Actividades antibacterianas y antioxidantes del plátano (Musa, AAA cv.

Cavendish) Cáscara de frutas

RESUMEN: La cáscara fresca de plátano verde y amarillo de frutos (Musa, cv.
Cavendish) se trató con acetona al 70%, que se repartió con cloroformo (CHCl3) y
acetato de etilo (EtOAc), secuencialmente.Las actividades antioxidantes de los
extractos se evaluaron mediante el método de tiocianato, el método de
blanqueamiento de ß-caroteno y la eliminación de radicales libres de 1,1-difenil-2-
picrilhidrazilo (DPPH). Mientras que, las actividades antimicrobianas de los
extractos y componentes aislados se evaluaron utilizando métodos de disco de
papel y concentración mínima de inhibición (MIC). El EtOAc y las fracciones solubles
en agua de la cáscara verde mostraron una alta actividad antimicrobiana y
antioxidante, respectivamente. La actividad antioxidante de los extractos de agua
fue comparable a la de los antioxidantes sintéticos como el hidroxianisol butilado y
el hidroxitolueno butilado. Entre todos los componentes aislados, el ß-sitosterol, el
ácido málico, el ácido succínico, el ácido palmático, el ácido 12-hidroxiestraárico, el
glucósido, el ácido d-málico y el ácido 12-hidroxiestraárico fueron los más activos
contra todas las especies bacterianas Gram-negativas y positivas analizadas. La
MIC del ácido d-málico y succínico variaba entre 140-750 ppm, respectivamente.
INTRODUCCIÓN
Los azúcares libres, los ácidos orgánicos y los aminoácidos son componentes
naturales de muchas frutas y verduras y juegan un papel importante en el
mantenimiento de la calidad de la fruta y la determinación del valor nutritivo [1].
Durante el repinado del plátano, el almidón se convirtió en azúcares reductores y la
sacarosa aumentó con la madurez [2]. El banano, una planta tropical, puede
protegerse del estrés oxidativo causado por la fuerte insolación y la alta temperatura
al producir grandes cantidades de antioxidantes [3]. Se debe considerar que el
plátano es una buena fuente de antioxidantes naturales para los alimentos y una
fuente funcional de alimentos contra el cáncer y enfermedad cardíaca [4]. Por lo
tanto, la atención en los últimos tiempos se ha centrado en el aislamiento,
caracterización y utilización de antioxidantes naturales, especialmente el creciente
interés en los polifenoles como agentes potenciales para prevenir enfermedades.
Como estos compuestos se encuentran predominantemente en la mayoría de los
tejidos de frutas, valdría la pena investigar la naturaleza de los polifenoles que están
presentes en la cáscara de plátano. Sin embargo, las frutas y verduras contienen
muchos componentes antioxidantes y antimicrobianos diferentes. La mayor parte
de la capacidad antioxidante de una fruta o verdura puede provenir de compuestos
como otras vitaminas C, vitamina E o ß-caroteno. Los plátanos son una de las frutas
más populares del mundo y es bien sabido que las frutas contienen varios
compuestos antioxidantes como la gallocatequina [4] y la dopamina [3].
Dado que las frutas de banano están ampliamente disponibles, se han utilizado
como alimento sin efecto tóxico aparente. La cáscara podría ser una fuente
potencial de actividades antioxidantes y antimicrobianas.
La presente investigación se realizó para evaluar el poder antioxidante y
antibacteriano de la cáscara de la fruta de plátano e identificar los compuestos
responsables de esas actividades. Además, en la presente comunicación
estudiamos los componentes aislados de la cáscara verde y determinamos sus
actividades.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y métodos de extracción: los frutos de plátano (Musa, AAA cv.
Cavendish) se compraron en la ciudad de Kagoshima en la etapa verde sin ningún
tratamiento con etileno y se almacenaron a 20 ° C durante 24 horas antes de
extraerlos. El color (un valor) se midió con un medidor de croma (modelo CR-200;
Minolta, Japón) como se describe en estudios anteriores [5].
Procedimientos de extracción: Los tejidos de cáscara de fruta de plátano fresca
(300 g) en verde con una traza de etapa amarilla se calentaron en 1 litro de agua
destilada durante 2 minutos.
La cáscara se homogeneizó con acetona al 70% dos veces a temperatura ambiente
en un mezclador eléctrico. Los extractos combinados de extractos de acetona al
70% se filtraron y se concentraron hasta 200 ml. Este extracto acuoso se repartió
en un CHCl3 y agua, usando un agitador eléctrico y luego se extrajo con acetato de
etilo saturado acuoso. Las materias secas fueron 0,73, 1,2 gy 9 g, respectivamente.
Se midió la actividad antimicrobiana y antioxidante de CHCl3, EtOAc y extractos de
agua.
La cáscara de plátano amarilla se trató de manera similar. Los extractos activos de
acetona al 70% se sometieron a gel de sílice 60 eluyendo mediante un alambre
paso a paso con mezclas de diferentes solventes (hexano: EtOAc: MeOH)
respectivamente. Las fracciones resultantes se examinaron mediante cromatografía
en capa fina (TLC) de gel de sílice 60 y esas fracciones con perfiles de TLC similares
se combinaron para dar fracciones totales.
Determinación de la actividad antioxidante utilizando la actividad de
eliminación de radicales libres (DPPH): La inhibición de la actividad de
eliminación de radicales libres por la materia seca de los tejidos de fruta de plátano
se midió de la siguiente manera: se preparó una solución de DPPH (1,1-difenil-2-
picrilhidrazol) 0,5 mM en metanol y un tampón de acetato 0.05 M (5.5). Se añadió
una parte alícuota de 0,1 ml (a concentraciones de 0,5-1 mg ml? 1) del extracto a 2
ml de tampón de acetato y 1,9 ml de metanol + 1 ml de solución de DPPH.
El blanco contiene 2 ml de tampones de acetato, 1,9 ml de metanol y 0,1 ml del
extracto. Mientras que el control contenía 2 ml de tampón de acetato, 1 ml de DPPH
y 2 ml de metanol. La mezcla se agitó inmediatamente después de agregar DPPH
y se dejó reposar a temperatura ambiente en oscuro y la disminución de la
absorbancia a 517 nm se midió después de 30 minutos hasta que la reacción
alcanzó una meseta. Estos experimentos se realizaron por duplicado. Se calculó el
porcentaje inhibitorio de DPPH según Shyu et al. [6] como sigue: efecto de
eliminación (%) = [(Ao- (A-Ab)) / Ao] x 100%, donde: Ao: A517 de DPPH sin muestra
(control); A: A517 de muestra y DPPH; y Ab: A517 de muestra sin DPPH (en blanco).
Determinación de la actividad antioxidante utilizando Sistema modelo de
linoleato de ß-caroteno: La actividad antioxidante se midió utilizando los métodos
de Jayaprakasha et al. [7] Con ligera modificación. A 3,34 mg de ß-caroteno en
solución de cloroformo (1 ml) y el cloroformo se eliminó a 40ºC al vacío usando un
evaporador rotativo. Posteriormente, se añadieron 40 mg de ácido linoleico y 400
mg de Tween-20 y se mezclaron bien. La mezcla resultante se diluyó
inmediatamente con 5-10 ml de agua triple destilada y se mezcló bien. La emulsión
se completó hasta 100 ml con peróxido de hidrógeno 0,01 M (H2O2). Se
transfirieron alícuotas (2 ml) de esta emulsión a diferentes tubos de ensayo que
contenían 0,1 ml de muestras de prueba en metanol. En este experimento, se usó
BHA con fines comparativos. Se preparó un control que contenía 0,2 ml de etanol y
4 ml de la emulsión anterior. Los tubos se colocaron en un baño de agua a 50 ° C.
Las absorbancias de todas las muestras a 470 nm se tomaron a tiempo cero y cada
20 minutos hasta que desapareció el color del ß-caroteno en la reacción de control.
El espacio en blanco preparado como se mencionó anteriormente, pero sin ß-
caroteno.
Ensayo antioxidante utilizando métodos de tiocianato férrico: Se colocó una
mezcla de una muestra de 2 ml en etanol al 99,5%, 2,052 ml de ácido linoleico al
2,51% en etanol al 99,5%, 4 ml de tampón fosfato 0,05 M (PH 7.0) y 1,948 ml de
agua en un vial con tapón de rosca y colocado en un horno a 60 ° C en la oscuridad.
A 0,1 ml de esta solución de muestra se añadieron 9,7 ml de etanol al 75% y 0,1 ml
de tiocianato de amonio al 30%. Después de la adición de 0,1 ml de cloruro ferroso
2 x 10-2 M en ácido clorhídrico al 3,5% a la mezcla de reacción, el La absorbancia
del color rojo desarrollado se midió en 3 minutos a 500 nm [8].
Ensayo antimicrobiano: El ensayo antimicrobiano se midió utilizando los métodos
de Mokbel y Hashinaga [9]. Se utilizaron cinco especies de bacterias: Bacillus
cereus IFO 13597, Salmonella enteritidis IFO 3313, Escherichia coli IFO 13168,
Bacillus subtilis IFO 3009, Staphylococcus aureus IFO 3761. Los medios de cultivo
de bacterias se mantuvieron en agar duro nutritivo (peptona 1g, extracto de carne
0.5 g, cloruro de sodio 0.25 gy agar 1 g 100 mL? H2O) a 4 ° C. El medio de cultivo
bacteriano se preparó como sigue, caldo nutritivo (peptona 0.5 g, extractos de carne
0.25 g, sodio y cloruro 0.25 g 50 mL? 1 H2O) y medio de agar blando (peptona 0.5
g, extractos de carne 0.25 g, cloruro de sodio 0.125 g y agar 0.2 g 50 mL? 1 H2O)
ajustado a pH 6.6 y esterilizado en autoclave a 121 ° C durante 20min. Para
determinar la actividad antibacteriana, el Los microorganismos se cultivaron en
caldo de nutrientes a 36 ° C durante la noche. Se añadieron tres y cinco μl de la
inóculo (esporas) a 3,5 ml de agar nutritivo blando y se agitó bien. El agar de
nutrientes blandos se añadió luego en una placa de Petri que contenía 15 ml de
agar duro. Los discos de papel de filtro (6 mm de diámetro) se impregnaron con
diferentes concentraciones (discos de 0,1 a 1 mg? 1) y se dejaron secar
completamente durante 10-15 minutos y luego se colocaron uniformemente en la
superficie del agar previamente inoculado. Las placas de Petri se incubaron a 36 °
C durante 24 h. El cloranfenicol se utilizó como control positivo.
Determinación de MIC: Las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) se
definieron como la concentración más baja (ppm) del extracto en placas de agar
que no muestran crecimiento bacteriano visible. El agar de nutrientes blandos se
añadió luego a una placa de Petri que contenía 15 ml de agar duro como se
mencionó anteriormente. Las muestras se disolvieron en cloroformo y / o metanol.
Las soluciones se agregaron individualmente a diferentes concentraciones. de (0
(control) a 1 mg mL? 1) a agar blando y mezclado bien antes de verterlo en placas
de Petri estériles que contienen 15 mL de agar duro. Los cultivos (5 μL) se tomaron
del caldo de nutrientes y se agregaron a tres lugares en la superficie del medio y se
incubaron a 37 ° C.
Análisis de análisis de cromatografía de capa fina (TLC): el análisis de TLC para
extractos crudos o fracciones de cromatografía en columna de gel de sílice se
realizó en láminas de aluminio (20x20 cm) de placa de gel de sílice 60 F254 que se
desarrollaron con solventes apropiados para cada muestra, tales como (CHCl3:
MeOH: hexano (5: 1: 0.5), CHCl3: MeOH: H2O (5: 1: 0.5), CHCl3: acetona: MeOH:
H2O (5: 3: 4: 1) o 1-butanol: ácido acético: MeOH: H2O (2: 1: 0.5: 1)). Las bandas
resultantes se ubicaron usando Luz UV y spray de ácido sulfúrico al 10% seguido
de calentamiento en el horno durante 5-10 minutos a 120 ° C.
Procedimientos generales: los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN)
se registraron en un espectrómetro JEOL FX-400 operado a 400 MHz para 1H-NMR
y a 100 MHz para 13C-NMR. Los espectros se observaron en CDCl3 para
compuestos de baja polaridad y óxido de deuterio (D2O) para compuestos de alta
polaridad que contienen TMS como patrón interno.
Cromatografía de gases / espectrometría mss: el peso molecular se determinó
mediante cromatografía de gases (Thermo Finnign Polaris Q) equipado con una
fuente de iones EI acoplada a una MS (Polaris Q). Se usó helio como portador de
gas, y la temperatura del inyector se mantuvo a 250 ° C.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Separación cromatográfica: el aislamiento y las identificaciones de extracto de
acetato de etilo (1,2 g) de cáscara de plátano verde se llevaron a cabo en una
columna de gel de sílice. La cromatografía en columna se eluyó con una cantidad
de EtOAc: MeOH gradualmente para producir tres frs. 5: 1: 0, 1: 1: 0 y 0: 9: 0.5 (A,
B y C). Entre ellos, el p. Se registraron altas actividades antimicrobianas en C y se
cromatografió adicionalmente en una columna de gel de sílice y se eluyó con
hexano: EtOAc: MeOH, produciendo dos activos frs. 1: 1: 0 y 0: 1: 0.5 (C.1 y C.3).
El p. (C.1) se desarrolló con CHCl3: MeOH (1: 1) para producir (2,3 mg, 191 mg 100
g? 1 de peso seco)? -Sitosterol (compuesto conocido 1). El p. (C.3) se cromatografió
adicionalmente en columna de gel de sílice y se eluyó con EtOAc: MeOH,
produciendo dos fracciones activas 9: 1 y 1: 1 (C.6 y C. 8). El p. (C.8) se sometió
adicionalmente a placas preparativas de TLC (PTLC) (20x20 cm) de gel de sílice 60
F254 Merch Ltd. Japón usando CHCl3: MeOH: H2O (7: 1: 0.1) como un sistema
disolvente para producir (2.2 mg , 183 mg 100 g? 1 peso seco) ácido palmítico y
(1,7 mg, 141 mg 100 g? 1 peso seco) ácido 12-hidroxiestraárico (compuestos
conocidos 2 y 3), respectivamente. El p. (C.6) se sometió adicionalmente a TLC
preparativa usando CHCl3: MeOH: H2O (5: 1: 0.1) para producir dos compuestos
activos (2.5 mg, 208 mg 100 g? 1 peso seco) de ácido málico y (1.2 mg, 100 mg
100 g? 1 peso seco) de ácido succínico (compuestos conocidos 4 y 5),
respectivamente.
Otras fracciones producían manchas que contenían compuestos antimicrobianos y
antioxidantes débiles o de baja concentración. Esos compuestos se identificaron
mediante la comparación del comportamiento de TLC, los espectros de 1H-NMR y
13C-NMR con los de muestras auténticas. El extracto de agua (9 g) se
cromatografió en una columna de gel de sílice usando un eluyente de EtOAc:
MeOH: agua con una cantidad creciente de MeOH: agua gradualmente para
producir cinco fracciones 9: 1: 0, 5: 1: 0, 1: 1 : 0, 0: 1: 0 y 0: 9: 1 (A, B, C, D y E).
Entre ellos, tres fracciones activas B, C y D registraron una alta actividad
antioxidante. La fracción (B) se cargó más a PTLC usando CHCl3: acetona: MeOH:
H2O (5: 3: 4: 1) para producir (26 mg, 288 mg 100 g? 1 peso seco) componente de
glucósido (6), mientras que, otra fracción tiene una fuerte actividad antioxidante
medida por Métodos DPPH que se purificaron usando PTLC con butanol: ácido
acítico: MeOH: H2O (2: 1: 0.5: 1) para producir (40 mg 100 g? 1 peso seco) de
compuesto de monosacárido (7). Esas fracciones (C y D) se combinaron de acuerdo
con la monitorización TLC.
La fracción activa se cromatografió adicionalmente en una columna de gel de sílice
y se eluyó con EtOAc: MeOH 1: 1 y 0: 1 dando Fr. (13) azúcares solubles totales
(1,25 g, 13,89 g 100 g \ leq 1 peso seco) según se determina usando datos de RMN.
Esta fracción se sometió adicionalmente a una columna de gel de sílice y se eluyó
con EtOAc: MeOH (1: 1 a 0: 1) respectivamente varias veces. Posteriormente,
purificado por PTLC para producir dos fracciones de acuerdo con el sistema de
monitoreo de aluminio TLC, una fracción no tiene actividades antioxidantes de
azúcares solubles totales (sacarosa, glucosa y fructosa).
Minobel y Hashinaga [5] han reportado que la fruta se pudre y se pudre durante el
repinado del plátano, especialmente cuando estas frutas se almacenaron en una
película de plástico debido a la disminución del ácido málico y el ácido succínico
con el grado de refinado del fruto del plátano.
Si bien esas frutas almacenadas con alto contenido de dióxido de carbono
extendieron la vida útil de las frutas de plátano, lo que puede estar relacionado con
el aumento de ácido málico y ácido succínico. La fruta del plátano en la etapa verde
menos descomposición también puede deberse a altas concentraciones de ácido
málico, ácido succínico y otros compuestos y la descomposición aumentaron al
disminuir esos compuestos durante el repinado.
Según un estudio anterior, una fruta climatérica como el melocotón, se ha
demostrado que hay una acumulación de ácido málico en la fruta durante el
crecimiento y la maduración y que la madurez de la fruta está más avanzada cuando
la concentración de ácido málico es mayor [11]. Según nuestros estudios anteriores
(Mokbel y Hashinaga [5], el pico climatérico de las frutas de banano almacenadas a
20 ° C ocurrió entre 5 y 7 días de almacenamiento, después de las respiraciones, la
producción de etanol y la conversión de El contenido total de azúcar aumentó
inmediatamente. Holcroft y Kader [12] encontraron que la concentración de ácido
málico en la fruta de fresa disminuyó, aumentando el ácido succínico durante la
maduración de las frutas y también informaron que las concentraciones de ácido
succínico aumentaron durante el almacenamiento por debajo de 20 kPa de CO2. El
aumento de CO2 puede conectarse con el aumento ácido succínico, que extiende
la vida útil de las frutas de banano durante el almacenamiento debido a la inhibición
del crecimiento de hongos in vivo [13]. Beaudry y otros [14]. informó que la sacarosa
aumentó muy rápidamente después del pico en la síntesis de etileno. La cantidad
de azúcares reductores y sacarosa aumentó y la cantidad de almidón disminuyó
drásticamente con la maduración. Fractosa, glucosa y sacarosa fueron los
principales azúcares solubles en las fracciones de agua de la cáscara de plátano
verde como se determinó mediante RMN. El doblete a 5,42 ppm se debe a H-3 'de
sacarosa; el triplete a 4.05 ppm se debe a H-4 'de sacarosa; las señales de
resonancia a 3.89, 3.82, 3.77, 3.68 y 3.56 ppm también se han asignado a sacarosa.
Los dobletes a 5,24 y 4,65 ppm se deben a los protones anoméricos de glucosa, \
beta - glucosa H - 1 y beta - glucosa H - 1, respectivamente; el triplete a 3.25 ppm
se debe a la? -glucosa H-2. El doblete a 4,12 ppm es la única señal de resonancia
claramente asignada a la fructosa.
Las señales de resonancia en la región de 3.98 ppm se deben principalmente a
resonancias superpuestas de protones en anillo de sacarosa, fructosa y glucosa.
Este resultado corresponde con los datos de 1H-NMR de Raffo et al. [15]. Sin
embargo, la sacarosa, la fructosa y la glucosa registraron bajas actividades
antioxidantes medidas por radicales libres DPPH. Los componentes de glucósidos
y monosacáridos aislados (compuestos 6 y 7) tenían una mayor actividad
antioxidante que la sacarosa, la glucosa, la fructosa o el control a una concentración
de 100 mg mL? 1.
CONCLUSIÓN
El acetato de etilo y las fracciones solubles en agua de la cáscara de plátano verde
mostraron una alta actividad antimicrobiana y antioxidante. La mayoría de los
compuestos aislados de la cáscara verde ß-sitosterol, ácido málico, ácido 12-
hidroxiestraárico y ácido succínico, que mostraron actividades antibacterianas
significativas y bajas actividades antioxidantes. Mientras que aquellos compuestos
aislados de extractos solubles en agua, los componentes glucósidos y
monosacáridos mostraron una importante actividad antioxidante y antimicrobiana.