Taller 1 Genética.

Departamento de Biología Celular e Histología

1° Unidad Académica, FMED, UBA.

TALLER 1 DE GENÉTICA

Guía de actividades

Introducción:
Existen múltiples técnicas moleculares para determinar de manera directa la secuencia de
nucleótidos presentes en un fragmento de ADN, que pueden utilizarse para detectar variaciones
respecto de una secuencia tomada como patrón (secuencia wild type). Esas variaciones son
consideradas mutaciones: cambios permanentes en la secuencia del ADN.
En este taller analizaremos dos aplicaciones de las técnicas directas de detección de mutaciones:
el diagnóstico molecular en el contexto de enfermedades producidas por mutaciones en genes
únicos y el uso en medicina forense (filiación, criminalística, etc).
Las técnicas analizadas en este taller son: PCR, PCR alelo específica y secuenciación de Sanger.
Para interpretar correctamente los resultados de las técnicas moleculares deben comprenderse
sus fundamentos bioquímicos y tener en cuenta las características de las secuencias presentes
en el genoma humano.

PARTE 1. Aplicación de técnicas directas para la detección de mutaciones en el diagnóstico

molecular. PCR, PCR alelo específica y secuenciación de Sanger.

La Fibrosis quística constituye una patología multisistémica producto de la alteración en el

transporte de iones en las células epiteliales. Afecta principalmente, a la secreción de las
glándulas exócrinas y a los epitelios de los aparatos respiratorio, digestivo y reproductor. Desde
un enfoque genético clásico, se la define como una entidad monogénica mendeliana de herencia
autosómica recesiva. Esto significa que padecen la enfermedad quienes poseen en su genoma
dos variantes alélicas patogénicas del gen involucrado, heredadas por vía materna y paterna
respectivamente.
En el año 1989 puedo determinarse que el gen involucrado en esta patología codifica un canal
iónico que fue denominado CFTR1 (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator:
Regulador transmembrana de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística).
Variante alélica wild type: El locus del gen CFTR está ubicado en 7q31.2; presenta una longitud
de 230 kb, contiene 27 exones. Su producto es un ARNm de 6.5 kb, que es traducido en la
proteína canal cftr. Esta proteína es transportada a la membrana plasmática y está involucrada
en el transporte de iones Cl- y HCO3- , y en la regulación de múltiples canales iónicos (entre ellos
Canal epitelial de sodio: ENac); en consecuencia, participa en diferentes procesos celulares (Ej.:
respuestas celulares a AMPc; transporte de cloruros; modificación del pH intracelular;
hiperpolarización de membrana, exocitosis, entre otros)2.
Variantes alélicas patogénicas: Desde su identificación, se han descripto alrededor de 1.900
variantes de secuencia (mutaciones) del gen CFTR. Los tipos de mutaciones que se relacionan
con fenotipos clínicos enfermos son mayormente: mutaciones sin sentido (corren el marco de
lectura produciendo codones de terminación prematuros), mutaciones en sitios que regulan
procesos de splicing (ARNm más cortos o con estructura inestable, conlleva a una alta velocidad
de degradación sin traducción); o mutaciones con cambio de sentido (cambian la secuencia
aminoacídica alterando la estructura/función proteica). Estos tipos de mutaciones generan

1
Riordan, J.R.et al.(1989) Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of
complementary DNA. Science
2
Para mayor información sobre los procesos celulares que involucran a la proteína cftr consultar:
http://www.uniprot.org/uniprot/P13569

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desde un punto de vista funcional celular pérdida de función (alelos nulos o alelos
hipofuncionantes). La mutación más prevalente en afectados es c.1521-1523delCTT//
p.Phe508del (mutación que a nivel del ADN representa la pérdida de 3pb entre los nucleótidos
1521-1523 del exón 10 y a nivel proteico se expresa como la ausencia del aminoácido
fenilalanina en la posición 508, generando un defecto en el plegado proteico que altera su
transporte a su localización definitiva en la membrana plasmática, comportándose como un
alelo nulo. Esta mutación presenta una prevalencia del 70% en población de Europa del norte.
En Argentina también es la mutación más frecuente con una prevalencia del 59% en los
afectados

Una niña de 8 años presenta signos compatibles con fibrosis quística, pero el diagnóstico es
controversial. Se decide realizar una prueba de diagnóstico molecular para determinar la
presencia de la mutación p.Phe508del. La prueba consiste en amplificar mediante PCR una
región del gen que contiene el triplete CTT del exón 10. Los productos de amplificación se
resuelven luego en un gel de poliacrilamida.
A continuación, se muestra el resultado de la prueba molecular de los miembros de la familia y
4: de la niña con diagnóstico presuntivo de fibrosis quística (probando):

C1 C2 1 2 3 4
C1, C2: controles (individuos de genotipo conocido)
1: padre del probando
2: madre del probando
3: hermano del probando
4: probando

1.1 Interprete el patrón de bandas para cada individuo de la familia. ¿Pude explicarse el
diagnóstico clínico del probando con esta prueba?

Basándose en los resultados obtenidos, se decidió buscar la presencia de la segunda mutación

más frecuente, llamada G551D, que provoca un cambio de un aminoácido de glicina (G) por un
ácido aspártico (D) en la posición 551 de la cadena polipeptídica. Para realizar la búsqueda de la
mutación G551D se utilizó PCR alelo específica.

1.2 Explique el fundamento de la PCR alelo específica. ¿Qué resultados esperaría ver si la
mutación G551D estuviera ausente en la muestra analizada? ¿Y si estuviera presente? ¿Cómo
distinguiría la presencia de la mutación en homocigosis y heterocigosis?
El siguiente es el resultado de la PCR alelo específica para la mutación G551D
M CA CB 1 2 3 4
M: marcadores de peso molecular
CA, CB: controles (individuos de genotipo conocido)
1: padre del probando
2: madre del probando
3: hermano del probando
4: probando

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1.3 ¿Qué conclusiones puede sacar de esta prueba para la familia analizada?

Se realizaron pruebas con otras 10 mutaciones frecuentes, que en conjunto permiten explicar
el 84% de los casos. No se pudo encontrar una de estas mutaciones en la familia estudiada.
Por esa razón, se decidió secuenciar el gen CFTR en los miembros de la familia utilizando el
método de secuenciación de Sanger. Se detectó una variación respecto de la secuencia wild
type, en la posición 113 del exón 3. Esta mutación fue hallada en muestras de la madre y del
probando, pero no en muestras del padre y del hermano del probando.
A continuación, se muestra el fragmento de la secuenciación que compara la secuencia wild type
(izquierda) y la mutada (derecha)

1.4 Explique el fundamento de la técnica de secuenciación de Sanger.

1.5 Observe los fragmentos de la secuenciación. ¿Por qué hay un ‘doble pico’ en la posición en
dónde se observa la mutación?
1.6 ¿Explica la mutación hallada el diagnóstico clínico de fibrosis quística? Justifique.

PARTE 2. Aplicación en medicina forense I: Análisis de polimorfismos en secuencias no

codificantes. El uso de secuencias repetitivas en tándem (STR).

A excepción de los gemelos monocigóticos, el material genético de cada individuo es único. Se

ha estimado que dos genomas humanos, escogidos al azar, difieren aproximadamente en 1 cada
500 nucleótidos. Esa variabilidad interindividual puede ser estudiada a nivel genotípico
mediante el análisis directo del ADN.
Uno de los objetivos del estudio de la variabilidad de ADN es su aplicación en pruebas de filiación
(paternidad, otras relaciones filiales como abuelidad), o en la identificación de muestras
pertenecientes a un individuo humano específico (hechos delictivos, medicina forense). Para
ello se ha utilizado un subgrupo de secuencias repetitivas en tándem (STR: Short Tandem
Repeat) denominadas ‘microsatélites’.

2.1 ¿Por qué no se utiliza el análisis de ADN de regiones codificantes con fines forenses?

3
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En la siguiente tabla se observan ejemplos de STR utilizados en estudios de paternidad

Nombre del STR Cromosoma Rango de n repeticiones

TPOX 2 6-13
D2S1338 2 11-28
D3S1358 3 9-20
FGA 4 15-51
CSF1PO 5 6-16
D5S818 5 7-16
D7S820 7 6-15
D8S1179 8 8-19
TH01 11 3-14
VWA 12 10-24
D13S317 13 5-15
PENTA E 15 5-26
D16S539 16 5-15
D18S51 18 7-27
D19S433 19 5-20
D21S11 21 24-38
PENTA D 21 2-18

El polimorfismo de los STR puede determinarse mediante la amplificación de estos por medio
de la técnica de PCR y el análisis posterior del tamaño de los productos de amplificación por
electroforesis en gel. A continuación, se observan ejemplos de tres STRs (M: marcadores de peso
molecular. 1-8: Distintos individuos analizados).

M 1 2 3 4 M 5 6 7 8 M

M 1 2 3 4 M 5 6 7 8 M

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M 1 2 3 4 M 5 6 7 8 M

2.2 ¿Por qué al analizar un microsatélite particular algunos individuos presentan una única
banda (ejemplo: individuo 5, para el microsatélite D7S820), mientras que hay otros que
presentan dos bandas (ejemplo: individuo 7, para el mismo microsatélite)?

2.3 ¿Cuáles son los mecanismos biológicos que permiten explicar el alto polimorfismo
poblacional de los microsatélites?

Microsatélites en estudios de filiación:

Para estimar el grado de certeza con que se asigna la paternidad es necesario contrastar la
probabilidad de que los alelos de un STR presentes en el hijo provengan del presunto padre
versus la probabilidad que los haya recibido de cualquier otro individuo en la población. De
acuerdo con eso, se calcula la razón entre ambas probabilidades, denominada índice de
paternidad (IP). Si al comparar los perfiles del hijo/a con los del presunto padre hay dos o más
STR en que los que no se observan alelos que tengan el mismo número de repeticiones, se
excluye la paternidad sin necesidad de realizar un cálculo probabilístico.

2.4 Observe la siguiente tabla perteneciente a un caso en que se quiere establecer una relación
de paternidad entre un niño y un presunto padre A (p-padre A), versus presunto padre B (p-
padre B). Los valores representan el número de repeticiones observadas en los alelos de los
microsatélites estudiados, que han sido determinados mediante la técnica de PCR con posterior
electroforesis en gel. ¿Qué conclusiones obtiene? ¿Alguno de los dos es el padre biológico del
niño? Justifique.

Nombre del Alelos de Alelos Alelos del Alelos del

STR la madre del hijo p-padre A p-padre B
TPOX 8 8 8 8 8 11 8 11
D2S1338 19 19 19 20 20 22 21 22
D3S1358 15 15 15 16 15 16 15 18
FGA 23 25 23 23 21 23 21 22
CSF1PO 11 12 11 12 12 12 6 16
D5S818 11 13 12 13 11 12 11 11
D7S820 10 11 11 12 12 12 12 12
D8S1179 11 13 11 15 13 15 11 13
TH01 9 9 6 9 6 7 7 8
VWA 16 17 17 18 15 18 15 16
D13S317 8 11 8 13 12 12 11 11
D16S539 11 14 11 14 11 13 12 12
D18S51 17 18 17 18 13 17 14 16
D19S433 13 15 15 15 15 15 13 14
D21S11 29 31 29 31 29 30 24 25

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Para seguir practicando:

Se sugiere realizar el ejercicio 1 de la “Guía complementaria de actividades

de práctica y autoevaluación”