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Universidad de Guayaquil

Facultad de Ciencias Químicas


Carrera: Química y Farmacia
Prácticas de Laboratorio
PRACTICA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS Y PREPARACIÓN DE DILUCIONES
#1
Grupo 4B Nombre: Alay Murillo Yesenia Paola. Docente: Dra. Celeste Carrillo Tomalá.
Microbiología II Fecha: 02/06/2019
Objetivos de la práctica de laboratorio
1. Realizar siembras por estrías empleando un agar cromogénicos.
Fundamento
Por más de un siglo, desde el trabajo de Robert Koch con “la mezcla de nutrientes líquidos y gelatina”, los
medios de cultivo sólidos han sido usados para el cultivo de formaciones de microorganismos en constante
expansión. Fue el trabajo de Walther Hesse (1846-1911) y su esposa Fanny (née Eilshemius) (1846-1934) el
que estableció el uso de agar como un agente gelificante superior para los medios sólidos1. El principal
problema con tales medios nutritivos de uso general fue la incapacidad para distinguir entre organismos
patógenos y no patógenos solo por características morfológicas. En un tiempo cuando se estaban descubriendo
muchas nuevas cepas, la identificación microbiana y la taxonomía estaba en su infancia y la necesidad de
establecer perfiles bioquímicos de las especies bacterianas (y así proporcionar un medio para la diferenciación)
se hizo evidente. Sin embargo, esto necesitó de extensivas pruebas de colonias individuales de crecimiento
bacteriano y fue un trabajo altamente intensivo. Además, el trabajo debía ser muy meticuloso y la experiencia
estaba en las manos de unos pocos.

Gradualmente, mientras más se sabía acerca de las diferencias bioquímicas entre diferentes géneros y especies
(por ejemplo la habilidad para degradar ciertas sustancias o producir sustancias bioquímicas específicas tales
como puntos finales del metabolismo), los medios de cultivo fueron evolucionando para incorporar
componentes adicionales, tales como fuentes de carbohidratos específicos y un indicador de pH adecuado, para
ayudar la identificación diferencial. Los agentes inhibidores (por ejemplo sales biliares, ciertos colorantes y
otros compuestos) también se convirtieron en un ingrediente usado comúnmente para reducir o eliminar el
crecimiento de organismos no deseados. Así, los medios pudieron ser clasificados como selectivos tanto como
diferenciales. Un ejemplo clásico de esto es el Agar MacConkey (imagen 1), que contiene lactosa y rojo neutro
para la diferenciación de organismos fermentadores de lactosa, junto con sales biliares para la inhibición de
especies sensibles a la bilis. Estas propiedades lo hacen útil en la identificación de patógenos intestinales como
salmonellas (de importancia en microbiología clínica, de alimentos y agua), que son generalmente no
fermentadoras de lactosa (NLF), así como comensales como Escherichia coli que pueden fermentar lactosa (un
indicador clave de contaminación fecal, también importante en microbiología de alimentos, agua e industrial).
SUSTRATOS CROMOGÉNICOS

Un sustrato cromogénico puede ser definido como “un compuesto o sustancia que contiene un grupo formador
de color”4. Los sustratos cromogénicos comercialmente sintetizados (o cromógenos) están disponibles para la
detección de muchas enzimas hidrolasas, incluyendo glicosidasas, peptidasas, fosfatasas y esterasas (Tabla 1).
Este grupo de enzimas incluye varios productos génicos específicos para cierto género (o en algunos casos
especie) de bacterias y su detección a menudo puede ser una ayuda invaluable para la diferenciación e
identificación. Esto puede reducir significativamente la cantidad de trabajo requerido para confirmar la
identidad y el significado de la colonia sospechada.

Las glicosidasas exhiben especificidad no solo por el tipo de azúcar, sino por su conformación estérica (D- o
L-) y la conformación del enlace glucosídico (α- o β-)2. Por ejemplo los cromógenos β-D-glucósidos son
específicos para detectar actividad de β-D-glucosidasa y su utilidad en la diferenciación bacteriana está bien
documentada

MEDIOS DE CULTIVO CROMOGÉNICOS

La incorporación de más de un cromógeno en un medio puede mejorar sus propiedades de especificidad y


diferenciales. Un medio que contiene 5-bromo-4-cloro-3-indoxil β-D-glucopiranosida (X-Gluc) y 6-cloro-3-
indoxil β-D-galactopiranosida (red-Gal) es útil para la diferenciación de potenciales patógenos del tracto
urinario, como muestran las imágenes 5 y 6.

Los organismos que expresan β-galactosidasa escinden el sustrato red-Gal para producir colonias rosas/rojas
(por ejemplo E. coli), mientras que la expresión de β-glucosidasa resulta en una escisión del X-Gluc para formar
colonias verdes (por ejemplo Enterococcus spp.). La expresión de ambas enzimas resulta en colonias de un
azul-violeta oscuro y es indicativo de Klebisiella, Enterobacter o Serratia spp. (grupo KES). Staphylococci (con
la principal excepción de S. saprophyticus) y streptococci no producen ninguna de esas enzimas y crecen como
colonias blancas o incoloras. La diferenciación de estos géneros se establece rápidamente por una prueba de
catalasa (los estafilococos son positivos para esta enzima, y los estreptococos negativos). Proteus spp. puede
ser diferenciado por la inclusión of triptófano, formando colonias color canela debido a la reacción del
triptófano con la deaminasa (TDA).

Esta tecnología también se aplicó a la diferenciación de Candida spp. con el uso de cromógenos de indoxil para
detectar la presencia de hexosaminidasa y fosfatasa alcalina. Esto está ilustrado en la imagen

BENEFICIOS DE LOS MEDIOS CROMOGÉNICOS

Un amplio rango de medios cromogénicos están disponibles comercialmente para la detección de muchos
organismos de significación en microbiología de agua, alimentos, clínica e industrial (por ejemplo, Listeria,
Salmonella, Bacillus cereus, clostridios, Cándida, enterococos, estafilococos, E. coli y coliformes). Los
principales beneficios de estos medios sobre los convencionales son su sensibilidad y especificidad mejoradas.
En algunos casos la sensibilidad mejorada puede conducir a una reducción del tiempo de incubación (por
ejemplo agars cromogénicos para detección de MRSA), permitiendo un tiempo más rápido del reporte de
resultados. Estas propiedades también los hace ideales como medios de cribado de alto volumen debido a la
reducción resultante en las pruebas confirmatorias requeridas. Desde la perspectiva de un encargado de
laboratorio, los beneficios clave de los medios cromogénicos pueden ser resumidos de la siguiente manera:

Facilidad de uso e interpretación:

 Entrenamiento requerido mínimo.


 Permite un uso más apropiado del personal experimentado.

Rendimiento mejorado:
 Mas confianza en los resultados comparado con los medios convencionales.
 Resultados más rápidos.
 Volumen reducido del trabajo de seguimiento.

Rentabilidad:

 Pruebas confirmatorias reducidas, evitan costo extra de medios.


 Significativamente más barato que un PCR u otros métodos moleculares automáticos.

Reactivos de laboratorio
 Agar cromóforo

Materiales de laboratorio
 Pipetas
 Caja de Petri
 Tubos de ensayos
 Auxiliar
 Algodón
 Fosforo

Equipos de laboratorio
 Balanza
 Estufas
 Mechero de bunsen

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria o procedimiento

Y SE REALIZO
se tomo los UNA SIEMBRA DEJAR PR
tunos positivos CON ESTRIAS EN INCUBAION POR
en el agar EC EL AGAR 48 HORAS
CROMOFORO
Resultados obtenidos /cálculos

DILUCIONES NOMBRE DEL BACTERIAS COLONIAS

PRODUCTO

1:1000 EC QUESO COLIFORMES 6

1:10OEC QUESO COLIFORMES 32

1:10.000 E.COLI

QUESO COLIFORMES

Conclusiones

Para concluir podemos decir que mediante el empleo de un agar cromógeno en un medio este puede mejorar

sus propiedades de especificidad y diferenciación. Un amplio rango de medios cromogénicos están

disponibles comercialmente para la detección de muchos organismos de significación en microbiología de

agua, alimentos, clínica e industrial (por ejemplo, Listeria, Salmonella, Bacillus cereus, clostridios, Cándida,

enterococos, estafilococos, E. coli y coliformes).

Por lo cual en esta práctica se concluye que según la INEM 1528 el producto de queso artesanal no es

consumible ya que presentan coliformes fecales y hay presencia de E.coli.

Recomendaciones

 Siempre esterilizar el mesón antes y después de la práctica.


 Realizar la siembra en forma de estría.
 Leer los resultados después de 48 horas.

Bibliografía
Granados, R. (2003). Bacteriologia,caracteristica y clasificacion bacteriana (1 ed., Vol. 1). Madrid-España:
Paranninfo S.A. doi:978-84-9732-123-5

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