SPECTROFOTOMETRIE

Aspecte teoretice:

Spectrofotometria de absorbtie este o metoda de spectroscopie optica care are la baza

proprietatea substantelor de a absorbi selectiv radiatiile electromagnetice. Acesta metoda este foarte
utilizata in fizica, chimie, biochimie, biologie moleculara cat si in multe ramuri industrial. Ea permite
caracterizarea chimica, structurala, determinarea puritatii si concentratia diferitelor substante sau
solutii. In functie de domeniile spectrale in care are loc absorbtia luminii se disting :
spectrofotometria in ultraviolet (185 – 400 nm), spectrofotometria in vizibil (400 – 800 nm),
spectrofotometria in infrarosu (peste 800 nm).

Un spectrofotometru masoara cantitatea de lumina pe care o substanta o absoarbe. Raza de

lumina compusa din pachete de fotoni a caror lungime de unda variaza intre 185 – 800 nm (domeniul
UV-Vis) este proiectata pe cuva care contine moleculele de analit (moleculele de studiat),
inregistrandu-se pentru fiecare lungime de unda in parte numarul de fotoni transmisi prin analit. La
ciocnirea fotonul cu moleculele de analit exista sansa ca analitul sa absoarba fotonul, trecand din stare
fundamentala intr-o stare excitata (figura 1). Astfel, absorbitia reduce numarul de fotoni de o anumita
lungime de unda, prin urmare reducand intensitatea luminii transmise. Conditia de absorbtie a fotonul
incident de catre molecula de analit este data de egalitatea dintre energia cuntificata hν a fotonului si
diferenta de energie ΔE intre nivelul fundamental si cel excitat al moleculei de analit. In spectrul de
absorbtie (cantitatea de fotoni absorbiti in functie de lungimea de unda a fotonilor) apare astfel o
rezonanta localizata la lungimea de unda a fotonului absorbit. Spectrele de absorbtie inregistrate in
domeniul ultraviolet si vizibil se datoresc tranzitiilor dintre nivelele energetice ale starilor electronice
ale moleculelor, numindu-se spectre electronice. Spectrele de absorbtie inregistrate in domeniul
infrarosu se datoresc tranzitiilor dintre nivele de vibratie, rotatie sau rotatie-vibratie ale moleculelor.

Figura 1: Stanga – tranzitia moleculei de analit din starea fundamentala intr-o stare excitata ca urmare
a absorbtiei fotonului de energie hν. Fiecarui nivel electronic ii corespund mai multe nivele de
vibratie, iar fiecarui nivel de vibratie ii corespund mai multe nivele de rotatie. Dreapta – rezonanta de
absorbtie localizata la lungimea de unda a fotonului absorbit.

1
Un spectrofotometru este format din urmatoarele componente principale: sursa de radiatii (lampa cu
filament de wolfram domeniul Vis, sau lampa de hidrogen sau deuteriu pentru domeniul UV),
monocromatorul (prisma din cuartz pentru UV sau sticla pentru Vis), suportul pentru cuve si cuvele
(din cuartz pentru UV sau sticla pentru Vis), detector, fotomultiplicator, inregistrator si computer.
Cele mai multe spectrofotometre foloseste doua cuve identice: cuva de masura unde se adauga solutia
substantei de analizat si cuva de referinta care se umple cu apa sau cu solventul folosit la prepararea
solutiei-proba. Acestul lucru permite eliminarea artifactelor din spectrul de absorbtie introduse de
variatiile energiei lampii sau fluctuatiile detectorului.

Legile cantitative ale spectrofotometriei in domeniul UV-VIS:

1. legea lui Lambert afirma ca raportul (I0 - I) / I de lumina absorbita de un analit pur si omogen
este proportional cu grosimea stratului de analit l in centimetrii; unde, I0 intensitatea luminii
incidente, iar I intensitatea luminii transmise.

2. legea lui Beer afirma ca raportul (I0 - I) / I de lumina absorbita de un analit in solutie este
proportional cu concentratia analitului c.

Ca urmare a acetor doua legi, s-a intocmit legea Lambert-Beer:

I = I0 10ε c l
unde ε coeficient molar de extinctie, daca c este o concetratrie molara. Daca c se masoara in g/100ml,
c%
atunci coeficientul ε devine E denumit coeficient specific de extinctie.
Se definesc astfel urmatoarele notiuni:

a. Absorbanta (densitatea optica, extinctia) unei solutii ca fiind logaritmul zecimal al raportului
dintre intensitatea luminii incidente si cea transmisa:

A = log ( I0 / I ) = ε c l

b. Transmitanta (transmisia) ca fiind raportul dintre intensitatea luminii transmise si cea incidente:

T = I0 / I

Obiectivul lucrarii: determinarea experimentala a concentratiei de alcool dintr-o solutie alcoolica

folosind metoda spectrofotometrica.

De foarte multe ori se intampla ca politisti rutieri sa opreasca soferi suspecti care conduc sub
influenta alcoolului. Chiar daca prin simtul olfactiv se poate verifica ca acestia au consumat alcool, nu
se poate determina cu precizie care este concetratia de alcool in sange. Pentru a face acest lucru la fata
2
locului politisti ruieri utilizeaza celebra fiola conectata la un mic spectrofotometru, care separa lumina
in functie de culorile sale individuale. Astfel, prin utilizarea acestui dispozitiv ei pot masura nivelul
de alcool din aerul expirat care apoi poate fi corelat cu concentratia de alcool din sange. Totusi, cum
poate un astfel de dispozitiv sensibil la culori sa detecteze alcoolul care dupa cum se stie este incolor.
Fiola contine o substanta chimica de culoare portocaliu-galbuie denumita dicromat de potasiu
(K2Cr2O7). Cand aceasta substanta reactioneaza cu alcool din aerul expirat un compus de culoare
albastru-verzui denumit sulfat de chromium (Cr2(SO4)3) se formeaza pe baza reactiei de mai jos:

2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + 3CH3CH2OH = 2Cr2(SO4)3 + 2K2SO4 + 3CH3COOH + 11H2O

In acest fel fiola se inverzeste iar politistul poate sa demonstreze ca soferul a consumat
alcool. Mai mult decat atat, aceasta culoare este analizata de catre spectrofotometrul conectat la fiola,
care va indica nivelul de alcool din aerul expirat.
Evident pentru a determina cat mai precis nivelul de alcool din aerul expirat este necesar ca
acest spectrofotometru sa fie bine calibrat. Ca atare, se vor inregistra spectrele unor solutii a caror
concentratie de alcool este stiuta, dupa care se va reprezenta grafic absorbanta in functie de
concentratia de alcool din solutiile respective. Din acest grafic de calibrare se va extrage in functie de
absorbanta concentratia de alcool dintr-o solutie oarecare.

Protocolul experimental:

1. Demarati calculatorul
2. Demarati spectrofotometrul
3. Dublu click pe icoana Spectra Manager de pe ecran - fereastra denumita Spectra
Measurement se va deschide pe ecran
4. Click pe Measurement din fereastra Spectra Measurement, dupa care pe Auto Zero – asteptati
pana cand spectrofotometrul se calibreaza.
5. Nu atingeti cuvele cu mana pe partile unde raza de lumina patrunde si iese , manipulatile prin
prinderea lor cu mana de partea superioara - altfel se poate imprima pe le grasime si astfel se
poate perturba masuratoare – sau purtati manusi. Puneti apa in cuva de referinta (R) si prima
solutie de masurat (cea de 1%) in cuva de masurare (S) (nu trebuie umplute cuvele). Ambele
cuve trebuie asezate cu latura care are imprimata o sageata inspre spectrofotometru.
6. Click pe Start din fereastra Spectra Measurement – se observa cum se realizeaza spectrul
(absorbanta in functie de lungimea de unda a luminii) – dupa finalizarea spectrului acesta va
fi redat integral intr-o fereastra denumita Spectra Analysis.
7. In fereastra Spectra Analysis click pe Processing, apoi pe Peak Processing, apoi pe Peak Find
- apare o alta fereastra denumita Peak Find, unde se face click pe Execute – in final apare
valoarea lungimii de unda la care apare maximul de absorbtie si valoarea acestui maxim (de
exemplu: 579, 0.4638) – se noteaza in tabel valoarea absorbtiei maxime corespunzatoare
solutiei masurate dupa care se inchide fereastra Peak Find.
8. Goliti continutul cuvei de masurat (S) in sticluta corespunzatoare.
9. Adaugati in cuva de masurat solutia urmatoare (cea de 1,5%) si repetati pasii 6 si 7.
10. Pentru a nu avea in fereastra Spectra Analysis mai multe ferestre cu diferite spectre, se
sugereaza ca spectrum pentru solutia de 1,5% sa fie adaugat in fereastra corespunzatoare
solutiei de 1%. Astfel, in fereastra solutiei de 1,5% pozitionam mouse-ul pe spectru, moment
in care sageata se schimba intr-un creion – cu mouse-ul nemiscat se face click stanga si apare
imaginea unei foi in locul creionului – moment in care se trage spectrul solutie de 1,5% in
fereastra corespunzatoare solutiei de 1%. Intr-un final vom avea o singura fereastra care va
contine cele doua spectre.
11. Goliti continutul cuvei de masurat (S) in sticluta corespunzatoare.
12. Adaugati in cuva de masurat solutia urmatoare (cea de 2%) si repetati pasii 6, 7 si 10.
3
13. Continuati cu solutiile de 2,5% , 3% si respective cu solutia a carui concentratie alcoolica nu
se cunoaste.
14. Copiati fereastra care contine graficul cu cele sase spectre intr-un document word sau power
point pentru a fi ulterior imprimat si adaugat in caietul de laborator. Pentru a face acest lucru
in fereastra Spectra Analysis se face click pe Edit, dupa care Copy Picture, apoi Paste intr-un
document word sau power point, iar in final se salveaza documentul.
15. Se reprezinta grafic absorbanta solutiilor alcoolice de diferite concentratii in functie de
concentratia alcoolui din acele solutii. Se face o fitare liniara.
16. Din grafic se extrage valoarea concentratiei de alcool a solutie necunoscute.

Nr. Concetratia de Valoarea Lungimea de unda a

alcool (%) Absorbantei (u.a) maximului de absorbtie
(nm)
1 1,0
2 1,5
3 2,0
4 2,5
5 3,0
6 x=

4
5