesanal y aprovechar sus propied s como conservador natural pro

la producción de la nisina.

El modelo permitirá obtener una curva de crecimiento que servirá de base para que la

industria láctica artesanal, quienes no tienen acceso a controles microbiológicos por sus

costo elevados, puedan servirse de una herramienta que controlando la el pH o acidez y

midiendo la concentración de cloruro de sodio puedan inferir los niveles de UFC/mL que

pueden contener sus productos y de ésta forma predecir la vida útil, garantizando la

inocuidad del alimento.

1.2 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION

Tecnológicamente, el presente estudio, favorecería a la industria láctea y frutos

fermentables debido a que las bacterias lácticas ofrecen la posibilidad de producir las

bacteriocinas in situ durante el proceso de fabricación. De hecho, se ha demostrado que

muchos de los cultivos iniciadores utilizados en sistemas alimentarios producen

bacteriocinas. Por lo tanto, se podría evitar la adición directa de una preparación pura de la

bacteriocina, que implicaría un mayor gasto económico.

7
Así mismo, la inclusión de cepas bacteriocinogénicas en los alimentos podría realizarse

siguiendo la estrategias de utilizar la cepa productor como cultivo iniciador puro o bien

como cultivo iniciador mixto, combinando la cepa produ ora con una segunda especie

microbiana resistente a la bacteriocina y responsable, a menos en parte, de la

fermentación.

Los modelos matemáticos estiman las acciones de los microorganismos como una

respuesta a las condiciones ambientales, incluyendo aquellas presentes durante las

operaciones de producción y procesamiento de alimentos. Desarrollar un modelo

matemáticos para estimar el comportamiento de las bacterias benéficas en los alimentos

permitirá conocer las actividades de Lactococcus lactis en fases de su crecimiento

mediante el método logístico. Los resultados permitirán tener una base para el monitoreo

de la conservación de los productos lácteos, quienes no recurrirán a la incorporación de

antibióticos o inhibidores químicos por poseer en su composición sustancias antibióticas

naturales producidas por Lactococcus lactis.

El estudio se justifica porque tecnológicamente el uso de esta bacteria se haría m s simple

manejando variables como pH, temperatura o medición de la concentración de cloruro de

sodio y se podría predecir como es el comportamiento del crecimiento y de esta mane a

estar seguro que Lactococcus lactis estaría produciendo nisina otorgándole al alimento

propiedades de inocuidad. Esta situación es benéfica t o para el productor como para el

consumidor.

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Así mismo los resultados de éste estudio permitirán evitar o bajar la dosis de aditivos

químicos usados como conservadores de alimentos, y de sta manera no producir daños a

la salud por los efectos secundarios por su consumo diario.

Económicamente será mucho más rentable adicionar una b cteria productora de nisina que

los aditivos químicos, más aun cuando los efectos cola erales de los aditivos químico son a

largo plazo y de manera irreversible, consecuentemente las atenciones de salud serán más

costosas.

Actualmente no se aplica la Microbiología Predictiva a nivel industrial, debido a ue se

entiende que el uso de los modelos matemáticos es complicado y de manejo difícil para el

personal común; sin embargo, la experiencia indica que cuando los resultados en el

proceso de producción se incrementan y aseguran el man jo de los Programas de Buenas

Prácticas de Manufactura y Análisis de peligros y Punt críticos de control, las empresas

comienzan a implementar sus áreas de producción con personal profesional matemático

que esté involucrado con el tema de microbiología o la biomatemática.

El cuidado de reportar predictivamente la cantidad de bacterias productoras de antibióticos

disminuirá los riesgos de consumir un alimento que está alterándose por bacterias no

exigidas en su control por las normas, evitará que los cuadros de enfermedades gastro-

intestinales aumenten, sobre todo en tiempos en que la temperatura del ambiente se eleve.

Finalmente, el presente proyecto tiene la finalidad de aportar información científica para

cepas naturales que mantienen un genoma adaptado a una ecología microbiana muy típica

9
de nuestros alimentos, para las cuales falta aporte de datos científicos para su mejor

aprovechamiento.

II. MARCO TEÓRICO

Las bacterias lácticas se encuentran en ambientes muy variados, pero generalmente están

asociadas con sustratos ricos en nutrientes. Esto ha d erminado que en su evolución hayan

perdido muchas capacidades biosintéticas, así como la acidad de esporulación,

innecesarias en sustratos como los alimentos o el tracto gastrointestinal (Makarova y

Koonin, 2007; Pfeiler y Klaenhammer, 2007). En relación con los alimentos, forman parte

de la microbiota natural de las superficies de vegetales, aparecen con frecuencia en leche y

derivados, en productos cárnicos y en otros alimentos. En estos sustratos la acidificación y

otros cambios que acompañan el crecimiento de las bact s lácticas, como por ejemplo la

producción de compuestos antimicrobianos, exopolisacár dos y diversas enzimas,

contribuyen al aroma, textura, conservación y valor nu ritivo de una gran variedad de

productos fermentados (Kleerebezem y Hugenholtz, 2003; Wood, 1997). En general, las

bacterias lácticas toleran bien concentraciones relativamente altas de ácidos y valores de

pH más bajos que el resto de las bacterias por lo que elen llegar a predominar en los

hábitats que colonizan. Gracias a las bacterias láctic la vida útil y la calidad

microbiológica y organoléptica de los productos finale aumentan notablemente con

respecto a la materia prima original. Sin embargo, el nterés industrial de estas bacterias no

se limita a la obtención de alimentos fermentados, sin que también abarca la producción

de diversos compuestos químicos y biológicos como etanol, ácido láctico, bacteriocinas,

biopolímeros o enzimas (Leroy y De Vuyst, 2004).

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El hecho de que las bacterias lácticas y los productos de su metabolismo hayan sido

consumidos por el hombre durante tantos siglos sin ocasionar problemas, salvo en muy

contadas excepciones, ha determinado se consideren como bacterias reconocidas

generalmente como seguras (GRAS, acrónimo de Generally Recognized As Safe). Para

hacernos una idea de su inocuidad baste considerar que n europeo ingiere unos 22 kg de

leche fermentada al año, lo que equivaldría a un consumo global, tan sólo en Europa, de

8,5 × 1020 bacterias lácticas (o 3.400 toneladas) cada año, sin que se les haya asociada con

ningún problema sanitario grave (Chamba y Jamet, 2007).

Los productos fermentados suponen alrededor de un tercio de los alimentos que

consumimos habitualmente. La importancia económica de las fermentaciones a gran escala

en la industria alimentaria ha desterrado la práctica radicional de confiar en las

fermentaciones espontáneas o de utilizar como inóculo una pequeña porción de una

fermentación previa (back -slopping). Estos métodos han quedado relegados en la

actualidad a la obtención de productos fermentados en aíses en vías de desarrollo o para

la elaboración de productos fermentados artesanos, así como en ciertos casos en los que no

se conoce con precisión la sucesión de los microorganismos implicados, en países

desarrollados (Harris, 1998). En los países occidentales la práctica habitual para la

producción a gran escala de alimentos fermentados es el empleo de cultivos in iciadores. En

este caso lo que se añade es un microorganismo, o una ezcla, seleccionado previamente

por sus características fisiológicas y metabólicas. Así, se logra un estrecho control del

proceso de la fermentación y de las características del producto fin evitándose las

grandes pérdidas económicas derivadas de fermentaciones fallidas o anómalas. Un grave

inconveniente asociado a esta práctica es que con frecuencia los productos fermentados

industriales carecen de las propiedades organolépticas que caracterizan a los productos

11
artesanos elaborados sin empleo de cultivos iniciadores y que son tan apreciadas por los

consumidores (Caplice y Fitzgerald, 1999).

Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos activos frente a otras bacterias

generalmente próximas filogenéticamente a la cepa productora. Debido a su naturaleza

peptídica las bacteriocinas pueden ser degradadas por nzimas digestivas, resultando

inocuas para el hombre y su microbiota intestinal. Además, sus propiedades fisicoquímicas

confieren a estos compuestos resistencia a los tratamientos térmicos y gracias a su pequeño

tamaño pueden difundir con relativa facilidad en los a imentos. Las bacteriocinas de las

bacterias lácticas presentan un gran interés para su uso en quesería como bioconservantes.

La nisina, producida por algunas cepas de lactococos, la más estudiada y se emplea

actualmente como conservante en más de 40 países (Rodríguez, 1996).

Existen numerosas bacteriocinas producidas por bacterias lácticas y cada una de ellas

exhibe un espectro de inhibición particular. Algunas inhiben únicamente el crecimiento de

cepas relacionadas taxonómicamente con la cepa product como las lactococinas A, B y

M, activas solamente frente a Lactococcus (Ross et al., 1999). Otras bacteriocinas, en

cambio, inhiben a un amplio rango de bacterias, si bien es cierto que la acción inhibitoria

de las bacteriocinas producidas por bacterias Gramposi vas suele restringirse a otras

bacterias Gram-positivas. Con respecto a las bacterias Gram-negativas, los mohos y las

levaduras, las bacteriocinas de las bacterias lácticas tienen difícil el acceso a su lugar de

acción, la membrana plasmática. Existen algunas excepciones a este comportamiento

general. Así, la nisina A es activa frente a diversas bacterias Gram-negativas de

importancia médica, como Campylobacter , Haemophilus, Helicobacter o Neisseria (Mota-

Meira et al., 2000). Además, la congelación, el calent miento suave, la exposición al ácido

12
láctico y/o EDTA o la presión hidrostática facilita la actuación de las bacteriocinas sobre

otras bacterias Gram-negativas (Kalchayanand et al., 1992; Stevens et al., 92;

Kalchayanand et al.,1998; Arqués et al., 2005).

La producción de bacteriocinas es una característica m y extendida y conservada entre las

bacterias. Esto indica que es un rasgo ventajoso para bacteria productora, ya que le

permite adquirir una posición dominante en un determinado nicho ecológico al e liminar a

otras bacterias competidoras (Deegan et al., 2006). A ferencia de las bacteriocinas de la

clase I, que tienen un espectro de acción bastante amplio, en la clase II suele ser más

limitado. Una de las posibles razones quizá sea la necesidad de un receptor en la bacteria

sensible. Es preciso aclarar que la sensibilidad depen de la especie e incluso de la cepa.

Merece la pena destacar que las mismas concentraciones de esta bacteriocina no tienen

ningún efecto en diversas especies que frecuentemente forman parte de cultivos

iniciadores, como las del género Lactococcus (Eijsink et al., 1998; Guyonnet et al.,2000).

Con respecto a las bacterias Gram-negativas, sus cubiertas celulares impiden el acceso de

las bacteriocinas a la membrana plasmática. Sin embargo, es suficiente alterar la

permeabilidad de sus membranas externas para permitir acción antibacteriana de las

bacteriocinas. Uno de los ejemplos más clásicos es el l quelante EDTA, que une

iones magnesio del lipopolisacárido y altera la membrana externa de las bacterias

Gramnegativas, permitiendo el paso de las bacteriocinas (Stevens et al., 1991). Este modo

de acción también explica que las bacterias Gram-negativas sean sensibles a las

bacteriocinas después de haber sido sometidas a algunos nuevos métodos de conservación

que debilitan o forman poros en sus cubiertas celulare como las altas presiones

hidrostáticas (Kalchayanand et al.,1998).

13
Es muy difícil comparar la actividad de unas bacteriocinas con otras porque, aunque se han

realizado muchos ensayos, las condiciones empleadas son difícilmente comparables. Por

otra parte, a pesar de la homología entre las secuencias de las bacteriocinas de la familia de

la pediocina, existe variabilidad tanto en la especificidad de las bacterias sensibles como en

la intensidad de su actividad (Eijsink et al., 1998; F mland et al., 1996; Richard et al.,

2006). Este hecho se ha relacionado con las diferencia que existen en las secuencias de

estas bacteriocinas (Johnsen et al., 2005).

Combinar el empleo de bacteriocinas con otros métodos de conservaci (control de pH,

temperatura, sal, altas presiones hidrostáticas, pulsos eléctricos o condiciones de

almacenamiento) si se considera como una opción muy prometedora (Deegan et al., 2006;

Muriana, 1996; Stiles, 1996). Esta estrategia, conocida como “siste a de barreras

múltiples” o “teoría de los obstáculos”, podría compatibilizar la obtención de alimentos

más seguros con una reducción considerable de las cantidades de aditivos químicos y/o de

la intensidad de los tratamientos tecnológicos (Leistner, 1992). De este modo, podríamos

disponer de alimentos que conservan mejor sus propiedades nutritivas y organolépticas, al

tiempo que tienen una excelente calidad higiénica que les permite tener una larga vida útil.

Cabe destacar que se ha comprobado, mediante experimentos realizados in vitro, que

cuando L. monocytogenes se somete a estrés osmótico (6,5% NaCl, w/v) se hace i sensible

a la acción de la bacteriocina. Igualmente la bacterio a era mucho menos activa sobre

bacterias sometidas previamente a estrés térmico con t eraturas de refrigeración (5ºC)

(Jydegaard et al., 2000). Se desconoce si estos efectos son debidos a cambios en la

14
conformación de la bacteriocina, a la dificultad de la interacción electrostática entre la

bacteriocina y la membrana bacteriana o a cambios en l cubierta celular de las bacterias.

Sería interesante comprobar si esos resultados son ext polables en la práctica a los

alimentos, dado que es muy común en la industria alimentaria aplicar refrigeración y

adicionar sal en muchos productos. Es posible que la limitada acción antibacteriana que

generalmente se observa durante la aplicación de bacte iocina en productos alimenticios

concretos se deba, al menos en parte, a que casi siempre se hace en combinación con el

empleo de refrigeración.

Ya en la primera aplicación de la bacteriocina a sustratos alimentarios se indicó que el

ácido láctico, que se encontraba de forma natural en los productos lácteos que se estaban

ensayando, tenía un efecto sinérgico con la bacteriocina (Pucci et al., 1988). Los ácidos

orgánicos y sus sales, sobre todo cuando el pH del ali to es ácido, son muy efectivos

potenciando la actividad de las bacteriocinas. En un m cido aumenta la solubilidad de

las bacteriocinas, y por tanto su capacidad para difundir, y se podría facilitar su

translocación a través de la pared celular al aumentar la carga neta de la molécula (Gálvez

et al., 2007). La acción sinérgica de las bacteriocinas y diversos ácidos orgánicos se ha

puesto de manifiesto en varios alimentos, como por ejemplo productos cárnicos, queso y

hortalizas (Barakat y Harris 1999; Bari et al.2005; Uhart et al.2004).

En este contexto de barreras múltiples, también se han empleado conjuntamente varias

bacteriocinas, con la idea de reducir la cantidad de cada una de las bacteriocinas y, al

mismo tiempo, impedir la aparición de bacterias resist tes (aunque esto último sea

dudoso). De las distintas combinaciones ensayadas cabe destacar que la pediocina PA-1

15
sue le tener un efecto sinérgico con bacteriocinas de otras clases (nisina, lactacina 481,

lactacina F y lactacina B), por lo que sería factible plear como bioconservante una

mezcla de distintas bacteriocinas (Mulet-Powell et al.,1998). El mismo efecto se ha

comprobado no sólo in vitro, sino también en un sustrato alimenticio, carne, con na

mezcla de una bacteriocina de la clase IIa (enterocina CRL35) y otras pertenecientes a

otras clases: nisina y lactocina 707. El empleo conjunto de estas tres bacteriocinas impidió

la aparición de células resistentes en L. monocytogenes y L. innocua (Vignolo et al., 2000).

Los alimentos conservados mediante la aplicación de tr tamientos térmicos también se

podrían beneficiar de la actividad de las bacteriocinas desde el punto de vista de los

sistemas de barreras múltiples. Las bacterias que han sometidas a un tratamiento

térmico son más sensibles a la acción de las bacteriocinas, como se ha demostrado para la

nisina (Kalchayanand et al., 1992). Y, al contrario, la acción de algunas bacteriocinas

reduce la resistencia térmica de las bacterias (Boziaris et al.1998). Es decir, el empleo

conjunto de bacteriocina y un tratamiento térmico perm iría reducir la intensidad de este

último, lo que se traduciría en una mínima modificación de las propiedades sensoriales del

alimento al tiempo que se logra una calidad microbiológica adecuada. Las bacteriocinas

también podrían ofrecer una protección adicional frent a la proliferación de las

endosporas que sobreviven al tratamiento térmico (Galvez et al., 2007).

El empleo de las bacteriocinas como una barrera adicional con métodos de conservación

no térmicos (aplicación de altas presiones hidrostátic s y los pulsos eléctricos de alta

intensidad) permitiría disminuir la intensidad de dichos tratamientos y/o contrarrestar el

efecto protector del alimento. Además, como uno de sus puntos clave de actuación es la

membrana celular, cuya integridad dañan, se potencia l eficacia bactericida de las

16
bacteriocinas, que llegan a destruir incluso bacterias Gram-negativas como, por ejemplo,

E. coli, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhymuri m y Serratia liquefaciens

(Kalchayanand et al., 1994). Por otra parte, estos inv tigadores han comprobado que el

efecto sinérgico de la combinación de pediocina PA-1 y nisina se potencia en gran medida

cuando se emplean con altas presiones, siendo efectivo in vitro incluso frente las esporas

de Clostridium que han germinado por las altas presiones (Kalchayanan et al., 1998;

2004).

A pesar de los resultados satisfactorios que se obtienen al añadir la bacteri cina más o

menos purificada a los alimentos, tanto desde el punto de vista legal como desde el

económico, una opción más interesante es la adición de un cultivo productor de la

bacteriocina, bien como cultivo iniciador o como adyuvante. Así tendríamos un ucto

dotado de su propio sistema de conservación, como si f era una fábrica “viva”, y sin

necesidad de aprobación legal. De hecho, ésta es la aplicación que ha aglutinado una gran

parte de la investigación realizada en los últimos años (Drider et al., 006). Por supuesto,

se ha de escoger el cultivo adecuado para cada aplicac ón, teniendo en cuenta las

peculiaridades de cada producto y, además, controlar q su metabolismo no modifique

indeseablemente las características del producto final.

En los productos cárnicos fermentados una opción relativamente sencilla sería emplear un

cultivo iniciador que posea la capacidad de producir b eriocina. La fermentación y el

descenso del pH (pH < 4,9), y el secado en el caso de los productos curados, controla en

cierta forma el crecimiento de L. monocytogenes . La bacteriocina producida in situ por el

cultivo iniciador a lo largo de la fermentación contribuiría adicionalmente a obtener un

producto seguro, especialmente en aquellos casos en los que no se llegasen a alcanzar esas

17
condiciones (Baccus-Taylor et al., 1993; Berry et al., 1990; Foegeding et ., 1992). Sin

embargo, muchas de las bacterias que producen bacteriocinas de la clase IIa no son

adecuadas para llevar a cabo las fermentaciones tradicionales porque n tienen la

capacidad de producir ácido láctico con rapidez (Drider et al., 2006).

Se debe resaltar que el empleo de las bacteriocinas casi siempre se ha enfocado desde el

punto de vista de la seguridad microbiológica, pero no se debe olvidar el posible p el que

pueden jugar para controlar el crecimiento de bacterias alterantes o incluso mejorar sus

propiedades sensoriales. Como ejemplo de esto último, comercializa un cultivo

liofilizado de P. acidilactici (Choozit™ Lyo. Flav 43), recomendado como cultivo adju o

en la elaboración de queso Cheddar y otros tipos semid os, para acelerar y potenciar los

rasgos aromáticos gracias a la producción de bacteriocinas (Deegan y col, 2006).

Aunque las bacteriocinas producidas por las bacterias ácticas son muy interesantes para la

bioconservación de los alimentos, su eficacia y/o la de las cepas productoras puede verse

seriamente comprometida por diversos factores. Entre ellos se incluye el que su espectro de

acción en algunas ocasiones puede ser bastante reducido, la incapacidad de obtener buenos

protocolos de purificación que permitan unos rendimien os aceptables, la aceptabilidad de

la cepa productora como microorganismo QPS, la adaptab lidad de la cepa

bacteriocinogénica a diferentes sustratos alimentarios o la posibilidad de aparición de

bacterias resistentes (Rodríguez et al., 2002b).

Algunas bacterias lácticas, como L. lactis, son muy versátiles y su potencial ha aumentado

notablemente en los últimos años como resultado de los recientes a ances en la

estabilización de genes heterólogos y en el control de su expresión, así como con la

18
secuenciación completa de su genoma (Le Loir et al., 2005). De hecho, ya se ha descrito la

producción heteróloga a escala industrial de una proteína (la lisos afina, con actividad

antibacteriana) en L. lactis, comprobándose que el escalado, la producción y el posterior

procesado del producto eran simples y permitían obtener una proteína muy purificada y

con actividad biológica (Mierau et al., 2005).

La producción de nisina y el crecimiento de L. lactis está determinado por las condiciones

de cultivo en periodos de tiempo de 24 horas, temperat 22 °C, pH entre 5.8 – 8.2 y

concentraciones de NaCl 0-6% p/v. Se demostró que la actividad antimicrobial de 50

I.U./ml de Nisina disminuyó con la presencia de NaCl, con un mínimo efecto inhibitorio

entre 2 y 4% de NaCl. La actividad antimicrobiana sobre Listeria monocytoge es se

caracteriza por la modificación de los parámetros de crecimiento como la tasa de

crecimiento de y el tiempo lag, que fueron estimados m iante el modelo matemático de

Gompertz (Lebois, et. al, 2004). En relación a bacterias esporuladas como Bacillus

licheniformis se observó que su crecimiento en leche a 37 °C es favorable, sin embargo

concentraciones subletales de nisina (30 IU/ml) actúa totalmente la germinación

de las esporas y células vegetativas a pH 6.0, sin posibilidad de remontar el crecimiento

después de 7 días a 37 °C. (Mansour, 1999). Cuando se refiere a patógenos como

Staphylococcus aureus presente en quesos experimentales con pH 5 y acidez 0.53%. la

nisina inhibió el crecimiento de la bacteria, mientras que en el queso control el crecimiento

fue de cinco ciclos logarítmicos (100.000UFC/g) a los siete días de almacenamiento

(Maldonado, 2007). En otro estudio se vuelve a reiterar el efecto inhibidor de la nisina

sobre el mismo patógeno cuando interactúa la la bacteriocina con un quelante EDTA y la

concentración de ácido láctico 2 mg%. (Marquez, 2007).

19
Así mismo los componentes de los sustratos que se encu ntran incorporado en los medios

de cultivo también pueden afectar la producción de nisina. Comparativamente los

compuestos proteicos solubles presentes en el medio de MRS permitieron obtener menor

cantidad de nisina comparado con el medio de TYT (Triptona, extracto de levadura y

tween 80), (Parente, 1992).

Existiendo una variedad de factores que intervienen en el crecimiento de Lactococus lactis

y que estos factores repercuten en la producción de la nisina. Muchos ores proponen

diversos modelos matemáticos para explicar y obtener p rámetros constantes del

crecimiento de dicha bacteria, sin embargo las respuestas que se obtiene no siempre tiene

sentido biológico sino matemático. El mayor atributo de un modelo es p ecir el evento

biológico con una elevada correlación con la realidad. En este aspecto existen

modelamientos del incremento de la biomasa de acuerdo una ecuación logística, el

consumo de sustrato asociado al mantenimiento del metabolismo (no crecimiento) y

cinética del metabolito primario para la producción de bacteriocina. Lejeune (1998)

estableció un modelo empírico simple que examina el cr ento y la producción de

bacteriocina en diferentes condiciones. Los parámetros estimados fueron obtenidos a artir

de una fermentación con 20 g.l-1 (p/v) que podría ser usado para predecir la evolución de la

masa celular seca, concentración de glucosa y concentraciones de ácido láctico de

fermentaciones estructuradas con 5, 30, 40 y 60 g l-1 de glucosa inicial, operando a

temperaturas de a 30, 37 and 45 °C. El modelo ajustó datos experimentales y se pudo

establecer que la tasa específica de la producción de ina es a 30 °C y las mejores

predicciones se realizan entre el rango de 30 a 37 °C. Wenhua (2002) varió el uso de

sustrato con la sacarosa y propuso un modelo matemático que pueda describir el proceso

de fermentación utilizando 6, 7, 8 y 10 g l– 1 h–1 , de sacarosa por Lactococcus lactis subsp.

20
Lactis y su producción de nisina, determinando que existe un incremento del 58% de la

producción de nisina cuando se alimenta el bach con 7 g l–1 h–1 La biosíntesis de nisina se

vio afectada por la sacarosa residual. Finalmente, el modelo matemático fue desarrollado

para simular el crecimiento celular, el consumo de sac a, la producción de ácido láctico

y la producción nisina. El modelo fue capaz de describir el proceso de fermentación en

todos los casos.

El modelo primario de Gompertz viene siendo utilizado como preferente par simular el

crecimiento bacteriano y producción de metabolitos pri ios y secundarios. El modelo de

Gompertz fue utilizado para evaluar el crecimiento de bacterias lácticas y producción de

bacteriocinas bajo la influencia del pH, temperatura y medio de cultivo. Los resultados

indican que el medio de cultivo y la temperatura tuvie on un dramático efecto sobre la

producción de bacteriocinas y las condiciones óptimas de ésta producción fueron diferent s

a las condiciones óptimas del crecimiento. Se demostró que el descenso del pH del medio

de cultivo fue paralelo al crecimiento. Las condiciones óptimas de la producción de nisina

en caldo MRS es pH inicial 6 y temperatura de 37 °C y en el medio de LAPTg después de

6 horas de cultivo a 37 °C, pH inicial de 6.8. (Juarez. 2002).

Poschet (2005) propuso un nuevo modelo para estimar el crecimiento bacteriano, en

contraste con los modelos logísticos comúnmente utilizados porque incorpora a su modelo

los efectos que inducen al establecimiento de la fase stacionaria que le atribuye a la

inhibición del crecimiento por la formación de product tóxicos y el modelo lo describe

como una función de la evolución del pH y además por un agotamiento del sustrato. El

modelo es llamado P-Model es aplicado de manera eficiente al crecimiento de Listeria

21
inocua en cocultivo con Lactococcus lactis mediatizados por la producción de ácido

láctico.

III. MATERIALES Y METODOS

El universo y la muestra se caracterizan por ser de la misma dimensión y ambas están

determinado por todas las células de Lactococcus lactis contenidas en un cepario.

3.1.1. MATERIALES

3.1.1.1 EQUIPOS

Refrigeradora congeladora, 15 pies 3

Baño de agua, 15 l capacidad

Estufa Incubadora, Temperatura máxima 65 ºC sensibilidad 1 ºC

Estufa Esterilizadora, Temperatura máxima 250 ºC, sens bilidad 1 ºC

Potenciómetro, rango de pH 1 – 14

Contador de colonia, Amplitud 15X

Centrifugadora 5,00 g

3.1.1.2 MATERIAL DE VIDRIO

Frascos de cultivo microbiológico de 2 L capacidad

Placas petri 15 cm diámetro

Tubos de ensayo 20x200 c/tapa rosca

22
Tubos de ensayo 15 x 100

Tubos de centrífuga cónico graduados 1/10 con tapa

Pipetas de 10 mL div. 1:10

Pipeta 1 mL, div 1: 10

3.1.1.3 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Caldo MRS (Oxoid)

Agar MRS (Oxoid)

Agar BHI (Oxoid)

Agar Agar (Merck)

3.1.1.4 MATERIAL BIOLOGICO

Cepa experimental: Lactococcus lactis

Cepa sensible a bacteriocina: Lactobacilus innocua

3.1.2. METODOS

Microorganismo y medios de cultivo

Se ha considerado como cepa experimental a La ct o coc cu s la ct is subsp. la ct is la cual

posee la capacidad de sintetizar nisina. Para efectos de medir la actividad biológica de la

nisina se utilizó como organismo Indicador sensible a nisina a Lactobacilo innocua cuya

respuesta de su crecimiento sirvió para cuantificar los niveles de actividad de la

bacteriocina .

A partir de las cepas que se encontraban conservadas en congelación a -20 °C en Agar

MRS y Agar BHI (Meck) y ambas conteniendo 25% (vol/vol) de glicerol como un

23
crioprotector, sirvieron para obtener cultivos frescos. Para el uso experimental las cepas

fueron reactivadas por dos veces 30 °C por 12 horas en caldo MRS, antes de su uso en los

experimentos.

Para la cuantificación de las células se utilizó caldo MRS (MerK) que se modificó a agar

MRS añadiéndole 1.5% (p/v) de agar (Oxoid).

Para la valoración de títulos de bacteriocina se utilizaron sobrecapas de agar que se

prepararon usando 0.7 % de agar. (p/v).

Para establecer las condiciones de esterilidad de los edios de cultivo y otras soluciones

requeridas todos ellos fueron esterilizados a 121°C por 20 minutos.

Las fermentaciones se realizaron en Frasco de 2000 mL estériles con un volumen de

trabajo de 1000 mL de caldo MRS estéril.

Se realizaron una serie de fermentaciones in vitro usando caldo MRS con 20 g de glucosa

por litro, complementado con concentraciones diferente de NaCl (0, 2, 4, y el 6 % [p/v])

para investigar sus efectos tanto sobre el crecimiento como sobre la producción de

bacteriocina de L. lactis. Todas las fermentaciones se realizaron por triplicado para mostrar

la reproductibilidad de los experimentos.

Preparación del inóculo

El inóculo fue preparado utilizando un cultivo fresco de L. lactis en caldo MRS obtenido

en fase logarítmica que corresponde a un tiempo de 8 horas de cultivo a 30 ºC. Bajo estas

24
condiciones, 10 ml de caldo MRS fueron inoculados con 0.5 ml de L. lactis, obtenido de

un cultivo reciente y luego fue incubado a 30°C por 12 h para alcanzar su máximo

crecimiento. Luego, 5 mL de este precultivo es añadidos a 100 ml de caldo MRS. Después

de 12 horas de crecimiento a 30°C, este cultivo fue usado como inóculo primario.

El inóculo definitivo consistió en tomar volúmenes suficientes hasta alcanzar una

equivalencia del nivel 0.5 de la escala McFarland. (1,5x109 u.f.c/mL). De esta solución se

tomaron volúmenes necesarios diluidos con suero fisiológico estéril para obtener

finalmente el inóculo experimental correspondiente a 103 ufc/mL aproximadamente, el

cual fue inoculado en los frascos de fermentación.

De las fermentaciones

Se utilizaron 12 frascos de 2000 mL de capacidad en condiciones de esterilidad a los

cuales se les adicionó 1000 mL de caldo MRS estéril con 20 g de glucosa. Los frascos se

dividen en 4 grupos o Tratamientos, con 3 unidades de etición, caracterizados de la

siguiente manera:

Grupo 01: Caldo MRS glucosado sin adición de NaCl.

Grupo 02: Caldo MRS glucosado + 2 % NaCl [p/v]

Grupo 03: Caldo MRS glucosado + 4 % NaCl [p/v]

Grupo 04: Caldo MRS glucosado + 6 % NaCl [p/v]

A cada uno de los frascos de cultivo el grupo 01 se les inoculará 1 mL del inóculo

experimental en la cual se estima un aproximado de Log UFC/mL iniciales de 103.

Inmediatamente después de la inoculación los frascos se agitarán de manera suave asta

25
lograr una homogenización completa de las células en el medio de cultivo. Los frascos se

dejarán incubando a 30 ºC por un periodo de 24 horas.

Antes de llevar los frascos a incubación a 30 ºC se obtendrá de cada uno de ellos y en

forma aséptica una muestra de 10 mL, considerándose a ésta como tiempo cero (t=0).

Luego los frascos son trasladados a incubación y a int alos de 2 horas, de cada frasco de

fermentación se retiraron 10 mL. De esta muestra se utilizó 0.1 mL para determinar las

Unidades Formadoras de Colonias (UFC/mL) estimado por iembra por inmersión en

placa.

La biomasa o masa seca celular (CDM) se determinó por gravimetría después de filtrar 5

ml del cultivo por membranas de acetato ? 22µ.

Los niveles de actividad de la bacteriocina soluble en una suspensión libre de células

(CFS) se determinaron por el método de dilución crítica usando como cepa indicadora a

Lactobacillus innocua. Se utilizaron 2 mL del medio de cultivo fermentado que se

homogenizaron con 1 volumen de HCl 0.04 N y luego fue calentado a 98ºC durante 5 min.

Las muestras se centrifugaron a temperatura ambiente para luego recoger los

sobrenadantes. Una vez neutralizados, se analizarán mediante el test d difusión en agar.

Las concentraciones de ácido láctico se medirá, neutralizando 9 ml del cultivo con NaOH

0.1 N en presencia de una solución alcohólica de fenolftaleína al 1% como indicador; los

resultados se expresarán como porcentaje de ácido láctico producido.

Las concentraciones residuales de glucosa serán cuanti icadas por métodos de

determinación enzimática para glucosa (Kit MercK).

Del mismo modo que se opera con el Grupo 01, se procederá con el resto de grupos.

26
Para determinar el efecto de factor de inducción añadido (IF), dos fermentaciones

adicionales se ejecutarán una de ellas será usando caldo 1000 mL de caldo MRS con 6 %

(p/v) de NaCl estéril a una temperatura controlada de °C y pH constante de 5.5 y otra

fermentación se realizará en las mismas condiciones de sustratos a una temperatura

controlada de 22°C y un pH constante de 5.4. Después de 24 horas de crecimiento, las

células serán retiradas por centrifugación (2,500 g y C durante 30 minutos). 50 mL del

supernadante libre de células (CFS), que se asumirán una actividad de 1,600 Unidades

arbitrarias [AU] ml-1 de bacteriocina, serán usadas como una fuente de FI para la primera

fermentación que contiene 1000 mL de caldo MRS. Esta fermentación que usará el CFS

también será ejecutada por triplicado, y sus desviacio es estándar serán calculadas.

Como una fuente alternativa del IF, un precipitado de acteriocina y asumiendo que éste es

un factor de inducción, se preparará de la manera siguiente. El pH del CFS fue ajustado a

6.5, luego se añadirá 300 g de sulfato de amonio por litro (saturación del 48 %). La

suspensión se agitará mecánicamente a 4 ºC por 12 horas. Luego se centrifugará a 20,500 g

y 4°C durante 30 minutos, el sedimento será cosechado y disuelto en buffer fosfato de

sodio 50 mM a pH 6.5 (5 ml por litro de CFS). La segunda fermentación se realizará

añadiendo 1.5 ml de la solución de proteína (represent do por el precipitado de sulfato de

amonio; biocina con una actividad de 153,600 AU ml-1) al fermentador (1.0 litro de caldo

MRS).

Del Modelado primario y secundario

El modelado primario del crecimiento celular, consumo e glucosa, producción de ácido

láctico, y la producción de bacteriocina se realizarán ajustando los datos según la ecuación

27
propuesta para el crecimiento celular y de esta manera determinar los valores de los

parámetros biocineticos del crecimiento y producción d bacteriocina. El modelo primerio

corresponde a la ecuación de Gompertz modificado: Y=a+c*exp(-exp(-b*(x-d))).

Donde:

Log N es logaritmo decimal del número de microorganismo tiempo t,

A es el valor asintótico cuando el tiempo decrece indefinidamente (aproximadamente

equivalente al logaritmo decimal del número inicial de microorganismos),

C representa el incremento en el logaritmo del número e microorganismos cuando el

tiempo se incrementa indefinidamente (número de ciclos de crecimiento),

B es la velocidad de crecimiento máxima relativa al ti mpo M

M es el tiempo requerido para alcanzar la máxima velocidad de crecimiento.

Las abreviaturas para parámetros biocinéticos represen ativos del crecimiento y la

producción de la nisina y las ecuaciones utilizadas qu se detallan en párrafo siguiente,

según los reporta Messens et al (2002), excepto que la ecuación pa a la producción de

bacteriocina fue elaborada dependiendo de XB , definido como la mínima concentración de

biomasa requerida para el inicio de la producción de b eriocina debido a la inducción.

Las fermentaciones se realizarán por triplicado, se calcularán las desviaciones estándar

para todos los parámetros biocinéticos estimados vía el modelo primario.

Las ecuaciones serán integradas usando el Programa Curve expert v. 1.4.

Mediante el empleo de modelado secundario, todos los p rámetros biocineticos (µ max,

Xmax, n, YX /S , ms, YL/S , el kB , y k inact), extraídos del modelo primario, serán expresados

28
como funciones de la concentración de sal. Por esta razón, se emplearan los modelos

empíricos. Las Desviaciones estándar serán calculadas donde se requiera necesario

hacerlo.

Ecuaciones usadas para el desarrollo de los modelos primarios:

Modelo Ecuación

Crecimiento celular dX/dt = {µ max [1 - (X/X max)]n - a } X

Cuando t >?

Modelo secundario para el Consumo dS/dt= - [(1/YX/S )(dX/dt)] - mSX

de Glucosa

Modelo secundario para la dL/dt= - (YL/S)(dS/dt)

Producción de ácido láctico

Modelo secundario para la dB/dt = [( k B)( dX/dt)] - [(k inact)( XB )]

Producción de Bacteriocinas Cuando X > XB

Abreviaturas:

X Concentración de biomasa (en gramos [CDM] por litro)

t Tiempo (en horas)

? Duración de la fase lag (en horas)

µ max Tasa máxima específica del crecimiento (en h-1)

X max Concentración de biomasa máxima alcanzable (en gramos CDM] por litro)

n Inhibición exponencial

a Índice de mortalidad específica (en h-1)

S Concentración residual de glucosa (en gramos de glucosa por litro);

29
YX/S Coeficiente de producción celular (en gramos [CDM] por gramo de glucosa);

ms Coeficiente de mantenimiento (en gramos de glucosa por gramo de CDM por

hora)

L Producción de ácido láctico (en gramos de acido láctico por litro);

YL/S Coeficiente de producción para la conversión de glucosa en ácido láctico (en

gramos de ácido láctico por gramo de glucosa)

B Actividad de bacteriocina soluble (en AU por litro)

kB Producción específica de bacteriocina (en AU por gramo de CDM);

k inact Tasa aparente de inactivación de bacteriocina (en litros por gramo de CDM por

hora)

X B’ Concentración mínima de biomasa para el inicio de pro ucción de bacteriocina

(en gramos [CDM] por litro).

3.1.3 ANÁLISIS EXPERIMENTAL

La bondad de ajuste de los modelos se evaluar on mediante los valores del coeficiente de

determinación (R2 ) de cada ajuste. Cuánto más cercano a 1 es el valor de R2 y más bajo el

valor de RMSE, mejor ajusta el modelo.

El efecto de las concentraciones de cloruro de sodio y producción de nisina se utilizaó el

diseño de Análisis de varianza con tres repeticiones y un nivel de confianza de 95%.

30
IV. RESULTADOS

1. Se obtuvo la curva de crecimiento de Lactococcus lactis sub sp. lactis en cultivo en

caldo MRS glucosa 20% en un periodo de tiempo de 24 ho as, a una temperatura de

30 ºC por un periodo de 24 horas, utilizando 13 iteraciones de tiempo. Los valores

de Log UFC/mL de la curva de crecimiento se ajustaron aplicando el modelo de

Gompertz modificado cuya expresión es: Y= a+c*exp(-exp(-b*(x-d))),

obteniéndose los parámetros de crecimiento que se mues an en la tabla Nº 1. La

bondad de ajuste permite decidir que el ajuste de la curva al modelo de Gompertz

modificado es suficiente el cual está representado por un coeficiente de

determinación de 99.8%.

2. La figura Nº 2 representa el crecimiento celular expresado por la Biomasa /X=g/L)

obtenida en caldo MRS glucosa durante el periodo de 24 horas. Se destaca que la

Xmax alcanza un valor de 2.88 g/L cuando alcanza una tasa ecimiento específico (µ max)

de 0.30 Log UFC/mL/h, según el modelo primario. El modelo de Gompertz adapta con

elevada bondad de ajuste los datos experimentales obtenidos con el 99% de validez

estadística. Tabla Nº 2.

3. El consumo de Glucosa durante los ensayos experimentales de fermentación se

observa en la Figura Nº 3, reportando un consumo prome de 18. 99 ± 0.46 g/L,

que relacionado a la concentración de biomasa se deter ina el Coeficiente del

rendimiento celular (Y(X/s) = g/L) que alcanza un valor de 0.15 g X/g S/L. Así

mismo el coeficiente de mantenimiento (ms) y el coeficiente del rendimiento celular

(YX/S) alcanzan valores de 0.27 g Glu/gXmax /h y 0.11 g Xmax/gGlu;

respectivamente. Tabla Nº 3

31
4. La producción de ácido láctico a partir de la glucosa orporada al medio de

cultivo se encuentra graficada en la figura Nº 4, en la cual se observa que la

concentración final de produccíon de ácido láctico es e 16,05 g/L, con un

coeficiente de conversión de 0.84.Tabla Nº 4.

5. La Figura Nº 5 grafica el modelamiento de la producción de la nisina destacando

que la máxima concentración es de 2.12 UA/L en un periodo de 14 horas, con una

producción específica de 0.74 AU/gXmax, requiriéndose de una concentración mínima de

biomasa de 0.0015 gXmax/L para iniciar la producción de nisina. Tabla Nº 5.

6. La adición de cloruro de sodio al 2% (p/v) no afectó el valor de µmax. Comparando

éste parámetro de crecimiento con el del control no existe diferencia

estadísticamente significativa Fc (n:3;a :0.0 5):3.22>Ft:3.47. Figura Nº 6.

Concentraciones de sal por encima del 2% afecta la tasa de crecimiento específica

(b ó µ max) disminuyéndola en forma lineal, (Fc (n:3 ;a :0.05) :6.44>Ft: 3.47). Del mismo

modo, el tiempo que se tarda en alcanzar la máxima tasa de crecimiento (M) para

valores de cloruro de sodio menores del 2% es de 5.14 oras y el control 4.91 horas

y a concentraciones mayores del 2% el incremento es mayor.

7. El modelamiento de la actividad de la bacteriocina pre ente en el sobrenadante libre

de células frente a varias concentraciones de cloruro e sodio está representado en

la figura Nº 7. La actividad de la Nisina con adición del 2% de sal no se modifica

sustancialmente sus parámetros cuando se compara con el cultivo que no contiene

sal. (Fc (n:3 ;a :0.05):4.36>Ft:3.47). Concentraciones mayores al 2% afectan

32
 drásticamente la actividad de la biocina, demostrándose que la adición de 6% de sal

determina que el Bmax alcance un valor de 0.38 AU/L y consecuentemente disminuye

el valor de producción específica de nisina (KB ) a 0.14 AU/gX max. Tabla N 7,

Cuando se adiciona 2% de sal, la cantidad mínima de bi a que se requiere para

iniciar la producción de nisina es de 0.42 g/L. El uso de mayores concentraciones

de sal como 6% obliga a utilizar concentraciones de biomasa equivalente a 1.12 g/L

8. Los datos derivados de los experimentos de fermentación fueron analizados a fin de

caracterizar cinéticamente el proceso y proponer estra egias para mejorar su

desempeño empleando modelos primarios como el de Gompertz modificado que se

ocupa de la descripción de los cambios del número microbiano en función del

tiempo. Por otro lado se propusieron modelos secundarios con la finalidad de

permitir evaluar cómo dos o más factores interactúan so el crecimiento

microbiano. Dichos parámetros biocinéticos derivados de los modelos primarios

están en la tabla Nº 8. Los datos representan las relaciones entre los parámetros

biocinéticos y el efecto del cloruro de sodio.

Los resultados expuestos son elementos que permiten aceptar la hipótesis de que el modelo

primario de Gompertz modificado tiene una elevada bondad de ajuste para atos

experimentales del crecimiento de Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa. Así mismo,

los modelos secundarios permiten estimar el efecto negativo de las concentraciones de

cloruro de sodio mayores del 2% sobre el crecimiento de Lactococus lactis y la producción

de nisina.

33
V. DISCUSIÓN

Las investigaciones en alimentación plantean nuevos retos en seguridad alimentaria. Estos

desafíos deben ir más allá de la vigilancia y el control de la calidad, en respuesta

básicamente a los nuevos métodos de producción agrícola y de novedades alimenticias,

como los denominados alimentos funcionales. Buena part de la labor se centra ahora en

identificar los principales riesgos alimentarios que emergen de los cambios en el sector de

la alimentación. El tema de la presencia de bacterias patógenas en lo alimentos cobra

importancia cuando se trata de su calidad en condiciones naturales o procesados, por tal

motivo se requiere buscar alternativas para el control, inhibición o eliminación de dichos

microorganismos.

La Nisina es efectiva en una gran variedad de productos alimenticios, a través de un amplio

rango de niveles de pH (3.5 - 6.0), como es el caso de la variedad de quesos,; productos de

crema tales como: saborizada, batida, espesa, ácida, etc.; lechería y postres elaborados con

grasa, yogurt y leches saborizadas; preparaciones de frutas y vegetales que incluyen la

pulpa, jugos de fruta pasteurizados, postres y bebidas elaborados con proteína vegetal y

leche de coco; bocadillos (snacks); productos de huevo líquido pasteurizado; salsas de bajo

pH, incluyendo mayonesa y salsas y aderezos salados; sopas y salsas pasteurizadas;

alimentos enlatados; carnes procesadas; procesos de fe entación y productos de

fermentación tales como la cerveza y alimentos de alto contenido de humedad / reducidos

en grasas.

34
La nisina es un grupo de polipéptidos compuestos por 3 aminoácidos, estrechamente

relacionados, y es producida por ciertas cepas de la bacteria Lactococcus (Streptococcus)

lacticas ssp. La nisina tiene un doble modo de acción antimicrobiana: se une a los

fosfolípidos II con la subsiguiente inhibición de la síntesis de pared celular y también

forma poro en la membrana citoplasmática. La nisina sólo se utiliza como conservante

alimentario y actualmente no tiene ningún uso terapéutico.

Sin embargo, la producción de nisina en condiciones de laboratorio no necesariamente

significa que es efectiva, suficiente y biodisponible en el ecosistema de los alimentos

debido a que en éstos se incluyen factores limitantes, por ejemplo, la disponibilidad de

nutrientes restringida para las células productoras de bacteriocina, la adsorción de las

bacteriocinas sobre las partículas de carne, grasas y roteínas, y / o la presencia de

proteasas endógenas degradantes de la bacteriocina. Además, la tecnología de

procesamiento de alimentos puede interferir con la capacidad de producción de

bacteriocinas de cultivos iniciadores o cocultivos utilizados como es el caso de embutidos

o salsas.

El crecimiento de Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa fue ajustado mediante el uso

del modelo de Gompertz modificado el cual incorpora cuatro variables obtenidas del

crecimiento en un periodo de 24 horas, siendo ésta la variable independiente. La velocidad

de crecimiento específicao (µ max ) de 0.27 UFC/mL/h indica que el medio de cultivo aporta

nutrientes suficientes para ,mantener el crecimiento en condiciones logarítmicas por

espacio de 6 a 8 horas. El declive de la tasa de crecimiento es debido a la falta de nutrientes

o factores de crecimiento como el extracto de levadura o riqueza de bioelementos; sin

embargo la velocidad de crecimiento hallada esta en concordancia con lo reportado por

35
Valbuena 2005 cuya µ max = 0.31LogUFC/mL/h en cultivos con leche fresca. Del mismo

modo Castro, 2008 ; reporta un valor de 0.29 LogUFC/mL/h en leche. Estos resultados

confirman que los datos experimentales de este estudio fueron bien obtenidos facilitando

su ajuste por el modelo primario de Gompertz.

Se realizaron fermentaciones en caldo MRS glucosa con la adición de cloruro de sodio en

los niveles de 2, 4, y 6%, observándose que la sal afecta el crecimiento de Lactococcus

lactis y del mismo modo la producción de bacteriocinas. En el caso de L. lactis , una baja

concentración de NaCl (2%, peso / volumen) no mostró ningún efecto sobre el crecimiento

bacteriano, mientras que la inhibición del crecimiento aumenta linealmente cuando se

utiliza mayores niveles de concentraciones de sal. El efecto negativo de concentraciones

elevadas de sal en el crecimiento de bacterias ácido lácticas (LAB) ha sido reportado por

Dew Vuyst (1996); Rozés (1996), Uguen(1999); así mismo se reporta que bajas

concentraciones de sal (1a2%, en peso/vol) muchas veces puede favorecer el crecimiento

bacteriano, como es el caso de las fermentaciones de vegetales o salsas reportados por

Ganzle (1998), Korkeala (1992), Vignolo ( 1995).

Si bien la sal tiene como propiedad ionizarse en el sistema agua proteínas del medio de

cultivo y que ésta condición que puede afectar el crecimiento, se observa que un nivel del

2% de sal no modifica sustancialmente la tasa máxima de crecimiento específico (µmax) y

concentración máxima de biomasa (X max) de L. lactis. Concentraciones más elevadas si

modifican dichos parámetros debido a que la concentración de solutos en el medio de

cultivo se incrementa generando condiciones de a w menores a las requeridas para la

fisiología del lactobacilo. La disminución de la actividad de agua demanda al lactobacilo

un mayor gasto energético para su mantenimiento; sin embargo la actividad enzimática no

36
se desarrolla en dichos niveles de actividad de agua que establecen las concentraciones de

4 y 6% de sal. Esta situación es poco diferente con el caso de ciertas BAL que resisten

altas concentraciones de sal en procesos fermentativos de carne y hortalizas. Herman

(2009), informa que concentraciones del 2% de sal no modifican la tasa máxima de

crecimiento, siendo ésta de 0.27 UFC/mL/h, compatibles para éste estudio.

Sin embargo, Lactococcus lactis es sensible a la concentración de sal y muestra una

tendencia decreciente de la X max con el aumento de las concentraciones de NaCl debido a

que esta sal interfiere con la eficiencia de la conversión de sustrato en biomasa. Semejante

situación encontró Leroy (1999) en donde el cloruro de sodio afecta el crecimiento y la

producción de nisina de las BAL cuando la fermentación de las salsas se eleva al 6%.

La presencia de ácido láctico y su consecuente modific ción de su pH del medio de cultivo

no afecto los parámetros del crecimiento de Lactococcus lactis porque su producción está

en íntima correlación con el consumo de glucosa y el d senso de la población bacteriana o

muerte celular es pequeña. Serna (2009) encuentra seme antes respuesta con este estudio

fermentando 20 g/L de glucosa y obtiene 13.7 g/L de ácido láctico, explicando que la cepa

Lactococcus lactis ssp. lactis se adapta a ambientes con altas concentraciones de sacarosa y

además es capaz de sobrevivir y replicarse en más altos niveles de estrés, en comparación

con otras cepas productoras de ácido láctico. Además el microorganismo tiene un sistema

enzimático que hidroliza el disacárido y metaboliza la glucosa mediante la vía glucolítica

en ambientes con baja disponibilidad de agua.

Por otro lado, se observó que si bien una concentración de 2% de sal no afecto el

crecimiento de bacterias, si afectó la máxima activida d de la bacteriocina (Bmax ) y se

37
redujo en 10% en relación al cultivo que no tenía sal. Esto se explica por la disminución de

la producción de bacteriocina espec ífica (KB ), aún cuando los valores de X max son

comparables. A mayores concentraciones de NaCl, k B disminuyó aún más. Leal-Sanchez

(2002) reporta que la plantaricina S por L. plantarum, la mayor producción se observa a

una concentración de cloruro de sodio de 2,5% (p/vol). Por otra parte, la producción de

sakacin K por L. sakei CTC 494 se ve afectada negativamente por el agregado de NaCl,

Leroy (1999). Aunque los enterococos son más resistentes a la sal, la producción de las

enterocinas A y B de Enterococcus faecium CTC 492 también se inhibe en presencia de

NaCl (Aymerich, 2000, 2002). Sin embargo, la producción de enterocina se puede

aumentar en la matriz de la carne mediante la adición de una pequeña cantidad de la

bacteriocina, que actúa como un inductor .

Tratando de explicar los efectos de la sal sobre la producción de bacteriocinas es que L.

lactis posee la capacidad de expulsar un péptido denominado Factor de Inducción (IF) y

cuando ésta alcanza una concentración crítica, facilita su unión a su receptor y pronto se

inicia la producción de bacteriocinas. El Cloruro de sodio interfiere al IF para su unión con

su receptor (Nilsen, 1998).

Nilson (2002) atribuye el rol del acetato como factor de inducción para la síntesis de

carnobacteriocina por C. piscicola A9b, la cual se ve afectada negativamente por la adición

de NaCl. Incluso en NaCl concentraciones que no afectan el crecimiento, la inducción de la

bacteriocina disminuye la producción, lo que indica que el aumento de las concentraciones

del inductor son necesarias para mantener la producción de bacteriocinas Nilsen ( 1998).

Glaster 1998, considera que es probable que la adición de sal a l medio de cultivo interfiera

38
con el crecimiento desestabilizando la unión del Factor de Inducción a su receptor

generando el síndrome de fatiga bacteriana y de forma irreversible.

Muchos alimentos se encuentran contaminados con bacterias patógenas que no siempre se

multiplican por la falta de algún factor nutricional determinante. Sin embrago, la naturaleza

del alimento puede servir de vehículo. En otros casos el alimento ofrece todas las

condiciones para su multiplicación. Debido a estas circunstancias se requiere utilizar un

sistema de barrera para evitar el crecimiento bacteriano y es así que se apunta al uso de

bacterias productoras de nisina, como es el caso de Lactococcus lactis , pero para la cual los

parámetros biocinéticos en sustratos complejos no está claramente establecidos, más aún

cuando los factores del entorno no son considerados de manera eficiente. Es allí donde los

modelos matemáticos primarios debidamente elegidos logran un nivel de ajuste de la curva

de crecimiento, como es el caso del modelo de Gompertz modificado, que aportarán

diferentes parámetros biocinéticos para utilizar los modelos matemáticos secundarios

utilizados en este estudio, que estiman valores de crecimiento o productividad de nisina

interaccionando dos o más variables al mismo tiempo sobre el microorganismo. Los datos

obtenidos en este estudio tienden a establecer criterios biocinéticos de Lactococcus lactis

para obtener a escala piloto concentraciones elevadas de nisina y de esta manera lograr su

aplicación masiva en muchos alimentos que se deterioran fácilmente.

Se ha conocido que las condiciones de fermentación y producción de nisina se afectan por

la presencia de cloruro de sodio en concentraciones mayores al 2%. Esta característica

servirá de modelo para predecir los eventos fermentativos en productos elaborados a base

de vegetales y carne.

39
Es esencial comprender los efectos de diferentes factores ambientales relacionados con los

alimentos en la inducción de nisina con el fin de comprender mejor el potencial de

aplicación de esta cepa en la producción de embutidos fermentados. El potencial de esta

cepa puede ser ampliado considerablemente si se logra manipular el Factor de Inducción

(IF) para alcanzar un nivel más alto de la producción de bacteriocina en condiciones

desfavorables. Se recomienda investigar el uso de licor de diversos procesos fermentativos

en donde se puede encontrar el factor de Inducción y de esta menra obtener mejores

resultados

40
VI. REFERENCIALES

1. Abee T., Krockel L. y Hill C. (1995) Bacteriocins: modes of action and potentials

in food preservation and control of food poisoning. Int. J. Food Microbiol., 28:

169-185.

2. Arqués, L., Rodríguez, E., Gaya, P., Medina, M., Nuñez, M. 2005. Effect of

combinations of high pressure treatments and bacteriocin-producing lactic acid

bacteria on the survival of Listeria monocytogenes in raw milk cheese. Int.Dairy J.

15: 893-900.

3. Aymerich, M. T., M. G. Artigas, M. Garriga, J. M. Monfort, and M. Hugas. 2000.

Effect of sausage ingredients and additives on the production f enterocins A and

B by Enterococcus faecium CTC 492. Optimization of in vitro production and anti-

listerial effect in dry fermented sausages. J. Appl. Microbiol.88:686–694.

4. Baccus-Taylor, G., Glass, K.A., Luchansky, J.B., Maurer, A.J. 1993. Fate of

Listeria monocytogenes and pediococcal starter culture during the manufacture of

chicken summer sausage. Poultry Sci. 72: 1772-1778.

5. Barakat, R.K., Harris, L.J. 1999. Growth of Listeria monocytogenes and Yersinia

enterocolitica on cooked modifiedatmosphere-packaged poultry in the presence and

absence of a naturally occurring microbiota. Appl. Environ.Microbiol. 65: 342-345.

41
6. Bari, M.L., Kawasaki, T., Inatsu, Y., Ukuku, D.O., Iss iki, K., Kawamoto, S. 2005.

Combined action of nisin and pediocin with sodium lact e, citric acid, phytic acid

and potassium sorbate and EDTA in reducing Listeria mo ytogenes population

of inoculated fresh-cut produce. J. Food Prot.68: 1381-1387

7. Berry, E.D., Liewen, M.B., Mandigo, R.W., Hutkins, R.W. 1990. Inhibition of

Listeria monocytogenes by bacteriocin producing Pediococcus during the

manufacture of fermented semidry sausage. J. Food Prot.53: 194-199

8. Berry, E.D., Liewen, M.B., Mandigo, R.W., Hutkins, R.W. 1990. Inhibition of

Listeria monocytogenes by bacteriocin producing Pediococcus during the

manufacture of fermented semidry sausage. J. Food Prot. 53: 194-199.

9. Boziaris, I.S., Humpheson, L., Adams, M.R. 1998. Effec of nisin on heat injury

and inactivation of Salmonella enteritidis PT4. Int. J. Food Microbiol. 43: 7-13.

10. Caplice, E., Fitzgerald, G.F. 1999. Food fermentations role of microorganisms in

food production and preservation. Int. J. Food Microbiol. 50: 131-149.

11. Chandler, R. E., and T. A. McMeekin. 1989. Modelling g response of

Staphylococcus xylosus to changes in temperature and glycerol concentration/water

activity. J. Appl. Bacteriol. 66:543–548.

42
12. Chamba, J.F., Jamet, E. 2007. Contribution to the safety assessment of

technological microflora found in fermented dairy prod s. Int. J. Food

Microbiol.12:45-54

13. Deegan, L.H., Cotter, P.D., Hill, C., Ross, P. 2006. B cteriocins: Biological tools

for biopreservation and shelf-life extension. Int.Dairy J. 16: 1058-1071.

14. De Vuyst, L., R. Callewaert, and K. Crabbe´. 1996. Primary metabolite kinetics of

bacteriocin biosynthesis by Lactobacillus amylovorus and evidence for stimulation

of bacteriocin production under unfavourable growth co ons. Microbiology

142:817–827.

15. Drider, D., Fimland, G., Hechard, Y., McMullen, L.M., revost, H. 2006. The

continuing story of class IIa bacteriocins. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70: 564-582

16. Eijsink, V.G.H., Skeie, M., Middelhoven, P.H., Brurberg, M.B., Nes, I.F. 1998.

Comparative studies of class IIa bacteriocins of lactic acid ba ria. Appl. Environ.

Microbiol. 64: 3275-3281.

17. Fimland, G., Blingsmo, O.R., Sletten, K., Jung, G., Nes, I.F., Nissen-Meyer, J.

1996. New biologically active hybrid bacteriocins cons ructed by combining

regions from various pediocin-like bacteriocins: the C-terminal region is important

for determining specificity. Appl. Environ. Microbiol. 62: 3313-3318.

43
18. Gálvez, A., Abriouel, H., López, R.L., Ben Omar, N. 2007. Bacteriocin -based

strategies for food biopreservation. Int. J.Food Microbiol. 120: 51-70.

19. Gänzle, M. G., M. Ehmann, and W. P. Hammes. 1998. Modeling of growth of

Lactobacillus sanfranciscensis and Candida milleri in response to process

parameters of sourdough fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 64:2616–2623.

20. Glaasker, Erwin, Tjan, Frans S. B., Ter Steeg, Pieter F., Konings, Wil N., Poolman,

Bert

Physiological Response of Lactobacillus plantarum to Salt and Nonelectrolyte

Stress. J. Bacteriol. 1998 180: 4718-4723

21. Guyonnet, D., Fremaux, C., Cenatiempo, Y., Berjeaud, J.M. 2000. Method for rapid

purification of class IIa bacteriocins and comparison their activities. Appl.

Environ. Microbiol. 66: 1744–1748.

22. Harris, L.J. 1998. The microbiology of vegetable fermentations. En: Microbiology

of Fermented Foods, Vol. 1, Wood, B.J.B. (Ed.). Blackie, Londres, pp. 45-72.

23. Herman C., Maguna F.,. Garro O. and. Castro E. Effect of temperature, pH and

NaCl on nisin activity against lactobacillus fructivorans The Journal of the

Argentine Chemical Society Vol. 97 N° 2, 11-18 (2009)

24. Johnsen, L., Fimland, G., Nissen-Meyer, J. 2005. The C-terminal domain of

pediocinlike antimicrobial peptides (Class IIa bacteriocins) is involved in specific

44
 recognition of the C-terminal part of cognate immunity proteins and in determining

the antimicrobial spectrum. J. Biol. Chem. 280: 9243-50.

25. Juarez Toma M.S., Bru E., Wiese B., de Ruiz Holgado A., Nader-Macías M.E.

Influence of pH, temperature and culture media on the and bacteriocin

production by vaginal Lactobacillus salivarius CRL 1328 Journal of Applied

Microbiology, Volume 93, Number 4, October 2002 , pp. 714- 724(11)

26. Jydegaard, A.-M., Gravesen, A., Knøchel, S. 2000. Growth condition-related

response of Listeria monocytogenes 412 to bacteriocina inactivation. Lett. Appl.

Microbiol. 31: 68 -72

27. Korkeala, H., T. Alanko, and T. Tiusanen. 1992. Effect of sodium nitrite and

sodium chloride on growth of lactic acid bacteria. Acta Vet. Scand. 33:27–32.

28. Kleerebezem, M., Hugenholtz, J. 2003. Metabolic pathway engineering in lactic

acid bacteria. Curr. Opin. Biotechnol. 14:232–237.

29. Kunji, E.R.S., Chan, K.W., Slotboom, D.J., Floyd, S., R., Monné, M.

2005. Eukaryotic membrane protein overproduction in La tococcus lactis.

Curr.Opin. Biotechnol. 16: 546-551.

30. Leal-Sa´nchez, M. V., R. Jime´nez-Diaz, A. Maldonado -Barraga´n, A. Garrido-

Ferna´ndez, and J. L. Ruiz-Barba. 2002. Optimization of bacteriocin production by

45
 batch fermentation of Lactobacillus plantarum LPCO10. Appl. Environ. Microbiol.

68 :4465–4471.

31. Lebois M., Connil N., Onno B., Pre´vost H. and Dousset X. Effects of divercin

V41 combined to NaCl content, phenol (liquid smoke) concentration and pH on

Listeria monocytogenes ScottA growth in BHI broth by an experimental design

approach. Journal of Applied Microbiology 2004, 96, 931–937

32. Leistner, L. 1992. Food preservation by combined methods. Food Res. Int. 25: 151-

158.

33. Lejeune R., Callewaert R., Crabbe´ K. De Vuyst L. Mod lling the growth and

bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471 in batch cultivation.

Journal of Applied Microbiology 1998, 84 , 159 –168

34. Leroy, F., De Vuyst, L. 2004. Lactic acid bacteria as functional starter cultures for

the food fermentation industry. Trends Food Sci. Technol. 15: 67-78.

35. Leroy, F., and L. De Vuyst. 1999. The presence of salt and curing agent reduces

bacteriocin production by Lactobacillus sakei CTC 494, a potential starter culture

for sausage fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 65:5350–5356.

36. Leroy, F., and L. De Vuyst. 1999. Temperature and pH conditions that prevail

during fermentation of sausages are optimal for produc on of the antilisterial

bacteriocin sakacin K. Appl. Environ. Microbiol. 65:974–981.

46
37. Makarova, K.S., Koonin, E.V. 2007. Evolutionary genomics of lactic acid bacteria.

J. Bacteriol. 189:1199-208.

38. Maldonado R. Llanca L. Efecto de la incorporación de sobre la

supervivencia del Staphylococcus aureus en queso de ma Rev. Fac. Agron.

(Maracay) 33:147- 163. 2007

39. Mansour M., Amri D., Bouttefroy A., Linder M., Milliere J.B. Inhibition of

Bacillus licheniformis spore growth in milk by nisin, laurin, and pH

combinations. Journal of Applied Microbiology1999, 86, 311–324

40. Marquez, J. García R. Efecto de la nisina sobre la microflora patógena del queso

blanco artesanal tipo"telita" elaborado en una quesera de Upata, Estado Bolívar,

Venezuela. Rev. Soc. Ven. Microbiol., 2007, vol.27, no.2, p.108-111.

41. Mierau, I., Leij, P., van Swam, I., Blommestein, B., F oris, E., Mond, J., Smid, E.J.

2005. Industrial-scale production and purification of a heterologous pr ein in

Lactococcus lactis using the nisin- controlled gene expression system NICE: The

case of lysostaphin. Microb. Cell Fact. 4: 15

42. Mota-Meira, M., Lapointe, G., Lacroix, C., Lavoie, M.C. 2000. MICs of Mutacin

BNy266, Nisin A, Vancomycin, and Oxacillin against Bacterial Pathogens.

Antimicrob. Agents Chemother. 44: 24-29.

47
43. Mulet-Powell, N., Lacoste-Armynot, A.M., Viñas, M., De Buochberg, M.S. 1998.

Interactions between pairs of bacteriocins from lactic acid bacteria. J. Food Prot.

61:1210-1212.

44. Muriana, P.M. 1996. Bacteriocins for control of Listeria spp. in food. J. Food Prot.

suppl. 1996: 54-63.

45. Nilsen, T., I. F. Nes, and H. Holo. 1998. An exported inducer peptide regulates

bacteriocin production in Enterococcus faecium CTC 492. J. Bacteriol. 180:1848–

1854.

46. Nilsson, L., M. K. Nielsen, Y. Ng, and L. Gram. 2002. Role of acetate in

production of an autoinducible class IIa bacteriocin in Carnobacterium piscicola

A9b. Appl. Environ. Microbiol. 68:2251–2260.

47. Parente E. Hill C. 1992. A comparison of factors affec ng the production of two

bacteriocins from lactic acid bacteria. Journal of Applied Bacteriology. 73: 290-

298

48. Pfeiler, E.A., Klaenhammer, T.R. 2007. The genomics of lactic acid bacteria.

Trends Microbiol. 15: 546- 553.

49. Poschet F.; Vereecken K.; Geeraerd A.; Noicolai. M. ; an Impe F. Analysis of a

novel class of predictive microbial growth models and pplication to coculture

48
 growth. International Journal of Food Microbiology Volume 100, Issues 1-3, 15

April 2005, Pages 107-124.

50. Pucci, M.J., Vedamuthu, R.E.R., Kunka, B.S., Vandenber P.A. 1988. Inhibition

of Listeria monocytogenes by using bacteriocin PA-1 produced by Pediococcus

acidilactici PAC1.0. Appl. Environ. Microbiol. 54: 2349- 2353.

51. Rodríguez, J.M. 1996. Espectro antimicrobiano, estructura, propiedades y modo de

acción de la nisina, una bacteriocina producida por La tococcus lactis. Food Sci.

Tech. Int. 2: 61-68.

52. Rodriguez, J.M., Martínez, M.I., Horn, N., Dodd, H.M. 2b. Heterologous

production of bacteriocins by lactic acid bacteria. I . J. Food Microbiol. 80: 101-

116.

53. Ross, R.P., Galvin, M., Mc Auliffe, O., Morgan, S.M., n, M.P., Twomey, D.P.,

Meaney, W.J., Hill, C. 1999. Developing applications for lactococcal bacteriocins.

Antonie Van Leeuwenhoek 76:337–346.

54. Roze´s, N., and C. Peres. 1996. Effect of oleuropein and sodium chloride on

viability and metabolism of Lactobacillus plantarum. Appl. Microbiol. Biotechnol.

45 :839–843.

49
55. Serna L. Lactic acid production by a strain of Lactococcus lactis subs lactis isolated

from sugar cane plants. Electronic Journal of Biotechnology Vol.9 No.1, Issue of

January 15, 2006

56. Stevens, K.A., Sheldon, B.W., Klapes, N.A., Klaenhamme , T.R. 1991. Nisin

treatment for inactivation of Salmonella species and other gram-negative bacteria.

Appl. Environ. Microbiol. 57: 3613-3615.

57. Stiles, M.E. 1996. Biopreservation by lactic acid bact ria. Antonie van

Leeuwenhoek Int.J. Gen. Mol. Microbiol. 70: 331-345.

58. Uguen, P., J. Hamelin, J. P. Le Pennec, and C. Blanco. 1999. Influence of

osmolarity and the presence of an osmoprotectant on Lactococcus lactis growth and

bacteriocin production. Appl. Environ. Microbiol. 65:291–293.

59. Uhart, M., Ravishankar, S., Maks, N.D. 2004. Control of Listeria monocytogenes

with combined antimicrobials on beef franks stored at C. J. Food Prot. 67 :2296-

2301

60. Valbuena E. Modelos cinéticos aplicados al crecimiento de Lactococcus lactis en

leche..Revista científica . Vol. 15 , Nº 5, 464 – 475, 2005.

61. Vignolo, G., Palacios, J., Farías, M.E., Sesma, F., Schillinger, U., Ho lzapfel, W,

Oliver. G. 2000. Combined effect of bacteriocins on the survival of various Listeria

species in broth and meat system. Curr. Microbiol. 41: 410-416.

50
62. Wenhua Lv, Xiaoyan Zhang and Wei Cong. Modelling the p oduction of nisin by

Lactococcus lactis in fed-batch culture. Applied Microbiology and Biotechnology.

Volume 68, Number 3 / agosto de 2005

51
VII. APÉNDICE

52
 Tabla Nº 1

Parámetros de crecimiento de Lactococcus lactis en caldo

MRs glucosa, según modelo primario de Gompertz
a 3.03
b 0.27
c 5.17
d 4.98
Desv. Estand 0.188
R2 0.998
a= población inicial UFC/mL
b= Tasa máxima de crecimiento UFC/mL/h
c= Máxima población obtenida UFC
M= Tiempo tasa máxima crecimiento
Edgar Zárate S.

53
 Tabla Nº 2

Parámetros de crecimiento de Lactococcus lactis en caldo

MRs glucosa, en función de la biomasa, según modelo
primario de Gompertz
a 0.02
b 0.30
c 2.93
d 7.72
Desv. Estand 0.064
R2 0.99
a= población inicial UFC/mL
b= Tasa máxima de crecimiento UFC/mL/h
c= Máxima población obtenida UFC
M= Tiempo tasa máxima crecimiento
Edgar Zárate S.

54
 Tabla Nº 3
Parámetros del consumo de Glucosa por la biomasa de
Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa
Concentración Glucosa inicial (g/L) 20.00
Consumo de Glucosa (g/L) 18.99
Concentración Glucosa residual (gL) 1.01
Máxima concentración Biomasa (Xmax=g/L) 2.88
Coeficiente del rendimiento celular (Y X/s= g/L) 0.15
Coeficiente mantenimiento (ms= g
Glu/gXmax/h) 0.27
Coeficiente rendimiento celular (Y X/S=g
X max/gGlu) 0.11
Edgar Zárate S.

55
 Tabla Nº 4
Parámetros de la producción de Ácido láctico por
Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa

Ácido láctico producido (L= g/L) 16.05

Conversión Glu/Ac. Lact (Y L/S = g Ac. Lac./g Gluc) 0.84

Edgar Zárate S.

56
 Tabla Nº 5

Parámetros de la producción de Nisina por Lactococcus lactis en caldo

MRS glucosa

Actividad de la Nisina (B= AU/L) 2.12

Producción especifica de nisina(KB= AU/gXmax) 0.74
Tasa aparente de inactivación nisina (Kinact = gX max/L/h) 0.052
Conc. Minima Biomasa para el inicio prod. Nisina (KB'=gX max/L) 0.0015
Edgar Zárate S.

57
 Tabla Nº 6
Efecto del cloruro de sodio sobre los parámetros de crecimiento de
Lactococcus lactis en caldo MRS según modelo de Gomper z
Parámetros
0% NaCl 2% NaCl 4% NaCl 6% NaCl
crecimiento
a 3.11 3.19 3.09 2.89
b 0.27 0.24 0.21 0.17
c 5.19 4.69 2.48 2.01
M 4.91 5.14 6.03 7.59
Desv. Estand 0.188 0.118 0.11 0.02
R2 0.998 0.999 0.997 0.989
a= población inicial UFC/mL
b= Tasa máxima de crecimiento UFC/mL/h
c= Máxima población obtenida
M= Tiempo tasa máxima crecimiento

58
 Edgar Zárate S.

Tabla Nº 7

Parámetros de la producción de nisina por Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa

Parámetros Cloruro de sodio

0% 2% 4% 6%
Actividad de la Nisina (B= AU/L)
2.12 1.39 1.22 0.38
Producción especifica de nisina(KB=
AU/gXmax) 0.82 0.53 0.47 0.14
Tasa aparente de inactivación nisina (K inac =
gX max/L/h) 0.052 0.072 0.129 0.268
Conc. Minima Biomasa para el inicio prod.
Nisina (XB'=gXmax/L) 0.25 0.42 0.76 1.12
Edgar Zárate S.

59
 Tabla Nº 8

Valores de los parámetros biocinéticos de Lactococcus lactis y su relación

con las concentraciones de NaCl y producción de nisina según modelos
primarios y secundarios

Ecuaciones modelo empírico

Parámetros Modelo primario
biocinéticos Modelo secundario
µ max 0.27 ± 0.18 0.30 ± 0.22

Xmax 0.30 ± 0.06 2.92 ± 0.18

? 0.51 ± 0.01 0.49 ± 0.04

YX/S 0.15 ± 0.03 0.14 ± 0.02

mS 0.27 ± 0.02 0.29 ± 0.03

kB 0.74 ± 0.01 0.76 ± 0.02

Kinact. 0.052 ± 0.002 0.0054 ± 0.005

Edgar Zárate S.

60