ANÁLISIS ARTÍCULO: “EL RECEPTOR ADRENÉRGICO ALFA-1A EN EL

CORAZÓN DEL CONEJO"

Los autores del artículo son:

 R. Croft Thomas, Jr,
 Patrick M. Cowley
 Et al. (Y asociados)
La investigación se llevó acabo en el Departamento de Medicina, División de
Cardiología y Servicio de Investigación, Centro Médico VA, San Francisco, CA,
Estados Unidos de América. Junto con el Departamento de Medicina e Instituto
de Investigación Cardiovascular, Universidad de California San Francisco, San
Francisco, CA, Estados Unidos de América.
El artículo fue:
 Recibido el 16 de enero de 2016.
 Aceptado: 26 de abril de 2016.
 Publicado: 3 de junio de 2016.

( PLoS ONE REVISTA DE PUBLICACIóN)

El subtipo de receptor adrenérgico alfa-1A (AR) está asociado con la

señalización cardioprotectora en el ratón y en el corazón humano. El conejo es
útil para el modelado de enfermedades cardíacas, pero los datos sobre el alfa-
1A en el corazón de conejo son limitados.
El objetivo de la investigación era probar la expresión y función de la alfa-1A en
corazón de conejo. Por transcripción inversa cuantitativa en tiempo real. PCR
(qPCR) en el ARNm del miocardio ventricular de conejos blancos adultos de
Nueva Zelanda macho lograron identificar los diferentes ARNm de cada uno de
los receptores tipo alfa que se encontraron en los conejos arrojando como
resultado que el alfa-1B fue el 99% del ARNm del alfa-1-AR total y que los
conejos tenían un <1% de alfa-1A y alfa-1D del total de receptores alfa. En
cambio el ARNm alfa-1A fue superior al 50% del total en el CEREBRO Y EL
HÍGADO.
El Radioligando de saturación la unión identificó ~ 4 fmol de alfa-1-AR totales por
mg de proteína miocárdica, o sea que habían 4moles de receptores alfa 1 por
cada mg de proteína de miocardio. Ademas identificaron con un 17% de alfa-1A
por competición con el antagonista selectivo 5-metilurapidil. Tambien notaron
que el alfa-1D no era detectado por la competencia con BMY-7378, por lo tanto
esto indico que el 83% de las alfa-1-AR fueron alfa 1B. lo que infiere la gran
prevalencia de receptores alfa 1B en el corazón de conejo a diferencia del
corazón humano. En el ventrículo izquierdo aislado y el ventrículo derecho, el
agonista alfa-1A selectivo A61603 ESTIMULÓ UN EFECTO INOTRÓPICO
NEGATIVO(Provocando la disminución de la contractibilidad cardiaca) , frente a
un efecto inotrópico positivo con el efecto no selectivo fenilefrina agonista alfa-1
y el agonista isoproterenol beta, lo cual indica que en el corazón de conejo los
agonistas alfa 1ª tienen un efecto contrario al del ser humano debido a que en
este caso el efecto es inotrópico negativo a pesar de ser un agonista de dicho
receptor Alfa 1A.
En cuanto al ensayo de presión arterial en los conejos conscientes que utilizaron
un telémetro aórtico permanente mostraron que A61603 por bolo intravenoso la
dosis aumentó la presión arterial media en 20 mm Hg a 0,14 μg / kg, 10 veces
más bajo de norepinefrina, e infusión crónica de A61603 por micro infusión
programable iPRECIO la bomba no aumentó la PA a 22 μg / kg / d. Un modelo
de corte miocárdico útil en humanos.
También se descubrió que el miocardio y un modelo de cardiotoxicidad por
antraciclina útiles en ratones fueron problemáticos en conejo.

POR LO TANTO LOS INVESTIGADORES LLEGARON A LA CONCLUSIÓN

DE QUE EL ARNM ALFA-1A ES MUY BAJO EN EL CORAZÓN DE CONEJO,
PERO EL RECEPTOR ESTÁ PRESENTE POR UNIÓN Y MEDIA UNA
RESPUESTA INOTRÓPICA NEGATIVA. EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL ALFA-
1A EN EL CORAZÓN DE CONEJO DIFIEREN DEL RATÓN Y EL HUMANO,
PERO LA RESPUESTA VASOPRESORA ES SIMILAR AL RATÓN.
DE TAL FORMA QUE EL SUBTIPO ΑLFA 1A-AR SE EXPRESA A UN NIVEL
MUY BAJO EN EL MIOCARDIO DE CONEJO, PERO ES FUNCIONAL,
MEDIANDO UN EFECTO INOTRÓPICO NEGATIVO. EL Α1A ES 3 A 4 VECES
MÁS ABUNDANTE EN RATÓN Y MIOCARDIO DEL VENTRICULO
IZQUIERDO HUMANO, DONDE ESTIMULA UN EFECTO INOTRÓPICO
POSITIVO. SIN EMBARGO, EL EFECTO DE LA ESTIMULACIÓN DE Α1A EN
EL CONEJO Y EL RATÓN CON RESPECTO A LA PRESION ARTERIAL ES
SIMILAR. ENFOQUES EXPERIMENTALES ÚTILES PARA ESTUDIAR. LA
SEÑALIZACIÓN Y LA PROTECCIÓN CARDIACA EN EL MIOCARDIO
HUMANO O EN EL RATÓN SON MÁS DIFÍCILES EN EL CONEJO.
 TRADUCCION
INTRODUCCIÓN
Evidencia de un papel importante para los receptores α1-adrenérgicos (AR) en
la fisiología de los miocitos cardíacos se ha acumulado durante varias décadas
(revisado en [1,2,3]), a pesar de que estos receptores son mucho menos
abundantes que los β-AR. Entre los 3 subtipos α1-AR, A, B y D, el α1A es de
Interés especial, ya que este subtipo puede mediar efectos de adaptación y
protección en modelos de mouse.
[4,5,6,7], y puede estimular la señalización y contracción de ERK protectora en
el miocardio humano[8].
Para probar la señalización descubierta en roedores, el conejo ofrece un animal
de tamaño mediano con múltiples modelos de enfermedades cardíacas. El
conejo tiene la ventaja sobre roedores de mayor similitud con miocardio humano,
en términos de electrofisiología, manejo de calcio e isosoforma de miosina
expresión [9], y varios estudios muestran protección cardíaca mediada por α1-
AR contra la isquemiareperfusión lesión en conejos (revisada en [1]).
Sin embargo, si el subtipo α1A es importante en los efectos de α1-AR en el
corazón de conejo es incierto. Un grupo encontró mRNA α1A despreciable y
unión en corazón de conejo [10,11], mientras que otros informan que el α1A es
12-27% de la unión total de α1-AR [12,13]. Si el α1A es funcional en el miocardio
de conejo se ha evaluado principalmente por el antagonismo de fenilefrina (PE)
los efectos inotrópicos positivos inducidos por antagonistas de selectividad
incierta, y los resultados son confuso [12,13,14,15].
Deseamos probar si los efectos cardioprotectores y contráctiles α1A
descubiertos en el Ratón [4,5,6,7] fueron vistos en el conejo. Aquí medimos los
ARNm del subtipo α1-AR y la unión en el miocardio de conejo, y probó los efectos
inotrópicos del miocardio y la presión arterial (PA) respuestas a los agonistas α1.
Encontramos que α1A expresión y función en el corazón de conejo difiere del
ratón y del humano, mientras que la respuesta vasopresora es similar al ratón.
También notamos aplicación fallida al modelo de corte de miocardio de conejo
útil en miocardio humano y un modelo de cardiotoxicidad de antraciclina útil en
el ratón.

MATERIAL Y MÉTODOS
Conejos
Los conejos blancos adultos adultos de Nueva Zelanda que pesaban entre 3,25
y 4,0 kg procedían del Conejo del oeste de Oregón Empresa (Philomath, OR).
En el momento de la entrega, los conejos fueron alojados individualmente en el
Veterinario. Unidad médica en acero inoxidable, rejillas de conejo ventiladas y
se deja asimilar durante una semana. La temperatura ambiente fue de 62–72 °
F, con una humedad de 30–70%, y el ciclo de luz fue de 12 h (6 am a 6 pm). Los
conejos fueron alimentados con 8 onzas diarias de Teklad Global High Fiber
Rabbit Diet # 2031, más ocasionalmente Alfalfa y verduras (4 oz). La cirugía se
realizó en una suite dedicada. La eutanasia fue por cardiectomía.
Bajo anestesia profunda con isoflurano. Todos los procedimientos fueron
revisados y aprobados por el San Francisco VA Medical Center Comité de
cuidado y uso de animales.
PREPARACIÓN DE ARN
El tejido se homogeneizó en el reactivo TRIzol (ThermoFisher Scientific # 15596–
018), usando un homogeneizador rotor-estator (Polytron) a velocidad 7 de 10 a
4 ° C. ARN fue extraído con cloroformo (Fisher Scientific # C606-1), y la fase
acuosa se purificó en Qiagen Mini-Prep columnas (RNeasy Mini Kit # 74106).
Las muestras fueron tratadas con DNasa (Turbo DNAfree, Ambion # AM1907) y
se cuantificó utilizando espectrofotometría (BioRad SmartSpec 3000). A260 /
280 relaciones fueron de al menos 1.9. Se analizaron muestras de ARN
seleccionadas para confirmar la ausencia de degradación (Agilent 2100
BioAnalyzer).

Unión de radioligandos
Se homogeneizaron aproximadamente 200 mg de peso húmedo de tejido (Tris-
HCl 5 mM, EDTA 5 mM, 250 M de sacarosa a pH 7,4 más 0,1 mM de PMSF) y
se centrifugaron a 100.000 x g durante 1 h. El pellet se resuspendió en tampón
de homogeneización y se centrifugó de nuevo. La membrana final resultante
el sedimento se resuspendió en tampón de ensayo (Tris 50 mM, pH 7,4, 1
mMEDTA), y se usó para saturación y competición de los radioligandos de unión.
La unión de saturación de α1-AR fue a 30 ° C durante 60 minutos con 50–200
μg de proteína de membrana por tubo (~ 2,5 mg de tejido), por triplicado con 6
concentraciones (0,04–1,2 nM) de 3H-prazosina (85 Ci / mmol, Perkin Elmer #
NET-823), o 6 concentraciones (10–800 pM) de 125I-HEAT (2- [β- (4-hidroxifenil)
- etil-aminometil] tetralona) (2200 Ci / mmol, Perkin Elmer # NEX182100UC).
La fentolamina (10 μM) (Sigma # P-131) definió la unión no específica [18].
Las proteínas del subtipo se cuantificaron mediante unión competitiva. Unión de
3H-prazosina (0,5 nM) o 125I-HEAT (50 pM) se compitió con 22 concentraciones
(0.05 nM — 500 μM) en duplicado de BMY-7378 (Sigma Aldrich # B134), un
antagonista selectivo α1D [19,20], o 5-metilurapidil (5MU) (Sigma-Aldrich #
U101), un antagonista selectivo α1A [21]. Unión los datos se analizaron
utilizando GraphPad Prism v5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).
Subtipo los porcentajes se calcularon a partir de curvas de competencia
ajustadas.

CONTRACCIÓN DEL MIOCARDIO

Se disecaron trabéculas lineales no ramificadas del ventrículo izquierdo (LV) y
del ventrículo derecho (RV) en solución de Krebs-Henseleit modificada que
contiene (en mM) NaCl, 137; KCl, 10; MgSO4, 1.2; NaH2PO4, 1.2; glucosa, 10;
NaHCO3, 20; CaCl2, 0,2; y 2,3-butanediona monoxime, 30; y se gasificó con
95% de O2 / 5% de CO2 para dar un pH de 7.4 a 22 ° C. Las trabéculas quedaron
en esta solución. Hasta su uso. Se estudiaron consecutivamente dos trabéculas
por corazón, una de cada ventrículo, con el orden de uso alternado entre
experimentos. Se colocaron trabéculas en un músculo. Cámara (3 x 3 x 15 mm)
y se monta entre un transductor de fuerza (AE-801, Kronex, Oakland, CA), y un
micromanipulador con pasadores de acero inoxidable. Las trabéculas se
sobrefundieron a 5 ml / min. Durante 1 hora a temperatura ambiente en Krebs-
Henseleit. Solución que contiene KCL 5 mM y no 2,3, -butanediona monoxime.
CaCl2 fue gradualmente aumentado más de 30 min. a 1,5 mM. La temperatura
de la solución se aumentó a 36,5ºC. Trabéculas fueron estimulados
eléctricamente a 1.5 Hz usando electrodos de alambre de platino, y la longitud
del músculo se incrementó para maximizar la fuerza de contracción.
Los receptores α1-adrenérgicos cardíacos se estimularon mediante la adición de
una dosis máxima del subtipo Agonista no selectiva fenilefrina (PE) (Sigma # P-
6126) (10 μM), o una dosis máxima de el agonista selectivo del subtipo α1A
A61603 (N- [5- (4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il) -2-hidroxi Hidrobromuro de 5,6,7,8-
tetrahidronaftalen-1-il] metanosulfonamida) (100 nM) (Tocris Productos
farmacéuticos # 1052). El orden fue alternado entre experimentos. Agudo
inotrópico las respuestas a los agonistas del receptor adrenérgico α1 se
evaluaron cuando la fuerza de contracción se estabilizó, Normalmente ~ 20 min
después de la adición. Después de cada tratamiento con agonista, el agonista
se eliminó Perfusión durante 20 min. Con solución libre de drogas.
Los receptores β-adrenérgicos cardíacos se estimularon mediante la adición de
una dosis máxima (1 µM) de Agonista subtipo-no selectivo L-isoproterenol HCl
(ISO) (Sigma # I6504). El inotrópico la respuesta a ISO se midió 150-200
segundos después de la adición, cuando la fuerza de contracción fue máximo.
TELEMETRÍA PARA LA PRESIÓN ARTERIAL (PA) Y LA FRECUENCIA
CARDÍACA (HR)
BP y HR se midieron en conejos despiertos usando telémetros implantados.
Formas de onda de presión se adquirieron a 500 Hz y se redujeron a 5-20 s.
Todo el equipo de telemetría fue comprado. de Data Sciences International (DSI)
(St. Paul, MN) incluidos los telemetros (modelo TL11-M2- D70-PCT catéter de
25 cm, # 270-0093-816), receptores (modelo RPC-1, # 272-6001-001), un dato
dispositivo de procesamiento (modelo Data Exchange Matrix, # 271-0117-001),
una referencia de presión ambiental monitor (modelo APR-1, # 275-0020-001) y
software Dataquest A.R.T con computadora Dell (Modelo Dataquest A.R.T., #
271-0147-CFG). Los datos fueron analizados en Excel (Microsoft), y los gráficos
y estadísticas utilizados Prism 6.0 (GraphPad). Para la implantación del
telémetro, los conejos fueron sedados con buprenorfina 0,3 mg / kg subcutánea.
y se combinaron 25 mg / kg de ketamina y 3 mg / kg de xilazina por vía
intramuscular; entonces anestesiado con isoflurano inhalado 2–5%; y
administrado 100% de oxígeno a través de un tubo endotraqueal (con manguito,
tamaño 2). SpO2, HR y temperatura (37 ° C) fueron monitoreados. El telémetro
fue roscado en la aorta abdominal a través de la arteria femoral derecha, que
estaba ligada permanentemente, y la aorta abdominal se implantó transmisor en
el flanco derecho. Dos derivaciones de ECG se colocaron por vía subcutánea
sobre La caja torácica. Se administró carprofeno 4 mg / kg por vía subcutánea
para el dolor postoperatorio y enrofloxacina
Se administraron 5 mg / kg por vía subcutánea para la profilaxis antibiótica.
Conejos descansados durante 7 d después cirugía.

ESTUDIOS DE DOSIS-RESPUESTA INTRAVENOSA AGUDA (IV)

Los conejos despiertos, no sedados fueron restringidos suavemente (caja de
restricción de conejo Tecniplast). Un 20 el medidor IV se insertó en una vena de
la oreja, y los conejos se recuperaron durante al menos 30 minutos y hasta BP y
HR normalizados. Vehículo y dosis crecientes del agonista AR no selectivo
norepinefrina (Sigma # A0937) y el agonista específico de α1A-AR A61603 se
infundieron en 3 ml de solución salina, con al menos 5 min entre dosis para que
la PA y la FC vuelvan a la línea de base. Los valores fueron capturados cada 5
s; la línea de base se tomó como el promedio de 1 minuto antes de la
dosificación, y el pico fue el máximo valor de 10 segundos dentro de 1 min de
infusión.

INFUSIÓN CRÓNICA DE DROGAS POR IPRECIO

Las dosis crecientes de A61603 se infundieron utilizando una bomba de
microinfusión iPRECIO (Primetech, Tokio, Japón). Después de la anestesia
como se indica anteriormente para el implante de telémetro, la bomba iPRECIO
se colocó en la parte posterior entre las escápulas, y se colocó un catéter en
forma de túnel y se insertó en el Vena yugular, que fue ligada permanentemente.
Después de 4 d de recuperación, aumentando las dosis de A61603. se
infundieron mientras que la PA se medía en el conejo despierto, no restringido,
por el residente telémetro.
RODAJAS DE MIOCARDIO
Un enfoque para hacer cortes finos de miocardio a partir del LV de conejo siguió
un protocolo que desarrollamos para LV humano [8], con numerosas
modificaciones en un intento de obtener viables, relajados rebanadas Se obtuvo
anestesia profunda con isoflurano al 5%; El corazón con una longitud máxima de
la aorta se eliminó rápidamente y se sumergió en cardioplejía helada que
contenía (en mM) NaCl 110; KCl 16; CaCl2 1.2; NaHCO3 10; MgCl2 16. La aorta
fue canulada y 100 ml de hielo la cardioplejía se perfundió anterógrada en las
arterias coronarias, lo que resultó en una relajación estado. Se generaron
núcleos de cinco u 8 mm de diámetro a partir de la pared o tabique libre del VI
utilizando un prensa de núcleo (Alabama Investigación y Desarrollo, MD5000 /
53000, Munford, AL) con una herramienta de perforación cilíndrica (Alabama
Investigación y Desarrollo, MP0144 para 8 mm o MP0143 para 5 mm).
Los núcleos se incrustaron utilizando una unidad de inclusión de tejidos
(Alabama Research and Development, MD2299) en agarosa de baja
temperatura de fusión de 1.25% a 2% (agarosa II, Amresco 0815) en varios
diferentes tampones de corte que contienen (en mM) NaCl 110–130; KCl 15-16;
HEPES 0-10; NaHCO3 4.2–10; Na2HPO4 0–0,3; MgSO4-7H2O 0–0.5 o MgCl2
0–16; glucosa 0–5.6; CaCl2 0–1.3; y 2,3-butanediona monoxime (BDM, Sigma-
Aldrich B0753) 0–30; pH 7.2). Alternativamente, Los núcleos se utilizaron
directamente para cortar sin incrustar. El núcleo estaba orientado en el Cortador
de tejido Krumdieck (Alabama Research and Development, MD4000) con el
endocardial superficie hacia la cuchilla, de modo que el plano de corte fuera
paralelo al eje largo del miocito; una el peso mantiene la presión hacia abajo. El
grosor de la rebanada se fijó en 150–350 μm. El instrumento Pasó el núcleo
repetidamente y automáticamente a través de una cuchilla de acero inoxidable
reemplazable, mientras que sumergido en 4 ° C, tampón de corte estéril. El
tampón de circulación hizo flotar las rodajas resultantes en un vaso. Trampa y
una bandeja recolectora. Si los cortes resultantes se relajaron, entonces el
protocolo fue planeado como para rodajas humanas, para agregar CaCl2
adicional a intervalos de 10 minutos para aumentar la concentración de calcio
gradualmente a 25, 50, 100, 200, 400, 700 y 1000 μM.

TRATAMIENTO DE ANTRACICLINA
Los conejos recibieron daunorubicina (BioVision # 1524-1) 3 mg / kg,
doxorubicina (Tocris # 2252, lote
# 3B / 137005) 1.5 mg / kg, o vehículo para 10 a 12 dosis semanales por vía
intravenosa a través de la vena del oído. Al mismo tiempo, bajo anestesia con
buprenorfina 0,03 mg / kg e isoflurano 5% para la inducción y El 2,5% para
mantenimiento, ecocardiografía para medir la función cardíaca se realizó con un
Acuson. Sequoia C256 y la troponina cardíaca I se cuantificaron como un índice
de daño miocárdico, Uso de una gota de sangre de una arteria de la oreja en un
cartucho iSTAT Cardiac Troponin I, un sitio de dos sitios. ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (Abaxis # 600-9009).

ESTADÍSTICA
Los resultados son media ± SE. Se ajustaron las curvas de unión al radioligando
y se encontraron diferencias significativas. Probado en GraphPad Prism v5.0d.
Se utilizó una prueba t de 1 muestra para los datos de contracción.
RESULTADOS
El α1B es el ARNm dominante del subtipo α1-AR en el ventrículo de conejo 267
Cuantificamos los niveles relativos de los ARNm de α1A, α1B y α1D en el
ventrículo de conejo, usando
qPCR. Como se describió anteriormente para el miocardio humano [22], los
cebadores se diseñaron en conejos secuencia para cruzar el intrón grande entre
los 2 exones codificadores, para evitar la contaminación falsa.
Por ADN genómico. La figura 1A ilustra las curvas de amplificación de qPCR. La
curva del miocardio del conejo. muestra que el ARNm de α1B es mucho más
abundante que el α1A o α1D, mientras que el ratón. La curva de miocardio para
comparación muestra que α1A y α1B son igualmente abundantes. α1B
mRNA fue> 99% del total de α1-AR mRNA en el miocardio del ventrículo
izquierdo (LV), y hay fueron trazas de α1A y α1D (Fig. 1B). Los ARNm de α1A y
α1D fueron ligeramente más altos en el ventrículo derecho (VD) (Fig. 1B). En
contraste, y como control para los cebadores y el protocolo, Fig. 1B también
muestra que el α1A fue el ARNm de α1-AR predominante en el cerebro (85%) y
en el hígado (95%), se sabe que tiene ARNm α1A abundante [10,11].

EL Α1A ES DETECTABLE PERO BAJO POR LA UNIÓN DEL RADIOLIGANDO

EN EL VENTRÍCULO DE CONEJO
Hicimos la unión del radioligando para probar si el α1A estaba presente a nivel
de proteína. No pudimos usar Anticuerpos α1-AR, ya que encontramos que estos
anticuerpos son inespecíficos [23]. Utilizamos un “total” Preparación de la
membrana para la unión, que no descarta los pellets de baja velocidad. Esta
El enfoque redujo la densidad del receptor normalizada a la proteína, pero no
descartó ningún receptor.
actividad vinculante. Las figuras 2A y 2B muestran las curvas de unión de
saturación y competición originales en el miocardio de conejo. La unión de
saturación con 3H-prazosina o 125I-HEAT detectó una población de α1-AR (Fig.
2A). La fracción de α1A se estimó por competencia con 5MU, ya que 5MU
identifica el mismo número de α1A-AR que se identifica por α1A knockout [21].
Competencia con 5MU
para 3H-prazosin o 125I-HEAT vinculante producido curvas de 2 sitios, con
componentes de alta y baja afinidad, como se ilustra en la figura 2B izquierda.
En el corazón, hubo 4.7 ± 0.8 fmol de α1-AR totales por mg de proteína (n = 7),
con unión específica
34 ± 4% del total en el ligando Kd. Hubo 17 ± 2% de sitios con alta afinidad de
5MU (n = 10, registro
IC50–8.9 ± 0.3), que representa el α1A; y 83% ± 2% de sitios con baja afinidad
(log IC50-5.5 ± 0.4),
representando el α1B y / o α1D. En el cerebro para comparación, el total de α1-
AR fue de 46 ± 9 fmol por
mg de proteína (n = 4), con unión específica 81 ± 2% del total en el ligando Kd.
Hubo 68 ± 9%.
sitios con alta afinidad de 5MU (n = 4), que representan el α1A. La competencia
con BMY-7378, un antagonista con alta afinidad α1D, identificó si el los sitios
con baja afinidad de 5MU fueron α1B y / o α1D. Competición BMY-7378 en
membranas del corazón. Produjo una curva de 1 sitio con un solo sitio de baja
afinidad (registro IC50–5.67), mientras que la competencia en el cerebro
produjo una curva de 2 sitios con un 8% de sitios de alta afinidad (log IC50–
8.52) y un 92% de baja afinidad (log IC50–6.10) (Fig. 2B derecha). Tomados en
conjunto, estos datos mostraron que el miocardio tenía 17% de α1A, 83% de
α1B y no α1D. En comparación, el cerebro tenía un 68% de α1A, un 24% de
α1B y un 8% de α1D.
La Fig. 2C muestra los datos de enlace de α1A en el corazón y el cerebro,
como porcentaje del enlace total de α1-AR (izquierda), y como fmol por mg de
proteína (derecha). Para calcular fmol α1A por mg de proteína multiplicamos el
porcentaje de sitios con alta afinidad para 5MU por la unión total de α1-AR,
usando saturación y análisis de competición realizados en las mismas
preparaciones de membrana. Por este método, el α1A fue de 0,8 ± 0,2 fmol por
mg de proteína en el corazón (n = 3), versus 34 ± 8 en el cerebro (n = 3).
EL Α1A MEDIA UN EFECTO INOTRÓPICO NEGATIVO EN EL MIOCARDIO
DE CONEJO
Para probar si los niveles bajos del α1A identificados en el miocardio de conejo
eran funcionales,
Se estudiaron las respuestas inotrópicas in vitro. Las trabéculas del VD y del VI
fueron estimuladas a 37 ° C y tratado con A61603. A61603 es un agonista α1A
altamente selectivo [24], que requiere el α1A para
actividad, como se muestra en los experimentos con el knockout α1A [21, 25]).
La Fig. 3A muestra trazas de contracción originales, y la Fig. 3B ha agrupado
los datos de 7–9 corazones.
A61603 a 100 nM, una concentración máxima, causó un efecto inotrópico
negativo (-42 ± 7% cambio en la fuerza desde la línea de base, p <0,001). El
aumento de A61603 a 2 μM no tuvo efecto en el negativo Efecto inotrópico de
100 nM, y no causó un efecto inotrópico positivo. Sin embargo, subsiguiente la
adición del agonista α1-AR no selectivo en la misma trabécula estimuló un
inotrópico positivo efecto. En general, PE a 10 μM, una dosis máxima, fuerza
aumentada desde el inicio (59 ± 12%, p <0,004). Se observó un efecto
inotrópico positivo más marcado pero variable con el agonista β-AR ISO a 1 μM
(709 ± 227%, p <0,015). Por lo tanto, estos datos sugirieron que el α1A era
funcional en un efecto inotrópico negativo en conejos. miocardio Debido a que
PE activa tanto el α1A como el α1B, los datos también sugieren que el α1B
Mediada un efecto inotrópico positivo.
EL Α1A AUMENTA LA PA EN EL CONEJO.
Para probar los efectos vasculares del α1A, medimos la PA en conejos
despiertos utilizando un catéter de telemetría. En la aorta abdominal y un
transmisor implantado en el flanco. Utilizamos A61603 en agudo y
Protocolos de dosificación crónica IV. La figura 4A muestra el cambio en la
presión arterial media (MAP) y HR con infusión aguda de A61603, en
comparación con el agonista de AR no selectivo NE. Ambos A61603 y NE
aumentaron el MAP de una manera relacionada con la dosis. La dosis de
A61603 requerida para el aumento de MAP 20 mmHg fue de 0.15 μg / kg,
mientras que la dosis de NE fue aproximadamente 10 veces mayor a 2 μg / kg.
La FC se redujo de manera recíproca, reflejando el barorreflejo. La figura 4B
muestra MAP con infusión crónica IV de A61603. Este experimento utilizó un
iPRECIO. Unidad, programada para administrar dosis crecientes de A61603
para una duración de 6 h en intervalos de 6 h. A61603 no cambió el MAP
cuando se entregó a 4 o 22 μg / kg / d, y aumentó el MAP a los 65 y 130 μg / kg
/ d. Los hallazgos fueron similares en un segundo conejo.

UN MODELO DE CORTE PARA PROBAR LA SEÑALIZACIÓN EN EL

MIOCARDIO DE CONEJO.
Desarrollamos un modelo de cultivo de corte para estudiar la señalización en
miocardio humano, utilizando cortes 8. mm de diámetro y 250 μm de espesor
[8]. Examinamos este modelo en el conejo LV, para probar la señalización α1A.
Hicimos rebanadas de 5 u 8 mm de diámetro y 150–350 μm de grosor. Sin
embargo, a pesar de variar los múltiples aspectos del protocolo humano en 14
conejos, como se indica en Métodos, el corte no se realizó. Produce rebanadas
relajadas y viables a partir de LV de conejo, incluso antes de la reintroducción
de calcio.
UN MODELO DE TOXICIDAD DE ANTRACICLINA PARA PROBAR LA
CARDIOPROTECCIÓN EN EL CONEJO.
En el ratón, el agonista α1A A61603 puede prevenir la apoptosis cardíaca
causada por la antraciclina.
doxorubicina [4]. Dado que la cardiotoxicidad por antraciclina es un problema
clínico importante, Exploré este modelo en el conejo. Basados en informes
publicados, tratamos 4 conejos con daunorubicina. 3 mg / kg IV semanalmente
durante 10 semanas, o 2 conejos con doxorubicina 1 mg / kg IV semanalmente
para 10-12 semanas [26,27,28]. La mortalidad fue del 100% antes de la
finalización del protocolo. Con la daunorubicina, la pérdida de peso fue del 2%,
frente al 7% de aumento de peso en el control; acortamiento fraccional
ecocardiográfico, un índice de la función del ventrículo izquierdo, cayó un
promedio del 23% (rango 5-40%) al final del tratamiento con daunorubicina,
frente a una disminución del 18% en el control, y la troponina aumentó
ligeramente, a 0,66 ng / ml frente a 0,01 in controlar. Con la doxorubicina, la
pérdida de peso fue del 12%, versus el 8% de aumento de peso en el control;
fraccionario el acortamiento no cambió y la troponina aumentó a 1.32 ng / ml.
Concluimos que la El modelo no era productivo y tenía preocupaciones de
bienestar animal, en nuestras manos.
DISCUSIÓN
Se cuantificó el ARNm de α1A-AR, la unión y la función en el corazón de conejo.
Los datos muestran que El ARNm de α1A es una fracción muy pequeña del
ARNm de α1-AR total, pero la unión específica es detectable, en
aproximadamente el 17% de la unión total. Debido a que la unión total de α1-AR
es baja, el nivel absoluto de α1A-AR es Muy bajo, <1 fmol por mg de proteína. A
pesar de este bajo nivel, el α1A es funcional, mediando un negativo. Efecto
inotrópico en el miocardio de conejo in vitro. En contraste con el α1A, el α1B es
predominante en el corazón de conejo, en los niveles de mRNA y proteínas, y
media un efecto inotrópico positivo. Debido a que los anticuerpos α1A
comerciales disponibles no son válidos [23], nuestras conclusiones sobre α1A
La proteína y la función dependen de la precisión de 2 fármacos, el antagonista
α1A 5MU y el α1A agonista A61603. La capacidad de estos reactivos para
identificar α1A-AR está respaldada por estudios que muestra la pérdida de
efectos de los fármacos en ratones knockout α1A [21,25]. Nuestros datos
coinciden con los informes de unión de α1A en el corazón de conejo [12,13], pero
no están de acuerdo con el hallazgo de no α1A vinculante [10,11]. Las diferencias
técnicas pueden explicar esta discrepancia, tales como la preparación de la
membrana, o el antagonista utilizado para identificar el α1A en ensayos de
competición; el α1A se detectó con 5MU (estudio actual), HV723 [12] y WB-4101
[10,11], pero no con KMD3213 [10,11]. Estamos de acuerdo con los informes de
muy bajo nivel de ARNm α1A en corazón de conejo [10,11], que ilustra una
desconexión entre los niveles de ARNm y proteína (ver Tabla 1). Usamos un
Preparación de membrana para la unión que no descartó ningún α1-AR. Como
en estudios anteriores, encontramos que la PE media un efecto inotrópico
positivo en el miocardio de conejo [12,13,14,15]. Sin embargo, los estudios
previos concluyeron que el α1A media una parte de este efecto inotrópico
positivo, basado en la inhibición por presuntos antagonistas α1A [12,13,14,15].
Nuestra observación de que el α1A causa un efecto inotrópico negativo es difícil
de reconciliar con estos estudios pasados. PE activa tanto el α1A como el α1B,
por lo que el antagonismo α1A de buena fe sería se espera que mejore el efecto
inotrópico positivo de la EP, no lo inhiba, al reducir el efecto negativo.
Inotropismo de la estimulación α1A. La escasa selectividad de los antagonistas
disponibles a las dosis utilizadas podría explica esta discrepancia La Tabla 1
compara los niveles de subtipo α1A-AR y los efectos en el miocardio de conejos,
ratones y hombre. En particular, los niveles de α1A son mucho más bajos en el
miocardio de conejo que en las otras 2 especies, y el efecto inotrópico α1A es
negativo en LV de conejo, en comparación con positivo en LV de ratón y hombre.
Dada la diferencia cardíaca en la función α1A entre el conejo y el ratón,
probamos la vascularización Efecto α1A, y encontró que la regulación de la PA
por A61603 en conejos y ratones era muy similar (Tabla 1). Por lo tanto, la
función α1A en el LV del conejo difirió del ratón, pero los efectos vasculares se
midieron por BP no lo hizo. Para probar la señalización y la cardioprotección en
conejos, exploramos una porción de miocardio Modelo útil para la señalización
en miocardio humano [8], y una cardiotoxicidad por antraciclina Modelo útil en
ratón [4]. Ninguno de estos enfoques tuvo éxito en el conejo. Anterior los
informes utilizaron conejos Chinchilla en un modelo de antraciclina idéntico
[26,27,28], frente a Nueva Zelanda Blanco en este estudio, y la cepa de conejo
podría ser importante.
CONCLUSIÓN
El subtipo α1A-AR se expresa a un nivel muy bajo en el miocardio de conejo,
pero es funcional, Mediando un efecto inotrópico negativo. El α1A es 3 a 4 veces
más abundante en ratón y Miocardio LV humano, donde estimula un efecto
inotrópico positivo. Sin embargo, el efecto de La estimulación de α1A en el conejo
y el ratón BP es similar. Enfoques experimentales útiles para estudiar. La
señalización y la protección cardiaca en el miocardio humano o en el ratón son
más difíciles en el conejo.