UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

CENTRO DE TECNOLOGIA - CTEC

ENGENHARIA QUÍMICA

Marília Inês Oliveira Belo

QUANTIFICAÇÃO DE COLIFORMES NA ÁGUA E ALIMENTOS

Maceió – AL

2018
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 MARÍLIA INÊS OLIVEIRA BELO

QUANTIFICAÇÃO DE COLIFORMES NA ÁGUA E ALIMENTOS

Relatório apresentado à disciplina

Laboratório de Engenharia Química II, do
curso de Engenharia Química da
Universidade Federal de Alagoas, como
requisito avaliativo para a mesma.

Orientador: Professor Dr. Jorge José de

Brito Silva

Maceió – AL

2018
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 RESUMO

A contaminação de água e alimentos para consumo por microrganismos

patogênicos, habitantes do trato intestinal de seres humanos e outros animais, pode
causar diversas doenças, desde diarreias e infecções urinárias a gastrenterites que
podem ter sérias complicações. Devido à importância médica, um grande número
dessas espécies é caracterizado e possui testes que indicam sua presença no meio.
Assim, a partir do conhecimento do metabolismo da Escherichia coli, utilizando o
método do Número Mais Provável para mensurar sua presença e quantidade
aproximada em amostra, foi determinada a existência de coliformes totais e
termotolerantes numa amostra de manga, que se mostrou apropriada para consumo.

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 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 5
2. OBJETIVOS ................................................................................................................................. 7
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................................ 7
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................................. 9
5. CONCLUSÕES .......................................................................................................................... 12
REFERÊNCIAS ............................................................................................................................... 13

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1. INTRODUÇÃO

Bactérias do gênero Escherichia, em especial Escherichia coli, habitam o trato

intestinal de seres humanos e outros animais, podendo sintetizar vitaminas, auxiliar
no consumo de oxigênio, etc. No entanto, algumas de suas linhagens são
patogênicas, causando diarreia, infecção urinária e até surtos de doenças graves
transmissíveis por alimentos ou água contaminada, podendo levar à graves
complicações e até à morte (MADIGAN et al, 2016). Deste modo, há padrões
previamente estabelecidos para as quantidades aceitáveis destes microrganismos na
água fornecida e em alimentos.

A contaminação de alimentos e do abastecimento de água por esgotos pode

ser detectada pela presença de coliformes. A terminologia ‘coliforme’ não se refere
apenas à Escherichia coli, incluindo gêneros de bactérias tais como Enterobacter e
Klebsiella – todas pertencentes ao grupo das bactérias entéricas. No entanto, como
apenas a E. coli é exclusiva do intestino, o termo é usado para indicar contaminação
fecal (LEVINSON, 2011).

De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA –, pelo

disposto na resolução 310/99, a água mineral natural e a água natural devem ser de
tal qualidade que não apresentem risco à saúde do consumidor, de modo que, em
100mL, não pode haver E. coli ou quaisquer coliformes termotolerantes. Para frutas
frescas, por outro lado, a tolerância é de 500 por grama ou mililitro (Resolução
12/2001).

As bactérias entéricas são caracterizadas por serem anaeróbias facultativas,

gram-negativas, podendo ou não apresentar motilidade. Seus gêneros podem ser
diferenciados pelo tipo e proporção dos produtos da fermentação que realizam:
Escherichia produz ácidos acético, lático e succínico, enquanto Enterobacter e
Klebsiella fermentam butanediol. Portanto, o metabolismo característico destes
microrganismos serve de base para o teste de sua presença em amostras, por várias
técnicas diferentes. Por exemplo, a identificação presuntiva das bactérias entéricas
pode ser feita a partir de meios que reúnem várias reações bioquímicas num único

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tubo de ensaio, como o Meio de Rugai, TSI e EPM MILI, seguida de provas
complementares, confirmativas (ANVISA, 2013).

Neste sentido, o uso do método do Número Mais Provável (NMP) para

identificação e cálculo do número de microrganismos baseado em probabilidade é
muito utilizado. Esta técnica é composta de três testes: teste presuntivo, no qual é
obtida uma estimativa preliminar da densidade de bactérias num meio restritivo; teste
confirmativo, no qual ocorre a inoculação do material positivo do teste anterior, num
meio mais seletivo; e o teste completo, usado para determinação do número de
coliformes totais.

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2. OBJETIVOS

Avaliar a qualidade da água e alimentos consumidos, através da detecção de

coliformes totais e termotolerantes, por meio da técnica do Número Mais Provável.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Materiais:
• Água Peptonada;
• Balança analítica;
• Béquer;
• Erlenmeyer;
• Estufa;
• Manga;
• Meio de cultivo caldo lactosado;
• Meio de cultivo caldo verde brilhante a bile 2% (VB);
• Meio de cultivo caldo Escherichia coli (EC);
• Pipeta automática;
• Ponteiras;
• Suporte de metal;
• Tubos de Durhan;
• Tubos de ensaio.

3.2. Métodos:

3.2.1. Teste presuntivo

• Pesar, num béquer, 5g da fruta, transferindo-a em seguida para o erlenmeyer

e acrescentar 45mL de água peptonada, agitando vigorosamente a mistura por
cinco minutos (esta solução corresponde à diluição 10-1);
7
• Preparar nove tubos de ensaio com o meio caldo lactosado e tubo de Durhan
invertido, para realizar o teste presuntivo;
• Em três dos tubos contendo caldo lactosado, adicionar 0,5mL da solução 10-1;
• Preparar a diluição 10-2, transferindo 0,5mL da solução anterior para um tubo
de ensaio contendo 4,5mL de água peptonada;
• Em três dos tubos contendo caldo lactosado, adicionar 0,5mL da solução 10 -2;
• Preparar a diluição 10-3, transferindo 0,5mL da solução 10-2 para um tubo de
ensaio contendo 4,5mL de água peptonada;
• Nos três tubos restantes contendo caldo lactosado, adicionar 0,5mL da solução
10-3;
• Colocar o suporte com os tubos de ensaio na estufa e aguardar 24 horas para
a primeira observação;
• Caso o meio tenha ficado turvo após 24h, ou bolhas de ar sejam perceptíveis
nos tubos de Durhan dentro dos tubos de ensaio, o teste presuntivo foi positivo
e deve-se proceder com os testes confirmativos. Caso contrário, aguardar mais
24 horas para nova observação e, se nenhuma mudança for observada,
considerar este teste negativo.

3.2.2. Teste confirmativo

• Para cada tubo de ensaio no qual o teste presuntivo foi positivo, preparar um
tubo com meio VB e outro, com meio EC. O primeiro fornecerá o teste
confirmativo para coliformes totais e o segundo, para coliformes
termotolerantes;
• Para cada tubo de teste presuntivo positivo, transferir 0,01mL do seu conteúdo
para o tubo contendo VB e a mesma quantidade para o tubo contendo EC;
• Aguardar 24 horas para análise. Se, após este período, o tubo com meio VB
tornar-se turvo, o teste confirmativo para coliformes totais é positivo. Do mesmo
modo, se o tubo contendo meio EC tornar-se turvo, o teste confirmativo para
coliformes termotolerantes é positivo. Caso nenhuma mudança seja percebida
nesse intervalo de tempo, aguardar mais 24 horas para nova observação;
• Tomar nota do número de tubos positivos na fase confirmativa, para consulta à
tabela de NMP de cálculo de microrganismos.
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4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Os resultados dos testes presuntivo e confirmativo estão dispostos na Tabela

1 e podem ser visualizados através das figuras 1 e 2:

Tabela 1: Resultado dos testes presuntivo e confirmativo de coliformes.

Teste Teste
Tubo Teste confirmativo
presuntivo confirmativo
Diluição de para coliformes
com caldo para coliformes
ensaio termotolerantes (EC)
lactosado totais (VB)
1 Positivo Positivo Positivo
10-1 2 Positivo Positivo Positivo
3 Positivo Positivo Positivo
1 Positivo Positivo Positivo
10-2 2 Positivo Positivo Positivo
3 Positivo Positivo Positivo
1 Positivo Positivo Positivo
10-3 2 Negativo - -
3 Negativo - -
Fonte: autor, 2018.

Figura 1: Teste presuntivo, após 24 horas, para (a) diluição 0,1, (b) diluição 0,01 e (c) diluição 0,001.

(a) (b) (c)

Fonte: autor, 2018.

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 Figura 2: Testes confirmativos VB e EC, após 24 horas de inoculação, diluição 0,001.

Fonte: autor, 2018.

A combinação dos resultados positivos das três diluições, partindo da Tabela 2

de Número Mais Provável para 3 séries de 3 tubos cada, fornece o número mais
provável de microrganismos, incluindo o limite de confiança.

Tabela 2: Número Mais Provável para 3 séries de 3 tubos cada, com intervalo de confiança de 95%.

For 3 tubes each at 0.1, 0.01, and 0.001 g inocula, the MPNs per gram and 95
percent confidence intervals.
Pos. Tubes MPN/ Conf. lim. Pos. tubes MPN/ Conf. lim.
0.1 0.0 0.00 g Lo Hig 0.1 0.0 0.00 g Lo High
0 1 1 w h 0 1 1 w
0 0 0 <3.0 – 9.5 2 2 0 21 4.5 42
0 0 1 3.0 0.1 9.6 2 2 1 28 8.7 94
5
0 1 0 3.0 0.1 11 2 2 2 35 8.7 94
5
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94
10
 0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94
1 0 0 3.6 0.1 18 3 0 1 38 8.7 110
7
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,00
0
2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,00
0
2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,00
0
2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,10
0
2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 –
Fonte: U.S. Department of Health and Human Services.

A combinação de três resultados positivos na diluição 0,1, seguida de três

resultados positivos na diluição 0,01 e um resultado positivo na diluição 0,001 resulta
no número mais provável de microrganismos por grama NMP = 460/g.

Comparando-se este valor com o limite estabelecido pela ANVISA para frutas
frescas (500/g), o resultado obtido se encontra dentro da tolerância, seja para
coliformes totais, quanto para coliformes termotolerantes, visto que todos os testes
presuntivos deram positivos nos testes confirmativos seguintes.

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5. CONCLUSÕES

De acordo com as determinações estabelecidas pela Agência Nacional de

Vigilância Sanitária – ANVISA – para quantidades limite de microrganismos em
diversos alimentos, o valor obtido nos testes por Número Mais Provável, NMP = 460/g,
encontra-se dentro da faixa aceitável para coliformes totais e termotolerantes em
frutas frescas, que é de 500/g. Deste modo, seguindo a resolução 12/2001, o alimento
se encontra de acordo com os padrões legais vigentes e apropriado para o consumo
humano.

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 REFERÊNCIAS

AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Microbiologia clínica para o

controle de infecção relacionada à assistência à saúde. Módulo 6: detecção e
identificação de bactérias de importância médica. ANVISA. Brasília, 2013.
Disponível em <
https://www20.anvisa.gov.br/segurancadopaciente/index.php/publicacoes/item/detec
cao-e-identificacao-de-bacterias-de-importancia-medica>. Acesso em 25/08/2018.

AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Resolução nº 310, de 16 de

junho de 1999. Disponível em <
http://www.anvisa.gov.br/anvisalegis/resol/310_99.htm>. Acesso em 25/08/2018.

AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Resolução RDC Nº 12, de 02

de janeiro de 2001. Disponível em <
http://portal.anvisa.gov.br/documents/33880/2568070/RDC_12_2001.pdf/15ffddf6-
3767-4527-bfac-740a0400829b>. Acesso em 25/08/2018.

LEVINSON, W. Microbiologia médica e imunologia. 10 ed. AMGH. Porto Alegre,

2011.

MADIGAN, M. T. et al. Microbiologia de Brock. 14 ed. Artmed. Porto Alegre, 2016.

U.S. Department of Health and Human Services. BAM Appendix 2: Most Probable
Number from Serial Dilutions. 2010. Disponível em <
https://www.fda.gov/food/foodscienceresearch/laboratorymethods/ucm109656.htm>.
Acesso em 25/08/2018.

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