Informe de pasantias

Trabajo realizado en el laboratorio de biotecnología y biología molecular

Cenbiotec
Introduccion
Objetivos logrados
Actividades realizadas
Conclusiones
Recomendaciones
Agradecimientos
Bibliografia
Actividades Realizadas

Objetivo: extracción y purificación de plásmido.

Los plásmidos como vectores de clonación: Los plásmidos son replicones que poseen los
procariotas y se heredan de manera estable en estado extra cromosómico. Esta definición
implica homogenización genética, tamaño constante de las unidades monoméricas y la
capacidad de replicarse independientemente del cromosoma. Los genes existentes en los
plásmidos codifican para distintos caracteres fenotípicos como: resistencia a antibióticos,
producción de antibióticos, resistencia a metales pesados, degradación de compuestos
aromáticos, etc.
Para poder ser utilizados como un vector de clonación ideal un plásmido debe tener: bajo
peso molecular, origen de replicación, capacidad de conferir caracteres fenotípicos
fácilmente seleccionables en las células huésped por ejemplo resistencia a algún antibiótico
y poseer poly linker o “MCS” (multiple cloning site), el cuál es una pequeña región con
alto número de secuencias reconocibles por un gran número de endonucleasas de
restricción.fig 1

Extracción de DNA plasmídico:

Existe una gran variedad de métodos para el aislamiento de DNA plasmídico, en particular
para aquellos plásmidos encontrados en Escherichia coli y otras enterobacterias. Estos
métodos se diferencian en la pureza del producto final, en el tiempo necesario para llevarlos
a cabo y en la posibilidad de aplicarlos en aislamientos a pequeña o gran escala; sin embargo,
todos incluyen tres etapas comunes:
1.crecimiento de las bacterias y amplificación del plásmido.
2. cosecha y lisis de las bacterias.
3. purificación del DNA plasmídico.

En los protocolos para el aislamiento de plásmidos de bacterias Gram-negativas, el primer

paso es lisar las células por tratamiento con EDTA y Tris. El EDTA desorganiza la membrana
externa, de esta forma el tris tiene acceso a los muropéptidos de la pared, degradándola y
generando esferaplastos. La reacción se realiza en presencia de Glucosa para evitar la
inmediata lisis osmótica de los esferoplastos. Estos son lisados, posteriormente, por el
agregado de un detergente y luego de esta etapa los restos celulares y los fragmentos de
cromosoma bacteriano unidos a la membrana son eliminados por centrifugación mientras que
el DNA plasmídico permanece en solución.
El procedimiento de desnaturalización alcalina, descripto por Birnboim & Doly constituye
la base de varios protocolos de extracción de DNA plasmídico. El principio de la técnica es
que las condiciones alcalinas (pH 12-12,5) desnaturalizan por completo las moléculas
lineales de DNA, pero no las moléculas CCC (las cuales sufren una desnaturalización
parcial). De esta manera como el DNA cromosómico por ser tan grande estará en forma
fragmentada (múltiples moléculas lineales) y el plásmido al ser tan pequeño se mantendrá
cerrado, se desnaturalizarán solo las primeras. Cuando el extracto celular es neutralizado con
una alta concentración salina el DNA cromosoma precipita; esto posiblemente obedezca a
que la Re asociación de largas cadenas de moléculas de DNA simple cadena ocurre en
múltiples sitios formando una masa insoluble. La mayor parte del RNA también precipita, al
igual que las proteínas debido a que la reacción se realiza en presencia de SDS y alta fuerza
iónica, debido al efecto de acetato de potasio Fig 2

El ADN del plásmido del sobrenadante se transfiere a otro tubo y es concentrado por
precipitación con etanol absoluto en frío, después es disuelto en buffer TE que aumenta la

Fig 2. Desnaturalización por lisis alcalina l ll y lll

estabilidad del ADN en muestras almacenadas a largo plazo o de uso frecuente, pues inhibe
DNasas presentes en la muestra. estabilidad del ADN en muestras almacenadas a largo plazo
o de uso frecuente, pues inhibe DNasas presentes en la muestra.
Objetivo: preparación de células electro competentes y electroporación

La transformación genética es un proceso mediante el cual la célula capta moléculas de ADN

libre y las mantiene en su interior en forma de un replicón extracromosómico o las incorpora
a su genoma por recombinación homóloga.1 Muchas bacterias pueden activamente
incorporar ADN exógeno mediante una capacidad genéticamente programada denominada
competencia natural.1,2 El estado de competencia natural nunca ha sido demostrado
directamente en Escherichia coli y en la mayoría de los casos, se emplea el término de
transformación genética en lugar de permeabilización artificial del ADN (1)
Un proceso de transformación genética consta de cuatro etapas que son comunes para todas
las bacterias y necesarias para la detección exitosa de los transformantes. Estas etapas son:
(1) el desarrollo de un estado de competencia en la célula, (2) la unión de la molécula de
ADN a la superficie celular, (3) su entrada y procesamiento y, (4) la expresión fenotípica del
nuevo genotipo resultante. (3) Por otra parte, la introducción de un vector plasmídico es
esencial y constituye la primera etapa en los trabajos de Biología Molecular. Usualmente se
emplea el tratamiento con sustancias químicas y la electroporación para la transformación
artificial de E. coli(4,6)
1.El protocolo realizado es un método descrito por Sambrook y col 1989(13), con
modificaciones, el cual se utilizó para la preparación de células electro competentes. Se
inoculó 2,5 mL de un precultivo en 200mL de LB, contiene peptona de caseína y extracto de
levadura que proporcionan al medio los nutrientes necesarios para el desarrollo óptimo de la
mayoría de los microorganismos. El cloruro de sodio ayuda a mantener el equilibrio
osmótico., a 37c con agitación hasta obtener una densidad óptica a 600 nm fue seleccionada
en el intervalo de 0,4 a 0,6. Las células fueron colectadas mediante centrifugación a5.000g a
4 °C durante 20 min, el sobrenadante se desechó en tubos previamente enfriados. La
suspensión se dispuso en baño de hielo durante 30 min y las células fueron nuevamente
colectadas por centrifugación a 5000 g durante 20 min. Luego de eliminar el sobrenadante,
el precipitado celular se Re suspendió con glicerol al 20 %. De esta forma se disminuye la
fuerza iónica de la suspensión celular, al limpiar las sales. La mezcla había sido previamente
colocada sobre hielo y la concentración celular obtenida fue de 2 x 1011 Unidades formadoras
de colonias (UFC)/mL. Finalmente, alícuotas de 200 μL fueron conservadas a – 70 °C..La
densidad óptica de 600nm fue monitoreada cada 60 minutos para mirar el crecimiento en
absorbancia con el espectrofotómetro .
Tiempo Absorbancia
0 0
60 0,33
120 0.1
150 0.210
170 0.33
 180 0.384
190 0.436
195 0.476

2. Electroporación con plásmido ligado PUC 19 HN

pUC19 es un vector de clonación de plásmido usado comúnmente en E. coli. La molécula es
un pequeño círculo bicatenario, 2686 pares de bases de longitud, y tiene un alto número de
copias. pUC19 porta un poliligador de sitio de clonación múltiple de 54 pares de bases que
contiene sitios únicos para 13 endonucleasas de restricción específicas de hexanucleótidos
diferentes (Yanisch-Perron 1985).Este plasmido es ligado con el inserto del gen HN
(Hemaglutanina Neuraminidasa ) por medio de una enzima ligasa DNA T4 en PCR a 4 c por
4 horas, y a 22c toda la noche .Es la más grande de las moléculas glucoproteicas y tiene
actividad hemaglutinante y de elusión (Scheid y Chopping, 1973; Murphy y col., 1999). Esta
proteína es la responsable de la unión de las partículas virales a los receptores del ácido siálico
de la célula hospedero, actúa como neuraminidasa removiendo los receptores del ácido
siálico de la progenie viral para prevenir la aglutinación de las mismas y desempeña un papel
importante en la patogenicidad de este virus (Huang y col., 2004).
Actividad de Hemaglutinación: La capacidad del VEN(virus de la enfermedad de newcastle
) de aglutinar eritrocitos es debida a la unión de la proteína HN a los receptores presentes en
la superficie de los mismos. Esta propiedad y la inhibición específica de la misma por
antisueros constituyen una poderosa herramienta para el diagnóstico de la enfermedad. Las
cepas del VEN aglutinan glóbulos rojos de pollos pero también de otras aves, de reptiles,
anfibios, ratón, curiel y humanos. Además algunas cepas aglutinan asimismo, eritrocitos de
bovinos, ovinos, caprinos, porcino y equinos (Kouwenhoven, 1993; Alexander, 1997).
Actividad de Neuraminidasa: Es producida por el mucopolisacárido Nacetyl neuramínico
presente en las partículas del VEN. Después de la unión a los eritrocitos, la neuraminidasa
destruye el receptor del ácido siálico y produce la elusión de los mismos. Su función en la
replicación viral no se conoce hasta el momento y no se han encontrado variaciones
antigénicas entre las neuraminidasa de las diferentes cepas del VEN, por lo tanto no son de
interés en el diagnóstico serológico (Kouwenhoven, 1993; Alexander, 1997).

Electroporación: es un método permite la captación de ADN mediante la permeabilización

de las membranas provocada por una descarga eléctrica. Con este método la eficacia de la
transformación aumenta considerablemente, obteniendo entre 109 -1010 transformantes por
µg de ADN. (Dower et al., 1988)
A partir de un inóculo crecido toda la noche se realiza una dilución 1:50 en medio LB fresco
y se incuba a 37ºC hasta una DO a 600 nm de 0,5; Se prepara el medio SOC Se utiliza como
medio de recuperación de las células después de la electroporación en la mutagénesis de
genes cromosómicos utilizando fragmentos de PCR , finalmente para ajustar el volumen a
10ml se le adicionan 200uL de glucosa 1M 50 Ul de MgCl2 2M y completando con ddH2O.
 Plásmido uL Bacterias E.C
1.1 1 50
1.2 2 100
1.3 5 100
2.1 1 100
2.2 2 100
2.3 5 100
3 2 50
4 2 50

3.Las células se mantienen en hielo hasta el momento de la electroporación: se mezclan 50

µl de células con 1-5 µl de la suspensión que contiene el ADN y a continuación se transfiere
a cubetas esterilizadas con luz ultravioleta. El electroporador utilizado en esta tesis fue el
Electro Cell Manipulator 600 (BTX Electroporation System), con las condiciones de
electroporación que se muestran a continuación:
Modo Prokaryotes
v 1,7000
Tiempo ms

4.Se siembran las células en medio LB liquido con ampicilina 10mg/ml y se deja incubando
toda la noche para mirar que bacterias fueron transformadas fig3
Objetivo : Extraccion de ADN
El ADN es una estructura química cuyos elementos fundamentales (nucleotidos) se
organizan de manera lineal generando enormes secuencias de información (Fig. 1, Tabla 1).
La información que define y codifica un carácter determinad o se denomina gen (Lewin
1995).

Objetivo: Extracción de Quitosano

Que es el quitosano?
Proceso de extracción.
Explicar como se separar el quitosano de la quitina por desasetilacion (hidrolisis básica y
acida)
 13. Sambrook J, Maniatis T, Fritsch ET. Molecular Cloning, a Laboratory Manual. 2ed.
Book1. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, EE.UU.; 1989:p. 1,82-1,84.
1. Mandel,M. and Higa,A. (1970) J. Mol. Bio. 53, 159-163. 2. Cohen,S.N., Chang,A.C.Y.
and Hsu,L. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110-2118.
1. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985). Gene. 33, 103-119.
2. Scheid, A. y Choppin, P.W. (1973). Isolation and purification of the envelope proteins of
Newcastle disease virus. J. Virol., 11:263-271.
.Huang, Z.; Elankumaran, S.; Panda, A. y Samal, S.K. (2003). Recombinant Newcastle
disease virus as a vaccine vector. Poultry Sci. 82:899-906.
.Kouwenhoven, B. (1993). Newcastle disease In: Virus infectious of birds. J.B. Mc Ferran
and M.S. McNulty eds. Vet. Res. Lab., Department of Agriculture, Stormont, Belfast,
Northern Ireland, Elsevier Science Publisher, B.V.