Abstracto

Las técnicas de placa de Jerne et al. 1 y de Ingraham y Bussard2 para el ataque de células
productoras de anticuerpos individuales implican la lisis de eritrocitos suspendidos en tres
dimensiones alrededor de las células activas en un medio de apoyo, agar o METcelulosa de HYL. Se
esperaría una sensibilidad máxima con este sistema si se examinaba una sola capa de células
linfoides y eritrocitos Diana. Se ha ideado un método que dispensa con medios de apoyo y permite
la detección de células productoras de anticuerpos Suficiente Lyse sólo 10 – 20 eritrocitos
adyacentes.

Una hoja de párrafofcera de aletas 2 cm x 2 cm y 10µ gruesa se corta con un micrótomo, y un

orificio de 1 cm diámetro entonces perforado en él con un barrenador del corcho. Esta hoja se
seca en un MICROSCOPe Se deslizóe Formando una "cámara" superficial. Una suspensión de las
células productoras de anticuerpos para Ser examinado se hace en el medio de Eagle en 0 °C Y
complementar y Objetivo Eritrocitos concentraciones finales del 10 por ciento cada una. La mezcla
es Calienteed Para temperatura ambiente durante unos segundos, y una pequeña gota (alrededor
de 5 µl.) se pipeteó en el vaso en un borde interior de la cámara. Un cubreobjetos redondo, 1-3 cm
de diámetro, es Bajado lentamente a la gota, que se propaga para llenar la cámara y lo desborda.
El exceso de líquido se succiona con un filtro-Papel alrededor de los bordes del cubreobjetos,
wHich Coloca en el borde del párrafoHonorarion por debajo, y el cámara se sella con paraff
calentadoiNo ' Vaselina '.

Las placas comienzan a aparecer en la monocapa Dentro 1-2Min Cuando el Deslice es incubado at
37°C, y Un número máximo puede ser contado después de 20min. Most placas no aumentan de
tamaño 1-2h. el número de CE nucleadasLls en la cámara de el tamaño medido se determina
directamente contando varios campos de alta potencia (calibrados) Microscopio. Las diapositivas
pueden ser hANDLmuy áspero sin alterar las monocapas.

el principales ventajas de esta modificación Técnica as:

(a) aumento de la sensibilidad: aproximadamente tres veces más hemolisina los productores se
cuentan con el método de "suspensión libre" Son visto con la "placa de agar" Técnica. Uso de
células de varilla de oveja recubiertas con Salmonella Lipopolysaccharide (3) como el blanco,
ovejas lymcélulas de los nodos de pH que secretan anticuerpos la bacteria se encontró producir un
gran número de muy pequeño (30-40µ diámetro) placas que no pudo ser detectado por la placa
de agar Técnica (4) (Fig. I). Esferas muy pequeñas de lisis en agar Son Probablemente Oscurecido
por los glóbulos rojos intactos por encima o por debajo.

b) todas las células de una cámara Son sin oscurecido y pueden examinarse con un alto aumento.

c el técnica de suspensión libre detecta la aglutinación localizada característica de recubierto de

lipopolisacáridos Eritrocitos Alrededor Ovejas Linfa Nodo células productoras Antibacteriano
Anticuerpo en una respuesta secundaria 4. La principal desventaja del método es que no Más que
alrededor de 300.000 linfoides Células Quizás Incubados En Se cÉlBer. Aumentar el tamaño de un
soltero cámara is Insatisfactoria.

A. J. CUNNLNGHAM
Resumen

Las técnicas de placa de Jerne et al.1 y de Ingraham y Bussard2 para analizar células productoras
de anticuerpos individuales implican la lisis de eritrocitos suspendidos en tres dimensiones
alrededor de las células activas en un medio de soporte, agar o metilcelulosa. Se esperaría una
sensibilidad máxima con este sistema si se examinara una sola capa de células linfoides y
eritrocitos objetivo. Se ha ideado un método que prescinde de los medios de soporte y permite la
detección de células que producen anticuerpos suficientes para lisar solo 10 a 20 eritrocitos
adyacentes.

Se corta una lámina de parafina de 2 cm x 2 cm y 10 µ de espesor con un microtomo, y luego se

perfora un orificio de 1 cm de diámetro con un perforador de corcho. Esta hoja se seca en un
portaobjetos de microscopio formando una 'cámara' poco profunda. Una suspensión de las células
productoras de anticuerpos que se examinarán se realiza en medio de Eagle a 0 ° C y los eritrocitos
del complemento y objetivo se añaden a concentraciones finales del 10 por ciento cada una. La
mezcla se calienta a temperatura ambiente durante unos segundos, y se pipeta una pequeña gota
(aproximadamente 5 µl) en el vaso en un borde interior de la cámara. Un cubreobjetos redondo,
de 1 a 3 cm de diámetro, se baja lentamente sobre la gota, que se extiende para llenar la cámara y
desbordarla. El exceso de líquido se aspira con un filtro de papel alrededor de los bordes del
cubreobjetos, que se asienta en el borde de la parafina que se encuentra debajo, y la cámara se
sella con parafina caliente - 'Vaselina'.

Las placas comienzan a aparecer en la monocapa dentro de 1-2min cuando la diapositiva se incuba
a 37 ° C, y se puede contar un número máximo después de 20min. La mayoría de las placas no
aumentan de tamaño después de 1-2 h. El número de células nucleadas en la cámara de tamaño
medido se determina directamente contando varios campos de alta potencia (calibrados) bajo el
microscopio. Las diapositivas se pueden manejar de manera bastante aproximada sin molestar a
las monocapas.

Las principales ventajas de esta técnica modificada son:

(a) Sensibilidad aumentada: aproximadamente el triple de los productores de hemolisina se

cuenta con el método de "suspensión libre" que con la técnica de "placa de agar". Usando células
de bastón de oveja recubiertas con lipopolisacárido de Salmonella (3) como objetivo, se encontró
que las células de los ganglios linfáticos de la oveja que secretan anticuerpos contra la bacteria
producen grandes cantidades de placas muy pequeñas (30-40µ de diámetro) que no pudieron ser
detectadas por la técnica de la placa de agar (4) (Fig. I). Estas esferas muy pequeñas de lisis en agar
están probablemente ocultas por glóbulos rojos intactos arriba o abajo.

(b) Todas las células en una cámara no están oscurecidas y se pueden examinar con gran aumento.

(c) La técnica de suspensión libre detecta la aglutinación localizada característica de los eritrocitos
recubiertos con lipopolisacáridos alrededor de las células de los ganglios linfáticos de las ovejas
que producen anticuerpos antibacterianos en una respuesta secundaria (4). La principal
desventaja del método es que no se pueden incubar más de 300,000 células linfoides en una sola
cámara. Aumentar el tamaño de una sola cámara es insatisfactorio.

A. J. CUNNLNGHAM
Abstract

The plaque techniques of Jerne et al.1 and of Ingraham and Bussard2 for assaying single antibody-
producing cells involve the lysis of erythrocytes suspended in three dimensions around the active
cells in a supporting medium, agar or methyl cellulose. Maximum sensitivity with this system
would be expected if a single layer of lymphoid cells and target erythrocytes was examined. A
method has been devised which dispenses with supporting media and allows detection of cells
producing antibody sufficient to lyse only 10–20 adjacent erythrocytes.

A sheet of paraffin wax 2 cm x 2 cm and 10µ thick is cut with a microtome, and a hole 1 cm
diameter then punched in it with a cork borer. This sheet is dried on to a microscope slide forming
a shallow 'chamber'. A suspension of the antibody-producing cells to be examined is made in
Eagle's medium at 0°C and complement and target erythrocytes added to final concentrations of
10 per cent each. The mixture is warmed to room temperature for a few seconds, and a small drop
(about 5 µl.) is pipetted on to the glass at an inner edge of the chamber. A round coverslip, 1-3 cm
in diameter, is Lowered slowly on to the drop, which spreads to fill the chamber and overflows it.
Excess fluid is sucked off with a filter-paper around the edges of the coverslip, which settles on to
the rim of paraffin beneath, and the chamber is sealed with heated paraffin- 'Vaseline'.

Plaques begin to appear in the monolayer within 1-2min when the slide is incubated at 37°C, and a
maximum number may be counted after 20min. Most plaques do not increase in size after 1-2h.
The number of nucleated cells in chamber of measured size is determined directly by counting
several (calibrated) high-power fields under the microscope. Slides may be handled quite roughly
without disturbing the monolayers.

The main advantages of this modified technique ace:

(a) Increased sensitivity: about three times as many haemolysin producers are counted with the
'free suspension' method as are seen with the 'agar plate' technique. Using sheep rod cells coated
with Salmonella lipopolysaccharide (3) as the target, sheep lymph node cells secreting antibody to
the bacterium were found produce large numbers of very small (30-40µ diameter) plaques which
could not be detected by the agar plate technique (4) (Fig. I). Such very small spheres of lysis in
agar are probably obscured by intact red cells above or below.

(b) All cells in a chamber are unobscured and may be examined at high magnification.

(c) The free-suspension technique detects the characteristic localized agglutination of

lipopolysaccharide-coated erythrocytes around sheep lymph node cells producing antibacterial
antibody in a secondary response (4). The main disadvantage of the method is that not more than
about 300,000 lymphoid cells may be incubated in ono chamber. Increasing the size of a single
chamber is unsatisfactory.

A. J. CUNNLNGHAM